CN116635408A - 反应性偶联物 - Google Patents

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帕特里克·加鲁特
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Abstract

本发明涉及用于治疗性抗体或蛋白质的化学修饰的化合物(反应性偶联物)。该化合物能够在单一步骤中将有效载荷区域选择性地附接至抗体或抗体片段，从而产生能够用于诊断、监测、成像或治疗疾病的修饰抗体或修饰抗体片段。

Description

反应性偶联物
技术领域
本发明涉及用于抗体或抗体片段(例如，治疗性抗体)化学修饰的化合物(以下有时称为“反应性偶联物”)。该化合物能够在一个单一步骤中将一种或多种有效载荷区域选择性地附接至抗体或抗体片段上，从而产生修饰抗体或修饰抗体片段，这种修饰抗体或修饰抗体片段可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病、和/或对所述疾病的治疗进行监测或成像。
背景技术
传统的癌症治疗(例如，化学疗法)不仅是非常艰辛的(因为它们的毒性会引起的严重副作用)，而且也可能是非常偶然的，治疗对一个患者有效，而对另一个患者完全无效。因此，开发新的毒性更小和/或更有效的治疗是始终存在的需求，监测治疗效果的能力也是始终存在的需求，例如，能够区分“应答者”患者与“非应答者”患者。
为了对这些需求进行应答，出现了一类称为“抗体-药物-偶联物”(Antibody-Drug-Conjugate，ADC)的新型治疗剂。ADC利用抗体(例如，单克隆抗体(monoclonalantibodie，mAb))的靶向能力，将有效载荷(例如，细胞毒素剂或标记剂)直接递送至癌细胞。癌细胞的特异性靶向使有效载荷的治疗效果最大化，而使对健康细胞的毒性效果最小化。根据有效载荷，ADC可以实现各种作用，例如诊断、监测和/或治疗。
ADC可以通过各种方法制备。然而，这些方法中的大多数导致化学上不同的ADC的异质混合物，这些异质混合物具有不同的偶联位点和/或有效载荷(药物)抗体比率(或“DAR(有效载荷抗体比，payload antibody ratio)”或“药物负载”；指附接至一个抗体部分的药物分子的平均数)。这种异质性会使制造复杂化，从而导致批次间(batch-to-batch)的高度变化性，并且有时会导致不可预测的安全性和功性。此外，由于有效载荷疏水性和所得到的偶联物聚集趋势的增加，具有各种有效载荷和/或高DAR值的ADC的实现通常受到限制。
因此，可以制备均质混合物和/或具有宽范围有效载荷的偶联物的方法(例如，区域选择性或位点特异性偶联方法)越来越受关注。这种方法可以明显增加DAR和有效载荷(药物)偶联位点的可预测性，并且可以用于简化具有更可预测的安全性和/或改进的功效的、更明确的ADC产品的开发和制造，例如均质的高DAR分布。位点特异性偶联方法还可以确保抗体表位在偶联过程中不会改变，从而使ADC与靶标保持高结合亲和力。
已经开发了几种方法来用于有效载荷与抗体的区域特异性和位点特异性偶联。然而，通常已知的方法需要抗体的修饰/工程化，例如通过掺入非天然氨基酸或通过修饰碳水化合物部分来进行抗体的修饰/工程化。这种修饰可能负面地影响相应ADC的治疗功效和/或安全性，例如，因为与抗体的活性、靶向、代谢和/或排泄、以及对抗体的免疫应答相关的不期望的影响。其他方法涉及多个步骤，例如在WO 2018/199337中所列出的方法。这种多步骤方法可能成本高昂和/或费力，使得它们不太有吸引力或者甚至不适合于需要快速和简单的抗体修饰过程的应用，例如用于“护理点”(point-of-care，POC)诊断应用。
因此，仍然需要寻找用于有效载荷与抗体或抗体片段的区域或位点特异性偶联的替代方法。特别地，需要在此之前不需要对抗体或抗体片段进行工程化的方法，并且需要寻找能够以尽可能少的步骤(优选在一个单一步骤中)制备抗体药物偶联物，例如，对于护理点诊断应用，需要允许有效载荷(例如，诸如金属螯合剂或荧光探针的信号单元)与治疗性抗体进行位点特异性偶联的简单的方法。特别地，需要一种保持抗体结合亲和力并使体内抗体分布的改变最小化的简单偶联方法。此外，需要制备具有各种有效载荷和/或高药物抗体比率的ADC的方法。
鉴于上述，本发明的一个目的是提供化合物(反应性偶联物)，使得能够在一个单一步骤中将有效载荷区域选择性偶联至抗体或抗体片段，而在此之前不需要对抗体或抗体片段进行工程化和/或修饰。另一目的是提供一种包含这种化合物的试剂盒。
本发明的又一目的是提供一种用于制备修饰抗体或修饰抗体片段(例如，ADC)的方法，该修饰抗体或修饰抗体片段可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法中。
发明内容
本发明提供了一种化合物，该化合物能够将一种或多种有效载荷区域选择性地附接至抗体(例如治疗性抗体)，或者附接至任选掺入Fc-融合蛋白中的抗体片段。这种区域选择性附接可以在一个单一(偶联)步骤中完成。所得到的修饰抗体或修饰的抗体片段(例如，ADC或抗体-放射性核素偶联物)可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病(特别是癌症)的方法中。
本发明的化合物(反应性偶联物)由下式(1)表示：
V-(Y-P)n (1)
其中，
V为包含载体的肽，该载体能够与抗体或其片段的可结晶片段(fragmentcrystallisable,Fc)区域相互作用，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中；
P为包括一个或多个有效载荷P1的基团；
Y为能够与氨基酸(优选赖氨酸)的侧链反应的反应性部分，其中Y共价附接至包含在V中的氨基酸的侧链；以及
n为1至3的整数、优选1或2、最优选1。
本发明还涉及用于对抗体或抗体片段进行区域选择性修饰的试剂盒，该抗体片段任选地掺入至Fc-融合蛋白中，其中所述试剂盒包含如上所述的化合物和缓冲液，该化合物任选地固定在固相基质(例如珠)上。
此外，本发明涉及用于对抗体或抗体片段进行区域选择性修饰的方法，该抗体片段任选地掺入至Fc-融合蛋白中，其中所述方法使用上述化合物。
此外，本发明涉及修饰抗体或修饰抗体片段(例如，通过上述方法可获得或获得)，该抗体片段任选地掺入至Fc-融合蛋白中，该修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测、成像和/或治疗疾病(尤其是癌症)的方法中。
特别地，本发明包括以下实施方案(“项目”)：
1.一种式(1)的化合物：
V-(Y-P)n
(1)
其中，
V为包含载体的肽，该载体能够与抗体或其片段的可结晶片段(Fc)区域相互作用的，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中；
P为包括一个或多个有效载荷P1的基团；
Y为能够与氨基酸(优选赖氨酸)的侧链反应的反应性部分，其中Y共价附接至包含在V中的氨基酸的侧链；以及
n为1至3的整数、优选1或2、最优选1。
2.根据项目1所述的化合物，其中，P为P1，或者P由下式(2a)、(2b)和(2c)中的一者表示：
P1-L-*
(2a)
(P1-L)n'-K-*
(2b)
(P1)n'-K-*
(2c)
其中，
P1为有效载荷；
L为接头，其中所述接头任选地是可裂解的，并且其中优选该接头包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子；
K为支化基团，该支化基团共价结合至基团Y、以及式(2b)中的两个或多个接头(L)或式(2c)中的两个或多个有效载荷(P1)，以形成树枝状结构(dendrimeric structure)；
n'为2至8的整数、优选2至4的整数，以及更优选为2；以及
*表示与反应性部分(Y)共价附接。
3.根据项目1或2所述的化合物，其中P1选自：
(i)衍生自以下的部分
·发色团，其中所述发色团优选选自
ο磷光团(phosphorophore)，和
ο荧光团，诸如荧光素或罗丹明，
·标记部分，该标记部分可以包括放射性核素，其中所述标记部分优选为含有或能够含有放射性核素的部分、更优选选自
ο含有或能够含有诸如125I、123I、131I、11C、15O、18F的非金属放射性核素的标记部分，诸如衍生自含有诸如125I、123I或131I的放射性核素的4-羟基苯基丙酸酯的部分，以及
ο螯合剂，该螯合剂任选地包含螯合放射性核素，诸如衍生自二亚乙基三胺五乙酸(diethylenetriamine pentaacetic acid，DTPA)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(cyclohexyl diethylenetriamine pentaaceticacid，CH-X-DTPA)、去铁胺(desferrioxamine，DFO)、N1-(27-氨基-11,22-二羟基-7,10,18,21-四氧代-6,11,17,22-四氮杂二十七烷基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO')、N1-(5-(3-(4-氨基丁基)-1-羟基-2-氧代哌啶-3-羧酰胺基)戊基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基-4-((5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO-cyclo')、1-(1,3-羧丙基)-4,7-羧甲基-1,4,7-四乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2'-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(NO2A)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、巯基乙酰-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(mercaptoacetyl-glycyl-glycyl-glycine，maGGG)、巯基乙酰-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸(mercaptoacetyl-serine-serine-serine，maSSS)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-甲硫氨酸(1,4,7,10-tetraatacyclododecane-1,4,7,10-tetraaceticacid-methonine，DOTA-Met)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(triethylenetetraminehexaacetic acid，TTHA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(1,4,8,11-tetraazacyclotetradecane，CYCLAM，环拉胺)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(CB-TE2A)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(DO3AM)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)、1,5,9-三氮杂环十二烷(TACD)、(3a1s,5a1s)-十二氢-3a,5a,8a,10a-四氮杂芘(顺式-乙二醛-环拉胺)、1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(cyclen，轮环藤宁)、三(羟基吡啶酮)(tri(hydroxypyridinone)，THP)、3-(((4,7-双((羟基(羟甲基)磷酰基)甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)甲基)(羟基)磷酰基)丙酸(3-(((4,7-bis((hydroxy(hydroxymethyl)phosphoryl)methyl)-1,4,7-triaz onan-1-yl)methyl)(hydroxy)phosphoryl)propanoic acid,NOPO)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酸(TRITA)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(TRITAM)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(TRITRAM)、反式-N-二甲基环拉胺、2,2',2”-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(NOTAM)、氧环拉胺(oxocyclam)、二氧环拉胺、1,7-二氧杂-4,10-二氮杂环十二烷、交联桥环拉胺(cross-bridged-cyclam，CB-cycram)、三氮杂环壬烷次膦酸盐(酯)(triazacyclononanephosphinate，TRAP)、双吡哆酸基二磷酸盐(酯)(dipyridoxyl diphosphate，DPDP)、内消旋-四-(4-磺酰基苯基)卟啉(meso-tetra-(4-sulfanotophenyl)porphine，TPPS4)、亚乙基双羟基苯基甘氨酸(ethylenebishydroxyphenylglycine，EHPG)、六亚甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(dimethylphosphinomethane，DMPE)、亚甲基二磷酸、二巯基琥珀酸(dimercaptosuccinic acid，DMPA)、1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四(2-氨基甲酰基甲基)环十二烷(1,4,7,10-tetraaza-1,4,7,10-tetra(2-carbamoylmethyl)cyclododecane，TCMC)或其衍生物；
(ii)包含选自以下的偶联基团的部分：任选取代的共轭二烯；任选取代的四嗪(tetrazine，TZ)；任选取代的炔烃或叠氮化物；任选取代的二苯并环辛烯(dibenzocyclooctyne，DBCO)；任选取代的反式-环辛烯(trans-cyclooctene，TCO)；任选取代的双环[6.1.0]壬炔(bicyclo[6.1.0]nonyne，BCN)；任选取代的醛；任选取代的酮；任选取代的卤代乙酰胺；任选取代的马来酰亚胺；以及任选取代的或受保护的硫醇，所述硫醇优选用单甲氧基三苯甲基(monomethoxytrityl)保护；
(iii)衍生自选自以下的药物的部分
·抗肿瘤剂，诸如
οDNA-烷化剂，诸如多卡霉素(duocarmycin)，
ο拓扑异构酶抑制剂，诸如多柔比星，
οRNA-聚合酶II抑制剂，诸如-鹅膏蕈碱，
οDNA裂解剂，诸如卡利奇霉素(calicheamicin)，
ο抗有丝分裂剂或微管干扰剂，诸如紫杉烷、澳瑞他汀或美登醇(maytansinoid)，
ο抗代谢物，诸如吉西他滨的衍生物，
ο纺锤体驱动蛋白抑制剂，诸如非兰尼塞(Filanesib)，
ο激酶抑制剂，诸如帕他色替(ipatasertib)或吉非替尼(gefitinib)，
ο烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂，诸如2241014-82-2，
ο基质金属肽酶9抑制剂，诸如CGS27023A的衍生物，
ο磷酸酶抑制剂，诸如微囊藻毒素-LR(mycrocystin-LR)，
·免疫调节剂，诸如氟替卡松，
·抗感染性疾病剂，诸如利福霉素、克林霉素(clindamycin)或瑞他莫林(reptamulin)，以及
·上述任何物质的放射性同位素、代谢物、药学上可接受的盐和/或前药；
(iv)包含一个或多个增溶基团的部分，各增溶基团优选独立地选自由包含一个或多个离子基团(诸如，铵基、硫酸盐基团或磺酸盐基团)的部分和聚环氧烷基团组成的基团；其中所述部分优选包含一个或多个C2-3聚环氧烷基团，并且其中优选各C2-3聚环氧烷基团独立地包含4至600个、优选10至200个、更优选15至80个重复单元；
如果存在多于一个有效载荷(P1)，则各P1独立地选自前述部分(i)至(iii)、或(i)至(iv)，有效载荷P1优选地是彼此相同的。
4.根据项目1至3中任一项所述的化合物，其中，P1是任选包含螯合放射性核素的螯合剂，所述螯合剂优选为衍生自DTPA、DOTA、DFO、NOTA、PCTA、CH-X-DTPA、NODAGA、DOTAGA、maSSS、maGGG或DOTA-甲硫氨酸的部分，且更优选衍生自DOTA、DTPA、CH-X-DTPA、PCTA、NOTA或DFO的部分。
5.根据项目3或4所述的化合物，其中，放射性核素选自124I、131I、86Y、90Y、177Lu、111In、188Re、55Co、64Cu、67Cu、68Ga、89Zr、203Pb、212Pb、212Bi、213Bi、72As、211At、225Ac、223Ra、97Ru、149Tb、152Tb、161Tb、99mTc、226Th、227Th、201Tl、89Sr、44/43Sc、47Sc、153Sm、133Xe和Al18F，优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga、99mTc、203Pb、72As、55Co、97Ru、201Tl、152Tb、133Xe、86Y和Al18F，更优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga和99mTc，最优选选自64Cu、99mTc和111In。
6.根据项目1至3中任一项所述的化合物，其中，P1是衍生自以下的部分：依喜替康(exatecan)、DM4、PNU-159682、鹅膏蕈碱、多卡霉素、澳瑞他汀、美登素(maytansine)、微管溶素(tubulysin)、卡利奇霉素、SN-38、紫杉醇、微管溶素、道诺霉素(daunomycin)、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯类纺锤体驱动蛋白(kinesin spindleprotein，KSP)抑制剂、吲哚啉苯并二氮杂卓二聚体(indolino-benzodiazepine dimers)或其放射性同位素和/或药学上可接受的盐；
如果存在多于一个的有效载荷(P1)，则各P1独立地选自项目3的前述部分(i)至(iii)、或(i)至(iv)，有效载荷优选地是彼此相同的。
7.根据项目1至3中任一项所述的化合物，其中，至少一个P1是衍生自包含一个或多个聚环氧乙烷基团的化合物的部分，其中优选各聚环氧乙烷基团独立地包含4至600个、更优选10至200个、甚至更优选15至80个重复单元；
P1优选是由下式(12c)表示的部分：
-X6-(CH2CH2O)n19'-X7 (12c)
其中，
n19'为4至600、优选10至200、更优选15至80的整数；
X6选自单个共价键、-(C＝O)-和-N(R)-，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；
X7表示具有1至6个碳原子的烷基，诸如甲基；含羰基的基团，诸如乙酰基或式-(CH2)n4-CO2H的基团；含硫代羰基的基团；式–(CH2)n4OR的基团；式-(CH2)n4-SO3H的基团；或含氨基的基团，诸如式
-(CH2)n4-(C＝X)-N(R')(R)或-(CH2)n4-n(R')(R)；其中X为O或S，R和R'各自
独立地选自氢原子、烷基或环烷基，n4为1至6的整数；
X7优选为-CH3，或由下式(12a')表示的基团：
–(CH2)n5–(C＝X)N(R)–(CH2)n6–(C＝X)N(H)(R) (12a')
其中，
各X独立地选自O和S，优选地为O，
各R独立地选自氢原子、烷基和环烷基，并且
n5和n6各自独立地为1至6的整数、优选为1或2；以及
X7最优选地为-CH3；
如果存在多于一个的有效载荷(P1)，则各P1独立地选自前述的项目3的部分(i)至(iv)，并且更优选地是上述式(12c)的部分，有效载荷优选地是彼此相同的。
8.根据项目2至7中任一项所述的化合物，其中，接头(L)选自
(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，例如亚丙基；
(b1)具有2或3个碳原子、且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基；优选由下式表示的基团
–NH–(CH2CH2O)n1–CH2CH2–
其中n1为0至35的整数，例如1至20的整数；
(c1)包含2至12个氨基酸的肽基团；
接头(L)优选为如上定义的(b1)基团；
如果式(1)的化合物包含多于一个的接头(L)，则各L独立地选自前述(a1)至(c1)基团，各接头(L)优选为(b1)基团。
9.根据项目2至8中任一项所述的化合物，其中，支化基团(K)由式*-CH(R1-**)(R2-**)(3a)、或下式(3b)表示，
其中，
R1和R2各自独立地选自由-(CH2)m1-**和-(CH2)m1R3-**组成的组；
R3选自由-NH-**、-(C＝X)R4-**和-NH(C＝X)R4-**组成的组，并且优选
为-NH-**或-NH(C＝X)R4-**；
R4为-(CH2)m2-**、-(CH2)m2S-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH-**、或式(3c)芳基：
R5和R6各自独立地选自–(CH2)m2-**、-(CH2)m2S**-、-CH(CH2S-**)2、
-(CH2)m2NH-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH(C＝X)R8-**和
-CH2(CH2)m2H-**；
R7为-CH2S-**、(CH2)m2-**或-(CH2)m2R9-**；
R8为-(CH2)m3S-**；
R9为-NH(C＝X)m3S-**；
各X独立地选自O和S，并且优选为O；
*表示与反应性部分(Y)共价附接，任选地经由接头(L2)附接；
**表示在式(2b)中与接头(L)共价附接，或在式(2c)中与有效载荷(P1)共价附接；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2和3，条件是，如果K为式(3a)，则m1不为0；各m1、m2和m3优选为1。
10.根据项目2至9中任一项所述的化合物，其中，支化基团(K)由下式(3d)-(3l)中的一者表示：
其中
m1为0、1、2或3，优选为1；
m2为1、2、3或4，优选为1；
m3为0、1、2或3，优选为1；
*表示与反应性部分(Y)共价附接；以及
**表示与接头(L)或有效载荷(P1)共价附接；支化基团(K)优选由式(3d)表示。
11.根据项目2至8中任一项所述的化合物，其中，支化基团(K)由下式(3m)表示：
*—(AA1)m4—G(3m)
其中，
m4为1至10的整数、优选1至6的整数、更优选1、2或3；
各AA1独立地是衍生自三官能氨基酸(诸如，二氨基羧酸)的部分，其中优选各AA1独立地是衍生自Orn、Lys、Dab或Dap的部分、更优选衍生自Orn或Lys的部分；源自三官能氨基酸的侧链共价附接至式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有效载荷(P1)；
G不存在，或表示选自以下的一者：
·氢原子，
·式–N(H)(R)的基团，其中R选自氢原子、烷基和环烷基；以及
·式–N(H)(R)–(CH2)n13–(C＝O)N(H)(R)的基团，其中各R独立地选自氢原子、烷基和环烷基，并且n13为1至6的整数，优选1或2；
如果G不存在，则所得到的游离价与式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有
效载荷(P1)形成共价键；
*表示与反应性部分(Y)共价附接；以及
**表示与接头(L)或有效载荷(P1)共价附接；
条件是如果m4为1，则G不存在。
12.根据项目1至11中任一项所述的化合物，其中，反应性部分(Y)由下式(4a)和(4b)中的一者表示：
*’-F1-RC-F2-***(4a)
*’-(F1-RC-F2)-M-***(4b)
其中，
RC是反应中心，优选亲电反应中心，并且更优选选自C＝O和C＝S的基团；
F1为单个共价键、原子或原子基团；优选为CH2或NH原子基团或选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为CH2原子基团或选自O和S的原子；
F2表示原子或原子基团；优选为选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自O和S的原子；
M为能够调节F2的电子密度和稳定性的基团，优选为能够吸电子的基团；
*’表示与基团(P)共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接；
反应性部分(Y)优选由式(4b)表示。
13.根据项目12所述的化合物，其中，能够调节F2的电子密度和稳定性的基团(M)由下式(4c)表示：
***‘--M’—B—E--*** (4c)
其中，
M’为衍生自琥珀酰亚胺，或分别具有6、10或14元环和1、2或3个稠环的芳基，或具有5至20元环、1、2或3个稠环和独立选自N、O和S的1至4个杂原子的杂芳基的部分，各基团任选地被一个或多个取代基取代；优选为衍生自苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯并三唑基的二价基团，各基团任选被一个或多个取代基取代，并且各取代基优选选自-F、-Br、-Cl、-I、-NO2、-CN、-C1-6-烷基、-C1-6-烷氧基、诸如，-C(O)NH2的-C1-6-氨基、以及它们的组合，诸如-CCl3、-CF3或-CH2NO2；
B选自以下以及它们的任何组合：
·单个共价键、O、S或原子基团NR'，其中R'表示氢原子、-OH、烷基、环烷基、C2-6-亚烯基或C2-6-亚炔基；
·由通式(4d)表示的基团：
◆–X1–(CH2CH2O)n2–CH2CH2–◆◆ (4d)
其中
X1为-C(＝O)NH-、-C(＝O)-、-NH-或-S-；优选为-C(＝O)NH-；
n2为1至24、优选为1至10、更优选为1至3的整数；
◆表示与M’共价附接，并且
◆◆表示与E共价附接；
·在主链中具有6至25个氨基酸(例如，在主链中具有9个氨基酸)的肽基团，各氨基酸优选选自Pro、Gly、Ala、Asn、Asp、Thr、Glu、Gln和Ser；更优选选自Pro、Gly和Ser；其中，B优选为单个共价键、或具有通式(4d)的基团，更优选为单个共价键；
E为C＝O、C＝S或C(＝NR”)，其中R”表示氢原子、OH、烷基、环烷基、
S＝O或S(＝O)2；优选E为C＝O；
***’表示与F2共价附接，并且
***表示与肽(V)共价附接。
14.根据项目12或13所述的化合物，其中，部分(F1-RC-F2)由下式(4a’)至(4l’)中的一者表示，和/或基团(M)由下式(5a)至(5i’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，
*'表示与基团(P)共价附接，
***表示与肽(V)共价地附接，或如果M存在，则与基团(M)共价附接，并且
***'表示与反应性部分(Y)的F2共价附接。
15.根据项目1至14中任一项所述的化合物，其中，所述反应性部分(Y)由下式(6a)至(6l’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，
*'表示与基团(P)共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接。
16.根据项目1-15中任一项所述的化合物，其中，肽(V)包含11至17个氨基酸(例如，13至17个氨基酸)的序列，肽优选为环状的，并且更优选由下式(7a)表示：
其中，
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、高酪氨酸(homo-tyrosine，hTyr)和间酪氨酸(meta-tyrosine，mTyr)的氨基酸；优选选自Lys、高赖氨酸(hLys)、鸟氨酸(Orn)、2,3-二氨基丙酸(2,3-diaminopropionic acid，Dap)、2,4-二氨基丁酸(2,4-diaminobutyric acid，Dab)、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；更优选为Ala；
·Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx各自独立地表示氨基酸；
·Axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(8a)表示的肽部分：
---Axx1–Axx2–Axx3---(8a)
其中，在式(8a)中，
Axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如Arg；
Axx2表示氨基酸，诸如Gly或Cys、优选为Gly；以及
Axx3表示氨基酸，诸如Asp或Asn；
·Hxx表示氨基酸或由下式(8b)表示的肽部分：
---Hxx1–Hxx2–Hxx3--- (8b)
其中，在式(8b)中，
Hxx1表示氨基酸，诸如Thr；
Hxx2表示单个共价键或氨基酸，诸如Tyr或Cys；以及
Hxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如His；并且Axx2的侧链可以共价附接至Hxx2的侧链以形成环；
其中，优选Hxx2和Hxx3两者表示单个共价键；
·如果Axx2为Cys且Hxx2为Cys，则优选将Axx2和Hxx2的侧链链接在一起以形成式–(S–X3–S)-的基团，其中X3表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，例如二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基；优选X3表示单个共价键；
·Lxx1和Lxx2各自独立地表示单个共价键或三官能氨基酸，例如二氨基羧酸；条件是Lxx1和Lxx2中的至少一个是单个共价键；
·Z1表示
ο如果Lxx1为单个共价键，则Z1表示共价附接至Axx的N-末端的基团，该基团选自氢原子、含羰基的基团(诸如，乙酰基)、含C2-3聚环氧烷的基团和衍生自含有偶联基团(诸如，生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇)的化合物的基团，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
ο如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1附接至Lxx1的侧链，则Z1表示共价附接至Lxx1的N-末端的基团，该基团选自氢原子、含羰基的基团(诸如乙酰基)和含C2-3聚环氧烷的基团；并且
ο如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1共价附接至Lxx1的N-末端，则Z1表示共价附接至Lxx1的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团；
·Z2表示
ο如果Lxx2是单个共价键，则Z2表示共价附接至Hxx的C-末端的基团，该基团选自-N(H)(R)，其中R表示氢原子、烷基或环烷基、含C2-3聚环氧烷的基团、和衍生自含有偶联基团(诸如，生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺或硫醇)的化合物的基团，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
o如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的侧链，则Z2表示共价附接至Lxx2的C-末端的基团，该基团优选为含C2-3聚环氧烷的基团、由N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；并
且
o如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的C-末端，则Z2表示共价附接至Lxx2的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团；
·Y1表示仅当Lxx1为三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z1附接至Lxx1的N-末端，则Y1共价附接至Lxx1的侧链，或者如果Z1附接至Lxx1的侧链，则Y1共价附接至Lxx1的N-末端；
其中Y1衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·Y2表示仅当Lxx2是三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z2附接至Lxx2的C-末端，则Y2共价附接至Lxx2的侧链，或者如果Z2附接至Lxx2的侧链，则Y2共价附接至Lxx2的C-末端；
其中Y2衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·S1是由下式(8c)表示的间隔基：
α–X4–(CH2CH2O)n2–CH2CH2–X5–β(8c)
其中
X4为NH、O或S；优选为NH；
如果X5共价附接至肽(V)，则X5为NH或C＝O，优选为C＝O；
n2为1至46、优选1至24、最优选1至12的整数；并且
如果X5共价附接至肽(V)，则α表示与Y1或Y2共价附接，或者如果X5共价附接至Y1或Y2，则α表示与肽(V)共价附接；并且
如果X4共价附接至Y1或Y2，则β表示与肽(V)共价附接，或者如果X4共价附接至肽(V)，则β表示与Y1或Y2共价附接；
·X2表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，诸如二价马来酰亚胺基团、二价丙酮基团或二价亚芳基；优选为单个共价键；
·其中Axx、Bxx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx和Hxx中的至少一种，优选Bxx、Dxx、Exx、Fxx和Gxx中的一种或多种，更优选Bxx、Exx和Gxx中的一种或多种，最优选Bxx和/或Exx表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸，更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，氨基酸通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)；条件是肽(V)不包含多于三个具有含氨基侧链的氨基酸；并且
如果反应性部分(Y)通过Tyr、hTyr或mTyr附接至肽(V)，则反应性部分(Y)优选为项目10中定义的式(4a)的部分。
17.根据项目16所述的化合物，其中，Axx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx、Hxx、Lxx1和Lxx2中的至少一者如下定义：
Axx表示选自Ala、2,3-二氨基-丙酸(Dap)、Asp、Glu、2-氨基辛二酸、α-氨基丁酸、Asn和Gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸和己二酸的二羧酸，或者式(8a)的肽部分；Axx优选为Ala、Asp或Asn，更优选为Asp；其中Axx1是单个共价键，Axx2是Cys，且Axx3是Asp；
Cxx表示选自Trp、Phe、Tyr、苯基甘氨酸(Phg)、3-苯并噻吩-2-基-L-丙氨酸、3-萘-2-基-L-丙氨酸、3-联苯-4-基-L-丙氨酸和3-萘-1-基-L-丙氨酸的氨基酸；优选为Trp；
Dxx表示选自His、Ala、3-吡啶-2-基-L-丙氨酸、mTyr和Phe的氨基酸；优选为His、Ala或mTyr；更优选为His；
Exx表示选自Ala、2-氨基-丁酸(Abu)、Gly、Leu、Ile、Val、Met、环己基丙氨酸(Cha)、Phe、Thr、Cys、Tyr和正亮氨酸(Nle)的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；
Fxx表示选自Ala、Gly、Asn、Ser、Abu和Asp的氨基酸；优选为Ala或Gly；更优选为Gly；
Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；优选为Asp或Glu；更优选为Glu；
Hxx表示选自Thr、Ser、Ala、Asn、Val、Abu、Ile、Met、Leu、Pro、Gln和Cys的氨基酸或者式(8b)的肽部分；Hxx优选为Thr或Ser，更优选为Thr；其中Hxx1为Thr，Hxx2为Cys，Hxx3为单个共价键；
Lxx1和Lxx2各自独立地表示选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸，优选为选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸；并且
如果Dxx或Exx表示通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，则Gxx优选为Glu、Gln、His、Arg或Asn，且更优选为Gln。
18.根据项目1至17中任一项所述的化合物，其中，肽(V)由下式(9a)表示：
其中，
·Z1、Z2、Bxx、Exx、Gxx和X2如项目16所定义；并且
·Bxx、Exx和Gxx中的至少一者(优选Bxx和/或Exx)表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr；优选具有含氨基侧链的氨基酸；且更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸；氨基酸通过其侧链共价结合至反应性部分(Y)；并且
·如果Exx表示具有通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸；
并且更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，则Gxx优选为Glu、Gln、His、Arg或Asn，更优选为Gln；
并且优选地，Bxx、Exx和Gxx中的一个或两个如下定义：
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；优选为Lys、hLys、Orn、Dap、Dab、Ala、Tyr、hTyr或mTyr；
更优选为Ala；
·Exx表示选自Ala、Abu、Gly、Leu、Ile、Val、Met、Cha、Phe、Thr、Cys、Tyr和Nle的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；并且
·Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；
优选为Asp或Glu；更优选为Glu。
19.根据项目1-18中任一项所述的化合物，其中，肽(V)由下式(10a)至(10v)、(10b’)和(10g’)中的一者表示：
/>
/>
其中，
Z1、Z2和X2如项目14中所定义；并且
在式(10a)至(10v)、(10b’)和(10g’)中，肽(V)通过包含在V中的Tyr、Lys、hLys、Orn、Dap或Dab的侧链共价附接至反应性部分(Y)；
肽(V)优选由式(10a)、(10b)、(10b’)、(10c)、(10e)、(10f)、(10g)、(10g’)(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10m)、(10n)、(10p)、(10q)、(10s)、(10t)和(10u)中的任一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任一者表示，且甚至更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任一者表示。
20.根据项目16至19中任一项所述的化合物，其中，Z1和Z2中的至少一者是含C2-3聚环氧烷的基团；优选为含聚环氧乙烷的基团，该含C2-3聚环氧烷的基团优选包含4至600个、更优选10至200个、甚至更优选15至80个重复单元；
其中，
Z1优选由下式(13a)表示：
X8–(OCH2CH2)n7–X9– (13a)
其中
X8表示具有1至6个碳原子的烷基(例如，乙基)，或者含氨基的基团，优选式(CH2)n8–N(H)(R)的基团，其中R选自氢原子、烷基、环烷基和含羰基的基团(例如，乙酰基)，n8为1至6的整数，优选为2；
X9表示-(C＝X)-，X选自O和S，优选为O；并且
n7为4至100、优选为10至80、更优选为15至40、最优选为20或24的整数；
和/或
Z2优选由下式(13b)表示：
–X10–(CH2CH2O)n9–X11 (13b)
其中
n9为4至100、优选10至80、更优选15至40的整数；
X10为单个共价键、NH、O或S；优选NH；
X11表示：具有1至6个碳原子的烷基，诸如甲基；含羰基的基团，诸如乙酰基或式–(CH2)n10–CO2H的基团；含硫代羰基的基团；式–(CH2)n10OR的基团；式–(CH2)n10–SO3H的基团；或含氨基的基团，诸如式–(CH2)n10–(C＝X)–N(R')(R)或–(CH2)n10–N(R')(R)；其中X为O或S，R和R'各自独立地选自氢原子、烷基或环烷基，且n10为1至6的整数；
X11优选为甲基，或由-CH3或下式(13b’)表示的基团：
–(CH2)n11–(C＝X)N(R)–(CH2)n12–(C＝X)N(H)(R) (13b’)
其中
各X独立地选自O和S，优选为O；
各R独立地选自氢原子、烷基和环烷基；并且
n11和n12各自独立地为1至6、优选为1或2的整数，更优选为2；
X11最优选为-CH3。
21.根据项目20所述的化合物，其中Z1是包含10至200个、优选15至80个重复单元的含聚环氧乙烷的基团，更优选如项目20中所定义的式(13a)的基团，并且Z2是由–N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；并且
其中，肽(V)优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任一者表示，且甚至更优选由式(10f)表示。
22.根据项目1至21中任一项所述的化合物，化合物选自由以下组成的组
/>
/>
/>
23.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，试剂盒包含项目1至22中任一项所述的化合物和缓冲液；其中，缓冲液的pH优选为5.5至11、更优选为7.0至9.5。
24.根据项目23所述的用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，其中，化合物被固定在固相基质上，优选其中化合物经由生物素-链霉亲和素相互作用、经由炔烃与叠氮化物之间的点击化学反应(click reaction)获得的共价键(covalent linkage)、经由硫醇与乙酰胺之间的反应获得的共价键、经由TCO的衍生物与TZ的衍生物之间的反应获得的共价键、或经由硫醇与马来酰亚胺之间的反应获得的共价键而固定在固体支承物上。
25.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的方法，抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，该方法包括使抗体或其片段与根据项目1-22中任一项所述的化合物反应。
26.根据项目25所述的方法，其中
·抗体是单克隆抗体，优选为选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗、阿杜那单抗、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗(altumomab pentetate)、阿特珠单抗、阿奈妥单抗(anetumab)、阿维鲁单抗、巴匹组单抗
(bapineuzumab)、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝迈奇单抗(bermekimab)、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗(bezlotoxumab)、本妥昔单抗、维布妥昔单抗、布罗达单抗(brodalumab)、卡妥索单抗、西米普利单抗(cemiplimab)、西妥昔单抗、辛帕奈单抗(cinpanemab)、克利妥珠单抗
(clivatuzumab)、克雷内治单抗(crenezumab)、轮环藤宁四乙酸(tetraxetan)、达利珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、依帕伐单抗(emapalumab)、恩弗妥单抗
(enfortumab)、维汀-恩弗妥单抗(enfortumab vedotin)、依帕珠单抗、依帕珠单抗-SN38、埃达组单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星
(gemtuzumab ozogamycin)、吉妥昔单抗、戈奈单抗(gosuranemab)、替伊莫单抗、英比利珠单抗、英夫利昔单抗(inebilizumab infliximab)、英妥珠单抗、奥英妥珠单抗(inotuzumab ozogamicin)、伊匹单抗、艾萨妥昔单抗、伊西贝单抗(isatuximabixekizumab)、J591 PSMA-抗体、拉贝珠单抗、莱卡单抗、莫格利珠单抗(mogamulizumab)、奈昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗(ocrelizumab)、奥法木单抗、奥拉单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗(polatuzumab)、维博妥珠单抗(polatuzumab vedotin)、普尼珠单抗
(prasinezumab)、雷妥莫单抗(racotumomab)、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、赛妥珠单抗(sacituzumab)、戈沙妥组单抗(sacituzumab govitecan)、西瑞奈单抗(semorinemab)、司妥昔单抗、茄尼醇单抗、他珠单抗、替妥木单抗、替拉奈单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、德喜曲妥珠单抗(trastuzumab deruxtecan)、恩美曲妥珠单抗(trastuzumabemtansine)、
TS23、乌司奴单抗、维多珠单抗、伏妥莫单抗、泽格特奈单抗
(zagotenemab)、扎芦木单抗(zalutumumab)、扎木单抗(zanolimumab)、及其片段和衍生物；更优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗；或者
·将抗体片段掺入至Fc-融合蛋白中，该Fc-融合蛋白优选选自贝拉西普(belatacept)、阿柏西普(aflibercept)、ziv-阿柏西普(ziv-aflibercept)、度拉糖肽(dulaglutide)、利钠西普、罗米司亭、阿巴西普和阿法西普。
27.一种修饰抗体和修饰抗体片段，该修饰抗体和修饰的抗体片段是通过使抗体或抗体片段与根据项目1至22中任一项所述的化合物反应而获得的，该抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，其中抗体或抗体片段优选与项目26中的相同。
28.根据项目27所述的修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段由下式(11)表示：
(P-W)p-A(11)
其中，
P为包含根据权利要求3至7中任一项指定的一种或多种有效载荷(P1)的基团，其中P优选是式(2a)的基团；
W为F1-RC’，其中F1附接至P上，且RC’为衍生自附接至A的反应中心(RC)的部分，F1和RC如式(4a)和(4b)所定义；
A为衍生自任选掺入Fc-融合蛋白中的抗体或抗体片段的部分，该抗体或抗体片段如上项目25或26所指定；以及
p为1至5、优选地p为1至3的整数，更优选为1或2。
29.根据项目27或28所述的修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测、成像或治疗疾病和/或监测或成像其治疗的方法，该方法包括向受试者施用修饰抗体或修饰抗体片段。
30.一种用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据项目27或28所述的修饰抗体或修饰抗体片段。
31.根据项目29所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目30所述的方法，其中，疾病是神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
32.根据项目29或31所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目30或31所述的方法，其中，疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脑动脉硬化症、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、包括不稳定型心绞痛的心绞痛、主动脉瘤、动脉粥样硬化症、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植术、包括心房颤动终止收缩性心力衰竭的心力衰竭、高胆固醇血症、局部缺血、心肌梗塞、血栓栓塞、血栓症、强直性脊柱炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、肉芽肿性多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化症、斑块状银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(Ulcerative colitis，UC)、葡萄膜炎、以及血管炎。
33.根据项目29或31所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目30或31所述的方法，其中，疾病是癌症，并且该疾病涉及选自以下的细胞：淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞、以及以不受调节和加快速度生长和分裂而导致癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞和头颈癌细胞。
在一些其他方面，本发明包括以下实施方案(“项目”)：
1.一种式(1)的化合物：
V-(Y-P)n
(1)
其中，
V为包含载体的肽，该载体能够与抗体或其片段的可结晶片段(Fc)区域相互作用，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中；
P为包括一个或多个有效载荷P1的基团；
Y为能够与氨基酸(优选赖氨酸)的侧链反应的反应性部分，其中Y共价附接至包含在V中的氨基酸的侧链；以及
n为1至3的整数、优选1或2、最优选1。
2.根据项目1所述的化合物，其中，P为P1，或者P由下式(2a)、(2b)和(2c)中的一者表示：
P1-L-＊
(2a)
(P1-L)n’-K-＊
(2b)
(P1)n’-K-＊
(2c)
其中，
P1为有效载荷；
L为接头，其中所述接头任选地是可裂解的，并且其中优选该接头包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子；
K为支化基团，该支化基团共价结合至基团Y、以及式(2b)中的两个或多个接头(L)或式(2c)中的两个或多个有效载荷(P1)，以形成树枝状结构；
n’为2至8的整数、优选2至4的整数，以及更优选为2；以及
*表示与反应性部分(Y)共价附接。
3.根据项目1或2所述的化合物，其中P1选自：
(i)衍生自以下的部分
·发色团，其中该发色团优选选自
ο磷光团，和
ο荧光团，诸如荧光素或罗丹明，
·标记部分，该标记部分可以包括放射性核素，其中所述标记部分优选为含有或能够含有放射性核素的部分、更优选选自
ο含有或能够含有诸如125I、123I、131I、11C、15O、18F的非金属放射性核素的标记部分，诸如衍生自含有诸如125I、123I或131I的放射性核素的4-羟基苯基丙酸酯的部分，以及
ο螯合剂，该螯合剂任选地包含螯合放射性核素，诸如衍生自二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(CH-X-DTPA)、去铁胺(DFO)、N1-(27-氨基-11，22-二羟基-7，10，18，21-四氧代-6，11，17，22-四氮杂二十七烷基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO’)、N1-(5-(3-(4-氨基丁基)-1-羟基-2-氧代哌啶-3-羧酰胺基)戊基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基-4-((5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO-cyclo’)、1-(1，3-羧丙基)-4，7-羧甲基-1，4，7-四乙酸(NODAGA)、1，4，7，10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2'-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(NO2A)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、巯基乙酰-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(maGGG)、巯基乙酰-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸(maSSS)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-甲硫氨酸(DOTA-Met)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、
1,4,8,11-四氮杂环十四烷(CYCLAM，环拉胺)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(CB-TE2A)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(DO3AM)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)、1,5,9-三氮杂环十二烷(TACD)、(3a1s,5a1s)-十二氢-3a,5a,8a,10a-四氮杂芘(顺式-乙二醛-环拉胺)、1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(cyclen，轮环宁)、三(羟基吡啶酮)(THP)、3-(((4,7-双((羟基(羟甲基)磷酰基)甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)甲基)(羟基)磷酰基)丙酸(NOPO)、
3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)、
2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酸(TRITA)、
2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(TRITAM)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(TRITRAM)、反式-N-二甲基环拉胺、2,2',2”-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(NOTAM)、氧环拉胺、二氧环拉胺、1,7-二氧杂-4,10-二氮杂环十二烷、交联桥环拉胺(CB-cycram)、三氮杂环壬烷次膦酸盐(酯)(TRAP)、双吡哆酸基二磷酸盐(酯)(DPDP)、内消旋-四-(4-磺酰基苯基)卟啉(meso-tetra-(TPPS4)、亚乙基双羟基苯基甘氨酸(EHPG)、六亚甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(DMPE)、亚甲基二磷酸、二巯基琥珀酸(DMPA)
或其衍生物；
(ii)包含选自以下的偶联基团的部分：任选取代的共轭二烯；任选取代的四嗪(TZ)；任选取代的炔烃或叠氮化物；任选取代的二苯并环辛烯(DBCO)；任选取代的反式-环辛烯(TCO)；任选取代的双环[6.1.0]壬炔(BCN)；任选取代的醛；任选取代的酮；任选取代的卤代乙酰胺；任选取代的马来酰亚胺；以及任选取代的或受保护的硫醇，所述硫醇优选用单甲氧基三苯甲基保护；
(iii)衍生自选自以下的药物的部分
·抗肿瘤剂，诸如
οDNA-烷化剂，诸如多卡霉素，
ο拓扑异构酶抑制剂，诸如多柔比星，
οRNA-聚合酶II抑制剂，诸如-鹅膏蕈碱，
οDNA裂解剂，诸如卡利奇霉素，
ο抗有丝分裂剂或微管干扰剂，诸如紫杉烷、澳瑞他汀或美登醇，
ο抗代谢物，诸如吉西他滨的衍生物，
ο纺锤体驱动蛋白抑制剂，诸如非兰尼塞，
ο激酶抑制剂，诸如帕他色替或吉非替尼，
ο烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂，诸如2241014-82-2，
ο基质金属肽酶9抑制剂，诸如CGS27023A的衍生物，
ο磷酸酶抑制剂，诸如微囊藻毒素-LR，
·免疫调节剂，诸如氟替卡松，
·抗感染性疾病剂，诸如利福霉素、克林霉素或瑞他莫林，以及
·上述任何物质的放射性同位素、代谢物、药学上可接受的盐和/或前药；
如果存在多于一个有效载荷(P1)，则各P1独立地选自前述部分(i)至(iii)，有效载荷P1优选地彼此相同。
4.根据项目1-3中任一项所述的化合物，其中，P1是任选包含螯合放射性核素的螯合剂，所述螯合剂优选为衍生自DTPA、DOTA、DFO、NOTA、PCTA、CH-X-DTPA、NODAGA、DOTAGA、maSSS、maGGG或DOTA-甲硫氨酸的部分，且更优选衍生自DOTA、DTPA、CH-X-DTPA、PCTA、NOTA或DFO的部分。
5.根据项目3或4所述的化合物，其中，放射性核素选自124I、131I、86Y、90Y、177Lu、111In、188Re、55Co、64Cu、67Cu、68Ga、89Zr、203Pb、212Pb、212Bi、213Bi、72As、211At、225Ac、223Ra、97Ru、149Tb、152Tb、161Tb、99mTc、226Th、227Th、201Tl、89Sr、44/43Sc、47Sc、153Sm、133Xe和Al18F，优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga、99mTc、203Pb、72As、55Co、97Ru、201Tl、152Tb、133Xe、86Y和Al18F，更优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga和99mTc，最优选选自64Cu、99mTc和111In。
6.根据项目1-3中任一项所述的化合物，P1是衍生自以下的部分：依喜替康、DM4、PNU-159682、鹅膏蕈碱、多卡霉素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、卡利奇霉素、SN-38、紫杉醇、微管溶素、道诺霉素、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯类纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂、吲哚啉苯并二氮杂卓二聚体或其放射性同位素和/或药学上可接受的盐；
如果存在多于一个的有效载荷(P1)，则各P1独立地选自项目3的前述部分(i)至(iii)、或(i)至(iv)，有效载荷优选地是彼此相同的。
7.根据项目2-6中任一项所述的化合物，其中所述接头(L)选自
(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基、优选具有2至6个碳原子的亚烷基，例如亚丙基；
(b1)具有2或3个碳原子、且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基；优选由下式表示的基团
–NH–(CH2CH2O)n1–CH2CH2–
其中n1为0至35的整数，例如1至20的整数；
(c1)包含2至12个氨基酸的肽基团；
接头(L)优选为如上定义的(b1)基团；
如果式(1)的化合物包含多于一个的接头(L)，则各L独立地选自前述(a1)至(c1)基团，各接头(L)优选为(b1)基团。
8.根据项目2-7中任一项所述的化合物，其中，支化基团(K)由*-CH(R1-**)(R2-**)(3a)或下式(3b)表示，
其中，
R1和R2各自独立地选自由-(CH2)m1-**和-(CH2)m1R3-**组成的组；
R3选自由-NH-**、-(C＝X)R4-**和-NH(C＝X)R4-**组成的组，并且优选为-NH-**或-NH(C＝X)R4-**；
R4为-(CH2)m2-**、-(CH2)m2S-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH-**、或式(3c)芳基：
R5和R6各自独立地选自–(CH2)m2-**、-(CH2)m2S**-、-CH(CH2S-**)2、-(CH2)m2NH-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH(C＝X)R8-**和-CH2(CH2)m2H-**；
R7为-CH2S-**、(CH2)m2-**或-(CH2)m2R9-**；
R8为-(CH2)m3S-**；
R9为-NH(C＝X)m3S-**；
各X独立地选自O和S，并且优选为O；
*表示与反应性部分(Y)共价附接；
**表示在式(2b)中与接头(L)共价附接，或在式(2c)中与有效载荷(P1)共价附接；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2和3，条件是，如果K为式(3a)，则m1不为0；各m1、m2和m3优选为1。
9.根据项目2-8中任一项所述的化合物，其中，支化基团(K)由下式(3d)-(3l)中的一者表示：
/>
其中
m1为0、1、2或3，优选为1；
m2为1、2、3或4，优选为1；
m3为0、1、2或3，优选为1；
*表示与反应性部分(Y)共价附接；以及
**表示与接头(L)或有效载荷(P1)共价附接；
支化基团(K)优选由式(3d)表示。
10.根据项目1-9中任一项所述的化合物，其中，反应性部分(Y)由下式(4a)和(4b)中的一者表示：
＊’-F1-RC-F2-＊＊＊ (4a)
＊’-(F1-RC-F2)-M-＊＊＊ (4b)
其中，
RC为反应中心，优选亲电反应中心，并且更优选选自C＝O和C＝S的基团；
F1为单个共价键、原子或原子基团；优选为CH2或NH原子基团或选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为CH2原子基团或选自O和S的原子；
F2表示原子或原子基团；优选为选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自O和S的原子；
M为能够调节F2的电子密度和稳定性的基团，优选为能够吸电子的基团；
*’表示与基团(P)共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接；
反应性部分(Y)优选由式(4b)表示。
11.根据项目10所述的化合物，其中，能够调节F2的电子密度和稳定性的基团(M)由下式(4c)表示：
＊＊＊‘--M’-B-E--＊＊＊ (4c)
其中，
M’为衍生自琥珀酰亚胺，或分别具有6、10或14元环和1、2或3个稠环的芳基，或具有5至20元环、1、2或3个稠环和独立选自N、O和S的1至4个杂原子的杂芳基的部分，各基团任选地被一个或多个取代基取代；优选为衍生自苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯并三唑基的二价基团，各基团任选被一个或多个取代基取代，并且各取代基优选选自-F、-Br、-Cl、-I、-NO2、-CN、-C1-6-烷基、-C1-6-烷氧基、诸如，-C(O)NH2的-C1-6-酰胺基、以及它们的组合，诸如-CCl3、-CF3或-CH2NO2；
B选自以下以及它们的任何组合：
·单个共价键、O、S或原子基团NR’，其中R’表示氢原子、-OH、烷基、环烷基、C2-6-亚烯基或C2-6-亚炔基；
·由通式(4d)表示的基团：
◆–X1–(CH2CH2O)n2–CH2CH2–◆◆ (4d)
其中
X1为-C(＝O)NH-、-C(＝O)-、-NH-或-S-；优选为-C(＝O)NH-；
n2为1至24、优选为1至10、更优选为1至3的整数；
◆表示与M’共价附接，并且
◆◆表示与E共价附接；
·在主链中具有6至25个氨基酸(例如，在主链中具有9个氨基酸)的肽基团，各氨基酸优选选自Pro、Gly、Ala、Asn、Asp、Thr、Glu、Gln和Ser；更优选选自Pro、Gly和Ser；
其中，B优选为单个共价键、或具有通式(4d)的基团，更优选为单个共价键；
E为C＝O、C＝S或C(＝NR”)，其中R”表示氢原子、OH、烷基、环烷基、S＝O或S(＝O)2；优选E为C＝O；
***’表示与F2共价附接，并且
***表示与肽(V)共价附接。
12.根据项目10或11所述的化合物，其中，所述部分(F1-RC-F2)由下式(4a’)至(4l’)中的一者表示，和/或所述基团(M)由下式(5a)至(5i’)中的一者表示：
/>
/>
/>
/>
其中，
*’表示与基团(P)共价附接，
***表示与肽(V)共价附接，或如果M存在的话，与基团(M)共价附接，并且
***’表示与反应性部分(Y)的F2共价附接。
13.根据项目1至12中任一项所述的化合物，其中，反应性部分(Y)由下式(6a)至(6l’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，
*’表示与基团(P)共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接。
14.根据项目1-13中任一项所述的化合物，其中，肽(V)包含11至17个氨基酸的序列，例如13至17个氨基酸，肽优选为环状的，并且更优选由下式(7a)表示：
其中，
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、高酪氨酸(hTyr)和间酪氨酸(mTyr)的氨基酸；优选选自Lys、高赖氨酸(hLys)、鸟氨酸(Orn)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、Ala、Tyr、hTyr
和mTyr的氨基酸；更优选为Ala；
·Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx各自独立地表示氨基酸；
·Axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(8a)表示的肽部分：
---Axx1–Axx2–Axx3--- (8a)
其中，在式(8a)中，
Axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如Arg；
Axx2表示氨基酸，诸如Gly或Cys、优选为Gly；以及
Axx3表示氨基酸，诸如Asp或Asn；
·Hxx表示氨基酸或由下式(8b)表示的肽部分：
---Hxx1–Hxx2–Hxx3--- (8b)
其中，在式(8b)中，
Hxx1表示氨基酸，诸如Thr；
Hxx2表示单个共价键或氨基酸，诸如Tyr或Cys；以及
Hxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如His；并且Axx2的侧链可以共价附接至Hxx2的侧链以形成环；
其中，优选Hxx2和Hxx3两者表示单个共价键；
·如果Axx2为Cys且Hxx2为Cys，则优选将Axx2和Hxx2的侧链链接在一起以形成式–(S–X3–S)–的基团，其中X3表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，例如二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基；优选X3表示单个共价键；
·Lxx1和Lxx2各自独立地表示单个共价键或三官能氨基酸，例如二氨基羧酸；条件是Lxx1和Lxx2中的至少一个是单个共价键；
·Z1表示
o如果Lxx1为单个共价键，则Z1表示共价附接至Axx的N-末端的基团，该基团选自氢原子、含羰基的基团(诸如，乙酰基)、含C2-3聚环氧烷的基团和衍生自含有偶联基团(诸如，生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇)的化合物的基团，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
o如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1附接至Lxx1的侧链，则Z1表示共价附接至Lxx1的N-末端的基团，该基团选自氢原子、含羰基的基团(诸如乙酰基)和含C2-3聚环氧烷的基团；并且
o如果Lxx1为三官能氨基酸、且Y1共价附接至Lxx1的N-末端，Z1表示共价附接至Lxx1的侧链的氢原子；
·Z2表示
o如果Lxx2是单个共价键，则Z2表示与Hxx的C-末端共价附接的基团，该基团选自-N(H)(R)，其中R表示氢原子、烷基或环烷基、含C2-3聚环氧烷的基团、和衍生自含有偶联基团(诸如，生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺或硫醇)的化合物的基团，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
o如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的侧链，则Z2表示共价附接Lxx2的C-末端的基团，该基团优选为含C2-3聚环氧烷的基团、由N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；并
且
o如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的C-末端，则Z2表示共价附接至Lxx2的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团；
·Y1表示仅当Lxx1为三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z1附接至Lxx1的N-末端，则Y1共价附接至Lxx1的侧链，或者如果Z1附接至Lxx1的侧链，则Y1共价附接至Lxx1的N-末端；
其中，Y1衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·Y2表示仅当Lxx2是三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z2附接至Lxx2的C-末端，则Y2共价附接至Lxx2的侧链，或者如果Z2附接至Lxx2的侧链，则Y2共价附接至Lxx2的C-末端；
其中，Y2衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·S1是由下式(8c)表示的间隔基：
α–X4–(CH2CH2O)n2–CH2CH2–X5–β (8c)
其中
X4为NH、O或S；优选为NH；
如果X5共价附接至肽(V)，则X5为NH或C＝O，优选为C＝O；
n2为1至46、优选1至24、最优选1至12的整数；并且
如果X5共价附接至肽(V)，则α表示与Y1或Y2共价附接，或者如果X5共价附接至Y1或Y2，则α表示与肽(V)共价附接；并且
如果X4共价附接至Y1或Y2，则β表示与肽(V)共价附接，或者如果X4共价附接至肽(V)，则β表示与Y1或Y2共价附接；
·X2表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，诸如二价马来酰亚胺基团、二价丙酮基团或二价亚芳基；优选为单个共价键；
·其中Axx、Bxx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx和Hxx中的至少一种，优选Bxx、Dxx、Exx、Fxx和Gxx中的一种或多种，更优选Bxx、Exx和Gxx中的一种或多种，最优选Bxx和/或Exx表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸，更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，这些氨基酸通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)；条件是肽(V)不包含具有含氨基侧链的三个以上氨基酸；并且
如果反应性部分(Y)通过Tyr、hTyr或mTyr附接至肽(V)，则反应性部分(Y)优选为项目10中定义的式(4a)的部分。
15.根据项目14所述的化合物，其中，Axx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx、Hxx、Lxx1和Lxx2中的至少一者如下定义：
Axx表示选自Ala、2,3-二氨基-丙酸(Dap)、Asp、Glu、2-氨基辛二酸、α-氨基丁酸、Asn和Gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸和己二酸的二羧酸，或者式(8a)的肽部分；Axx优选为Ala、Asp或Asn，更优选为Asp；其中Axx1是单个共价键，Axx2是Cys，且Axx3是Asp；
Cxx表示选自Trp、Phe、Tyr、苯基甘氨酸(Phg)、3-苯并噻吩-2-基-L-丙氨酸、3-萘-2-基-L-丙氨酸、3-联苯-4-基-L-丙氨酸和3-萘-1-基-L-丙氨酸的氨基酸；优选为Trp；
Dxx表示选自His、Ala、3-吡啶-2-基-L-丙氨酸、mTyr和Phe的氨基酸；优选为His、Ala或mTyr；更优选为His；
Exx表示选自Ala、2-氨基-丁酸(Abu)、Gly、Leu、Ile、Val、Met、环己基丙氨酸(Cha)、Phe、Thr、Cys、Tyr和正亮氨酸(Nle)的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；
Fxx表示选自Ala、Gly、Asn、Ser、Abu和Asp的氨基酸；优选为Ala或Gly；更优选为Gly；
Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；优选为Asp或Glu；更优选为Glu；
Hxx表示选自Thr、Ser、Ala、Asn、Val、Abu、Ile、Met、Leu、Pro、Gln和Cys的氨基酸或者式(8b)的肽部分；Hxx优选为Thr或Ser；更优选为Thr；其中Hxx1为Thr，Hxx2为Cys，Hxx3为单个共价键；
Lxx1和Lxx2各自独立地表示选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸，优选为选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸；并且
如果Dxx或Exx表示通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，则Gxx优选为Glu、Gln、His、Arg或Asn，且更优选为Gln。
16.根据项目1-15中任一项所述的化合物，其中，肽(V)由下式(9a)表示：
其中，
·Z1、Z2、Bxx、Exx、Gxx和X2如项目16所定义；并且
·Bxx、Exx和Gxx中的至少一者(优选Bxx和/或Exx)表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr；优选具有含氨基侧链的氨基酸；且更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸；所述氨基酸通过其侧链共价结合至反应性部分(Y)；并且
·如果Exx表示通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸；并且
更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，则Gxx优选是Glu、Gln、His、Arg或Asn，更优选是Gln；
并且优选地，Bxx、Exx和Gxx中的一个或两个定义如下：
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；优选为Lys、hLys、Orn、Dap、Dab、Ala、Tyr、hTyr或mTyr；
更优选为Ala；
·Exx表示选自Ala、Abu、Gly、Leu、Ile、Val、Met、Cha、Phe、Thr、Cys、Tyr和Nle的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；并且
·Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；
优选为Asp或Glu；更优选为Glu。
17.根据项目1-16中任一项所述的化合物，其中，肽(V)由下式(10a)-(10v)、(10b’)和(10g’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，Z1、Z2和X2如项目14中所定义；并且
在式(10a)至(10v)、(10b’)和(10g’)中，肽(V)通过包含在V中的Tyr、Lys、hLys、Orn、Dap或Dab的侧链共价附接至反应性部分(Y)；
肽(V)优选由式(10a)、(10b)、(10b’)(10c)、(10e)、(10f)、(10g)、(10g’)(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10m)、(10n)、(10p)、(10q)、(10s)、(10t)和(10u)中的任一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任一者表示，且甚至更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任一者表示。
18.根据项目1至17中任一项所述的化合物，该化合物选自由以下组成的组
/>
/>
19.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，试剂盒包含项目1至18中任一项所述的化合物和缓冲液；其中，缓冲液的pH优选为5.5至11、更优选为7.0至9.5。
20.根据项目19所述的用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，其中，化合物被固定在固相基质上，优选其中化合物经由生物素-链霉亲和素相互作用、经由炔烃与叠氮化物之间的点击化学反应获得的共价键、经由硫醇与乙酰胺之间的反应获得的共价键、经由TCO的衍生物与TZ的衍生物之间的反应获得的共价键、或经由硫醇与马来酰亚胺之间的反应获得的共价键而固定在固体支承物上。
21.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的方法，抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，该方法包括使抗体或其片段与根据项目1-18中任一项所述的化合物反应。
22.根据项目21所述的方法，其中
·抗体是单克隆抗体，优选为选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗、阿杜那单抗、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿特珠单抗、阿奈妥单抗、阿维鲁单抗、巴匹组单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝迈奇单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、维布妥昔单抗、布罗达单抗、卡妥索单抗、西米普利单抗、西妥昔单抗、辛帕奈单抗、克利妥珠单抗、克雷内治单抗、轮环藤宁四乙酸、达利珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、依帕伐单抗、恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗、依帕珠单抗、依帕珠单抗-SN38、埃达组单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、吉妥昔单抗、戈奈单抗、替伊莫单抗、英比利珠单抗、英夫利昔单抗、英妥珠单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、艾萨妥昔单抗、伊西贝单抗、J591 PSMA-抗体、拉贝珠单抗、莱卡单抗、莫格利珠单抗、奈昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、维博妥珠单抗、普尼珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、赛妥珠单抗、戈沙妥组单抗、西瑞奈单抗、司妥昔单抗、茄尼醇单抗、他珠单抗、替妥木单抗、替拉奈单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、德喜曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、TS23、乌司奴单抗、维多珠单抗、伏妥莫单抗、泽格特奈单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、及其片段和衍生物；更优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗；或者
·将抗体片段掺入至Fc-融合蛋白中，该Fc-融合蛋白优选选自贝拉西普、阿柏西普、ziv-阿柏西普、度拉糖肽、利钠西普、罗米司亭、阿巴西普和阿法西普。
23.一种修饰抗体和修饰的抗体片段，该经修饰抗体和修饰抗体片段是通过使抗体或抗体片段与根据项目1至18中任一项所述的化合物反应而获得的，该抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，其中抗体或抗体片段优选与项目22中的相同。
24.根据项目23所述的修饰抗体或修饰抗体片段，该修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测、成像或治疗疾病和/或监测或成像其治疗的方法，该方法包括向受试者施用修饰抗体或修饰抗体片段。
25.一种用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法，该方法包括向有需要的受试者施用根据项目23所述的修饰抗体或修饰抗体片段。
26.根据项目24所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目25所述的方法，其中，疾病是神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
27.根据项目24或26所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目25或26所述的方法，其中，疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩性侧索硬化症、脑动脉硬化症、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、包括不稳定型心绞痛的心绞痛、主动脉瘤、动脉粥样硬化症、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植术、包括心房颤动终止收缩性心力衰竭的心脏衰竭、高胆固醇血症、局部缺血、心肌梗塞、血栓栓塞、血栓症、强直性脊柱炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、肉芽肿性多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化症、斑块状银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎、以及血管炎。
28.根据项目24或26所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据项目25或26所述的方法，其中，疾病是癌症，并且该疾病涉及选自以下的细胞：淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞的细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞、以及以不受调节和加快速度生长和分裂而导致癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞和头颈癌细胞。
附图说明
图1-使用本发明化合物的抗体偶联方法的示意图。能够与抗体的Fc区域相互作用的载体结合至Fc区域，从而使反应性部分紧邻暴露在抗体表面的氨基酸(例如，赖氨酸残基)的侧链。氨基酸(例如，赖氨酸残基)的侧链与反应性部分之间的反应引起有效载荷(任选地通过接头)共价附接至抗体，并引起载体的伴随释放。
图2-使用本发明化合物的抗体耦联方法的示意图，该化合物通过点击化学固定在固体支承物。能够与抗体的Fc区域相互作用的载体结合至Fc区域，从而使反应性部分紧邻暴露在抗体表面的氨基酸例如，赖氨酸残基的侧链。氨基酸(例如，赖氨酸残基)的侧链与反应性部分之间的反应引起有效载荷(任选地通过接头)共价附接至抗体，并引起载体-固体支承构建体的伴随释放。
图3-使用本发明化合物的抗体耦联方法的示意图，该化合物包含支化基团和两个彼此不同的有效载荷部分1和2。能够与抗体的Fc区域相互作用的载体结合至Fc区域，从而使反应性部分紧邻暴露在抗体表面的氨基酸(例如，赖氨酸残基)的侧链。氨基酸(例如，赖氨酸残基)的侧链与反应性部分之间的反应引起支化基团和有效载荷(任选地通过接头)共价附接至抗体，并引起载体的伴随释放。
图4-使用本发明化合物的抗体耦联方法的示意图，该化合物包含支化基团和两个有效载荷部分(彼此相同)。能够与抗体的Fc区域相互作用的载体结合至Fc区域，从而使反应性部分紧邻暴露在抗体表面的氨基酸(例如，赖氨酸残基)的侧链。氨基酸(例如，赖氨酸残基)的的侧链与反应性部分之间的反应引起支化基团和有效载荷(任选地通过接头)共价附接至抗体，并引起载体的伴随释放。
具体实施方式
1.定义
如本文中使用的术语“有效载荷”表征当该物质与抗体或抗体片段附接(偶联)时能够赋予新功能的物质(例如，天然存在的或合成的物质)。在一些实施方案中，如本文使用的术语“有效载荷”应理解为能够和/或促进检测和/或可视化其所附接的互补部分(例如，抗体)的标记部分(例如，发色团、荧光团、放射性标记的部分)。例如，标记部分可以通过本领域已知的功能化(生理)成像技术来检测和/或可视化，该功能化(生理)成像技术诸如计算机断层扫描(computed tomography，CT)、正电子发射断层扫描(positron emissiontomography，PET)。在一些实施方案中，如本文使用的术语“有效载荷”应理解为可以抑制或防止细胞的功能和/或杀死细胞的药理活性物质。在一些实施方案中，术语“有效载荷”应被理解为与本领域中常用的其他术语同义，例如癌症治疗领域中使用的“细胞毒素剂”、“毒素”或“药物”。替代地，有效载荷可以是偶联基团。有效载荷可以包括可衍生自官能团的基团，该官能团允许有效载荷共价附接至化合物的其余部分(例如，与式(1)中的反应性部分Y附接)，该化合物的其余部分例如为羧酸、伯胺、仲胺、羟基、硫醇基等。在一些实施方案中，如本文使用的术语“有效载荷”应理解为能够增强(改善)其所附接的化合物的水溶性的(增溶)部分。能够提高水溶性的部分的非限制性实施例包括：(a)多元醇聚合物，诸如甘油、赤藓糖醇、季戊四醇等的聚合物；(b)多糖，诸如蔗糖、葡萄糖、果糖、山梨醇等的聚合物；(c)肌氨酸聚合物(聚肌氨酸)，即通式–(N(CH3)–CH2–(C＝O))n–的聚合物，其中n表示肌氨酸重复单元的数量；(d)包含一个或多个增溶基团的部分(如下文进一步描述的)，以及它们的任何组合或衍生物。
如本文中使用的术语“增溶基团”或“增溶部分”是指亲水性基团或部分，其能够增强(改善)其所附接的部分或化合物的水溶性。增溶基团可以是例如：聚环氧烷基团，诸如聚环氧乙烷(PEO)或聚环氧丙烷(PPO)基团；或者，包含一个或多个离子基团的部分，即在生理pH(7.4)下带电荷(阴离子或阳离子)的官能团，诸如衍生自氨基酸的部分，例如衍生自Lys、Glu、Asp、His、Arg、二氨基丙酸(Dap)、二氨基丁酸(Dab)、2-氨基己二酸(Aad)、Orn的部分。离子基团的实施例包括铵基、胍基、硫酸基、磷酸基、膦酸基和磺酸基。在一些实施方案中，术语“增溶部分”是指包含一个或多个增溶基团的部分。在进一步的实施方案中，增溶部分可以由一个或多个增溶基团(例如氨基酸、PEO基团)组成。
如本文中使用的术语“聚环氧烷”(或“聚亚烷基二醇”、“聚氧化亚烷基”)是指具有一般结构HO-(X-O)n-H的物质，其中X表示具有2或3个碳原子的亚烷基，并且n表示重复单元的数量，例如2至2000、4至600、10至200或15至80个重复单元，例如20或40个重复单元，例如16、20、24或32个PEO重复单元。因此，术语“聚环氧烷基团”应理解为式*–O–(X-O)n–**的二价基团，其中X和n如上定义，并且*和**表示与相邻部分的共价附接。在一些实施方案中，术语“聚环氧烷”可以指聚环氧乙烷(或聚乙二醇，C2-聚环氧烷)，或聚环氧丙烷(或聚丙二醇，C3-聚环氧烷)。也可以提供聚环氧烷基团，其中两个或更多个不同的亚烷基(如上文所定义)以随机或模块化(block-wise)方式排列。
如本文中使用的术语“肽”是指包含通过肽键彼此连接的至少三个氨基酸的连续序列的化合物。在这方面，术语“肽键”是指涵盖(骨架)酰胺键以及修饰键，如果在肽序列中引入非天然氨基酸，则可以获得修饰键。在这种情况下，修饰键取代了(骨架)酰胺键，该酰胺键通过两个氨基酸残基的氨基和羧基反应而形成在连续肽序列中。例如，修饰键可以是酯、硫酯、尿素、硫脲或三唑键。优选地，形成连续肽序列的氨基酸通过骨架酰胺键彼此连接。肽可以是直链的或支链的。在一个方面，肽可以是例如由经修饰以形成环(例如，“头至尾”环化)的氨基酸的直链形成的环状，或者由具有彼此共价附接的侧链的氨基酸直链(例如，通过二硫键形成或任何其他修饰)形成的环状。本文，氨基酸包括天然存在的氨基酸以及非天然(合成)氨基酸，如下面所描述的。
本文所用的术语“氨基酸”是指含有或衍生自含有至少一个氨基和至少一个酸性基团(优选羧基)的化合物的化合物。氨基与酸性基团之间的距离没有特别的限制。α-氨基酸、β-氨基酸和γ-氨基酸是合适的，但α-氨基酸、且尤其是α-氨基羧酸是特别优选的。术语“氨基酸”既涵盖了天然存在的氨基酸(诸如，天然存在的蛋白氨基酸)，也包括在自然界中没有发现的合成氨基酸。在下文中，可以通过3个字母的氨基酸代码(Arg、Phe、Ala、Cys、Gly、Gln等)或通过1个字母的氨基酸代码(R、F、a、C、G、Q等)来引用氨基酸。在下文中，氨基酸序列从N-末端书写到C-末端(从左到右)。
如本文中使用的“氨基酸的侧链”可以指附接至氨基酸α-碳上的部分。例如，Ala的侧链是甲基，Phe的侧链是苯甲基，Cys的侧链是硫甲基，Tyr的侧链是4-羟基苯甲基等。天然存在的侧链和非天然存在的侧链两者都包括在这个定义中。
如本文中使用的术语“三官能”是指具有三个官能团的化合物或部分，这些官能团可以形成或已经形成与相邻部分的三个共价键。因此，术语“三官能氨基酸”是指含有或衍生自至少含有氨基、酸基(例如，羧基)和另一官能团(诸如，氨基或羧基)的化合物的化合物。
如本文中使用的术语“C-末端”是指氨基酸(肽)链的C-末端。与“C-末端”结合意味着在氨基酸残基主链(骨架)中的酸基与结合配偶体之间形成共价键。例如，基团“X”与氨基酸残基“Axx”的C-末端结合产生酯或酰胺型结构元素*–C(O)–X，其中羰基衍生自Axx的酸性基团，并且(*)表示与主链附接。
如本文中使用的术语“N-末端”是指氨基酸(肽)链的N-末端。与“N-末端”结合意味着在氨基酸残基主链(骨架)中的氨基与结合配偶体(该结合配偶体取代一个氢原子)之间形成共价键。例如，基团“X”与氨基酸残基“Axx”的N-末端结合产生结构元素X–NH–*，其中氨基衍生自Axx，并且(*)表示与主链附接。
如本文使用的表达“能够与抗体或其片段的可结晶片段(Fc)区域相互作用”表明载体可以结合至下文定义的抗体或抗体片段的Fc区域。所述相互作用/结合可以产生靶向作用，即，使抗体或抗体片段的氨基酸(例如赖氨酸残基)侧链附近的反应性部分的浓度局部增加。载体、与抗体或抗体片段的Fc区域的相互作用(结合)可以通过使用本领域已知的并将在下面进一步描述的荧光偏振(FP)技术来评估。在一些方面，“能够与抗体或其片段的Fc区域相互作用的化合物”的表述是指保留至少20％、优选至少50％、更优选至少80％的配体“Fc-III”对IgG的Fc区域的结合亲和力的化合物，该结合亲和力如由DeLano等人(Science 2000,287,1279-1283)描述、且通过荧光偏振测量。该化合物能够与抗体或其片段的Fc区域相互作用，因此，与Fc-III相比，该化合物可以具有对Fc区域优异的结合亲和力。
如本文中使用的术语“抗体”(也同义地称为“免疫球蛋白”(immunoglobulin，Ig))涵盖单克隆抗体、多克隆抗体、二聚体、多聚体、多特异性抗体(例如，双特异性抗体)、贴面抗体(veneered antibodies)和小免疫蛋白，前提是它包含至少一个可结晶片段(Fc)区域。抗体是由免疫系统产生的、能够识别和结合至特定抗原的蛋白质。靶抗原通常具有由多个抗体上的互补决定区域识别的许多结合位点，也称为表位。特异性结合不同表位的各抗体都有不同的结构。因此，一种抗原可能具有超过一种对应的抗体。抗体包括全长免疫球蛋白分子或全长免疫球蛋白分子的免疫活性部分，即包含抗原结合位点的分子，该抗原结合位点免疫特异性结合靶的目标抗原或目标抗原的部分。抗体可以是IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。优选地，抗体是IgG蛋白，更优选IgG1、IgG2或IgG4蛋白。最优选地，抗体是IgG1蛋白。抗体可以是人类的或衍生自其他物种的。优选地，抗体是人类抗体。
如本文中使用的术语“单克隆抗体”表征了相同的抗体，因为它们是由一种类型的免疫细胞产生的，并且都是单个母体细胞的克隆。
如本文中使用的术语“抗体片段”是指包含衍生自抗体的至少一个多肽链的分子，该抗体是非全长的，并且具有能够与配体相互作用的至少一个可结晶片段区域。
如本文中使用的术语“商业配制的抗体”是指包含治疗性抗体和一种或多种赋形剂的市售制剂。优选地，商业配制的抗体是在欧盟市售的制剂。商业配制的抗体的实施例包括 Humax-CD/>及其生物仿制药。关于商业配制的抗体的信息可以在例如Allgemeine and Spezielle Pharmakologie und Toxicologie，Thomas Karow andRuth Lang-Roth，Karow，第27版(2018)中找到。
优选地，商业配制的抗体是由欧洲药品管理局(European Medicines Agency，EMA)批准在欧洲联盟市售的、授权号为EU/1/00/145/001和EU/1/00/145/002(可以购自罗氏)的(含曲妥珠单抗的制剂)，或由EMA批准在欧洲联盟市售的、授权号为EU/1/98/067/001、EU/1/98/067/002、EU/1/98/067/003和EU/1/98/067/004的/>(含利妥昔单抗的制剂)。
本文所用的术语“Fc-融合蛋白”是指至少包括含Fc的抗体片段—即包含至少一个Fc区域的免疫球蛋白衍生部分—和衍生自第二非免疫球蛋白的部分的蛋白质。含Fc的抗体片段形成Fc-融合蛋白的一部分，由此掺入至Fc-融合蛋白中。含Fc的抗体片段可以衍生自上文所描述的抗体，特别是衍生自IgG，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4。优选地，含Fc的部分衍生自IgG1蛋白，更优选地衍生自人IgG1蛋白。非Ig蛋白可以是治疗性蛋白，例如衍生自以下的治疗性蛋白：促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)；促血小板生成素(thrombopoietin，THPO)，诸如THPO结合肽；生长激素；干扰素(IFN)，诸如IFNα、IFNβ或IFNγ；血小板衍生生长因子(platelet-derived growth factor，PDGF)；白细胞介素(IL)，诸如IL1α或IL1β；转化生长因子(transforming growth factor，TGF)，诸如TGFα或TGFβ；或者，肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)，诸如TNFα或TNFβ；或者衍生自受体的治疗性蛋白，特别是衍生自受体胞外结构域的配体结合片段的治疗性蛋白，例如衍生自分化簇2(cluster of differentiation 2，CD2)、CD4、CD8、CD11、CD14、CD18、CD20、CD22、CD23、CD25、CD33、CD40、CD44、CD52、CD58(LFA3)、CD80、CD86、CD147、CD164、IL2受体、IL4受体、IL6受体、IL12受体、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)受体、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)受体、上皮细胞粘附分子(epithelialcell adhesion molecule，EpCAM)或细胞毒性T淋巴细胞相关蛋白4(cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4，CTLA4)。Fc融合蛋白的实施例包括贝拉西普阿柏西普/>利纳西普/>罗米司亭/>阿巴他塞/>阿法赛特和依那西普/>
如本文中使用的术语“反应性部分”是指可以容易地与另一分子(例如，亲核试剂)上的结合配偶体反应的部分。这与需要添加催化剂或非常不切实际的反应条件才能反应的部分(即“非反应性”或“惰性”部分)形成对比。特别地，“反应性部分”的表述是指反应性偶联物的部分，该反应性偶联物的部分与抗体(优选为曲妥珠单抗(可以购自罗氏(Roche)的))的Lys的侧链在50mM的、pH为9.0的NaHCO3中、偶联物与曲妥珠单抗的摩尔比为2比1、以1000rpm在室温下搅拌2小时来反应，使得至少25％的偶联物反应、优选至少50％的偶联物反应、更优选至少70％的偶联物反应(例如，有效载荷附接至曲妥珠单抗)。根据下面第9.3.4节中描述的方法，可以通过高分辨率质谱法(high-resolution massspectrometry，HRMS)确定有效载荷与曲妥珠单抗的附接。
如本文中使用的术语“发色团”是指有机或金属-有机化合物，该有机或金属-有机化合物能够吸收350nm至1100nm范围或其子范围内的电磁辐射，例如350-500nm或500-850nm，或350-850nm。
如本文中使用的术语“磷光团”是指当通过暴露于特定波长的光而激发时、在延长的时间段(例如，长达数小时)内在不同波长和较低强度下发射光的化合物。
如本文中使用的术语“荧光团”是指当通过暴露于特定波长的光而激发时、在不同(更高)波长下发射光的化合物。荧光团通常根据其发射分布或“颜色”来描述。例如，诸如Cy3或FITC的绿色荧光团通常发射515-540nm范围内的波长，而诸如Cy5或四甲基罗丹明的红色荧光团通常发射590-690nm范围内的波长。如本文中使用的术语“荧光团”应被理解为特别涵盖有机荧光染料，例如荧光素、罗丹明、AMCA、Alexa Fluor染料(例如，Alexa Fluor647)和生物荧光团。
如本文中使用的术语“标记部分”(或同义词“标记”或“标记基团”)是指包含以下基团的部分：该基团能够和/或促进通过视觉或仪器手段检测和/或可视化其所附接的互补部分(例如，抗体)。标记部分的实施例包括放射性标记(例如，放射性核素)、用于磁共振成像(magnetic resonance imaging，MRI)的造影剂、以及吸收或发射光的化学物质(例如，发色团和荧光团)。
如本文中使用的术语“螯合剂”是指含有两个或多个电子给体原子的分子，该电子给体原子可以与单个中心金属离子(例如，放射性核素)形成配位键。通常，螯合剂通过氧或氮给体原子或两者来配位金属离子。在形成第一配位键后，结合的各连续的给体原子产生含有金属离子的环。螯合剂可以是双齿、三齿、四齿等，这取决于螯合剂是否含有能够与金属离子结合的2、3、4或更多个给体原子。然而，螯合机制尚不是完全清楚的，并且取决于螯合剂和/或放射性核素。例如，认为DOTA可以通过羧酸盐和氨基(给体基团)来配位放射性核素，从而形成具有高稳定性的络合物(Dai等人的Nature Com.2018,9,857)。术语“螯合剂”应理解为包括螯合剂及其盐。例如，具有羧酸基团的螯合剂(例如DOTA、TRITA、HETA、HEXA、EDTA、DTPA等)可以被衍化以将一个或多个羧基转化为用于附接至化合物(即，附接至反应性部分或接头)的酰胺基团，替代地，例如，所述化合物可以被衍化以能够通过螯合环中的CH2基团中的一者而附接至化合物。
如本文中使用的术语“放射性核素”是指具有不稳定原子核的原子，该不稳定原子核为一种特征在于可用于赋予原子核内新产生的辐射粒子或原子电子过量能量的原子核。放射性核素是天然存在的，也可以是人工产生的。在一些实施方案中，在本发明中使用的放射性核素是医学上有用的放射性核素，包括例如带正电的离子的放射性金属，例如Y、In、Cu、Lu、Tc、Re、Co和Fe。放射性核素可以选自124I、131I、86Y、90Y、177Lu、111In、188Re、55Co、64Cu、67Cu、68Ga、89Zr、203Pb、212Pb、212Bi、213Bi、72As、211At、225Ac、223Ra、97Ru、149Tb、152Tb、161Tb、99mTc、226Th、227Th、201Tl、89Sr、44/43Sc、47Sc、153Sm、133Xe和Al18F。优选地，放射性核素选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga、99mTc、203Pb、72As、55Co、97Ru、201Tl、152Tb、133Xe、86Y和Al18F，更优选地选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga和99mTc，最优选地选自64Cu、99mTc和111In，特别是111In。
如本文中使用的表达或术语“衍生自药物的部分”是指对应于天然药物的部分，该部分与天然药物的区别仅在于与相邻部分结合(例如与本发明化合物中包含的反应性部分、接头或支化基团结合)所需的结构性修饰。这可能包括由现有官能团(在天然药物中可获得的)形成的共价键或为此目的新引入的共价键和相邻官能团。因此，该药物可以以其未修饰形式使用(除了氢原子被共价键取代)，或者药物可以被化学修饰，以掺入一个允许与本发明化合物中包含的反应性部分、接头或支化基团共价附接的官能团。本文中使用的表达或术语“衍生自药物的部分”意味着涵盖这两种含义。
以类似的方式，术语“衍生物”用于表征与相邻部分结合的部分，这些部分与它们所衍生的分子的区别仅在于用于与相邻部分结合的结构性元件。这可能包括由现有官能团形成的共价键或为此目的新引入的共价键和相邻官能团。
如术语“天然药物”表征一种已经通过体外和/或体内试验证实了治疗功效的化合物。在优选的实施方案中，天然药物是已经通过临床试验证实了治疗功效的化合物。最优选地，天然药物是已经可商购的药物。待证实的治疗功效的类型和待应用的合适试验当然取决于待治疗的医学适应症(medical indication)的类型。
当提及特定类别的药物分子时，例如抗肿瘤剂、拓扑异构酶抑制剂、RNA-聚合酶II抑制剂、DNA裂解剂、抗有丝分裂剂或微管干扰剂、抗代谢物、激酶抑制剂、免疫调节剂或抗感染性疾病剂，这些术语旨在具有医学领域中普遍接受的含义，例如，由在Mosby’sMedical Dictionary,Mosby,Elsevier 10th ed.(2016)，或者Oxford Textbook ofOncology,David J.Kerr,OUP Oxford 3rd ed.(2016)中体现的。
如本文中使用的术语“疏水有效载荷”(或“疏水性药物”)是指具有计算的CLogP>0或与单甲基澳瑞他汀E(monomethyl auristatin，MMAE)相当或大于单甲基澳瑞他汀E(MMAE)的疏水性的药物，其中“相当”是指药物的疏水性在MMAE的疏水性的20％以内。疏水性可以使用SlogP来测量，SlogP被定义为辛醇/水分配系数(包括隐含的氢)的对数。它可以使用来自化学计算组(Chemical Computing group)的MOETM程序进行计算(参见Wildman等人的J Chem Inf Comput Sci.1999,39(5),868-873)。
本文中使用的术语“药学上可接受的盐”是指公开的化合物(包括反应性偶联物)的衍生物，其中母体化合物通过制备其酸盐或碱盐进行修饰。药学上可接受的盐包括例如由无毒无机酸或碱、或无毒有机酸或碱形成的母体化合物的无毒盐或季铵盐。合适的盐的列表可以在以下中发现：Remington's Pharmaceutical Sciences,17th ed.,MackPublishing Company,Easton,PA,1985,1418页；S.M.Berge,L.M.Bighley和D.C.Monkhouse,"Pharmaceutical Salts,"J.Pharm.Sci.66(1),1–19(1977)；P.H.Stahl和C.G.Wermuth,editors,Handbook of Pharmaceutical Salts:Properties,Selection andUse,Weinheim/Zürich,Wiley-VCH,2008；以及A.K.Bansal等人,PharmaceuticalTechnology,3(32),2008。药学的盐可以通过常规化学方法由含碱性或酸性部分的母体化合物来合成。对于反应性偶联物，这可以在将药物部分掺入到本发明的化合物之前或之后进行。除非上下文另有规定，所有提及本发明的化合物(偶联物、修饰抗体等)也应理解为提及相应化合物的药学上可接受的盐。
如本文所用的“能够调节X的电子密度和稳定性的基团”是指能够调节(增加或减少)相邻基团(X)的性质(电子密度/稳定性)的基团，例如式(4a)和(4b)中的部分(F2)。调节基团(M)可以例如通过诱导效应和/或中介效应(参见International Union of Pure andApplied Chemistry,Compendium of Chemical Technology,Gold Book 2012,477-480)向相邻基团吸收或供给电子。优选地，诱导和中介效应可以导致电子密度分布向调节基团的偏移，从而调节相邻基团(如，F2)的电子密度和稳定性。电子密度的调节可以通过13C NMR光谱测定、例如通过测量碳酸盐(酯)基团的碳原子的位移并将其与参考化合物(例如，实施例5中描述的L6K-碳酸酯-DOTA)的位移进行比较而确定。碳酸酯(酯)信号的NMR位移变化为更高的ppm值(与参考化合物的位移相比)，表明电子密度降低，因此稳定性降低。碳酸盐(酯)信号的NMR位移变化为更低的ppm值(与参考化合物的位移相比)，表明电子密度增加和稳定性增加。所述电子密度的调节可以用于优化本发明偶联物的反应性和稳定性。
根据本发明的实施方案，选择“能够调节X的电子密度和稳定性的基团”，使得在不存在其他试剂的情况下偶联物对降解(例如，水解)是稳定的，这意味着在当偶联物与浓度为1mg/mL、pH为9的水/DMSO(95/5,v/v)混合并在25℃下以500rpm搅拌1小时时，该偶联物表现出如HPLC测定的低于50％的降解、优选低于25％的降解、更优选低于10％的降解、特别是低于5％的降解。
如本文中使用的术语“吸电子基团”是指能够从与其结合的部分吸电子的基团或取代基，即，与携带氢原子而不是吸电子基团的相同部分相比，该吸电子基团降低该部分的电子密度。典型的吸电子基团包括但不限于氰基、硝基、卤代烷基、羧基、芳基、磺酰基等。吸电子基团可以通过诱导效应和/或中介效应(如上所述)发挥其吸电子效应。如本文中使用的术语“吸电子”意在涵盖这两种含义。吸电子基团/取代基在本领域中是已知的，并且例如由Carey&Sundberg在Advanced Organic Chemistry,Part A:Structure and Mechanisms,第4版中描述的。
本文中使用的术语“离去基团”是指在被认为是从参与特定反应的分子的剩余或主要部分的原子或分子中脱离的原子或基团(其可以带电荷或不带电荷)，该特定反应例如为亲核取代反应(Pure Appl.Chem.1994,66,1134)。离去基团的实施例包括硫代酚盐(酯)、酚盐(酯)、羧酸盐(酯)、磺酸盐(酯)。
如本文使用的术语“固相基质”(或同义词“固体支承物”、“固相”或“固相材料”)表征不溶或可通过后续反应使其不溶的材料。固相材料的代表性实施例包括聚合物或玻璃珠、微粒、管、片、板、载玻片、孔和带。
如本文中使用的术语“癌症”是指哺乳动物中以不受调节的细胞生长为特征的生理状况。肿瘤包括一个或多个癌细胞。癌症的实施例包括癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病或淋巴系统同恶性肿瘤。癌症的其他实施例包括：鳞状细胞癌，例如，上皮鳞状细胞癌；肺癌，包括小细胞肺癌、非小细胞肺癌、肺腺癌和肺鳞状癌；腹膜癌；肝细胞癌；胃窦癌或胃癌，包括胃肠道癌、胃肠道间质瘤；胰腺癌；成胶质细胞瘤；宫颈癌；卵巢癌；肝癌；膀胱癌；肝细胞瘤；乳腺癌；结肠癌；直肠癌；结肠直肠癌；子宫内膜癌或子宫癌；唾液腺癌；肾脏癌或肾癌；前列腺癌；甲状腺癌；以及肝癌。
如本文中使用的术语“烷基”是指具有1至20个碳原子、优选1至5个碳原子的直链或支链烃基，更优选为甲基或乙基；或具有3至20个碳原子、优选5至8个碳原子的环烷基。环烷基可以由单个环组成，但也可以由两个或多个稠环形成。
如本文中使用的术语“芳基”是指具有6至14个环碳原子的、单环或多环(例如，双环或三环)4n+2芳环系统(例如，在环状阵列中共享6、10或14个π电子)、且在芳环系统中提供零个杂原子的基团。在一些实施方案中，芳基具有6个环碳原子(例如，苯基)。在一些实施方案中，芳基具有10个环碳原子(例如萘基，诸如1-萘基和2-萘基)。在一些实施方案中，芳基具有14个环碳原子(例如，蒽基)。本文中使用的术语“芳基”意味着涵盖环系统，其中芳环与一个或多个碳环基或杂环基稠合，其中基团或附接点位于芳基环上(在这种情况下，碳原子数表示芳环系统中的碳原子数)。除非另有说明，否则芳基可以是未取代的(“未取代的芳基”)或被一个或多个(例如，1至5个)取代基取代的(“取代的芳基”)。芳基的非限制性实例包括衍生自苯、萘、蒽、联苯等的基团。在本公开的上下文中，术语“碳环基”是指在非芳环系统中具有3至14个环碳原子和零个杂原子的非芳族环状烃基的基团。术语“杂环基”是指具有环碳原子以及1至4个环杂原子的3-14元非芳环系统的基团，每个杂原子独立地选自N、O和S。在含有一个或多个氮原子的杂环基中，如果化合价允许，则附接点可以是碳原子或氮原子。
如本文中使用的术语“杂芳基”是指在芳环系统中具有环碳原子和1至4个杂原子的、5-14元单环或多环(双环、三环)4n+2芳环系统(例如，在环状阵列中共享6、10或14个π个电子)的基团，其中每个杂原子独立地选自氮、氧和硫。在含有一个或多个氮原子的杂芳基中，如果化合价允许，附接点可以是碳原子或氮原子。杂芳基多环系统可以在一个或两个环中包括一个或多个杂原子。如本文中使用的术语“杂芳基”意味着涵盖杂芳基环与一个或多个芳基、碳环基或杂环基稠合的环系统，其中附接点在杂芳基环上(在这种情况下，环成员的数量表示杂芳基环系统中的环成员的数量)。术语“杂芳基”也意味着包括其中杂芳基环与一个或多个芳基稠合的环系统，其中附接点在芳基或杂芳基环上(在这种情况下，环成员的数目表示稠合多环(芳基/杂芳基)环系统中的环成员的数目)。
如本文中使用的术语“取代的芳基”是指其中一个或多个氢原子各自独立地被取代基取代的芳基。取代基的非限制性实施例包括-Z、-R、-OR、-SR、-NR2、-NR3、-CZ3、-CN、-OCN、-SCN、-NO2、-C(O)R、-C(O)NR2、-SO3、-S(O)2R、-C(S)R、-C(O)OR、-C(O)SR，其中每个Z独立地是卤素(即，-F、-Cl、-Br或-I)，并且每个R独立地是-H、-C1-20烷基、-C1-20烷氧基(诸如，甲氧基或乙氧基)、未取代的-C6-20芳基或未取代的-C5-14杂芳基。上述杂芳基可以类似地被取代。
术语“二价亚芳基”是指衍生自如上定义的任选取代的芳基或杂芳基的二价部分，其中另一个氢原子被共价键取代，从而允许附接至相邻部分。二价亚芳基型二硫桥(例如，式-S-X2-S-/-S-X3-S-的二价基团，其中X2/X3表示二价亚芳基)可以根据本领域已知的技术(参见Stefanucci et al.in ACS Med.Chem.Lett.2017,8,449-454,and Beard等人的Bioorg.&Med.Chem.2018,26,3039-3045)通过侧链-至-侧链环化作用获得。
本文中使用的术语“二价二甲苯基团”是指衍生自二甲苯的三种异构体(即，邻二甲苯、间二甲苯、对二甲苯)中的一个的二价部分，其中，各甲基的一个氢原子由共价键取代，从而允许附接至相邻部分。优选地，二价二甲苯基团是二价间-二甲苯基团。二价二甲苯型二硫桥(例如，式-S-X2-S-/-S-X3-S-的二价基团，其中X2/X3表示二价二甲苯基团)可以例如在二溴二甲苯的存在下、通过侧链-至-侧链环化作用获得，如Stefanucci等人在ACSMed.Chem.Lett.2017,8,449-454中描述的。
如本文中使用的术语“二价马来酰亚胺基团”是指衍生自马来酰亚胺的二价部分，其中位置2和位置3处的氢原子各自被共价键取代，从而允许附接至相邻部分。二价马来酰亚胺型二硫桥(例如式-S-X2-S-/-S-X3-S-的二价基团，其中X2/X3表示二价马来酰亚胺基团)可以在例如在2,3-二溴马来酰亚胺或另一种合适的试剂的存在下、通过侧链-至-侧链环化作用获得，如在Kuan等人在Chem.Eur.J.2016,22,17112-17129中描述的。
如本文中使用的术语“二价丙酮基团”是指衍生自丙酮(acetone，ACE)的二价部分，其中各甲基的一个氢原子被共价键取代，从而允许附接至相邻部分。二价ACE型二硫桥(例如，式-S-X2-S-/-S-X3-S-的二价基团，其中X2/X3表示二价ACE基团)可以在例如在二溴丙酮或二氯丙酮存在下、通过侧链-至-侧链环化作用获得(参见Assem等人的Angew.Chem.Int.Ed.Engl.2015,54(30),8665-8668)。
在本描述涉及“优选”实施方案/特征的情况下，只要这些“优选”实施方案/特征的组合在技术上有意义，则这些“优选”实施方案/特征的组合也应被认为是公开的。
在下文中，在本发明和权利要求书中，术语“包含”和“包括”的使用应被理解为除了上述元素之外，还可以存在其他未提及的元素。然而，作为一个更受限制的实施方案，这些术语也应该被理解为公开了术语“由……组成”，使得可以不存在额外的未提及的元素，只要这在技术上是有意义的。
除非另有规定或上下文另有规定，否则对“取代”或“任选取代”的基团的引用应理解为对存在(或任选存在，视情况而定)至少一个选自以下的取代基的引用：F、Cl、Br、I、CN、NO2、NH2、NH-C1-6-烷基、N(C1-6-烷基)2，-X-C1-6-烷基，-X-C2-6-烯基，-X-C2-6-炔基，-X-C6-14-芳基，-X-(具有1-3个选自N、O、S的杂原子的5-14元杂烷基)，其中X表示单键、-(CH2)-、-O-、S-、S(O)-、S(O)2-、-NH-、-CO-或它们的任意组合，包括例如-C(O)-NH-、-NH-C(O)-。取代基的数量没有特别的限制，并且可以从1至可以由取代基饱和的最大价数的范围。取代基的数目典型为1、2或3，通常为1或2，最典型地为1。
除非另有说明，否则本文所述的化合物或部分的单个原子的所有化合价都是饱和的。特别是，它们被指定的结合配偶体饱和。如果未示出结合配偶体或结合配偶体的数量太少，则各个原子的剩余化合价被相应数量的氢原子饱和。
除非另有说明，否则手性化合物和部分可以以纯立体异构体的形式或以立体异构体混合物的形式存在，包括50:50的外消旋体。在本发明的上下文中，对特定立体异构体的引用应理解为对化合物或部分的引用，其中指定的立体异构体以至少90％的对映体过量(enantiomeric excess，ee)、更优选至少95％ee和最优选100％ee的形式存在，其中％ee定义为(|R-S|)/(R+S)*100％，其中R和S表示各自对映体的摩尔量。
除非另有说明或上下文另有规定，否则相邻氨基酸基团之间的所有连接都是由肽(酰胺)键形成的。
除非上下文另有规定，和/或本文明确提供了替代含义，否则所有术语都旨在具有本领域普遍接受的含义，如IUPAC Gold Book(2020年8月1日状态)或Dictionary ofChemistry,Oxford,6th Ed.所反映的。
2.概览
本发明基于以下令人惊讶的发现：有效载荷与抗体或抗体片段的区域选择性附接可以使用本发明的化合物来完成，更具体地，所述区域选择性附接可以在一个单一步骤中完成，例如不需要进一步的化学反应来裂解载体、与抗体或抗体片段之间的共价键。
通过引入反应性基团实现了有效的偶联过程，该反应性基团能够在储存和合成时保持稳定，但能够与抗体或抗体片段表面处的氨基酸侧链形成共价键，同时裂解另一个共价键以释放载体。
所得到的修饰抗体或修饰抗体片段(例如，ADC或抗体-放射性核素偶联物)可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病(特别是癌症)的方法中。
3.式(1)的化合物
本发明涉及由通式(1)表示的化合物：
V-(Y-P)n(1)
式(1)的化合物包含包括载体的肽、一个、两个或三个(n＝1、2或3)反应性部分以及附接至反应性部分的基团(P)，该载体能够与抗体或其片段的Fc区域相互作用(对抗体或其片段的Fc区域具有结合亲和力)，所述抗体片段任选地掺入Fc融合蛋白中，所述反应性部分能够与氨基酸的侧链反应，每个反应性部分附接至包含在肽中的氨基酸的侧链，每个基团可以包含一个或多个有效载荷P1。
在一优选的实施方案中，该化合物包含一个或两个(n＝1或2)能够与氨基酸的侧链反应的反应性部分以及一个或两个(n＝1或2)个附接至反应性部分的基团(P)，每个反应性部分附接至包含在肽中的氨基酸的侧链，每个基团可以包含一个或多个有效载荷P1。最优选地，该化合物包含一个(n＝1)能够与氨基酸的侧链反应的反应性部分以及一个(n＝1)基团(P)，该反应性部分附接至包含在肽中的氨基酸的侧链上，该基团(P)包含一个或多个有效载荷P1。
3.1基团(P)
基团P是包括一个或多个有效载荷P1的基团。该基团没有特别的限制，并且可以使用任何包含有效载荷的基团，例如标记和/或药物活性分子，只要它可以共价附接至反应性部分Y。
在一实施方案中，P是如下文第3.2节所描述的有效载荷P1。
在另一实施方案中，基团(P)与反应性部分的附接可以经由链接基团(或“接头”)和/或经由支化基团进行。在本公开的上下文中，链接基团和/或支化基团可以被认为是基团(P)的一部分。因此，在一实施方案中，基团(P)由下式(2a)、(2b)和(2c)中的一者表示：
P1-L-＊ (2a)
(P1-L)n’-K-＊ (2b)
(P1)n’-K-＊ (2c)
其中，
P1是如下文进一步描述的有效载荷，例如任选包含螯合放射性核素的螯合剂(诸如177Lu-DOTA)或衍生自药物的部分；
L为接头；
n’为2至8、优选为2至4的整数，更优选为2；
K为支化基团，该支化基团共价结合至式(2b)中的反应性部分(Y)和两个或更多个接头(L)或式(2c)中的两个或更多个有效载荷(P1)，从而形成树枝状结构；并且
*表示与反应性部分(Y)共价附接。
在一优选实施方案中，P为P1或由式(2a)或(2c)表示的基团。更优选地，P为P1或由式(2a)表示的基团，且最优选为由式(2a)表示的基团。
因此，本发明的化合物可以由下式(2a’)至(2d’)中的一者表示：
V-(Y-P1)n (2a’)
V-(Y-L-P1)n (2b’)
V-(Y-K-(L-P1)n’)n (2c’)
V-(Y-K-(P1)n’)n (2d’)
其中，
V、Y、L、K、n和n’如上所述，并且
P1为如下文进一步描述的有效载荷。
在优选的实施方案中，本发明的化合物由式(2a’)或(2b’)表示。最优选地，本发明的化合物由式(2b’)表示。
包含在式(2a)和(2b)的基团中的接头是二价基团，优选包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子。
在一实施方案中，接头可以选自
(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，例如亚乙基、亚丙基；
(b1)具有2或3个碳原子且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基团，该重复单元任选地通过氨基或额外的亚烷基结合至相邻部分中的一个或两个上；优选由式-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-表示的基团，其中n1为0至35的整数，例如1至20的整数；并且
(c1)包含2至12个氨基酸的肽基团。
接头可以是可裂解或不可裂解接头。在一实施方案中，接头是不可裂解接头。在另一实施方案中，接头是可裂解接头，例如可裂解肽基团(c1)。
可裂解接头可以是能够在靶细胞内化时特异性释放有效载荷的接头。它可以利用靶细胞(例如，癌细胞)的固有特性来选择性地从修饰抗体或修饰抗体片段释放有效载荷，即(1)蛋白酶敏感性(酶触发释放接头系统)、(2)pH敏感性、(3)谷胱甘肽敏感性、或(4)葡萄糖苷酸酶敏感性。在具体实施方案中，接头是包含缬氨酸-瓜氨酸(Val-Cit)或缬氨酸-丙氨酸(Val-Ala)二肽的可裂解接头，该可裂解接头可以用作组织蛋白酶B(Cathepsin B，CatB)细胞内裂解的底物。
在另一具体实施方案中，接头是可裂解接头，该可裂解接头包含能够通过消除类或环化类机制释放有效载荷的自消耗(self-immolative)部分。包含自消耗部分的可裂解接头的实施例是对-氨基苄氧羰基(para-amino benzyloxycarbonyl，PABC)接头，如在维布妥昔单抗偶联物(bremtuximab-vedotin conjugate/>)中使用的(Younes et al.N.Engl.J.Med.2010,363,1812-1821；Jain et al.Pharm.Res.2015,32(11),3526–3540)。含PABC的接头包含蛋白酶敏感性Val-Cit-PABC二肽接头单元，该接头单元可以被Cat B识别和裂解。该接头单元可以通过马来酰亚胺己酰基部分(以及在抗体修饰至抗体后)附接至反应性部分。这种接头可以帮助避免Cat B在底物识别中的空间冲突。在瓜氨酸-PABC酰胺键的酶促裂解后，产生的PABC-取代的有效载荷自发地经历1,6-消除，该1,6-消除将游离有效载荷作为产物释放至靶细胞中。因此，根据式(2a)的基团可以表示维丁(vedotin)，即，由衍生自单甲基澳瑞他汀E的有效载荷部分组成的基团，该基团通过包含Val-Cit-PABC单元的接头附接至反应性部分。
在另一具体实施方案中，接头是包含C-末端二肽单元的可裂解接头，该可裂解接头能够作为用于Cat B的肽链端解酶活性(exopeptidase activity of Cat B，exo-Cat B)的高特异性底物。exo-Cat B-可裂解接头系统的实施例在WO 2019/096867A1中进行描述。特别地，接头可以包含如WO 2019/096867A1的权利要求1、2或3中定义的C-末端二肽单元(“Axx-Ayy”或“Ayy-Axx”)。
支化基团是多价基团(例如，三价基团或四价基团)，该支化基团共价附接至反应性部分以及两个或更多有效载荷或接头，从而形成支化(树状)树枝状结构。支化基团可以是衍生自包含允许共价附接至反应性部分的官能团的核分子以及额外的两个或更多个支链(branch)(优选两个支链)的基团，其中每个支链包含允许其他部分(例如，有效载荷或接头)共价附接的官能团。在一实施方案中，每个直链可以被亚支化为两个或更多个其他支链，其中每个末端支链包含允许其他部分(例如，有效载荷或接头)共价附接的官能团。从核分子开始，沿所有支链的每个连续重复单元形成“支化代(branching generation)”，直到产生终止代。例如，如果核分子共价附接至反应性部分并包含两个支链，每个支链都结合至其他部分，则沿从核分子开始沿所有支链都存在一个重复单元，并且支化基团是第1代(G1)(核分子被指定为第0代)。如果第1代的每个支链被亚支化为两个支链、每个支链都结合至其他部分，则从核分子开始沿所有支链存在两个重复单元、且附接至第1代支链的两个支化基团中的每一个都是第2代(G2)，以此类推。本文所用的支化基团优选为G1代或G2代。
在一实施方案中，支化基团由下式(3a)和(3b)中的一者表示：
＊-CH(R1-＊＊)(R2-＊＊) (3a)
其中，
R1和R2各自独立地选自由-(CH2)m1-**和-(CH2)m1R3-**组成的组；
R3选自由-NH-**、-(C＝X)R4-**和-NH(C＝X)R4-**组成的组，并且优选为-NH-**或-NH(C＝X)R4-**；
R4为-(CH2)m2-**、-(CH2)m2S-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH-**、或式(3c)芳基：
R5和R6各自独立地选自-(CH2)m2-**、-(CH2)m2S**-、-CH(CH2S-**)2、-(CH2)m2NH-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH(C＝X)R8-**和-CH2(CH2)m2H-**；
R7为-CH2S-**、-(CH2)m2-**或-(CH2)m2R9-**；
R8为-(CH2)m3S-**；
R9为-NH(C＝X)m3S-**；
各X独立地选自O和S，并且优选为O；
*表示与反应性部分(Y)共价附接，任选地经由接头(L2)附接；
**表示在式(2b)中与接头(L)共价附接，或在式(2c)中与有效载荷(P1)共价附接；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2和3，条件是，如果K为式(3a)，则m1不为0；每个m1、m2和m3优选为1。
在一个实施方案中，支化基团由下式(3d)至(3l)中的一者表示：
/>
其中，
m1为0、1、2或3，优选为1；
m2为1、2、3或4，优选为1；
m3为0、1、2或3，优选为1；
*表示与反应性部分共价附接，并且
**表示与接头或有效载荷共价附接。
在优选实施方案中，支化基团由式(3d)或式(3e)表示。因此，如果存在支化基团，则本发明的化合物可以由式(2c’)或(2d’)表示，其中K为式(3d)或式(3e)的支化基团。更优选地，本发明的化合物由式(2d’)表示，其中K为式(3d)或(3e)的支化基团，特别是式(3d)的支化基团。
如果支化基团(K)通过接头(L2)附接至反应性部分，则接头是二价基团，优选包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子的二价基团，且更优选选自以下的二价基团：
(a2)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，例如亚乙基、亚丙基；以及
(b2)具有2或3个碳原子且具有1至6个重复单元的聚环氧烷基团，该重复单元任选地通过氨基或额外的亚烷基与相邻部分中的一者或两者键合；优选由式η–(C＝X)-NH–(CH2CH2O)n3–CH2CH2–θ表示的基团，其中n3为0至10的整数，例如1至4的整数，X选自O和S，η表示与K共价附接且θ表示与Y共价附接。
在一个实施方案中，支化基团(K)是衍生自包含一种或多种三官能氨基酸(例如，Lys、Orn、Dab或Dap)的化合物的部分，其中一种或多种三官能氨基酸提供允许共价附接至反应性部分(Y)和至少两个支链的官能团，其中每个支链包含允许共价附接至其他部分(例如，有效载荷、接头或氨基酸)的官能团。例如，支化基团可以是包含两个或更多三官能氨基酸(例如，2、3或4个三官能氨基酸)的肽部分，其中肽N-末端共价附接至反应性部分(Y)，肽C-末端共价附接至有效载荷(P1)(如下进一步描述)或链终止基团(G)(例如，NH2，如下进一步描述)，并且每个三官能氨基酸的侧链共价附接至式(2c)中的有效载荷(P1)或式(2b)中的接头(L)。如果肽部分包含三个或更多个氨基酸残基，则这些残基可以以线性方式排列，其中每个氨基酸与不超过两个相邻氨基酸结合。替代地，它们可以形成支链结构(例如，树枝状结构)，其中至少一个氨基酸与另一个氨基酸的侧链结合，使得存在与三个或更多个氨基酸结合的至少一个氨基酸。
在一个实施方案中，支化基团(K)由下式(3m)表示：
在式(3m)中，m4表示1至10、优选1至6的整数，更优选1、2或3，*表示与式(1)中的反应性部分(Y)共价附接，并且**表示与式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有效载荷(P1)共价附接。
每个AA1独立地是衍生自三官能氨基酸的部分，例如二氨基羧酸，例如Orn、Lys、Dab或Dap。优选地，每个AA1独立地选自Orn、Lys、Dab和Dap，更优选地选自Orn和Lys，甚至更优选地选自Lys。三官能氨基酸的侧链附接至式(2b)中的接头(L)或附接至式(2c)中的有效载荷(P1)。
在另一方面，除了上述三官能氨基酸之外，AA1还可以包含其他接头和/或氨基酸。这种其他接头和/或氨基酸可以例如选自具有1至20(例如，1至10)个重复单元的聚环氧乙烷基团、和/或一个或多个氨基酸(其对支化没有贡献)，例如2、3或4个氨基酸，其中优选每个氨基酸独立地选自Arg、Cit、homo-Phe(hPHe)和Phe。在一个实施方案中，除了上述三官能氨基酸之外，AA1还包含肽接头，该肽接头包含2至12个氨基酸，该肽接头任选为可裂解的，优选为包含Val-Cit单元、Val-Ala单元、Val-Cit-PABC或Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解肽接头。
G不存在，或G表示选自以下的一者：
·氢原子，
·式–N(H)(R)的基团，其中R选自氢原子、烷基和环烷基；以及
·式–N(H)(R)–(CH2)n13–(C＝O)N(H)(R)的基团，其中每个R独立地选自氢原子、烷基和环烷基，并且n13为1至6的整数，优选1或2；
如果G不存在，则所得到的游离价形成与式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有效载荷(P1)的共价键；
条件是如果m4为1，则G不存在。
在优选实施方案中，支化基团(K)由下式(3n)表示：
在式(3n)中，*、**、m4和G是如式(3m)中所定义的。
每个AA2表示氨基酸，优选为独立选自Arg、Cit、hPhe和Phe的氨基酸。
AA3表示三官能氨基酸，该三官能氨基酸优选选自Dap、Dab、Orn和Lys，更优选选自Orn和Lys。三官能氨基酸的侧链附接至式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有效载荷(P1)。
每个n14独立地为0至10、优选1至8的整数，更优选5；每个n15为0至5、优选0至3的整数，更优选为0或1；每个n16和每个n17独立地为0至10、优选0至5的整数，更优选为0或1。
在更优选的实施方案中，支化基团(K)由下式(3o)表示：
在式(3o)中，*、**、m4和G如式(3m)中所定义的。
每个AA2表示氨基酸，优选独立选自Arg、Cit、hPhe和Phe的氨基酸。
AA3表示三官能氨基酸，该三官能氨基酸优选选自Dap、Dab、Orn和Lys，更优选选自Orn和Lys，甚至更优选Lys。三官能氨基酸的侧链附接至式(2b)中的接头(L)，或附接至式(2c)中的有效载荷(P1)。
每个n14独立地为0至10、优选1至8的整数，更优选为5；并且每个n15为0至5、优选0至3的整数，更优选为0或1。
3.2有效载荷(P1)
待使用的有效载荷(P1)没有特别的限制，并且可以使用任何有效载荷，例如标记和/或药物上活性的分子。
根据一个实施方案，有效载荷选自：
(i)衍生自以下的部分
·发色团，其中所述发色团优选选自
ο磷光团，和
ο荧光团，诸如荧光素或罗丹明，
·标记部分，该标记部分可以包括放射性核素，其中所述标记部分优选为含有或能够含有放射性核素的部分，更优选选自
ο含有或能够含有诸如125I、123I、131I、11C、15O、18F的非金属放射性核素的标记部分，例如衍生自含有诸如125I、123I或131I的放射性核素的4-羟基苯基丙酸酯的部分，以及
ο螯合剂，该螯合剂任选地包含螯合放射性核素，例如衍生自二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(CH-X-DTPA)、去铁胺(DFO)、N1-(27-氨基-11,22-二羟基-7,10,18,21-四氧代-6,11,17,22-四氮杂二十七烷基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO’)、N1-(5-(3-(4-氨基丁基)-1-羟基-2-氧代哌啶-3-羧酰胺基)戊基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基-4-((5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO-cyclo’)、1-(1,3-羧丙基)-4,7-羧甲基-1,4,7-四乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2’-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(NO2A)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、巯基乙酰-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(maGGG)、巯基乙酰-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸(maSSS)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-甲硫氨酸(DOTA-Met)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(环拉胺)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(CB-TE2A)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(DO3AM)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)、1,5,9-三氮杂环十二烷(TACD)、(3a1s,5a1s)-十二氢-3a,5a,8a,10a-四氮杂芘(顺式-乙二醛-环拉胺)、1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(轮环藤宁)、三(羟基吡啶酮)(THP)、3-(((4,7-双((羟基(羟甲基)磷酰基)甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)甲基)(羟基)磷酰基)丙酸(NOPO)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酸(TRITA)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(TRITAM)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(TRITRAM)、反式-N-二甲基环拉胺、2,2',2”-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(NOTAM)、氧环拉胺、二氧环拉胺、1,7-二氧杂-4,10-二氮杂环十二烷、交联桥环拉胺(CB-环拉胺)、三氮杂环壬烷次膦酸盐(酯)(TRAP)、双吡哆酸基二磷酸盐(酯)(DPDP)、内消旋-四-(4-磺酰基苯基)卟啉(TPPS4)、亚乙基双羟基苯基甘氨酸(EHPG)、六亚甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(DMPE)、亚甲基二磷酸、二巯基琥珀酸(DMPA)、1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四(2-氨基甲酰基甲基)环十二烷(TCMC)或其衍生物；
(ii)包含选自以下的偶联基团的部分：任选取代的共轭二烯；任选取代的四嗪(TZ)；任选取代的炔烃或叠氮化物；任选取代的二苯并环辛烯(DBCO)；任选取代的反式-环辛烯(TCO)；任选取代的双环[6.1.0]壬炔(BCN)；任选取代的醛；任选取代的酮；任选取代的卤代乙酰胺；任选取代的马来酰亚胺；以及任选取代的或受保护的硫醇，所述硫醇优选用单甲氧基三苯甲基保护；
(iii)衍生自选自以下的药物的部分
·抗肿瘤剂，诸如
οDNA-烷化剂，诸如多卡霉素，
ο拓扑异构酶抑制剂，诸如多柔比星，
οRNA-聚合酶II抑制剂，诸如α-鹅膏蕈碱，
οDNA裂解剂，诸如卡利奇霉素，
ο抗有丝分裂剂或微管干扰剂，诸如紫杉烷类、澳瑞他汀或美登醇，
ο抗代谢物，诸如吉西他滨的衍生物，
ο纺锤体驱动蛋白抑制剂，诸如非兰尼塞，
ο激酶抑制剂，诸如帕他色替或吉非替尼，
ο烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂，诸如2241014-82-2，
ο基质金属肽酶9抑制剂如，诸如CGS27023A的衍生物，或
ο磷酸酶抑制剂，诸如微囊藻毒素-LR，
·免疫调节剂，诸如氟替卡松，
·抗感染性疾病剂，诸如利福霉素、克林霉素或瑞他莫林，以及
·上述任何物质的放射性同位素、代谢物、药学上可接受的盐和/或前
药；以及
(iv)包含一个或多个增溶基团(例如，2、3、4或5个增溶基团)的部分，每个增溶基团优选独立地选自包含一个或多个离子基团的部分和聚环氧烷基团；其中该部分优选包含一个或多个C2-3聚环氧烷基团，并且其中优选每个C2-3聚环氧烷基团独立地包含4至600个、优选10至200个、更优选15至80个重复单元。
如果式(1)的化合物含有多于一个有效载荷，每个P1可以独立地选自前述部分(i)至(iii)或(i)至(iv)。优选地，有效载荷彼此相同。
在一个实施方案中，有效载荷是任选包含螯合放射性核素的螯合剂，所述螯合剂优选是衍生自DTPA、DOTA、DFO、NOTA、PCTA、CH-X-DTPA、NODAGA、DOTAGA、maSSS、maGGG或DOTA-甲硫氨酸的部分，更优选衍生自DOTA、DTPA、CH-X-DTPA、PCTA、NOTA或DFO的部分。
在一个实施方案中，放射性核素选自124I、131I、86Y、90Y、177Lu、111In、188Re、55Co、64Cu、67Cu、68Ga、89Zr、203Pb、212Pb、212Bi、212Bi、72As、211At、225Ac、223Ra、97Ru、149Tb、152Tb、161Tb、99mTc、226Th、227Th、201Tl、89Sr、44/43Sc、47Sc、153Sm、133Xe和Al18F，优选地选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga、99mTc、203Pb、72As、55Co、97Ru、201Tl、152Tb、133Xe、86Y和Al18F，更优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga和99mTc，最优选选自89Zr、64Cu、99mTc和111In。
在一个优选实施方案中，有效载荷选自：
·衍生自螯合111In的DOTA、PCTA、DTPA或CH-X-DTPA的部分(i)，最
优选为衍生自螯合111In的CH-X-DTPA的部分(i)；
·衍生自螯合64Cu的NOTA、NODAGA或PCTA的部分(i)，最优选为衍
生自螯合64Cu的NOTA的部分(i)；
·衍生自螯合89Zr的DOTA、DFO、DFO’或DFO-环’的部分(i)，最优选为衍生自螯合89Zr的DFO的部分(i)。
在一个实施方案中，有效载荷是(ii)选自包含偶联基团(如上所列)的部分的部分，以允许稍后附接如本文项目(i)和(iii)所指定的其他有效载荷。这可以是包含适合于“点击化学”的偶联基团的部分，该点击化学通过与包含“点击化学”配偶体基团的另一个部分(即，包含偶联配偶体基团的有效载荷)反应来快速且可靠地产生共价键，例如，通过应变促进的环加成、[2+3]偶极环加成或狄尔斯-阿尔德(Diels-Alder)环加成。
在一个实施方案中，该部分是包含偶联基团的部分，该偶联基团可以在不存在金属催化剂(“无金属”)的条件下反应形成共价键，例如Becer等人在“Click Chemistrybeyond Metal-Catalysed Cycloaddition”Angewandte Chemie Int.Ed.2009,48(27),4900-4908中描述的。可以在不存在金属催化剂的条件下反应的偶联基团的实施例包括缺电子炔烃、应变炔烃，诸如环辛烯、四嗪和叠氮化物。
在优选的实施方案中，该部分是(ii)包含选自以下的偶联基团的部分：叠氮化物(N3)、TZ、TCO、BCN和DBCO，更优选为BCN或DBCO，最优选为DBCO。
根据一个实施方案，有效载荷是(iii)衍生自药物的部分。下文是可以在本发明化合物中作为有效载荷使用的示例性药物：
(A)抗肿瘤剂，诸如
(A1)DNA-烷化剂，例如多卡霉素(包括合成类似物：阿多来新、卡折来新、比折来新、KW-2189和CBI-TMI)，氮芥类似物(例如，环磷酰胺-苯丁酸氮芥、美法仑、双氯乙基甲胺、异环磷酰胺、曲洛磷胺、泼尼莫司汀、苯达莫司汀、萘氮芥、雌莫司汀、二氯甲基二乙胺、氧化二氯甲基二乙胺盐酸盐(mechlorethamine oxide hydrochloride)、甘露莫司汀、二溴卫矛醇、新恩比兴、苯芥胆甾醇、乌拉莫司丁)，烷基磺酸盐(例如，白消安、苏消安、甘露舒凡、英丙舒凡和哌泊舒凡)，乙烯亚胺(例如，噻替派、三亚胺醌、卡巴醌)，亚硝基脲(例如，卡莫司汀、洛莫司汀、司莫司汀、链脲霉素、氯脲霉素、福莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀)，环氧化物(例如，依托格鲁)，其他烷化剂(例如，二溴甘露醇、哌
泊溴烷、替莫唑胺、达卡巴嗪)；
(A2)拓扑异构酶抑制剂，例如多柔比星、吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉-多柔比星、脱氧多柔比星、依托泊苷、磷酸依托泊苷、伊立替康及其代谢物(例如，SN-38、替尼泊苷、托泊替康、白藜芦醇、表鬼臼酚、表鬼臼毒素(epipodophyllin)(例如，9-氨基喜树碱、喜树碱、克立那托(crisnatol)、道诺霉素、米托蒽醌、诺凡特酮、维甲酸(视黄醇)、9-硝基喜树碱(RFS 2000)))；
(A3)RNA-聚合酶II抑制剂，例如α-鹅膏蕈碱、其它鹅膏蕈碱；
(A4)DNA裂解剂，例如卡利奇霉素；
(A5)抗有丝分裂剂或微管干扰剂，例如长春花生物碱(例如，长春新碱、长春碱、长春地辛、长春瑞、温诺平(navelbin)、长春氟宁(vinflunide)、长春福肽(vintafolide))、紫杉烷类(诸如，紫杉醇、多西他赛、多聚谷氨酸紫杉醇(paclitaxel polyglumex)、卡巴他赛)及其类似物、美登素生物碱(例如，DM1、DM2、DM3、DM4、美登素和安丝霉素)及其类似物、隐藻素(cryptophycins)(例如，隐藻素1和隐藻素8)、埃博霉素、软珊瑚醇(eleutherobin)、圆皮海绵内酯(discodermolide)、草苔虫素(bryostatins)、耳状截尾海兔毒素(dolostatins)、澳瑞他汀(例如，单甲基澳瑞他汀E(MMAE)、单甲基澳瑞他汀F)、微管溶素、赛法洛他汀(cephalostatins)、水鬼蕉硷、匍枝珊瑚醇(sarcodictyin)、海绵他汀(spongistatin)、地美可辛、丝裂霉素；
(A6)抗代谢物，例如DHFR抑制剂(例如，甲氨蝶呤、三甲曲沙、二甲叶酸、蝶罗呤、氨基蝶呤(4-氨基蝶酸)或其他叶酸类似物，诸如雷替曲塞、培美曲塞、普拉曲沙)、IMP脱氢酶抑制剂(例如，霉酚酸、噻唑呋林、利巴韦林、EICAR)、核糖核苷酸还原酶抑制剂(例如，羟基脲、去铁胺)、嘧啶类似物(例如，阿糖胞苷、氟尿嘧啶、5-氟尿嘧啶及其代谢物、喃氟啶、卡莫氟、吉西他滨、卡培他滨、阿扎胞苷、地西他滨、氟尿嘧啶组合物、喃氟啶组合物、三氟尿苷组合物、胞嘧啶阿拉伯糖苷、安西他滨、氟尿苷、去氧氟尿苷)、尿嘧啶类似物(例如，6-氮杂尿苷、脱氧尿苷)、胞嘧啶类似物(例如，依诺他滨)、嘌呤类似物(例如，咪唑硫嘌呤、氟达拉滨、巯基嘌呤、硫咪嘌呤、硫鸟嘌呤、克拉屈滨、氯法拉滨、奈拉滨)、叶酸补充剂(诸如，亚叶酸)；
(A7)驱动蛋白纺锤体蛋白抑制剂，诸如非兰尼塞；
(A8)激酶抑制剂，例如伊帕替尼(ipatasertib)、BIBW 2992(抗EGFR/Erb2)、伊马替尼、吉非替尼、哌加他尼、索拉非尼、达沙替尼、舒尼替尼、埃罗替尼、尼罗替尼、拉帕替尼、阿昔替尼、帕唑帕尼、凡德他尼、阿法替尼、维莫非尼、克唑替尼、瑞格拉非尼、马赛替尼、达拉菲尼、曲美替尼、依鲁替尼、色瑞替尼、乐伐替尼、尼达尼布、西地尼布、帕博西尼、奥希替尼、艾乐替尼(alectinib)、艾乐替尼、鲁卡帕尼(rociletinib)、考比替尼、米哚妥林、奥美替尼、E7080(抗-VEGFR2)、莫立替尼(mubritinib)、帕纳替尼(AP24534)、巴氟替尼(INNO-406)、博舒替尼(SKI-606)、卡博替尼、维莫德吉(vismodegib)、伊尼帕布(iniparib)、鲁索替尼、CYT387、替沃扎尼(tivozanib)、伊斯平斯(ispinesib)、替西罗莫司(temsirolimus)、依维莫司、地磷莫司(Ridaforolimus)；
(A9)烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂，例如CAS号2241014-82-2；
(A10)基质金属肽酶9抑制剂，例如CGS27023A的衍生物；
(A11)磷酸酶，例如微囊藻毒素-LR；
(B)免疫调节剂，其包括免疫刺激剂、免疫抑制剂、环孢霉素、环孢霉素A、氨基己酸、咪唑硫嘌呤、溴隐亭、苯丁酸氮芥、氯喹、环磷酰胺、皮质类固醇(例如，安西奈德、倍他米松、布地奈德、氢化可的松、氟尼缩松、丙酸氟替卡松、氟考龙达那唑(fluocortolonedanazol)、地塞米松、强的松、曲安奈德、丙酸倍氯米松)、DHEA、羟化氯喹、美洛昔康、甲氨蝶呤、莫非替利(mofetil)、麦考酚酸酯(mycophenylate)、西罗莫司、他克莫司、依维莫司、芬戈莫德、依鲁替尼、咪喹莫特、瑞喹莫德、细胞因子、肽免疫调节剂(诸如，TLR激动剂(例如，CpG寡核苷酸))；
(C)抗传染性疾病药剂，包括抗菌药物、抗分枝杆菌药物和抗病毒药物。在抗生素-抗体药物偶联物中使用的抗生素的非限制性实施例是利福霉素(rifalogue)衍生物，即，雷帕霉素(rafamycin)衍生物。
(D)上述药剂(A)至(C)任一者的放射性同位素、代谢物、药学上可接受的盐和/或前药。
根据一个实施方案，有效载荷是衍生自以下的部分、或所述部分的放射性同位素和/或所述部分的药学上可接受的盐：依喜替康、PNU-159682、DM4、鹅膏蕈碱、多卡霉素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、卡利奇霉素、SN-38、紫杉醇、道诺霉素、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、吡咯并苯并二氮杂卓，吡咯类驱动蛋白纺锤体蛋白(KSP)抑制剂、吲哚啉-苯并二氮杂卓二聚体。如果式(1)的化合物含有多于一个有效载荷，则每个P1可以独立地选自前述部分。优选地，有效载荷彼此相同。
在一个实施方案中，有效载荷是(iv)包含一个或多个增溶基团的(增溶)部分，例如1至10个增溶基团，优选1、2、3、4或5个增溶基团。
一个或多个增溶部分的共价附接可以显著增强其所附接的化合物(例如，抗体或抗体片段)的水溶性。由一个或多个增溶部分发挥的增溶作用能够实现更高的DAR值，同时保持有利的药代动力学(pharmacokinetic，PK)性质。在一些方面，增溶部分可以掩盖有效载荷(诸如，维汀(MMAE)或DM4)的疏水性，由此得到的修饰抗体或修饰抗体片段的物理结合特性和/或PK性质得到改善。在一些其他方面，一个或多个增溶部分与抗体的链接可以导致变化，包括例如增加(延长)血清半衰期和调节的物理相关特征(诸如,减少聚集和多聚体形成)。
增溶基团可以是能够提高水溶性的任何基团。优选地，每个增溶基团独立地选自由聚环氧烷基团(例如，PEO或PPO基团)、以及包含一个或多个离子基团的部分(诸如氨基酸，例如Lys、Glu、Asp、His、Arg、Dap、Dab、Orn、Aad)组成的基团。优选地，增溶部分包括含有4至600个、优选10至200个、更优选15至80个重复单元的一个或多个C2-3聚环氧烷基团，例如PEO基团。
在优选实施方案中，增溶部分包含一个或多个PEO基团，其中优选每个PEO基团独立地包含4至600个、更优选10-200个、甚至更优选15至80个重复单元，例如30至50个重复单元，例如40个重复单元。
对于增溶部分中增溶基团的一般排列没有特别的限制。因此，增溶部分可以具有线性结构，例如，其中若干增溶基团以随机或模块化方式排列；或者具有支化结构，例如，其中若干增溶基团以接枝或树枝状方式附接至核分子(诸如，季戊四醇或甘油)。增溶部分还可以包括若干块，每个块独立地具有线性或支化结构。
在一个方面，增溶部分包括以线性、模块化方式排列的一个或多个增溶基团。例如，增溶部分可以包含由–(So1)–(So2)–[…]–(Son)表示的结构，其中每个So1至Son表示增溶基团，例如，聚环氧烷基团(例如具有4至600个重复单元的PEO基团)或者包含一个或多个离子基团(例如Arg)的部分，n为1至20、例如1至10的整数，条件是相同结构的直接连接的聚环氧烷基团应被视为相同增溶基团的多个重复单元(而不是相邻的So基团)。也就是说，相邻的聚环氧烷基团必须具有不同的结构和/或通过官能团(如-C(O)-O-等)连接，以便被视为单独的So基团。
在一实施方案中，P1是由下式(12a)表示的部分：
-X6-(So-(X6)n20-)n18-X7 (12a)
在式(12a)中，n18为1至20、优选1至10、更优选1至6的整数，例如2或4，并且n 20为0或1。
每个So表示增溶基团，其中优选每个So独立地选自聚环氧烷基团(例如，具有4至600个重复单元的PEO基团)以及包含一个或多个离子基团(例如，Arg)的部分。
每个X6独立地选自单个共价键-(C＝O)-和-N(R)-，其中R表示氢原子、烷基或环烷基。
X7表示具有1至6个碳原子的烷基(例如，甲基)、含羰基的基团(诸如，乙酰基或式–(CH2)n4–CO2H的基团)、含硫代羰基的基团、式–(CH2)n4OR的基团、–(CH2)n4–SO3H的基团、或含氨基的基团(诸如，式–(CH2)n4–(C＝X)–N(R’)(R)或–(CH2)n4–N(R’)(R))，其中X是O或S，R和R’各自独立地选自氢原子、烷基或环烷基，且n4为1至6的整数。
优选地，X7是甲基，或由下式(12a’)表示的基团：
-(CH2)n5-(C＝X)N(R)-(CH2)n6-(C＝X)N(H)(R) (12a’)
其中，
每个X独立地选自O和S，优选地为O，
每个R独立地选自氢原子、烷基和环烷基，并且
n5和n6各自独立地为1至6的整数，优选为1或2。
最优选地，X7为甲基。
在一个实施方案中，P1是由下式(12b)表示的部分：
-X6-((CH2CH2O)n19-(AA4)n20)n21-X7 (12b)
在式(12b)中，X6和X7如式(12a)中所定义的。
AA4表示包含一个或多个离子基团的部分，优选选自Asp、Glu、Lys、Arg、His的氨基酸，且更优选为Arg。
n19为0至600、优选10至200、更优选15至80、例如30至50、例如40的整数；n20为0或1；n21为1至10，优选为1至5，更优选为1至3。
在优选实施方案中，P1是由下式(12c)表示的部分：
-X6-(CH2CH2O)n19’-X7 (12c)
在式(12c)中，X6和X7如式(12a)中所定义的，n19’为4至600、优选10至200、更优选15至80、例如30至50、例如40的整数。
在另一方面，增溶部分包括以无束缚、接枝或树枝状方式附接至核分子(诸如，季戊四醇或甘油)的一个或多个增溶基团。例如，增溶部分可以具有接枝结构或树状，该接枝结构表示为：
其中X为多价(例如，三价或四价)基团，Y为二价基团，每个So1至Son独立地选择为增溶基团，例如，聚环氧烷基团(具有4至600个重复单元的例如PEO基团)或包含一个或多个离子基团的部分，且n为1至20、例如1至10的整数；
树枝状结构表示为：
其中X’为多价(支化)基团，每个So1至Son独立地选择为增溶基团，例如聚环氧烷基团(例如具有4至600个重复单元的PEO基团)或包含一个或多个离子基团的部分，n为1至20、例如1至10的整数。
在一个实施方案中，P1为由下式(12d)表示的部分：
在式(12d)中，X6、X7和n18如式(12a)中所定义的；n22为1或2，优选为1。
每个So独立地选择为增溶基团，其中优选每个So独立地选自聚环氧烷基团(例如具有4至600个重复单元的PEO基团)以及包含一个或多个离子基团的部分。最优选地，每个So表示具有4至600个重复单元的PEO基团。
每个K1独立地选择为三价基团或四价基团，例如，衍生自包含一个或两个官能团的核分子的基团，每个官能团允许与增溶基团共价附接、且其他两个官能团允许与相邻部分共价附接。
在另一实施方案中，P1是由下式(12e)表示的部分：
-X6-K2(So)n18 (12e)
在式(12e)中，X6和n18如式(12a)所定义。
每个So独立地选择为增溶基团，其中优选每个So独立地选自聚环氧烷基团(例如，具有4至600个重复单元的PEO基团)和包含一个或多个离子基团的部分。最优选地，每个So表示具有4至600个重复单元的PEO基团
K2表示(n18+1)价基团(诸如三价或四价基团)，K2共价附接至X6、以及共价附接至两个或多个增溶基团，从而形成支化(树状或树枝状)结构。优选地，K2由下式(12e’)表示：
＊-CH(R10-＊＊)n18 (12e’)
其中，
n18如上定义；
R10为式-(CH2)m5-**或-(CH2)m5R11-**的基团，其中R11选自由-NH-**、-(C＝X)R12-**和-NH(C＝X)R12-**组成的基团；优选为-NH-**；
R12为-(CH2)m6-**、-(CH2)m6S-**、-CH(R13-**)2或-(CH2)m6NH-**；
R13为-CH2S-**、(CH2)m7-**或-(CH2)m7R14-**；
R14为-NH(C＝X)m15S-**；
每个X独立地选自O和S，并且优选为O；
*表示Y与X6共价附接；
**表示与增溶基团So共价附接；
m5为1、2或3；m6和m7各自独立地选自0、1、2和3；每个m5、m6和m7优选为1。
在一实施方案中，P1是由下式中的一者表示的部分：–(CH2CH2O)n19–CH2CH3、–(CH2CH2O)n19–(C＝O)CH3、–(CH2CH2O)n19–(C＝O)NH2、–(CH2CH2O)n19–CH2–N(H)(R)、–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–N(H)(R)、–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–(C＝O)N(R)–CH2–(C＝O)N(H)(R)、–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–(C＝O)N(R)–(CH2)2–(C＝O)N(H)(R)、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–CH2CH3、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–(C＝O)CH3、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–(C＝O)NH2、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–CH2–N(H)(R)、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–N(H)(R)、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–(C＝O)N(R)–CH2–(C＝O)N(H)(R)、–(C＝O)–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–(C＝O)N(R)–(CH2)2–(C＝O)N(H)(R)、–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–CH2CH3、–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–(C＝O)CH3、–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–(C＝O)NH2、–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–CH2–N(H)(R)、–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–N(H)(R)、–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–(C＝O)N(R)–CH2–(C＝O)N(H)(R)和–N(H)(R)–(CH2CH2O)n19–(CH2)2–(C＝O)N(R)–(CH2)2–(C＝O)N(H)(R)，其中n19和R如上文所定义。优选地，R为氢原子且n19为15至80、例如30至50或35至45的整数，特别是40。
3.3反应性部分(Y)
本发明的化合物包含可以与暴露于抗体或抗体片段表面的氨基酸侧链反应(例如，通过亲核取代反应)的反应性部分(Y)。优选地，反应性部分能够与赖氨酸残基的侧链反应。该反应使得包含一个或多个有效载荷(P1)的基团(P)共价附接至所述抗体或抗体片段，伴随释放肽(V)。当反应性部分(Y)与暴露在抗体或抗体片段表面的氨基酸侧链反应形成共价键时，Y内、或Y与V之间的共价键自发裂解以释放肽(无需进一步的化学反应，例如水解或还原)。
反应性部分包括反应中心(reactive center,RC)，该反应中心能够例如通过亲核取代反应与氨基酸的侧链反应，优选与赖氨酸残基的侧链反应。优选地，反应中心是亲电的。能够与氨基酸侧链反应的亲电反应中心的非限制性实施例包括C＝O和C＝S。优选的反应中心是羰基(C＝O)或硫代羰基(C＝S)，特别优选的是羰基(C＝O)。
共价附接至反应中心一侧的是部分(F1)，反应中心通过该部分附接至基团(P)。与反应中心另一侧共价附接的是部分(F2)，反应中心通过该部分附接至肽(V)，任选地通过间隔基(S)。因此，反应性部分可以由下式(4a)表示：
＊’-F1-RC-F2-＊＊＊ (4a)
其中，
RC是反应中心，优选亲电反应中心，并且更优选选自C＝O和C＝S的基团；
F1为单个共价键、原子或原子基团；优选为CH2或NH原子基团或选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为CH2原子基团或选自O和S的原子；
F2表示原子或原子基团；优选为选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自O和S的原子；
*’表示与基团(P)共价附接，并且
***表示与肽(V)共价附接。
F1和F2可以是相同的原子或原子基团。然而，优选地，构成F2的原子或原子基团使其在亲核取代反应中成为比F1更好/优选的离去基团。这确保了当反应中心(RC)通过亲核取代反应与抗体或抗体片段上的氨基酸残基的侧链(例如，与赖氨酸残基的侧链)反应时，F2是优选的离去基团；使得有效载荷附接至抗体或抗体片段，而不是载体/间隔基构建体。
为了确保在亲核取代反应中F2是比F1更好或更优选的离去基团，特别是如果F1和F2是相同的原子或原子基团，F2可以链接至修饰基团(M)，其中M是能够例如通过吸收或供给电子(从而也调节RC的反应性)调节相邻部分F2的电负性和/或稳定性的基团。因此，在一实施方案中，反应性部分可以由下式(4b)表示：
＊’-(F1-RC-F2)-M-＊＊＊ (4b)
其中，
RC、F1、F2、*’和***如上式(4a)中所定义的；并且
M是能够调节F2的电子密度和稳定性的基团，优选为能够吸电子的基团。
在一个优选实施方案中，反应性部分由式(4b)表示。
如果修饰基团(M)存在于本发明的反应性偶联物中，则在Y(特别是RC)与暴露在抗体或抗体片段表面的氨基酸侧链的一步反应过程中释放的肽包括部分H-F2-M-***。
在一个实施方案中，M由下式(4c)表示：
＊＊＊‘--M’-B-E--＊＊＊ (4c)
其中，
M’是衍生自以下的部分：琥珀酰亚胺；或分别具有6元环、10元环或14元环及1、2或3个稠环的芳基；或具有5至14元环、1、2或3个稠环和独立选自N、O和S的、1至4个杂原子的杂芳基；前述基团中的每一个任选地被一个或多个取代基取代。优选地，M’是衍生自苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基和苯并三唑基的二价基团，前述基团中的每一者任选地被一个或多个取代基取代，并且每一个取代基优选选自-F、-Br、-Cl、-I、-NO2、-CN、-C1-6-烷基、-C1-6-烷氧基(诸如-O-CH3或-O-CH2CH3)、-C1-6-氨基(诸如-CH2-C(O)NH2)、及它们的组合，诸如-CCl3、-CF3或-CH2NO2；
B选自以下以及它们的任何组合：
·单个共价键、O、S或原子基团NR’，其中R’表示氢原子、-OH、烷
基、环烷基、C2-6-亚烯基或C2-6-亚炔基；
·由下式(4d)表示的基团：
◆-X1-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-◆◆ (4d)
其中，
X1为-C(O)NH-、-CO-、-NH-或-S-；优选为-C(O)NH-；
n2为1至24、优选为1至10、更优选为1至3的整数；
◆表示与M’共价附接，并且
◆◆表示与E共价附接；
·在主链中具有6至25个氨基酸(例如，在主链中具有9个氨基酸)的肽基团，每个氨基酸优选选自Pro、Gly、Ala、Asn、Asp、Thr、Glu、Gln和Ser；更优选选自Pro、Gly和Ser；
其中，B优选为单个共价键、或具有通式(4d)的基团，更优选为单个共价键；
E为C＝O、C＝S或C(＝NR”)，其中R”表示氢原子、OH、烷基、环烷基、S＝O或S(＝O)2；优选E为C＝O；
***’表示与F2共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接。
如果在F2与肽(V)之间存在间隔基(S)，则间隔基为二价基团，优选包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子。
在一个实施方案中，该间隔基包括聚环氧烷基团，该聚环氧烷基团具有1至24个重复单元、且每个重复单元具有2或3个碳原子，优选具有1至10个重复单元；并且优选为由式–NH–(CH2CH2O)n1–CH2CH2–E’–表示的基团，其中n1为0至24的整数，例如1至10的整数，并且E’为(C＝O)或(C＝S)。
根据一个实施方案，部分(F1-RC-F2)由式(4a’)至式(4m’)中的一者表示，和/或M独立地由下式(5a)至式(5h’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，
*’表示与基团(P)共价附接，
***表示与肽(V)共价附接，或如果M存在，与基团(M)共价附接，并且
***’表示与反应性部分(Y)的F2共价附接。
在优选的实施方案中，反应性部分由下式(6a)至(6l’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，
*’表示与基团(P)共价附接，并且
***表示与肽(V)共价附接。
更优选地，反应性部分由式(6a)、(6l’)、(6m)和(6j’)中的一者表示。甚至更优选地，反应性部分由式(6a)或(6l’)表示。最优选地，反应性部分由式(6a)表示。
3.4肽(V)
本发明的化合物包含肽(V)，该肽(V)包含能够与抗体或其片段的可结晶片段(Fc)区域相互作用(结合)的载体(或“配体”)，该抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中。载体与Fc区域的相互作用使得暴露在与抗体或抗体片段表面的氨基酸侧链相邻的反应性部分的浓度增加，这导致有效载荷共价附接至侧链。在一些方面，载体与Fc区域的相互作用产生靶向效应，因为反应性部分将与暴露在抗体或抗体片段表面处的特定氨基酸的侧链(例如，248位处的赖氨酸残基)反应，使得可以包含一个或多个有效载荷的基团(P)区域选择性地附接至抗体或抗体片段。在一个实施方案中，该肽是能够与抗体或其片段的Fc区域相互作用的载体，该抗体片段任选地掺入Fc融合蛋白中。
能够与抗体或其片段的Fc区域相互作用的载体在本领域是已知的，并在例如Choe等人在Materials 2016,9,994中描述的。在WO 2018/199337A1中也公开了合适的载体。能够与抗体或其片段的Fc区域相互作用的载体的非限制性实施例包括蛋白质Z和Fc-III。特别地，环肽Fc-III已经被描述为对IgG蛋白的Fc区域具有高亲和力的肽载体/配体，报道的该环肽Fc III的解离常数Kd为约16nm(De Lano等人的Science 2000,287,1279-1283)。
在一个实施方案中，肽包含11至17个氨基酸的序列，例如13至17个氨基酸，其优选为环状的。
在一个优选实施方案中，肽由下式(7a)表示：
其中，
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、高酪氨酸(hTyr)和间酪氨酸(mTyr)的氨基酸；优选选自赖氨酸、高赖氨酸(hLys)、鸟氨酸(Orn)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；更优选为Ala
·Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx各自独立地表示氨基酸；
·Axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(8a)表示的肽部分：
---Axx1–Axx2–Axx3--- (8a)
其中，在式(8a)中，
Axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如Arg；
Axx2表示氨基酸，诸如Gly或Cys、优选为Gly；以及
Axx3表示氨基酸，诸如Asp或Asn；
·Hxx表示氨基酸或由下式(8b)表示的肽部分：
---Hxx1–Hxx2–Hxx3--- (8b)
其中，在式(8b)中，
Hxx1表示氨基酸，诸如Thr；
Hxx2表示单个共价键或氨基酸，诸如Tyr或Cys；以及
Hxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如His；并且Axx2的侧链可以共价附接至Hxx2的侧链以形成环；
其中，优选Hxx2和Hxx3两者表示单个共价键；
·如果Axx2为Cys且Hxx2为Cys，则优选将Axx2和Hxx2的侧链链接在一起以形成式–(S–X3–S)–的基团，其中X3表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，例如二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基；优选X3表示单个共价键；
·Lxx1和Lxx2各自独立地表示单个共价键或三官能氨基酸，例如二氨基羧酸；条件是Lxx1和Lxx2中的至少一个是单个共价键；
·Z1表示
ο如果Lxx1为单个共价键，则Z1表示共价附接至Axx的N-末端的基团，该基团选自氢原子、含羰基的基团(诸如，乙酰基)、含C2-3聚环氧烷的基团和衍生自含有偶联基团(诸如，生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇)的化合物的基团，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
ο如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1附接至Lxx1的侧链，则Z1表示共价附接至Lxx1的N-末端的基团，该基团选自氢原子、含羰基的基团(诸如乙酰基)和含C2-3聚环氧烷的基团(例如，含PEG的基团)；并且
ο如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1共价附接至Lxx1的N-末端，则Z1表示共价附接至Lxx1的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团(例如，含PEG的基团)；
·Z2表示
ο如果Lxx2是单个共价键，则Z2表示共价附接至Hxx的C-末端的基团，该基团选自-N(H)(R)，其中R表示氢原子、烷基或环烷基、含C2-3聚环氧烷的基团(例如，含PEG的基团)、和衍生自含偶联基团(诸如，生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺或硫醇)的化合物的基团，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
ο如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的侧链，则Z2表示共价附接至Lxx2的C-末端的基团，该基团优选为含C2-3聚环氧烷的基团(例如，含PEG的基团)、由N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；并且
ο如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的C-末端，则Z2表示共价附接至Lxx2的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团；
·Y1表示仅当Lxx1为三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z1附接至Lxx1的N-末端，则Y1共价附接至Lxx1的侧链，或者如果Z1附接至Lxx1的侧链，则Y1共价附接至Lxx1的N-末端；
其中，Y1衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·Y2表示仅当Lxx2是三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z2附接至Lxx2的C-末端，则Y2共价附接至Lxx2的侧链，或者如果Z2附接至Lxx2的侧链，则Y2共价共价附接至Lxx2的C-末端；
其中Y2衍生自含有偶联基团的化合物，该偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·S1是由下式(8c)表示的间隔基：
α-X4-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-X5-β (8c)
其中
X4为NH、O或S；优选为NH；
如果X5共价附接至肽(V)，则X5为NH或C＝O，优选为C＝O；
n2为1至46、优选1至24、最优选1至12的整数；并且
如果X5共价附接至肽(V)，则α表示与Y1或Y2共价附接，或者如果X5共价附接至Y1或Y2，则α表示与肽(V)共价附接；并且
如果X4共价附接至Y1或Y2，则β表示与肽(V)共价附接，或者如果X4共价附接至肽(V)，则β表示与Y1或Y2共价附接；
·X2表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，诸如二价马来酰亚胺基团、二价丙酮基团或二价亚芳基；优选为单个共价键；
·其中Axx、Bxx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx和Hxx中的至少一种、优选Bxx、Dxx、Exx、Fxx和Gxx中的一种或多种、更优选Bxx、Exx和Gxx中的一种或多种、并且最优选Bxx和/或Exx表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸，更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，这些氨基酸通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)；条件是肽(V)不包含多于三个具有含氨基侧链的氨基酸；
并且其中，
并且其中，如果反应性部分(Y)通过Tyr、hTyr或mTyr附接至肽(V)，则反应性部分(Y)优选为如上定义的式(4a)的部分。
在一实施方案中，部分Y1或Y2由下式(8d)表示：
Y3-L1--＊＊＊＊ (8d)
其中，
Y3为衍生自选自生物素、DBCO、TCO、BCN、炔烃、叠氮化物、溴
乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇的偶联基团的部分；
L1为二价基团，优选包含选自C、N、O和S的一个或多个原子，更优选包含具有1-12个重复单元(例如4个重复单元)的聚环氧乙烷基团；并且
****表示与Lxx1或Lxx2共价附接。
接头L1是二价基团，优选包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子。
在实施方案中，接头L1可以选自
(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，
例如亚乙基、亚丙基；
(b1)具有2或3个碳原子且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基团；优选由式–NH–(CH2CH2O)n1–CH2CH2–表示的基团，其中n1为0至35的整数，例如1至20的整数；并且
(c1)具有2至12个氨基酸的肽基团。
根据一优选实施方案，式(7a)中的Axx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx、Hxx、Lxx1和Lxx2中的至少一者如下定义：
Axx表示选自Ala、2,3-二氨基-丙酸(Dap)、Asp、Glu、2-氨基辛二酸、α-氨基丁酸、Asn和Gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸和己二酸的二羧酸，或者式(8a)的肽部分；Axx优选为Ala、Asp或Asn，更优选为Asp；其中Axx1是单个共价键，Axx2是Cys，且Axx3是Asp；
Cxx表示选自Trp、Phe、Tyr、苯基甘氨酸(Phg)、3-苯并噻吩-2-基-L-丙氨酸、3-萘-2-基-L-丙氨酸、3-联苯-4-基-L-丙氨酸和3-萘-1-基-L-丙氨酸的氨基酸；优选为Trp；
Dxx表示选自His、Ala、3-吡啶-2-基-L-丙氨酸、间酪氨酸(mTyr)和Phe的氨基酸；优选His、Ala或mTyr；最优选为His；
Exx表示选自Ala、2-氨基-丁酸(Abu)、Gly、Leu、Ile、Val、Met、环己基丙氨酸(Cha)、Phe、Thr、Cys、Tyr和正亮氨酸(Nle)的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；
Fxx表示选自Ala、Gly、Asn、Ser、Abu和Asp的氨基酸；优选为Ala或Gly；更优选为Gly；
Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；优选为Asp或Glu；更优选为Glu；
Hxx表示选自Thr、Ser、Ala、Asn、Val、Abu、Ile、Met、Leu、Pro和Cys的氨基酸，或式(8b)的肽部分；Hxx优选为Thr或Ser，更优选为Thr；其中Hxx1为Thr，Hxx2为Cys，且Hxx3为单个共价键；并且
Lxx1和Lxx2各自独立地表示选自Dap、Dab、Lys、Orn和高赖氨酸(hLys)的氨基酸，优选选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸。
根据一个实施方案，如果Dxx或Exx表示通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，则Gxx优选为Glu、Gln、His、Arg或Asn，更优选为Gln。
根据一个实施方案，肽由下式(9a)表示：
其中，
·Z1、Z2、Bxx、Exx、Gxx和X2如上文关于式(7a)所定义的；并且
·Bxx、Exx和Gxx中的至少一个(优选Bxx和/或Exx)表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr；优选具有含氨基侧链的氨基酸，并且
更优选选自Gln、Lys、hLys、Orn、Dap和Dab，所述氨基酸通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)；并且
·如果Bxx和/或Exx表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸，并且更优选选自Gln、Lys、hLys、Orn、Dap和Dab，这些氨基酸通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)，则Gxx优选为Gln；
并且优选地，Bxx、Exx和Gxx中的一者或两者定义如下：
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；优选为Lys、hLys、Orn、Dap、Dab、Ala、Tyr、hTyr或mTyr；
更优选为Ala；
·Exx表示选自Ala、Abu、Gly、Leu、Ile、Val、Met、Cha、Phe、Thr、Cys、Tyr和Nle的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；并且
·Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；
优选为Asp或Glu；更优选为Glu。
在一个实施方案中，肽由下式(10a)至(10k’)的一者表示：
/>
/>
/>
在上面的式(10a)至(10k’)中，Z1、Z2和X2与上面关于式(7a)的描述相同。在这些通式中，肽通过Tyr、Lys、hLys、Orn、Dap或Dab的侧链共价附接至反应性部分。
优选地，肽由通式(10a)至(10v)、(10b’)和(10g’)中的任何一者表示。
在优选的实施方案中，肽(V)由式(10a)、(10b)、(10b’)(10c)、(10e)、(10f)、(10g)、(10g’)(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10m)、(10n)、(10p)、(10q)、(10s)、(10t)和(10u)中的任何一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任何一者表示，甚至更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任何一者表示。最优选地，肽由通式(10f)、(10g)、(10j)和(10k)中的一者表示。
在一个实施方案中，在上面的式(7a)、(9a)和(10a)至(10k’)中，Z1和Z2中的至少一者是含C2-3聚环氧烷的基团，优选为含聚环氧乙烷的基团，该含聚环氧烷的基团优选包含4至600个，更优选10至200个，甚至更优选15至80个重复单元。
含C2-3聚环氧烷基团(例如含聚环氧乙烷基团)共价附接至肽(V)的N-末端和/或C-末端是有利的，因为它显著增强了反应性偶联物的水溶性，并防止了反应性偶联物与抗体在偶联反应期间的非特异性亲脂性相互作用。这使得能够实现更高的选择性和DAR值和/或能够使用更广泛的有效载荷，特别是疏水性有效载荷，例如维汀(MMAE)或DM4。
在一个实施方案中，在上面的式(7a)、(9a)和(10a)至(10k’)中，Z1由下面的式(13a)表示：
X8-(OCH2CH2)n7-X9- (13a)
其中，
X8表示具有1至6个碳原子的烷基(例如，甲基或乙基)或含氨基的基团，优选为式(CH2)n8–N(H)(R)的基团，其中R选自氢原子、烷基、环烷基和含羰基的基团(例如乙酰基)，n8为1-6的整数，优选为2；
X9表示-(C＝X)-，X选自O和S，优选为O；并且
n7为4至100、优选为10至80、更优选为15至40的整数、最优选为20或24；
和/或
Z2由下式(13b)表示：
-X10-(CH2CH2O)n9-X11 (13b)
其中，
n9为4至100、优选10至80、更优选15至40的整数；
X10为单个共价键NH、O或S；优选NH；
X11表示具有1至6个碳原子的烷基，诸如，甲基；含羰基的基团，诸如，乙酰基或式–(CH2)n10–CO2H的基团；含硫羰基的基团；式–(CH2)n10OR的基团；式–(CH2)n10–SO3H的基团；或含氨基的基团，诸如式–(CH2)n10–(C＝X)–N(R’)(R)或–(CH2)n10–N(R’)(R)，其中X为O或S，R和R’各自独立地选自氢原子、烷基或环烷基，且n10为1至6的整数；
X11优选为甲基，或由下式(13b’)表示的基团：
-(CH2)n11-(C＝X)N(R)-(CH2)n12-(C＝X)N(H)(R) (13b’)
其中，
每个X独立地选自O和S，优选为O；
每个R独立地选自氢原子、烷基和环烷基；并且
n11和n12各自独立地为1至6的整数、优选为1或2、更优选为2；
X11最优选为甲基。
在一个实施方案中，在上述式(7a)、(9a)和(10a)至(10k’)中，Z1表示包含10至200、优选15至80个聚环氧乙烷重复单元的含聚环氧乙烷的基团，更优选如上所定义的式(13a)的基团，且Z2为由N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基。优选地，肽(V)由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任一者表示，甚至更优选由式(10f)表示。
在更优选的实施方案中，肽由下式(14a)至(14k’)中的一者表示：
/>
/>
/>
/>
在上述式(14a)至(14k’)中，X2如上文关于式(7a)所描述的，X8、X9和n7如上文关于式(13a)所描述的。优选地，X8为甲基或由式–(CH2)n8–NH2表示的基团，其中n8＝1至6，X9为–(C＝O)–，n7为15至40的整数，例如20或24。在这些式中，肽通过Tyr、Lys、hLys、Orn、Dap或Dab的侧链共价附接至反应性部分。
优选地，肽由式(14a)至(14v)、(14b’)和(14g’)中的任一者表示。
在优选实施方案中，肽(V)由式(14a)、(14b)、(14b’)、(14c)、(14e)、(14f)、(14g)、(14g’)、(14h)、(14i)、(14j)、(14k)、(14m)、(14n)、(14p)、(14q)、(14s)、(14t)和(14u)中的任一者表示，更优选由式(14e)、(14f)、(14g)、(14h)、(14i)、(14j)、(14k)、(14t)和(14u)中的任一者表示，并且甚至更优选由式(14e)、(14f)、(14g)、(14h)、(14i)、(14j)和(14k)。最优选地，该肽由式(14f)、(14g)、(14j)和(14k)中的一者表示。
在实施方案中，上述式中半胱氨酸残基之间的二硫桥(即，式-(S-X2-S)-或-(S-X3-S)-的二硫桥)可以各自独立地由适用于侧链-至-侧链环化的二价基团取代(有时称为“半胱氨酸重新桥接”；参见例如Stefanucci等人的Scientific Reports 2019,9:5771)。合适的二价基团的实施例包括二价二甲苯基团、二价马来酰亚胺基团、二价含三唑基团、二价含羰基基团(例如，二价丙酮基团)、二价琥珀酰亚胺基团(其可通过使半胱氨酸侧链与例如芳氧基马来酰亚胺试剂反应获得；参见Marculescu等人的Chem.Commun.2014,50,7139)，二价硫醚基团(其可以通过使半胱氨酸侧链与例如双砜或烯丙基砜试剂反应而获得；参见Brocchini等人的Nat.Protoc.2006,1,2241-2252)，以及二价哌嗪二酮基团(其可以通过使半胱氨酸侧链与例如二溴哌嗪二酮试剂反应而获得；参见Chudamasa等人的Chem.Commun.2011,47,8781-8783)。特别地，二硫桥可以各自独立地由可以通过“点击”化学获得的二价含三唑基团取代。在这种情况下，半胱氨酸残基(在上述式中形成桥)可以由具有侧链的氨基酸取代，侧链包含适合点击化学的官能团，即，炔烃基团或叠氮基团，它们可以反应形成二价三唑部分(例如，1,4-二取代-1,2,3-三唑部分)。
根据一个实施方案，本发明的化合物是由以下式表示的化合物：V-(O-(C＝O)-O-P1)n、V-(O-(C＝O)-P1)n、V-(S-(C＝O)-P1)n、V-(S-(C＝O)-O-P1)n、V-(O-(C＝S)-O-P1)n、V-(O-(C＝O)-S-P1)n、V-(S-(C＝O)-S-P1)n、V-(S-(C＝S)-O-P1)n、V-(O-(C＝S)-S-P1)n、V-(S-(C＝S)-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-P1)n、V-(S-(C＝S)-S-P1)n、V-(O-(C＝O)-O-L-P1)n、V-(O-(C＝O)-L-P1)n、V-(S-(C＝O)-L-P1)n、V-(S-(C＝O)-O-L-P1)n、V-(O-(C＝S)-O-L-P1)n、V-(O-(C＝O)-S-L-P1)n、V-(S-(C＝O)-S-L-P1)n、V-(S-(C＝S)-O-L-P1)n、V-(O-(C＝S)-S-L-P1)n、V-(S-(C＝S)-L-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-L-P1)n、V-(S-(C＝S)-S-L-P1)n、V-(O-(C＝O)-O-K(-L-P1)n’)n、 V-(O-(C＝O)-K(-L-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-K(-L-P1)n’)n、 V-(S-(C＝O)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-K(-L-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-NH-K(-L-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n 、 V-(O-(C＝O)-K(-P1)n’)n 、V-(S-(C＝O)-K(-P1)n’)n、 V-(S-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n 、V-(O-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、 V-(O-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n 、 V-(S-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n 、V-(O-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n 、 V-(S-(C＝S)-K(-P1)n’)n 、V-(O-(C＝O)-NH-K(-P1)n’)n、 V-(S-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-P1)n 、 V-(M-O-(C＝S)-O-P1)n 、V-(M-O-(C＝O)-S-P1)n 、 V-(M-S-(C＝O)-S-P1)n 、V-(M-S-(C＝S)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-P1)n 、 V-(M-S-(C＝S)-S-P1)n 、V-(M-O-(C＝O)-O-L-P1)n 、 V-(M-O-(C＝O)-L-P1)n 、V-(M-S-(C＝O)-L-P1)n 、 V-(M-S-(C＝O)-O-L-P1)n 、V-(M-O-(C＝S)-O-L-P1)n 、 V-(M-O-(C＝O)-S-L-P1)n 、V-(M-S-(C＝O)-S-L-P1)n 、 V-(M-S-(C＝S)-O-L-P1)n 、V-(M-O-(C＝S)-S-L-P1)n 、 V-(M-S-(C＝S)-L-P1)n 、V-(M-O-(C＝O)-NH-L-P1)n 、 V-(M-S-(C＝S)-S-L-P1)n 、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-P1)n’)n或V-(M-S-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n，其中V、P1、L、K、M、n和n’如上面所定义，并且其中优选V、P1、L、K、M、n和n’中的至少一个(例如，两个、三个、四个或多于四个)如下定义：
(α)V为式(10e)、(10f)、(14e)或(14f)的肽，最优选为(10f)或(14f)的肽；
(β)P1为衍生自NOTA、DOTA、NODAGA、DTPA、N3、TZ、TCO、DBCO、BCN、澳瑞他汀(例如，MMAE)、DM4和PNU-159582的部分；
(γ)L为选自以下的接头
(a1)具有2至6个碳的亚烷基(-(CH2)2-6-)，
(b1)式-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-的聚亚烷基，n1为0-35的整数，以及
(c1)包含2至12个氨基酸的肽接头(该接头任选地为可裂解的)，优选包含Val-Cit单元、Val-Ala单元、Val-Cit-PABC或Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解肽接头；
(δ)K为式(3d)或(3e)的支化基团，其中优选m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或(5l)的基团，优选为式(5a)的基团；
(ζ)n为1；以及
(η)n’为2。
根据优选实施方案，在上述式中，V、K、M、n和n’的全部如下定义，而P1和L中的一者或两者优选如上述项目(β)和(γ)所定义：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(δ)K为式(3d)或(3e)的支化基团，其中m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或(5l)的基团，优选为式(5a)的基团；
(ζ)n为1；并且
(η)n’为2。
如果(β)P1为衍生自澳瑞他汀的部分(例如，MMAE)，则(γ)L优选表示包含Val-Cit单元、Val-Ala单元或Val-Cit-PABC单元的可裂解接头，更优选表示包含Val-Cit-PABC单元的可裂解接头。如果(β)P1是衍生自PNU-159582的部分，则(γ)L优选表示包含Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解接头。
根据一实施方案，本发明的化合物是由式V-(O-(C＝O)-O-P1)n,V-(O-(C＝O)-P1)n、V-(S-(C＝O)-P1)n、V-(S-(C＝O)-O-P1)n、V-(O-(C＝S)-O-P1)n、V-(O-(C＝O)-S-P1)n、V-(S-(C＝O)-S-P1)n、V-(S-(C＝S)-O-P1)n、V-(O-(C＝S)-S-P1)n、V-(S-(C＝S)-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-P1)n、V-(S-(C＝S)-S-P1)n、V-(O-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-K(-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-NH-K(-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-S-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-P1)n’)n或V-(M-S-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n，其中V、P1、K、M、n和n’如上面所定义，并且优选地，其中V、P1、K、M、n和n’中的至少一个(例如，两个、三个、四个或多于四个)定义如下：
(α)V为式(10e)、式(10f)或式(14f)的肽，最优选式(10f)或式(14f)的肽；
(β)P1为衍生自NOTA、DOTA、NODAGA、DTPA、N3、TZ、TCO、DBCO和BCN的部分；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中优选m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团；
(ζ)n为1；以及
(η)n’为2。
根据优选实施方案，在上述式中，V、K、M、n和n’的全部如下定义，而P1优选如上文项目(β)所定义的：
(α)V为式(10e)、式(10f)或式(14f)的肽，最优选式(10f)或式(14f)的肽；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团；
(ζ)n为1；以及
(η)n’为2。
根据一个实施方案，本发明的化合物是由以下式表示的化合物：V-O-(C＝O)-O-P1、V-O-(C＝O)-P1、V-S-(C＝O)-P1、V-S-(C＝O)-O-P1、V-O-(C＝S)-O-P1、V-O-(C＝O)-S-P1、V-S-(C＝O)-S-P1、V-S-(C＝S)-O-P1、V-O-(C＝S)-S-P1、V-S-(C＝S)-P1、V-O-(C＝O)-NH-P1、V-S-(C＝S)-S-P1、V-O-(C＝O)-O-K(-P1)2、V-O-(C＝O)-K(-P1)2、V-S-(C＝O)-K(-P1)2、V-S-(C＝O)-O-K(-P1)2、V-O-(C＝S)-O-K(-P1)2、V-O-(C＝O)-S-K(-P1)2、V-S-(C＝O)-S-K(-P1)2、V-S-(C＝S)-O-K(-P1)2、V-O-(C＝S)-S-K(-P1)2、V-S-(C＝S)-K(-P1)2、V-O-(C＝O)-NH-K(-P1)2、V-S-(C＝S)-S-K(-P1)2、V-M-O-(C＝O)-O-P1、V-M-O-(C＝O)-P1、V-M-S-(C＝O)-P1、V-M-S-(C＝O)-O-P1、V-M-O-(C＝S)-O-P1、V-M-O-(C＝O)-S-P1、V-M-S-(C＝O)-S-P1、V-M-S-(C＝S)-O-P1、V-M-O-(C＝S)-S-P1、V-M-S-(C＝S)-P1、V-M-O-(C＝O)-NH-P1、V-M-S-(C＝S)-S-P1、V-M-O-(C＝O)-O-K(-P1)2、V-M-O-(C＝O)-K(-P1)2、V-M-S-(C＝O)-K(-P1)2、V-M-S-(C＝O)-O-K(-P1)2、V-M-O-(C＝S)-O-K(-P1)2、V-M-O-(C＝O)-S-K(-P1)2、V-M-S-(C＝O)-S-K(-P1)2、V-M-S-(C＝S)-O-K(-P1)2、V-M-O-(C＝S)-S-K(-P1)2、V-M-S-(C＝S)-K(-P1)2、V-M-O-(C＝O)-NH-K(-P1)2或V-M-S-(C＝S)-S-K(-P1)2，其中V、P1、K和M如上面所定义，并且优选其中V、P1、K和M中的至少一者(例如，两个、三个、四个或多于四个)定义如下：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(β)P1为衍生自NOTA、DOTA、NODAGA、DTPA、N3、TZ、TCO、DBCO和BCN的部分；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中优选m1为1和/或m2为1；以及
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团。
根据优选实施方案，在上述式中，V、K和M全部如下定义，而P1优选如上文项目(β)所定义的：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中m1为1和/或m2为1；以及
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团。
根据一个实施方案，本发明的化合物是由以下式表示的化合物：V-(O-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(O-(C＝O)-(CH2)2-6-P1)n、V-(S-(C＝O)-(CH2)2-6-P1)n、V-(S-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(O-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(O-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(S-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(S-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(O-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(S-(C＝S)-(CH2)2-6-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-(CH2)2-6-P1)n、V-(S-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(O-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-NH-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(S-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(S-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(O-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(O-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(S-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(S-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(O-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(S-(C＝S)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(S-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(O-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-NH-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-O-AA2-12-P1)n、V-(O-(C＝O)-AA2-12-P1)n、V-(S-(C＝O)-AA2-12-P1)n、V-(S-(C＝O)-O-AA2-12-P1)n、V-(O-(C＝S)-O-AA2-12-P1)n、V-(O-(C＝O)-S-AA2-12-P1)n、V-(S-(C＝O)-S-AA2-12-P1)n、V-(S-(C＝S)-O-AA2-12-P1)n、V-(O-(C＝S)-S-AA2-12-P1)n、V-(S-(C＝S)-AA2-12-P1)n、V-(O-(C＝O)-NH-AA2-12-P1)n、V-(S-(C＝S)-S-AA2-12-P1)n、V-(O-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(S-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(O-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(O-(C＝O)-NH-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(S-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-AA2-12-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-AA2-12-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-AA2-12-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-AA2-12-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-O-AA2-12-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-S-AA2-12-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-S-AA2-12-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-O-AA2-12-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-AA2-12-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-AA2-12-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-AA2-12-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-S-AA2-12-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-AA2-12-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-AA2-12-P1)n’)n或V-(M-S-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)n’)n，其中V、P1、K、M、n1、n和n’如上所定义，并且AA2-12是如上所定义的接头(c1)，并且优选地其中V、P1、K、M、n和n'中的至少一者(例如，两个、三个、四个或多于四个)如下定义：
(α)V为式(10e)、式(10f)或式(14f)的肽，最优选式(10f)或式(14f)的肽；
(β)P1为衍生自NOTA、DOTA、NODAGA、DTPA、N3、TZ、TCO、DBCO、BCN、澳瑞他汀(例如MMAE)、DM4和PNU-159582的部分；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中优选m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团；
(ζ)n为1；以及
(η)n’为2。
如果(β)P1是衍生自澳瑞他汀的部分(例如，MMAE)，(γ)AA2-12优选表示包含Val-Cit单元、Val-Ala单元或Val-Cit-PABC单元的可裂解接头，更优选表示包含Val-Cit-PABC单元的可裂解接头。如果(β)P1是衍生自PNU-159582的部分，则(γ)AA2-12优选表示包含Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解接头。
根据优选实施方案，在上述式中，V、K、M、n和n’的全部如下定义，而P1优选如上文项目(β)所定义：
(α)V为式(10e)、式(10f)或式(14f)的肽，最优选式(10f)或式(14f)的肽；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团；
(ζ)n为1；以及
(η)n’为2。
根据一个实施方案，本发明的化合物是由以下式表示的化合物：V-O-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1、V-O-(C＝O)-(CH2)2-6-P1、V-S-(C＝O)-(CH2)2-6-P1、V-S-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1、V-O-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1、V-O-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1、V-S-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1、V-S-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1、V-O-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1、V-S-(C＝S)-(CH2)2-6-P1、V-O-(C＝O)-NH-(CH2)2-6-P1、V-S-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1、V-O-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-O-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-S-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-S-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-O-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-O-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-S-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-S-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-O-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-S-(C＝S)-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-O-(C＝O)-NH-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-S-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-O-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1、V-M-O-(C＝O)-(CH2)2-6-P1、V-M-S-(C＝O)-(CH2)2-6-P1、V-M-S-(C＝O)-O-(CH2)2-6-P1、V-M-O-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1、V-M-O-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1、V-M-S-(C＝O)-S-(CH2)2-6-P1、V-M-S-(C＝S)-O-(CH2)2-6-P1、V-M-O-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1、V-M-S-(C＝S)-(CH2)2-6-P1、V-M-O-(C＝O)-NH-(CH2)2-6-P1、V-M-S-(C＝S)-S-(CH2)2-6-P1、V-M-O-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-O-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-S-(C＝O)-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-S-(C＝O)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-O-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-O-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-S-(C＝O)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-S-(C＝S)-O-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-O-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-S-(C＝S)-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-O-(C＝O)-NH-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-M-S-(C＝S)-S-K(-(CH2)2-6-P1)2、V-O-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-O-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-S-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-S-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-O-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-O-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-S-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-S-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-O-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-S-(C＝S)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-O-(C＝O)-NH-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-S-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-O-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-O-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-S-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-S-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-O-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-O-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-S-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-S-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-O-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-S-(C＝S)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-O-(C＝O)-NH-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-S-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-O-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-O-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-S-(C＝O)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-S-(C＝O)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-O-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-O-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-S-(C＝O)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-S-(C＝S)-O-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-O-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-S-(C＝S)-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-O-(C＝O)-NH-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-S-(C＝S)-S-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1、V-M-O-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-O-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-S-(C＝O)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-S-(C＝O)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-O-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-O-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-S-(C＝O)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-S-(C＝S)-O-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-O-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-S-(C＝S)-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-O-(C＝O)-NH-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-M-S-(C＝S)-S-K(-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-P1)2、V-O-(C＝O)-O-AA2-12-P1、V-O-(C＝O)-AA2-12-P1、V-S-(C＝O)-AA2-12-P1、V-S-(C＝O)-O-AA2-12-P1、V-O-(C＝S)-O-AA2-12-P1、V-O-(C＝O)-S-AA2-12-P1、V-S-(C＝O)-S-AA2-12-P1、V-S-(C＝S)-O-AA2-12-P1、V-O-(C＝S)-S-AA2-12-P1、V-S-(C＝S)-AA2-12-P1、V-O-(C＝O)-NH-AA2-12-P1、V-S-(C＝S)-S-AA2-12-P1、V-O-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-O-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)2、V-S-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)2、V-S-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-O-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-O-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-S-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-S-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-O-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-S-(C＝S)-K(-AA2-12-P1)2、V-O-(C＝O)-NH-K(-AA2-12-P1)2、V-S-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-M-O-(C＝O)-O-AA2-12-P1、V-M-O-(C＝O)-AA2-12-P1、V-M-S-(C＝O)-AA2-12-P1、V-M-S-(C＝O)-O-AA2-12-P1、V-M-O-(C＝S)-O-AA2-12-P1、V-M-O-(C＝O)-S-AA2-12-P1、V-M-S-(C＝O)-S-AA2-12-P1、V-M-S-(C＝S)-O-AA2-12-P1、V-M-O-(C＝S)-S-AA2-12-P1、V-M-S-(C＝S)-AA2-12-P1、V-M-O-(C＝O)-NH-AA2-12-P1、V-M-S-(C＝S)-S-AA2-12-P1、V-M-O-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-M-O-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)2、V-M-S-(C＝O)-K(-AA2-12-P1)2、V-M-S-(C＝O)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-M-O-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-M-O-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-M-S-(C＝O)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-M-S-(C＝S)-O-K(-AA2-12-P1)2、V-M-O-(C＝S)-S-K(-AA2-12-P1)2、V-M-S-(C＝S)-K(-AA2-12-P1)2、V-M-O-(C＝O)-NH-K(-AA2-12-P1)2，其中V、P1、K、M和n1如上文所定义，且AA2-12是如上文所定义的接头(c1)，且优选其中V、P1、K和M的至少一者(例如，两个、三个、四个或多于四个)如下定义：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(β)P1为衍生自NOTA、DOTA、NODAGA、DTPA、N3、TZ、TCO、DBCO、BCN、澳瑞他汀(例如，MMAE)、DM4和PNU-159582的部分；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中优选m1为1和/或m2为1；以及
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团。
如果(β)P1是衍生自澳瑞他汀的部分(例如，MMAE)，(γ)AA2-12优选表示包含Val-Cit单元、Val-Ala单元或Val-Cit-PABC单元的可裂解接头，更优选表示包含Val-Cit-PABC单元的可裂解接头。如果(β)P1是衍生自PNU-159582的部分，则(γ)AA2-12优选表示包含Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解接头。
根据优选实施方案，在上述式中，V、K和M全部如下定义，而P1优选如上文项目(β)所定义：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(δ)K为式(3d)或式(3e)的支化基团，其中m1为1和/或m2为1；以及
(ε)M为式(5a)或式(5l)的基团，优选式(5a)的基团。
根据优选实施方案，本发明的化合物是由以下式表示的化合物：V-(M-O-(C＝O)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-O-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-S-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-O-L-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-L-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-L-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-O-L-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-O-L-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-S-L-P1)n、V-(M-S-(C＝O)-S-L-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-O-L-P1)n、V-(M-O-(C＝S)-S-L-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-L-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-L-P1)n、V-(M-S-(C＝S)-S-L-P1)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-L-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-S-K(-L-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝O)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-O-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n、V-(M-S-(C＝S)-K(-P1)n’)n、V-(M-O-(C＝O)-NH-K(-P1)n’)n或V-(M-S-(C＝S)-S-K(-P1)n’)n，其中V、P1、L、K、M、n和n’如上文所定义，且优选其中V、P1、L、K、Mn和n’的至少一者(例如，两个、三个、四个或多于四个)如下定义：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(β)P1为衍生自NOTA、DOTA、NODAGA、DTPA、N3、TZ、TCO、DBCO、BCN、澳瑞他汀(例如，MMAE)、DM4和PNU-159582的部分；
(γ)L为选自以下的接头
(a1)具有2至6个碳的亚烷基(-(CH2)2-6-)，
(b1)式-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-的聚亚烷基，n1为0至35的整数，以及
(c1)包含2至12个氨基酸的肽接头(该接头任选地为可裂解的)，优选为包含Val-Cit单元、Val-Ala单元、Val-Cit-PABC单元或
Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解肽接头；
(δ)K为式(3d)或(3e)的支化基团，其中优选m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或(5l)的基团，优选为式(5a)的基团；
(ζ)n为1；并且
(η)n’为2。
如果(β)P1为衍生自澳瑞他汀的部分(例如，MMAE)，则(γ)L优选表示包含Val-Cit单元、Val-Ala单元或Val-Cit-PABC单元的可裂解接头，更优选表示包含Val-Cit-PABC单元的可裂解接头。如果(β)P1是衍生自PNU-159582的部分，则(γ)L优选表示包含Val-Cit-PABC-DMEA单元的可裂解接头。
更优选地，在上述式中，V、K、M、n和n’的全部如下定义，而P1和L中的一者或两者优选地如以上项目(β)和(γ)定义：
(α)V为式(10e)、(10f)或(14f)的肽，最优选(10f)或(14f)的肽；
(δ)K为式(3d)或(3e)的支化基团，其中m1为1和/或m2为1；
(ε)M为式(5a)或(5l)的基团，优选为式(5a)的基团；
(ζ)n为1；以及
(η)n’为2。
在一个实施方案中，式(1)化合物选自：
/>
/>
4.用于抗体或抗体片段的位点特异性修饰的试剂盒
在一些方面，本发明涉及一种试剂盒，该试剂盒包含上述化合物和缓冲液，该试剂盒可以用于抗体或其片段的区域选择性修饰(例如，用于标记)，该抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，该试剂盒特别是用于治疗性抗体的区域选择性修饰。
本发明的化合物和缓冲剂(一起形成试剂盒)可以单独存在，例如在单独初级容器中(可以在单个盒子中运送给客户)，这可以长时间储存而不会降解。化合物和缓冲液可以配制并按比例配置为给定量的待修饰抗体或其片段。在一些方面，本发明的化合物作为固体(例如，作为冻干粉，或非共价吸附或共价结合至如下面进一步描述的固相基质)，或作为在合适的溶剂中的溶液存在，诸如可以以水溶性的、极性非质子溶剂(例如，DMF、DMSO)，该化合物可以在抗体或抗体片段修饰前不久与缓冲液混合。
本发明试剂盒中待使用的缓冲液没有特别限制。优选地，缓冲液的pH为5.5至11、更优选为7.0至9.5。缓冲液可以选自例如2-双(2-羟乙基)氨基乙酸(2-bis(2-hydroxyethyl)amino acetic acid，Bicine)、碳酸盐-碳酸氢盐、三(羟甲基)甲基氨基丙磺酸(tris(hydroxymethyl)methylamino propane sulfonic acid，TAPS)、4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙烷磺酸(4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethane sulfonic acid，HEPES)。优选地，缓冲液是pH为7.0-9.5(例如pH约为9.0)的碳酸盐-碳酸氢盐或比Bicine缓冲液。
根据一个实施方案，将本发明的化合物固定在固相基质(固体支承物)上，例如固定在珠上。可以使用本领域已知的方法固定化合物，诸如高亲和力(例如，生物素-链霉亲和素、生物素-中性抗生物素蛋白)结合、“点击”化学(如Kolb Kolb等人在“Click Chemistry:Diverse Chemical Function from aFew Good Reactions”Angewandte ChemieInt.Ed.2001,40(11),2004-2021中定义的)、腙连接反应等。优选地，固相基质是包括材料的三维结构、晶格或网络的惰性基质，诸如聚合物凝胶。更优选地，固相基质是用于亲和色谱的材料，诸如干凝胶。这种凝胶在干燥后收缩成仅包含凝胶基质的致密固体。当干燥的干凝胶重新悬浮在液体中时，凝胶基质吸收液体，膨胀并返回到凝胶状态。可以适用于本发明的干凝胶的实施例包括聚合物凝胶，例如纤维素、交联葡聚糖凝胶(例如，)、琼脂糖、交联琼脂糖、聚丙烯酰胺凝胶、聚丙烯酰胺-琼脂糖凝胶。
优选地，通过生物素-链霉亲和素相互作用、通过炔烃与叠氮化物之间的点击反应而获得的共价键、通过硫醇与乙酰胺之间的反应而获得的共价键、通过TCO的衍生物与TZ的衍生物之间的反应而获得的共价键、或通过硫醇与马来酰亚胺之间的反应而获得的共价键来将化合物固定在固体支承物上。
在一个实施方案中，化合物通过式(7a)中的偶联基团Y1或Y2固定在固体支承物上，例如，通过高亲和力结合(诸如生物素-链霉亲和素或生物素-中性抗生物素蛋白结合)(在这种情况下，Y1/Y2表示例如含生物素的基团)、通过点击化学(在这种情况下，Y1/Y2表示例如含DBCO、叠氮化物或炔烃的基团)。
5.反应性偶联物在抗体或抗体片段的区域选择性修饰方法中的应用
本发明的化合物可以用于抗体或其片段的区域选择性修饰的方法中，该抗体片段任选地掺入至Fc融合蛋白中。该方法产生修饰抗体或修饰抗体片段(例如，ADC)，该修饰抗体或修饰抗体片段可以用于如下文进一步描述的诊断、监测(例如监测治疗(例如，随时间推移)的有效性)、成像或治疗疾病的方法。待修饰抗体或其片段可以由医生根据已建立的医学指南、待治疗的疾病来选择。
在一个实施方案中，该方法包括使抗体或其片段与化合物反应(接触)的步骤，该化合物可以包含在上文所述的试剂盒中。反应混合物可以通过本领域已知的技术来纯化，例如使用合适溶剂的凝胶渗透色谱来纯化。用于分离洁净偶联物的合适固定相的实施例包括聚丙烯酰胺凝胶(诸如P-30)和交联葡聚糖(诸如/>或/>)。
当将本发明的化合物固定在固体支承物上时，将固定的化合物与含有待修饰抗体或抗体片段的样品接触，然后用合适的溶剂洗涤固体支承物，该溶剂将基本上除去样品中除结合到固体支承物上的抗体之外的所有物质。最后，用另一种合适的溶剂洗涤固体支承物，例如pH 2.5的甘氨酸缓冲液，该溶剂将从固体支承物中释放修饰抗体/抗体片段(例如，ADC)。
本发明的方法可以应用于任何抗体(例如，IgG蛋白)、抗体片段或Fc-融合蛋白，条件是，该抗体包含用于与载体相互作用的Fc区域。在一个实施方案中，待修饰抗体是单克隆抗体(mAb)，优选选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗、阿杜那单抗、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿特珠单抗、阿奈妥单抗、阿维鲁单抗、巴匹组单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝迈奇单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、维布妥昔单抗、布罗达单抗、卡妥索单抗、西米普利单抗、西妥昔单抗、辛帕单抗、克利妥珠单抗、克雷内治单抗、轮环藤宁四乙酸、达利珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、依帕伐单抗、恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗、依帕珠单抗、依帕珠单抗-SN-38、埃达组单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、吉妥昔单抗、戈奈单抗、替伊莫单抗、英比利珠单抗、英夫利昔单抗、英妥珠单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、艾萨妥昔单抗、伊西贝单抗、J591 PSMA-抗体、拉贝珠单抗、莱卡单抗、莫格利珠单抗、奈昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、维博妥珠单抗、普尼珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、赛妥珠单抗、戈沙妥组单抗、西瑞奈单抗、司妥昔单抗、茄尼醇单抗、他珠单抗、替妥木单抗、替拉奈单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、德喜曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、TS23、乌司奴单抗、维多珠单抗、伏妥莫单抗、泽格特奈单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、其片段及衍生物；更优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗。
在一个实施方案中，待修饰抗体或其片段包含在商业配制的抗体中，优选包含在具有美国EMA或食品药品监督管理局(Food and Drug Administration，FDA)提供的上市许可的商业配制的抗体。根据一个实施方案，商业配制的抗体选自 Humax-CD/>及其生物仿制药；优选选自/>和/>
市售抗体通常与组氨酸一起配制以保持稳定性。当市售抗体与反应性偶联物混合时，组氨酸将有望以竞争方式作用于反应中心，从而降解反应性偶联物，这将导致ADC的产率降低。然而，发明人惊奇地发现，使用本发明的化合物，产率没有受到影响，或受到显著影响。不希望受到理论的约束，发明人认为这是由于本发明化合物与抗体或抗体片段(例如，赖氨酸或半胱氨酸)侧链上的氨基酸之间的反应速率增加所致。这种有利的动力学可能与载体与Fc片段结合后、靶标氨基酸附近的反应中心的局部浓度急剧增加有关。
在一个实施方案中，将待修饰抗体片段掺入至Fc-融合蛋白中，该Fc-融合蛋白优选选自贝拉西普、阿柏西普、ziv-阿柏西普、度拉糖肽、利钠西普、罗米司亭、阿巴西普和阿法西普。
6.修饰抗体或修饰抗体片段
通过使本发明化合物与抗体或抗体片段(该抗体片段任选地掺入至Fc-融合蛋白中)反应而获得的(可获得的)修饰抗体和修饰抗体片段包含通过二价基团附接至抗体或抗体片段的一个或多个有效载荷，该二价基团是衍生自式(1)的反应性部分(Y)的基团(即，它对应于已经与暴露于抗体或其片段表面处的氨基酸侧链反应的式(1)的反应性部分)。
根据一个实施方案，修饰的抗体或修饰抗体片段由下式(11)表示：
(P-W)p-A (11)
其中，
P是包括如上所述的一个或多个有效载荷(P1)的基团，其中P优选是式(2a)的基团；
W为F1-RC’，其中F1附接至P上，且RC’是衍生自附接至A的反应中心(RC)的部分，F1和RC如式(4a)和(4b)所定义；
A是衍生自任选掺入至Fc-融合蛋白中的抗体或抗体片段的部分，所述抗体或抗体片段如上文所定义；并且
p为1至5的整数。优选地，p为1至3，更优选为1或2。
在反应性部分与赖氨酸残基的侧链反应的情况下，基团(P)与抗体或抗体片段的附接通过含氮原子的基团(诸如，酰胺基、氨基甲酸乙酯基、硫代氨基甲酸乙酯基、二硫代氨基甲酸乙酯基等)发生的。例如，如果本发明的化合物包括式(4a’)或(6a)的反应性部分，则式(11)中的二价基团(W)是氨基甲酸乙酯基，其中氮原子形成Lys侧链的一部分。如果化合物包括式(4e’)的反应性部分，则二价基团(W)是硫代氨基甲酸乙酯基。
根据一个实施方案，修饰抗体或修饰抗体片段由下式(12a)至(12c)中的一者表示：
(P1-L-W)p-A (12a)
((P1-L)n’-K-W)p-A (12b)
((P1)n’-K-W)p-A (12c)
其中，
P1、L、K、W、A、n’和p如上所定义。
在优选实施方案中，修饰抗体或修饰抗体片段由式(12a)或(12b)表示，更优选由式(12a)表示。
在上述式中，p表示修饰抗体或修饰抗体片段的偶联度(Degree of Conjugation，DoC)。本发明的化合物可以产生具有高DAR值的修饰抗体或修饰抗体片段，例如ADC。具体地，抗体或抗体片段可以通过在多个偶联位点(p>1)处附接含有效载荷的基团来修饰，其中每个含有效载荷的基团可以包含多个有效载荷分子(n’>1)。
7.修饰抗体或修饰抗体片段在诊断和/或治疗目的中的用途
通过使本发明的化合物与抗体或抗体片段(抗体片段任选地掺入至Fc-融合蛋白中)反应而获得的(或可获得的)修饰抗体和修饰抗体片段可以用于诊断、监测、成像或治疗疾病(特别是癌症)，和/或监测或成像所述疾病的治疗。治疗可以是治疗性和/或预防性治疗，目的是预防、减少或停止不希望的生理变化或失调。在一些情况下，与未接受治疗的预期生存期相比，治疗可以延长受试者的生存期。
通过修饰抗体或修饰抗体片段(例如ADC)治疗的疾病可以是受益于治疗的任何疾病，包括慢性和急性失调或疾病，以及易患该失调的病理状况。在某些情况下，该疾病是一种肿瘤性疾病、诸如癌症，该肿瘤性疾病可以通过靶向破坏肿瘤细胞来治疗。可以治疗的癌症的非限制性实施例包括良性和恶性肿瘤，无论是实体瘤还是液体瘤。白血病和淋巴样恶性肿瘤，以及乳腺癌、卵巢癌、胃癌、子宫内膜癌、唾腺癌、肺癌、肾癌、结肠癌、甲状腺癌、胰腺癌、前列腺癌或膀胱癌。该疾病可以是神经元疾病、神经胶质疾病、星形胶质疾病、下丘脑或其他腺性疾病、巨噬细胞疾病、上皮疾病、基质疾病和囊胚腔疾病；或炎症性疾病、血管原疾病或免疫性疾病。一种示例性疾病是实体的、恶性肿瘤。
根据一个实施方案，疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、脑动脉硬化、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、帕金森氏病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、心绞痛(包括不稳定型心绞痛)、主动脉瘤、动脉粥样硬化、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植术、心力衰竭(包括心房颤动终止的收缩性心力衰竭)、高胆固醇血症、局部缺血、心肌梗死、血栓栓塞、血栓症、强直性脊柱炎、自身免疫性血细胞减少、自身免疫性心肌炎、克罗恩氏病、移植物抗宿主病、肉芽肿性多血管、特发性血小板减少性紫癜、青少年关节炎、青少年糖尿病(1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化症、斑块型银屑病、银屑病、银屑病性关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎和血管炎。
根据一实施方案，待治疗的疾病涉及选自以下的细胞：淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、小细胞肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞、以及以不受调节和加快的速度生长和分裂而引起癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、小细胞肺癌细胞、淋巴瘤细胞、结直肠癌细胞和头颈癌细胞。
根据一个实施方案，修饰抗体或修饰抗体片段用于通过向受试者(例如，患者)施用修饰抗体或修饰抗体片段来诊断、监测(例如，随时间监测治疗的有效性)、成像和/或治疗疾病(例如，癌症)的方法中。
这种分子可以一次性或通过一系列治疗施用至受试者。根据疾病的类型和严重程度，和/或有效载荷，和/或抗体或抗体片段，在首次人体试验中，可以使用约0.1μg/kg至1mg/kg的药物作为首次施用的初始候选剂量，例如通过一次或多次单独施用或通过连续输注来使用。典型的每日剂量范围为约0.1mg/kg至50mg/kg或更多，或约0.5mg/kg至约30mg/kg，例如患者体重的0.5至约25mg/kg。然而，典型剂量将取决于多种因素，包括特定有效载荷(活性剂)、受试者的年龄、体重、一般健康、性别和饮食；施用是否用于成像、监测或治疗目的，以及医学领域公知的其他因素。
当治疗癌症时，观察到的治疗效果可以是癌细胞数量的减少；肿瘤大小的减小；癌细胞浸润周围器官的抑制或延缓；肿瘤生长的抑制；和/或与癌症相关的一种或多种症状的缓解。
根据优选的实施方案，通过注射(诸如，肠外、静脉内、皮下、肌肉内)施用修饰抗体或修饰抗体片段。
根据另一实施方案，修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测(例如，监测治疗的有效性(例如随时间))、成像和/或治疗癌症的方法，并且修饰抗体或修饰抗体片段与一种或多种其他治疗剂(诸如，化疗剂、放射治疗剂、免疫治疗剂、自身免疫性疾病剂、抗感染剂或一种或多种其他修饰抗体或修饰抗体片段)同时施用。也可以在修饰的抗体或经修饰抗体片段之前或之后施用其他治疗剂。
8.本发明化合物的制备
在下文中，提供了制备载体(配体)、间隔基、含有效载荷的基团和化合物(反应性偶联物)的方法，以及它们在治疗性抗体或治疗性蛋白质(例如，Fc-融合蛋白质)的区域选择性修饰中的用途。本发明的化合物可以依赖标准化学方法和Fmoc类固相肽合成(solid-phase peptide synthesis，SPPS)(包括树脂上肽偶联和聚合策略)进行合成。下面还举例说明了各种有效载荷的引入，以及在固相基质上的化合物固定。本领域技术人员已知且在图1-图4中说明了可以用于使用本发明的化合物对治疗性抗体或治疗性蛋白质(例如，Fc-融合蛋白质)进行区域选择性修饰的一般策略和方法。
9.实施例
9.1在实施例中使用的缩写列表：
Ac：乙酰基
ACN：乙腈
BCN：双环[6.1.0]壬炔
Bn：苄基
Boc：叔丁氧羰基
CV：柱体积
DBCO：二苯并环辛烯
DCC：N,N'-二环己基碳化二亚胺
DCM：二氯甲烷
DFO：去铁胺B
DIC：二异丙基碳化二亚胺
DIEA：二异丙基乙胺
DM1：美坦辛(Mertansine)
DM4：雷英妥昔单抗(Ravtansine)
DMF：二甲基甲酰胺
DMSO：二甲基亚砜
DOTA：1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸
DOTA-GA：2-(4,7,10-三(羧甲基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)戊二酸
DTPA：二亚乙基三胺五乙酸
EA：乙酸乙酯
EDC：1-乙基-3-(3-二甲基氨丙基)碳化二亚胺
eq.：当量
FAM：5(6)-羧基荧光素
FITC：异硫氰酸荧光素
Fmoc：芴甲氧羰基
HATU.HPF6：1-[双(二甲氨基)亚甲基]-1H-1,2,3-三唑并[4,5-b]吡啶3-氧化物六氟磷酸盐(1-[Bis(dimethylamino)methylene]-1H-1,2,3-triazolo[4,5-b]pyridinium3-oxide hexafluorophosphate)
HPLC：高效液相色谱法
HRMS：高分辨质谱
Hz：赫兹
ma：马来酰亚胺乙酸
min：分钟
Mmt：单甲氧基三苯甲基
mol：摩尔
MS：质谱
NHS：N-羟基琥珀酰亚胺
NMR：核磁共振
NODA-GA：2-(4,7-双(羧甲基)-1,4,7-三氮杂-1-基)戊二酸
NOTA：2,2',2”-(1,4,7-三氮杂烷-1,4,7-三基)三乙酸
PBS：磷酸盐缓冲盐水
PCTA：2,2',2”-(3,6,9-三氮杂-1(2,6)-吡啶环十烷-3,6,9-三基)三乙酸
PEG：聚乙二醇
pH：氢的潜能
Poc：丙炔氧羰基
rt：室温
Rt：保留时间
SMCC：琥珀酰亚胺基4-(N-马来酰亚胺甲基)环己烷-1-羧酸酯
SPPS：固相肽合成
TCO：反式环辛烯
TEA：三乙胺
TFA：三氟乙酸
THPTA：三(3-羟丙基三唑基甲基)胺
TIS：三异丙基硅烷
Tz：四嗪
UPLC：超高效液相色谱
UV：紫外线
9.2原材料和化学品：
下面列出了以下实施例中使用的主要原材料和化学品：
>除非另有说明，否则来自诺瓦生化公司(Novabiochem)(瑞士)的Fmoc-Rink酰胺AM树脂、N,N-二异丙基碳化二亚胺(DIC)、哌嗪；
>来自默克(Merck)或费舍尔科学(Fischer Scientific)AG(瑞士)的用于合成的溶剂、脱保护试剂、裂解剂；
>来自西格玛奥德里奇(Sigma-Aldrich)(瑞士)的TFA、TIS、DIEA、N-羟基琥珀酰亚胺、三(乙二醇)双(氯甲酸酯)、NaN3、DBU、Boc2O、DCC、HF.Pyr、2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐、N-羟基马来酰亚胺、4-(二甲氨基)吡啶、吡啶、哌啶、二氢呋喃-2,5-二酮、碘化铜；
>来自巴亨(Bachem)AG(瑞士)、诺瓦生化公司和Aapptec(美国)的氨基酸；
>来自Iris Biotech GmbH(德国)的Fmoc-L-HTyr(tBu)-OH、Fmoc-VC-PAB-OPNP、THPTA；
>来自马舍雷-纳格尔(Macherey-Nagel)(瑞士)的用于高效液相色谱(HPLC)、超高效液相色谱质谱(UPLC-MS)的溶剂和化学品；
>来自Macrocyclics(美国)的2-氨基乙基-单酰胺-DOTA-三(t-Bu酯)、p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA.3HCl、p-SCN-Bn-PCTA.3HCl、NOTA-Bn-NCS、ma-DFO、DBCO-DFO、p-SCN-Bn-TCMC；
>来自BroadPharm(美国)的Fmoc-N-氨基-PEG1/2/3/10-酸、生物素-PEG12-NHS酯、叠氮-PEG12-NHS酯、DBCO-NHS酯、TCO-NHS酯、TZ-PEG5-NHS酯、N3-PEG11-NH2、Fmoc-N-氨基-PEG20/24-酸、m-PEG24-酸、m-PEG37-NHS酯、3-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)丙酸、2,5-二氧代吡咯烷-1-基-2-叠氮乙酸酯；
>来自Fluorochem(美国)的2,5-二氧代吡咯烷-1-基-3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2h-吡咯-1(5h)-基)丙酰氨基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯、4-羟基苯甲酸叔丁酯、双(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯、2-叠氮乙醇；
>来自Combi-Blocks(美国)的4-羟基苯甲酸叔丁酯、双(全氟苯基)碳酸酯、HATU；
>来自Chematech(法国)的DFO-SCN、DOTA-NHS酯、2-[4,10-双(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-7-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧-2-氧代-乙基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酸叔丁基酯；六氟磷酸盐、p-SCN-Bn-NODA-GA、DOTA-GA(tBu)4、NODA-GA-NHS酯；
>来自巴亨(瑞士)的ma-template.3HCl、H-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr(tBu)-OtBu.HCl、1-羟基吡咯烷-2,5-二酮、ma-PEG5-(Lys(Poc)-PEG5-Arg)-(Lys(Poc)-PEG15-Arg)-Gly-CONH2*2TFA、H-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr-OH；
>来自Enovation Chemicals(美国)的DM1-SMCC、维汀、MMAE、PNU-159682；
>来自Activate Scientific GmbH(德国)的3,5-双-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)苯甲酸；
>来自阿波罗化学(Apollo Chemical)(美国)的EDC.HCl；
>来自免疫原公司(Immunogen Inc)(美国)的DM1；
>来自Fluorochem(英国)的3-(4-巯苯基)丙酸、3-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)丙酸、5-FITC-NHS酯；
>来自卡博森斯(Carbosynth)(美国)的DM4；
>来自美迪西生物(MedChemExpress)(美国)的SPDB；
>来自Acros Organics(比利时)的AcBr、3-(4-羟苯基)丙酸；
>来自览博网(LabNetworkCompounds)(中国)的3-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)硫代)丙酸；
>来自Synthonix(美国)的二氢天冬氨酸(dihydroasparagusic acid)；
>来自Berry&Associates Inc(美国)的BCN-NHS酯；
>来自金斯瑞(Genscript)(美国)的荧光标记肽Fc-III-FAM；
>来自昂博生物(Ambiopharm)(美国)的Fc-III-(OtBu)2-L6Orn、Cit-Lys(PEG5-MA)-Tyr、化合物025
>来自罗氏公司的(曲妥珠单抗)、/>(ado-曲妥珠单抗-美坦新偶联物(ado-trastuzumab emtansine))、/>(阿特珠单抗)、/>(利妥昔单抗)；
>来自BioCell(美国)的Fc区域；
>来自默沙东(MSD Merck Sharp&Dohme)的(派姆单抗)；
>来自赛诺菲-安万特(Sanofi-Avents)的(阿柏西普)；
>来自安进的(帕尼单抗)；
>来自Genovis(瑞典)的和/>蛋白酶；
>来自新英格兰生物实验室(美国)的EndoS；>
>
>来自Fluka(美国)的HOBt。
生物相似性单克隆IgG1抗体(曲妥珠单抗、阿仑单抗、贝伐单抗、利妥昔单抗)是在应用科学大学的G.Hagens博士实验室(HES-SO瓦莱州(Valais/Wallis)，瑞士)通过培养重组CHO细胞系进行制备的。
GingisKhan是对铰链上方的IgG1进行位点特异性裂解的半胱氨酸蛋白酶，从而产生两个Fab片段和一个Fc片段。Fabricator是对铰链下方的抗体进行位点特异性消化的半胱氨酸蛋白酶，从而产生F(ab’)2和Fc/2片段。
9.3方法：
以下方法用于评价本发明的化合物和偶联物：
9.3.1饱和FP结合试验
饱和荧光偏振(fluorescence polarization，FP)测量在平底384-孔康宁微孔板(默克集团)中、在SpectraMax Paradigm多模式检测平台(购自美谷分子(MolecularDevices))上，分别使用485nm和535nm的激发波长和发射波长来执行的。采集时间为700毫秒，且读取高度为1毫米。测定中使用的所有试剂均在含有0.05％吐温20的PBS中稀释。
将荧光标记肽Fc-III-FAM(结构如下所示)与一系列IgG1稀释液在含有0.05％吐温的PBS中混合，得到最终肽浓度为5nM。样品在27℃下温育15分钟，并一式三份测量荧光各向异性。
Fc-III为13-mer环肽，已知13-mer环肽与IgG抗体的Fc区域具有高亲和力(DeLano等人，Science 2000,287,1279-1283；Nilsson等人，Protein Eng.1987,1,107-113)。使用标准SPPS技术和聚合策略、通过制备荧光标记肽Fc-III-FAM。
9.3.2竞争性FP结合试验
竞争性FP测量在平底-384孔康宁微孔板(默克集团)中、在SpectraMax Paradigm多模式检测平台(美谷分子)上，分别使用485nm和535nm的激发波长和发射波长长来执行的。采集时间为700毫秒，且读取高度为1毫米。测定中使用的所有试剂均在含有0.05％吐温20的PBS中稀释。
将浓度增加的待测肽与Fc-III-FAM肽混合，并以80μL的总体积添加至IgG1中。Fc-III-FAM的最终浓度在5nM处保持恒定，并且IgG1的最终浓度为30nM。将混合物在27℃温育15分钟，并在Spectramax Paradigm上读取荧光信号。所有样品制备都在pH 7.0、且含有0.05％吐温的PBS中进行。每个实验一式三份执行。
9.3.3肽和偶联物浓度测定
通过将纯化的肽、反应性偶联物或抗体-有效载荷偶联物溶解在DMSO中来制备肽样品。在1x PBS pH 7.0中，使用280nm处Trp(ε＝5500M-1cm-1)、Tyr(ε＝1490M-1cm-1)、Cys(ε＝125M-1cm-1)残基、碳酸盐反应性调节剂(ε＝1510M-1cm-1)、硫酯反应性调节剂(ε＝1142M- 1cm-1)、p-SCN-Bn-CHX-A"-DTPA(ε＝13775M-1cm-1)、p-SCN-Bn-PCTA(ε＝13625M-1cm-1)、p-SCN-Bn-NOTA(ε＝16160M-1cm-1)、p-SCN-Bn-NODA-GA(ε＝14235M-1cm-1)、DOTA-GA(OtBu)4-NHS(ε＝100M-1cm-1)、DFO-SCN(ε＝21000M-1cm-1)、DBCO-DFO(ε＝9590M-1cm-1)、DBCO-NHS酯(ε＝12560M-1cm-1)、BCN-NHS(ε＝3050M-1cm-1)、TCO-NHS酯(ε＝3300M-1cm-1)、TZ-PEG5-NHS酯(ε＝16870M-1cm-1)、维汀(ε＝1870M-1cm-1)、SPDB-DM4(ε＝11200M-1cm-1)、SMCC-DM1(ε＝5700M- 1cm-1)、多(DM1)2(ε＝16332M-1cm-1)的吸光度或496nm处FITC(ε＝73000M-1cm-1)、FAM(ε＝83000M-1cm-1)的吸光度。
9.3.4高分辨率质谱法
通过在配置缓冲液中每μg偶联物温育1单位Endo S(37℃-1小时)来实现偶联物的去糖基化。
在与基于芯片的自动纳升电喷雾装置(automated chip-basednanoelectrospray device)(Triversa Nanomate，Advion，美国)耦合的QExactive HFOrbitrap-FT-MS(赛默飞世尔科技，德国)上执行用于肽/偶联物分析的直接注射HRMS。电喷雾电离在1.4kV的毛细管电压和0.15psi的氮纳米流下进行。MS实验以45000的标称分辨率和正离子模式进行。使用具有90％拟合因子的Xtract算法、使用Protein Deconvolution(赛默飞世尔科技，美国)执行数据去卷积。
对于完整质量测量(intact mass measurement，LC-MS)和中等下分析(middle-down analysis，LC-HCDMS/MS)，使用与HESI源(赛默飞世尔科学，德国)耦合的DionexUltimate 3000分析RSLC系统(戴安(Dionex)，德国)，将样本在Acquity UPLC蛋白质柱BEHC4(1.7μm，1x150mm，沃特世，美国)上分离。通过将溶剂B的梯度在2min内从15％施加至45％、然后在10min内从45％施加至60％，用90μL/min的流速执行分离，然后进行柱清洗和重新平衡步骤。溶剂A由水和0.1％甲酸组成，而溶剂B由乙腈和0.1％TFA组成。
在高分辨率QExactive HF-HT-Orbitrap-FTMS台式仪器(赛默飞世尔科技，德国)上分析洗脱的蛋白形式。对于完整质量测量MS1，扫描在蛋白质模式执行的，分辨率为15000，且取10μscans的平均值。对于Fc/2-mod，在PRM模式下、在1356m/z处分离物质进行结合位点定位的中等下分析，300Th隔离窗口，分辨率为240000，取10μscans的平均值。HCD(high energy collision-induced dissociation，高能碰撞诱导解离)被用作片段方法，归一化碰撞能量分别为12％、15％和18％。
使用具有99％噪声抑制置信度和20ppm平均质量识别精度的Respect算法、用Protein Deconvolution(赛默飞世尔科学，美国)分析完整质量测量数据。使用MASH Suite软件(Ge研究小组，威斯康星大学)对中等下数据进行去卷积。使用ProSight Lite软件(Kelleher研究小组，西北大学)，将用3个不同NCE值获得的数据组合在一起以创建具有15ppm质量容差的指定b-和y-片段的片段图。
9.3.5根据HRMS分析确定偶联度
平均偶联度(average Degree of Conjugation,DoC)值使用HRMS数据和下面的等式1(Eq..1)计算。这些结果衍生自去卷积质谱中的相对峰强度。
其中，I(DoCk)为具有k个附加分子/抗体的偶联物的相对峰强度。
实施例1：Fc结合载体的制备和表征
使用标准Fmoc/tBu类SPPS(包括树脂上偶联和聚合策略)制备如本文所述的Fc结合载体和载体间隔基构建体。实施例1中制备的配体显示在下表1中示出(氨基酸取代编号是指Fc-III从左到右的序列，N-末端D＝1和C-末端T＝13，例如“D1K”表示位置1的D已经被K取代；粗下划线表示在各个Cys残基的侧链之间存在二硫键)。
表1：Fc结合载体
/>
*-由D氨基酸组成的序列
**-参考载体
X-–NH(CH2)(C＝O)–
m-甲基
表2：Fc结合载体
使用Rink酰胺AM树脂(负载：0.57mmol/g)和Liberty BlueTM自动微波肽合成仪(购自CEM公司，德国)、通过标准Fmoc/tBu类SPPS制备肽。
在室温下，使用利用0.5M DIC预活化的0.2M Fmoc-氨基酸和1M的DMF进行用于酰胺键形成的偶联反应超过4分钟。用10％哌嗪的DMF(v/v)进行Fmoc去保护。
合成完成后，在室温下，通过用TFA/TIS/水(90/5/5，v/v/v)处理，在温和搅拌下从树脂中手动裂解肽超过1.5。在用氮气流过滤和蒸发裂解混合物后，用冷乙醚沉淀粗肽，离心，并用冷乙醚洗涤粗肽。将肽干燥，溶解在超纯水/ACN中，冷冻并冻干。
对于化合物L6Orn-PEG24、PEG20-L6Orn和PEG24-L6Orn的合成，将Fmoc-N-氨基-PEG20/24-COOH或mPEG24-COOH(1.6eq.，0.16mmol)和HATU.HPF6(1.4eq.，0.14mmol)的DMF溶液搅拌1分钟，并添加DIEA(6eq.，0.6mmol)。预活化3分钟后，将树脂上的肽(1eq.，0.1mmol，在3mL的DMF中溶胀)添加至反应混合物中，并在室温下搅拌23-27小时。通过ULPC-MS监测反应完成。用DMF和DCM清洗树脂。在L6Orn-PEG24和PEG20-L6Orn的情况下，在室温下用20％哌啶的DMF(v/v)执行Fmoc去保护30分钟。使用Liberty BlueTM自动微波肽合成仪继续L6Orn-PEG24合成。
对于二硫键的形成，将粗肽(0.1mmol)重悬于10ml的DMSO中，然后添加2eq.的2MNH3的甲醇和50eq.的过氧化氢，并在室温下搅拌30分钟。通过分析型UPLC-MS监测氧化过程。将10ml的0.1％TFA水溶液添加至溶液以停止反应。
使用溶剂系统A(水中0.1％TFA)和B(ACN中0.1％TFA)，以35mL/min的流速和25min内15-55％B范围内的梯度，在XB-C 18柱(/>5μm，100x 21.2mm；PhenomenexHelvetia)上通过制备型反相HPLC来纯化肽。在214nm的波长下监测肽洗脱。在冻干之前，通过UPLC-MS分析合适的级分。
对于化合物A3Dap-PEG1、L6K-PEG1、L6K-PEG2、L6K-PEG3和L6K-PEG10的合成，将Fmoc-NH-(CH2-CH2-O)n-CH2-CH2-COOH(n＝1、2、3、10；1.5eq.，8.2μmol)和HATU(1.4eq.，7.6μmol)的DMF溶液搅拌1分钟，并添加DIEA(2eq.，10.9μmol)。预活化3分钟后，将Fc结合肽(化合物L6K)的DMF(1eq.，5.4μmol)添加至反应混合物中，并在室温下搅拌1-3小时。通过ULPC-MS监测反应完成。然后用冷乙醚沉淀肽。在室温下，用20％哌啶的DMF(v/v)执行Fmoc去保护30分钟，然后用冷乙醚沉淀肽。在HPLC纯化后分离肽(如前一段所描述的)。
在UPLC-MS系统上测定肽的纯度：
·方法1：沃特世(Wateres)Acquity UPLC系统与配备有XB-C 18柱(1.7μm，50x2.1mm；Phenomenex Helvetia)的Micromass Quattro micro API质谱仪耦合，使用利用溶剂系统A(水中0.1％TFA)和B(ACN中0.1％TFA)的溶剂系统，流速以0.6mL/min且4min内B梯度为2-98％。在214nm波长下监测肽洗脱。
·方法2：配备有XB-C 18柱(/>1.7μm，50x2.1mm；PhenomenexHelvetia)的安捷伦InfinityLab液相色谱/质量选择性检测器XT(LC/MSD XT)系统，使用利用溶剂系统A(水中0.03％TFA)和B(ACN中0.03％TFA)的溶剂系统，流速为0.62mL/min且4min内B梯度为2-98％。在214和280nm的波长下监测肽洗脱。
·方法3：将沃特世Acquity UPLC系统与配备有在40℃下加热且装配有2μm插入式过滤器预柱(购自沃特世)的BEH C18 1.7μm 50x2.1 mm柱的沃特世SQD质谱仪耦合，并且溶剂系统A1(水+0.1％FA)和B1(ACN+0.1％FA)，流速为0.9ml/min，2.9min内B1的梯度为5-100％。
·方法4：将沃特世Acquity UPLC系统与配备有在40℃下加热的CSH C18柱(1.7μm，2.1mm x 50mm)的沃特世SQD质谱仪耦合，使用溶剂系统A(水+0.1％FA)和溶剂系统B(ACN+0.1％FA)，流速为0.6mL/min，5min内B的梯度为5-85％。
·方法5：将沃特世Acquity UPLC系统与配备有在40℃下加热的CSH C18柱(1.7μm，2.1mm x 50mm)的沃特世SQD质谱仪耦合，使用溶剂系统A(水+0.1％FA)和溶剂系统B(ACN+0.1％FA)，流速为0.9mL/min，2.7min内B的梯度为5-100％。
·方法6：将沃特世Acquity UPLC系统与配备有在40℃下加热的CSH氟苯基柱(1.7μm，2.1mm x 50mm)的沃特世SQD质谱仪耦合，使用溶剂系统A(水+0.1％FA)和溶剂系统B(ACN+0.1％FA)，流速为0.9mL/min，2.9min内B的梯度为5-100％。
结果如下表所示。
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*-由D个氨基酸组成的序列
表3：肽的表征
实施例2：饱和FP结合试验
在饱和FP结合试验中，评估了Fc结合配体Fc-III-FAM(如上所示结构)结合IgG1抗体(即，曲妥珠单抗、阿仑单抗、贝伐单抗和利妥昔单抗)的Fc-区域的倾向。证实了Fc-结合配体Fc-III-FAM、以高亲和力结合相应抗体(曲妥珠单抗：14nM，阿仑单抗：13nm，贝伐单抗：7nM，利妥昔单抗：11nM)。
实施例3：竞争性FP结合试验
在上述竞争性FP结合试验中评估实施例1中制备的Fc结合配体抗Fc-III-FAM、以结合曲妥珠单抗Fc区域的倾向。结果在下表4中给出。
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表4：曲妥珠单抗对Fc-III-FAM的竞争性FP结合试验中Fc-结合配体的IC50值
这些结果证实实施例1的Fc-结合配体和Fc-III-FAM竞争曲妥珠单抗Fc区域上的相同结合位点。结果表明，与Fc-III相比，Fc-III肽在D1、G7、E8、L9、T13位置的赖氨酸突变不会显著改变突变肽与抗体的Fc区域的结合。突变体A3K、H5K、L6K和V10K表现出中等的结合效率。然而，化合物W4K和W11K中Fc-III的修饰(即，用赖氨酸取代W4或W11)对肽与抗体的结合具有显著影响。化合物W11K没有用于进一步研究。
实施例4：构建体和有效载荷-碳酸酯衍生物-化合物001-016的制备
化合物001-027按照下述方法制备。
2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙基(4-氟羰基苯基)碳酸酯(化合物001)的制 备：
步骤1.向2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(6.61g，19.1mmol，2.0eq.)的DCM(70mL)溶液中添加4-羟基苯甲酸丁酯(1.85g，9.55mmol，1.0eq.)，然后添加4-(二甲基氨基)吡啶(2.33g，19.1mmol，2.0eq.)。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时，然后用水淬火。水相用DCM萃取三次。合并的有机层在MgSO4上干燥并真空浓缩。通过快速色谱法(100g柱体(Cartridge)，庚烷：EA为4:1、超过3CV，然后庚烷：EA为4:1至1:4、超过9CV)纯化，得到无色油状的4-[2-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸叔丁酯(2.87g，6.61mmol，69％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝2.17min，m/z＝326[M-Boc+H]+，448[M+Na]+。1H NMR(400MHz,DMSO)d 7.96(d,2H),7.38(d,2H),6.83(s,1H),4.41–4.28(m,2H),3.75–3.60(m,2H),3.43(t,J＝6.0Hz,2H),3.09(q,2H),1.54(s,9H),1.37(s,9H)。
步骤2.在室温下，将TFA(11mL)添加至4-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧羰基氧基]苯甲酸叔丁酯(2.87g，5.94mmol，1.0eq.)的DCM(11mL)溶液中。反应物在室温下搅拌35分钟，然后真空浓缩并从甲苯中再蒸发，得到相应的粗TFA盐(3.35g，假定定量产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝0.60min，m/z＝270[m+H]+。1H NMR(DMSO)d 8.01(d,1H),7.87(s,2H),7.37(d,2H),4.38(dd,2H),3.75(dd,2H),3.65(t,2H),3.06–2.97(m,2H)。
步骤3.粗4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧羰基氧基]苯甲酸；2,2,2-三氟乙酸(1.42g，2.22mmol，1.0eq.)和二叔丁基二碳酸酯(1.50g，6.69mmol，3eq.)在室温下溶解在DCM(24mL)和DMF(2.4mL)。在室温下，将三乙胺(0.6mL，4.45mmol，2.0eq.)添加至反应混合物中。在室温下搅拌2小时后，在真空下浓缩反应混合物。通过快速色谱(50g柱体，庚烷：EA为8：2至3：7、超过12CV，然后98％ EA、超过2CV)纯化，得到4-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸(1.17g，3.17mmol，70％纯度，定量产率)。
步骤4.在室温下、在塑料容器中，将二环己基甲烷二亚胺(158mg，0.76mmol，1.0eq.)和吡啶氢氟酸(80μL，0.83mmol，1.1eq.)添加至4-[2-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸(400mg，0.76mmol，1.0eq.)和吡啶(0.15mL，1.90mmol，2.5eq.)的DCM(4mL)混合物。室温搅拌2小时后，将0.5当量的吡啶氢氟酸，0.5当量的DCC和1当量的吡啶添加至反应混合物。室温搅拌4小时后，将0.5当量的吡啶氢氟酸，0.5当量的DCC和1当量的的吡啶添加至反应混合物。在室温下搅拌5小时后，反应混合物通过硅藻土垫来过滤并真空浓缩。通过快速色谱法(25g柱体，庚烷：EA为9:1至3:7、超过12CV)纯化，得到无色油状的2-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基]乙基(4-氟羰基苯基)碳酸酯(化合物001)(257.6mg，0.69mmol，92％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.86min，m/z＝272[m+H]+，394[m+Na]+；1H NMR(400MHz,CDCl3)d 8.05–7.99(m,2H),7.36–7.28(m,2H),4.83(br s,1H),4.40–4.32(m,2H),3.75–3.66(m,2H),3.52(t,J＝5.2Hz,2H),3.28(q,J＝5.1Hz,2H),1.38(s,9H)。
3-[4-[3-(2-氨基乙氧基)丙酰基磺酰基]苯基]丙酸(化合物002)的制备：
步骤1.在室温下，向3-(2-((叔丁氧羰基)氨基)乙氧基)丙酸(1.50g，6.24mmol，1.0eq.)的DCM(25mL)溶液中添加EDC·HCl(4.78g，24.95mmol，4.0eq.)、然后添加1羟基吡咯烷-2,5-二酮(2.87g，24.95mmol，4.0eq.)。在室温下搅拌16小时后，在C18(60g，20-80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA、超过10CV)上纯化，在冷冻干燥后得到无色油状的(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酸酯(1.77g，5.37mmol，94％ UVUV纯度，81％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.26min，m/z＝331[M+H]+，232[M-Boc+H]+，375[M+FA-H]-；1H NMR(CDCl3,400MHz):δ5.24(br s,1H),3.78(t,J＝6.1Hz,2H),3.51(t,J＝5.0Hz,2H),3.36–3.20(m,2H),2.90–2.73(m,6H),1.41(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ169.1,166.6,156.3,79.2,70.4,65.6,40.4,32.4,28.5,25.7。
步骤2.在室温下，将DIEA(0.12mL，0.67mmol，1.0eq.)添加至(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酸酯(221mg，0.67mmol，1.0eq.)和3-(4-巯基苯基)丙酸(128mg，0.67mmol，1.0eq.)的DMF(3mL)混合物中。在室温下搅拌2天后，在C18(30g，20-80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA、超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色固体的3[4[3[2(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基磺酰基]苯基]丙酸(99.6mg，0.24mmol，95％的UV纯度，36％的产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.67min，m/z＝298[M-Boc+H]+，396[M-H]-；1HNMR(CDCl3,400MHz):δ7.36(d,J＝7.9Hz,2H),7.27(d,J＝7.9Hz,2H),3.75(t,J＝6.2,2H),3.49(t,J＝5.0,2H),3.36–3.24(m,2H),2.99(t,J＝7.6,2H),2.88(t,J＝5.7,2H),2.69(t,J＝7.6,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ176.8,142.1,134.9,133.2,129.4,125.4,70.2,66.3,43.8,35.0,30.4,28.6.
步骤3.在室温下，将TFA(1mL)添加至3-[4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基磺酰基]苯基]丙酸(75.6mg，0.19mmol，1.0eq.)。反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后真空浓缩，得到白色固体的3-[4-[3-(2-氨基乙氧基)丙酰基磺酰基]苯基]丙酸(化合物002)(51.4mg，0.17mmol，98％ UV纯度，89％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝0.81min，m/z＝299[m+H]+，296[M-H]-。1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ5.14(d,J＝8.4,2H),5.12(d,J＝8.8Hz,2H),1.60(t,J＝5.8Hz,2H),1.47(t,J＝5.1Hz,2H),0.92(t,J＝4.8Hz,2H),0.78(t,J＝5.7Hz,2H),0.72(t,J＝7.4Hz,2H),0.47(t,J＝7.4Hz,2H)；13CNMR(DMSO-d6,100MHz):δ199.7,175.5,140.9,132.6,127.4,121.8,64.1,40.6,36.7,32.7,27.7.
4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基氧基]苯甲酸(化合物003)的制备：
在室温下，将4-羟基苯甲酸(65.4mg，0.47mmol，1.0eq.)添加至(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酸酯(158.1mg，0.47mmol，1.0eq.)和DBU(0.28mL，1.88mmol，4.0eq.)的DMF(1.6mL)混合物中。在室温下搅拌1小时后，在C18(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA、超过10CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色固体的4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基氧基]苯甲酸(化合物003)(9.2mg，25.0mol，96％UV纯度，5％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.46min，m/z＝254[m+H-Boc]+，352[M-H]-。
3-[4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基氧基]苯基]丙酸(化合物004)的制 备：
在室温下，将3-(4-羟基苯基)丙酸(160.5mg，0.96mmol，1.0eq.)添加至(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酸酯(322.4mg，0.96mmol，1.0eq.)和DIEA(0.17mL，0.96mmol，1.0eq.)的DMF(4mL)混合物中。在室温下搅拌16小时后，在C18(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA、超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色固体的3-[4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基氧基]苯基]丙酸(化合物004)(15.1mg，39.6mol，100％UV纯度，4％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.55min，m/z＝282[m+H-Boc]+，380[M-H]-。
3-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)硫代)丙酸(化合物005)的制备：
在室温下，将EDC.HCl(289mg，1.51mmol，3.0eq.)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(173mg，1.51mmol，3.0eq.)添加至的3-(((4-甲氧基苯基)二苯基甲基)硫代)丙酸(200mg，0.50mmol，1.0eq.)DCM(6mL)溶液中。在室温下搅拌2小时后，通过硅胶快速色谱(25g，20-80％EA的环己烷，超过12CV)纯化，在真空浓缩后得到白色固体的化合物005(202mg，0.42mmol，85％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ7.47–7.39(m,4H),7.37–7.32(m,2H),7.32–7.24(m,4H),7.24–7.17(m,2H),6.86–6.79(m,2H),3.78(s,3H),2.76(br s,4H),2.55(t,J＝7.4Hz,2H),2.42(t,J＝7.4,2H)；13C NMR(CDCl3,100MHz):δ169.0,167.2,158.3,144.7,136.5,130.8,129.5,128.1,126.9,113.4,66.7,55.3,30.6,26.2,25.6。
(4-[2-[2-[[2-[[2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸)(化合物006)的制备：
在室温下，向0.70g DOTA-三(叔丁基)酯NHS酯(0.83mmol)的3.5mL ACN溶液中添加0.88mL的DIEA(5.0mmol，6.0eq.)，然后添加0.44g的4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰基氧基]苯甲酸(0.92mmol，1.1eq.)的TFA盐，并在室温下搅拌反应混合物10分钟(立即出现固体，该固体在超声后溶解)。将溶液在3.5mL水中稀释，并通过C18柱体快速色谱(水/ACN，90/10至0/100)纯化。收集级分，真空浓缩并冷冻干燥，得到0.66g白色固体的化合物006(4-[2-[2-[[2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-1,4,7,10-四氮环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸)(纯度>95％，产率：93％)。LCMS：m/z＝824[m+H]+，413[m/2+H]+。1H NMR(DMSO)δ8.56(s,1H),7.95(d,2H),7.27(d,2H),4.31(s,2H),3.66(s,2H),3.48–3.42(m,2H),3.35–3.25(m,8H),3.00(s,2H),2.75(s,8H),2.63(s,4H),1.37(s,27H)。
化合物3-[4-[2-[2-[[2-[[2-[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-1,4,7,10- 四氮杂环十二烷-1-基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯基]丙酸(化合物007)的 制备：
步骤1.在室温下，向0.70g的3-(4-羟基苯基)丙酸(4.1mmol)的11mL甲苯溶液中添加4.6g的2-甲基丙烷-2-醇(62mmol，15eq.)，并将反应混合物加热至85℃。缓慢添加4.7mL的N,N-二甲基甲酰胺二新戊基乙缩醛(17mmol，4.0eq.)并在85℃下搅拌反应混合物6小时。添加50mL的饱和NaHCO3水溶液，并用3×10mL的EA萃取水层。合并的有机层用10mL水洗涤，并在真空下浓缩，得到0.74g的透明粉红色油状的3-(4-羟基苯基)丙酸叔丁酯，其用于下一步而无需进一步纯化(83％UV纯度，67％产率)。LCMS:m/z＝221[M-H]-。
步骤2.将0.35g的3-(4-羟基苯基)丙酸叔丁酯(1.3mmol)的11mL DCM溶液添加至0.91g化合物2(2.6mmol，2.0eq.)上，然后添加0.32g的4-(二甲基氨基)吡啶(2.6mmol，2.0eq.)。将反应混合物在室温下搅拌2小时。添加50mL水，并用3×10mL的DCM萃取水层。合并的有机层在真空下浓缩，残余物通过快速色谱(环己烷/乙酸乙酯90/10至60/40)纯化，得到0.55g无色油状的3-[4-[2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙氧羰基氧基]苯基]丙酸叔丁基酯(97％UV纯度，90％产率)。LCMS:m/z＝298[M-Boc-(t-Bu)+H]+,341[M-2(t-Bu)+H]+,354[M-Boc+H]+,397[M-(t-Bu)+H]+,476[M+Na]+。1H NMR(DMSO):δ7.27(d,2H),7.12(d,2H),6.83(t,1H),4.35–4.24(m,2H),3.65(dd,2H),3.42(t,2H),3.08(q,2H),2.81(t,2H),1.37(s,9H),1.35(s,9H)。
步骤3.在0℃下，向1.7mL TFA(22mmol，20eq.)的5.1mL DCM溶液中添加0.52g的3-[4-[2-[2-(叔丁氧基羰基氨基)乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯基]丙酸叔丁酯(1.1mmol)，并在室温下搅拌反应混合物3小时。在真空下蒸发DCM和TFA，得到0.63g无色油状的3-[4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧羰基氧基]-苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸，其用于下一步而无需进一步纯化(70％UV纯度，定量产率)。LCMS:m/z＝296[M-H]-,298[M+H]+。1H NMR(DMSO):δ7.84(s,3H),7.28(d,2H),7.12(d,2H),4.38–4.32(m,2H),3.78–3.71(m,2H),3.64(t,2H),3.01(q,2H),2.83(t,2H)。
步骤4.向0.54g的3-[4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰基氧基]苯基]丙酸；2,2,2-三氟乙酸的3,5mL乙腈溶液添加0.70g的2,2‘,2“-(10-(2-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三叔丁酯(0.83mmol)，然后添加0.88mL的N-二异丙基乙胺(5.0mmol，6.0eq.)，反应混合物在室温下搅拌10分钟。添加3.0mL水，通过C18快速色谱法(水/乙腈95/5至0/1)纯化溶液，得到0.62mg的白色固体化合物007(3-[4-[2-[2-[[4,7,10-三(2-叔丁氧基-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷基]乙酰基]氨基]乙氧基]乙氧羰基氧基]苯基]丙酸)(纯度＝98％，产率：85％)。LCMS:m/z＝342.7[(M-3(t-Bu))/2+H]+,370.8[(M-2(t-Bu))/2+H]+,398.9[(M-(t-Bu))/2+H]+,427[M/2+H]+,852[M+H]+。1H NMR(DMSO):δ8.56(t,1H),7.27(d,2H),7.10(d,2H),4.33–4.25(m,2H),3.69–3.65(m,2H),2.93(s,2H),2.85–2.70(m,10H),2.68–2.59(m,4H),1.41(s,27H)。
化合物3-(4-((3-(2-(2-(4,7,10-三(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四 氮杂环十二烷-1-基)乙酰氨基)乙氧基)丙酰基)硫代)苯基)丙酸(化合物008)的制备：
在室温下，将2-[4,10-双(2-叔丁氧基-2-氧代-乙基)-7-[2-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧代-2-氧代-乙基]-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基]乙酸叔丁酯；六氟磷酸盐(103.3mg，0.13mmol，1.0eq.)、然后DIEA(90μL，0.51mmol。4.0eq.)添加至3-[4-[3-(2-氨基乙氧基)丙酰基磺酰基]苯基]丙酸(37.7mg，0.13mmol，1.0eq.)的DMF(0.6mL)溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)进行纯化，在冷冻干燥后得到白色粉末的化合物008(3-(4-((3-(2-(2-(4,7,10-三(2-(4,7,10-三(2-(叔丁氧基)-2-氧代乙基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-基)乙酰氨基)乙氧基)丙酰基)硫代)苯基)丙酸)(64.3mg，60.4mmol，80％UV纯度，48％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.61min,m/z＝852[M+H]+,850[M-H]-。
化合物4-[2-[2-[(3’,6’-二羟基-3-氧代-螺[异苯并呋喃-1,9’-氧杂蒽]-5-基) 氨基甲酰基硫代基氨基]乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸(4-[2-[2-[(3',6'-dihydroxy- 3-oxo-spiro[isobenzofuran-1,9'-xanthene]-5-yl)carbamothioylamino]ethoxy] ethoxycarbonyloxy]benzoic acid)(化合物009)的制备：
向0.71g的4-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基羰基氧基]苯甲酸溶液；2,2,2-三氟乙酸(1.2mmol，1.2eq.)4.0mL的4.0mL ACN溶液中添加0.40g异硫氰酸荧光素酯异构体(1.0mmol)和4.0mLDMF，然后添加1,1mL N,N-二异丙基乙胺(6.0mmol，6.0eq.)。该混合物在室温下搅拌10分钟。溶剂在真空下蒸发。残留物通过C18快速色谱(水/乙腈95/5至0/1)纯化，得到橙色固体的0.38g化合物009(4-[2-[2-[(3',6'-二羟基-3-氧代-螺[异苯并呋喃-1,9'-氧杂蒽]-5-基)氨基甲酰基硫代基氨基]乙氧基]乙氧基羰基氧基]苯甲酸)(纯度：98％，产率：56％)。LCMS:m/z＝657[M-H]-,659[M+H]+。1H NMR(DMSO):δ13.07(s,1H),10.24–9.95(m,3H),8.26(s,1H),8.16(s,1H),7.98(d,2H),7.74(d,1H),7.35(d,2H),7.18(d,1H),6.67(d,2H),6.61–6.53(m,4H),4.42–4.37(m,2H),3.80–3.66(m,6H)。
2,2’,2”-(10-(1-((2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1,12,17-三氧代-2,5,8,11- 四氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸三 叔丁基酯(化合物010)的制备：
步骤1.向N-羟基琥珀酰亚胺(1.29g，11mmol)的THF(20mL)搅拌溶液中添加三(乙二醇)双(氯甲酸酯)(0.5g，1.8mmol)，并在冰浴中冷却该溶液。在10分钟内添加三乙胺(1.866mL，1.41g，11mmol)，30分钟后，使反应混合物升温至室温并搅拌过夜。反应混合物在冰浴中冷却。过滤沉淀物，用EA清洗，并用无水Na2SO4干燥。将产物溶解在10ml的THF中，无需进一步纯化即可使用。UPLC-MS(方法1)：Rt＝1.43,m/z＝433.24[M+H]+。
步骤2.向三(乙二醇)双(N-羟基琥珀酰亚胺)(0.532g，1.2mmol)的THF(16mL)溶液中分若干步骤添加2-氨基乙基-单酰胺-DOTA-三(叔丁基酯)(311.4mg，0.448mmol)，并在室温下搅拌该溶液，直到转化率达到约80％。然后，用16mL的TFA水溶液中和反应混合物，并通过HPLC纯化，得到化合物010(三叔丁基2,2',2”-(10-(1-(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)氧基)-1,12,17-三氧代-2,5,8,11-四氧杂-13,16-二氮杂十八烷-18-基)-1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酸酯)(71mg，76μmol，UV纯度91％，产率15％)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.611,m/z＝932.5[M+H]+。
二氢天冬氨酸-(维汀)2(化合物011)的制备：
在室温下，将二氢天冬氨酸(0.5mg，3.0mol，1.0eq.)的DMF(0.2mL)溶液添加至维汀(7.8mg，6.0μmol，2.0eq.)的DMF(0.2mL)溶液中，然后添加DIEA(3μL，17.7μmol，6.0eq.)。室温搅拌20分钟后，添加TFA(3μL)。在C18(12g，20至80％的ACN+0.1％的TFA水溶液+0.1％的TFA，超过10CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的化合物011(二氢天冬氨酸-(维汀)2)(5.1mg，1.8μmol，UV纯度，96％，59％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.71min,m/z＝1393[M+2H]2+,1414[M-2H+FA]2-。
化合物012的制备：
在室温下，将DIEA(85μL，0.49mmol，6.0eq.)添加至溴乙酸溶液(13.7mg，0.14mmol，1.7eq.)和DM1(60.0mg，81.3mol，1.0eq.)的DMF(0.6mL)溶液中。在室温下搅拌1小时后，将更多的溴乙酸(2.0mg，20mol，0.25eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌10分钟后，添加HATU.HPF6(34.0mg，89.4mol，1.1eq.)和1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(10.3mg，89.4mol，1.1eq.)的混合物。在室温下搅拌30分钟后，通过反相自动快速色谱C18 biotage柱(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，在冷冻干燥后得到白色粉末的化合物012(36.1mg，40.4μmol，UV纯度99％，50％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.71min,m/z＝893[M+H]+,891[M-H]-。
化合物013的制备：
H-Cit-Lys(PEG5-ma)-Tyr-OH购自昂博生物并按照以下一般方法制备：
根据固相肽合成的一般Fmoc/tBu策略，在2-CTC树脂上执行肽合成，通过二异丙基碳化二亚胺/HOBT进行羧基活化。顺序地，每个氨基酸作为活性酯偶联至肽链，从C-末端氨基酸开始。序列中的最后一个氨基酸与N-末端保护的Boc基团偶联。将Lys衍生物与由ivDde保护的侧链氨基结合，该ivDde在DMF中用2％肼除去。去除ivDde后，使用活化的酯用马来酰亚胺-PEG5-OH衍生侧链。随后，用TFA类酸解混合物(TFA-based acidolytic cocktail)处理肽，这导致其从树脂上裂解并去保护侧链基团。然后通过液相色谱(RP-HPLC)纯化肽。对经纯化的肽TFA盐进行冷冻干燥，并获得白色至灰白色粉末。
在室温下，将DIEA(11.5μL，66.0μmol，2.0eq.)添加至H-Cit-Lys(PEG5-ma)-Tyr-OH肽(29.6mg，33.0μmol，1.0eq.)和化合物012(29.5mg，33.0μmol，1.0eq.)的DMF(0.6mL)混合物中。在室温下搅拌80分钟后，添加一滴TFA。在C18 biotage柱(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上通过反相自动快速色谱纯化，在冷冻干燥后得到白色粉末的化合物013(41.4mg，23.8μmol，UV纯度96％，72％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.45min,m/z＝1673[M+H]+,1671[M-H]-。
化合物016的制备：
H-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr(tBu)-OtBu.HCl购自巴亨，并根据以下通用方法制备。将Fmoc-Cit-Osu与H-ε-叠氮基-Nle-OH偶联、以生成二肽Fmoc-Cit-ε-叠氮基-Nle-OH，然后将其与H-Tyr(tBu)-OtBu反应，以得到三肽Fmoc-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr(tBu)-OtBu。用哌啶处理三肽，以得到粗三肽。最后，纯化肽并交换盐，以得到最终肽H-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr(tBu)-OtBu。ma-PEG5-[Lys(POC)-PEG5-Arg]2-Gly-CONH2来源于昂博生物，并根据与H-Cit-Lys(PEG5-ma)-Tyr-OH相同的方法制备。
步骤1.在室温下，将TFA(1mL)添加至H-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr(tBu)-OtBu.HCl(20mg，31.2μmol，1.0eq.)。在室温下搅拌2小时后，将反应混合物真空浓缩。添加H2O(2mL)和ACN(2mL)并冷冻干燥混合物，以得到白色粉末的H-Cit-叠氮基-Nle-Tyr-OH(化合物014)(21.9mg，31.1μmol，定量产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝0.73min,m/z＝493[M+H]+,491[M-H]-。
步骤2.在室温下，将DIEA(19.5μL，0.11mmol，2.0eq.)添加至H-Cit-e-叠氮基-Nle-Tyr-OH(化合物014)(39.4mg，56.0μmol，1.0eq.)和化合物012(50mg，56.0μmol，1.0eq.)的DMF(2mL)混合物中。在室温下搅拌20分钟后，添加一滴TFA。在C18(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过8CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的化合物015(45.8mg，31.4μmol，UV纯度87％，56％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.66min,m/z＝1270[M+H]+,1268[M-H]-。
步骤3.预先装有马来酰亚胺-PEG5-(Lys(Poc)-PEG5-Arg)2-Gly-CONH2*2TFA(43.4mg，21.2μmol，1.0eq.)、碘化铜(I)(4.0mg，21.2μmol，1.0eq.)、THPTA(9.2mg，21.2μmol，1.0eq.)和化合物015(53.9mg，42.4μmol，2.0eq.)的施伦克试管用N2净化三次。将脱气DMF(2.1mL)和脱气DIEA(29.6μL，0.17mmol，8.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌1小时后，添加0.5mL0.5％TFA的ACN/H2O(1:1)溶液。在C18(30g，20至60％ACN+0.1％ TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的化合物016(47.7mg，9.3μmol，UV纯度85％，44％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.55min,m/z＝1454[M+2H]2+,1452[M-2H]2-。
BOC-HN-PEG 3 -碳酸酯-COOH(Boc-HN-PEG 3 -carbonate-COOH)(化合物017)的制备：
步骤1.在室温下，将DIEA(0.95mL，5.45mmol，4.0eq.)添加至二(2,5-二氧吡咯烷-1-基)碳酸酯(1.47g，5.45mmol，4.0eq.)和(2-(2-(2-(2-羟基乙氧基)乙氧基)乙氧基)乙基)碳酸叔丁酯(400.0mg，1.36mmol，1.0eq.)的ACN(6mL)混合物中。在室温下搅拌3小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(10-50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到无色油状的2-[2-[2-[2-(叔丁氧基碳酸羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(2-[2-[2-[2-(tert-butoxycarbonateonylamino)ethoxy]ethoxy]ethoxy]ethyl(2,5-dioxopyrrolidin-1-yl)carbonate)(206.0mg，474.2μmol，UV纯度100％，产率35％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.98min,m/z＝336[M-Boc+H]+,479[M+FA-H]-；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.03(br s,1H),4.51-4.43(m,2H),3.83-3.75(m,2H),3.69-3.61(m,10H),3.58-3.51(m,2H),3.35-3.27(m,2H),2.83(s,4H),1.44(s,9H)；13C NMR(CDCl3,400MHz)δ171.4,168.7,156.2,151.8,71.1,70.75,70.70,70.4,70.3,68.5,53.6,28.6,25.6。
步骤2.在DCM(2mL)中将2-[2-[2-[2-[2-(叔丁氧基碳酸羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙基(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(190.0mg，437.3μmol，1.0eq.)、4-羟基苯甲酸叔丁酯(88.5mg，437.3μmol，1.0eq.)和4-(二甲基氨基)吡啶(107.9mg，874.7μmol，2.0eq.)在室温搅拌1.5小时，然后真空浓缩反应混合物。在二氧化硅(25g，5-100％EtOAc的庚烷中，超过12CV)上纯化，真空浓缩后得到无色油状的4-[2-[2-[2-[2-(叔丁氧基碳酸羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸叔丁酯(161.9mg，31.5μmol，UV纯度100％，产率72％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.33min,m/z＝359[M-Boc-tBu]+,415[M-Boc]+,558[M+FA-H]-；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.04-7.98(m,2H),7.25-7.20(m,2H),4.44-4.39(m,2H),3.84-3.78(m,2H),3.73-3.67(m,4H),3.67-3.60(m,4H),3.54(t,J＝5.2Hz,2H),3.31(t,J＝5.1Hz,2H),1.58(s,9H),1.43(s,9H)；13C NMR(CDCl3,400MHz)δ165.0,156.2,154.3,153.2,131.2,129.9,120.9,81.4,70.9,70.8,70.4,68.9,68.0,28.6,28.3。
步骤3.在室温下，将三氟乙酸(0.7mL)添加至4-[2-[2-[2-[2-(叔丁氧基碳酸羰基氨基)乙氧基]乙氧基]乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸叔丁基(161.9mg，315.2μmol，1.0eq.)的DCM(0.7mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟后，将反应混合物真空浓缩，得到无色油状的4-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸(125mg，314.8μmol，UV纯度90％，产率99.9％)。该产品用于下一步而无需纯化。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.08min,m/z＝358[M+H]+,357[M-H]-。
步骤4.在室温下，将三乙胺(0.18mL，1.26mmol，4.0eq.)添加至4-[2-[2-[2-(2-氨基乙氧基)乙氧基]乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸(125.17mg，0.32mmol，1.0eq.)和二叔丁基二碳酸酯(139.00mg，0.63mmol，2.0eq.)的DMF(0.7mL)混合物。在室温下搅拌20分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在二氧化硅(在20-100％EA的庚烷中，然后在纯DCM中)上纯化，与DMF一起得到所需产物。通过制备型HPLC(20-50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到无色油状的BocHN-PEG3-碳酸酯-COOH(21.6mg，47.2μmol，UV纯度100％，产率15％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.26min,m/z＝358[M-Boc+H]+,458[M-H]-。
酸性-碳酸酯-N3(化合物018)的制备：
步骤1.将DIEA(0.3mL，1.7mmol，2.5eq.)添加至二(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)碳酸酯(373.20mg，1.4mmol，2.0eq.)和2-叠氮乙醇(60.30mg，692.5μmol，1.0eq.)的无水ACN(7mL)溶液。在室温下搅拌4.5小时后，将DMAP(169.20mg，1.4mmol，2.0eq.)和4-羟基苯甲酸叔丁酯(403.49mg，2.1mmol，3.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌25小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(30g，20至98％ACN+水中0.1％TFA+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到无色油状的4-(2-叠氮乙氧基碳酸羰基氧基)苯甲酸叔丁酯(138.00mg，426.6μmol，95％UV纯度，62％产率)。1H NMR(CDCl3,400MHz)δ7.96(d,J＝8.9Hz,2H),7.17(d,J＝8.9Hz,2H),4.34(t,J＝5.1Hz,2H),3.54(3.54Hz,J＝5.1Hz,2H),1.52Hz(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ164.8,154.0,152.8,131.1,130.0,120.7,81.4,66.9,49.5,28.2。
步骤2.在室温下，将三氟乙酸(1.5mL)添加至4-(((2-叠氮乙氧基)碳酸羰基)氧基)苯甲酸叔丁酯(138.00mg，449.1μmol，1.0eq.)的DCM(4mL)混合物中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后真空浓缩。添加水(5mL)和ACN(5mL)并冷冻干燥混合物，冷冻干燥后得到白色粉末的酸性-碳酸酯-N3(71.10mg，283.0μmol，100％UV纯度，63％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.47min,m/z＝250[M-H]-；NMR 1H(DMSO,400MHz)δ8.01(d,J＝8.7Hz,2H),7.38(d,J＝8.7Hz,2H),4.39(t,J＝8.7Hz,2H),3.68(t,J＝8.7Hz,2H)；13C NMR(DMSO,100MHz)δ166.9,154.3,152.8,131.5,129.2,129.2,121.9,67.8,49.5。
碳酸酯-PEG5-Bn-NOTA(化合物019)的制备：
步骤1.在室温下，将三氟乙酸(1mL)添加至HOOC-碳酸酯-PEG1-CO-PEG5-NH-BOC(11.00mg，20.0μmol，1.0eq.)的DCM(2mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。添加水(7.5mL)和ACN(7.5mL)并冷冻干燥混合物，冷冻干燥后得到无色油状的HOOC-碳酸酯-PEG1-CO-PEG5-NH2(16.43mg，29.3μmol，100％UV纯度，假定定量)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝0.90min,m/z＝561[M+H]+,559[M-H]-。
步骤2.将DIEA(20μL，110μmol，3.9eq.)添加至p-SCN-Bn-NOTA(18.10mg，30.0μmol，1.1eq.)和HOOC-碳酸酯-PEG1-CO-PEG5-NH2(16.43mg，29.3μmol，1.0eq.)的DMF(1.5mL)混合物中。在室温下搅拌4小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(10至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的HOOC-碳酸酯-PEG1-CO-PEG5-Bn-NOTA(14.30mg，14.1μmol，100％UV纯度，48％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.15min,m/z＝1011[M+H]+,506[M+2H]2+,1009[M-H]-。
NHS-suc-NH-VC-PAB-MMAE(化合物020)的制备：
步骤1.将HOBt(8.80mg，65.1μmol，0.5eq.)、其次是吡啶(0.3mL，3.7mmol，31.2eq.)添加至MMAE(129.00mg，176.1μmol，1.5eq.)和Fmoc-VC-PAB-OPNP(91.40mg，119.2μmol，1.0eq.)的DMF(4mL)溶液中。室温搅拌24小时后，将混合物倒入乙酸乙酯(25mL)中，并用水(20mL)洗涤两次。用乙酸乙酯(20mL)萃取水相两次。合并的有机相用10％柠檬酸(10mL)洗涤一次，用水(15mL)洗涤两次，且用盐水(15mL)洗涤一次。有机层用MgSO4干燥，过滤，真空浓缩。通过硅胶快速色谱(25g，1％甲醇的DCM，超过7CV，然后10％甲醇的DCM，超过7CV)纯化，真空浓缩后得到白色固体的Fmoc-VC-PAB-MMAE(94.50mg，70.2μmol，100％UV纯度，59％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.97min,1345[M+H]+,1389[M+FA-H]-,1165[M-Fmoc+CO2-H]-。
步骤2.将哌啶(1.0mL，10.0mmol，107.1eq.)添加至Fmoc-VC-PAB-MMAE(157.40mg，93.6μmol，1.0eq.)的ACN(4mL)溶液。在室温下搅拌12小时后，将反应混合物真空浓缩。所得残留物用DCM稀释，然后添加乙醚。过滤混合物，将滤饼溶解在DCM中，然后真空浓缩，得到黄色油状的NH2-VC-PAB-MMAE(138.70mg，102.5μmol，70％UV纯度，92％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.42min,m/z＝1123[M+H]+,1121[M-H]-。
步骤3.将二氢呋喃-2,5-二酮(15.10mg，149.4μmol，1.2eq.)、其次是DIEA(0.2mL，1.2mmol，9.3eq.)添加至在NH2-VC-PAB-MMAE(138.70mg，123.5μmol，1.0eq.)的DMF(5mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(20-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的suc-NH-VCVC-PAB-MMAE(100.00mg，81.7μmol，100％UV纯度，66％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.56min,m/z＝1223[M+H]+,1221[M-H]-。
步骤4.在室温下，将DIEA(56.6μL，326.9μmol，4.0eq.)添加至suc-NH-VC-PAB-MMAE(100.00mg，81.7μmol，1.0eq.)和HATU(31.08mg，81.7μmol，1.0eq.)的DMF(4mL)混合物中。在室温下搅拌5分钟后，将1-羟基吡咯烷-2,5-二酮(9.41mg，81.7μmol，1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(20-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的NHS-suc-NH-VC-PAB-MMAE(93.70mg，66.7μmol，94％UV纯度，82％产率)。UPLC-MS(方法5)：1.60min,m/z＝1320[M+H]+,1364[M+FA-H]-。
DBCO-NH-suc-NH-VC-PAB-MMAE(化合物021)的制备：
H2N-VC-PAB-MMAE(49.3mg，40.0μmol，1.0eq.)和DBCO-NHS酯(18.00mg，40.0μmol，1.0eq.)在DCM(1.2mL)中稀释。添加DIEA(30μL，180.0μmol，4.1eq.)并在室温下搅拌反应混合物2小时，然后在氮气流下浓缩并在真空下干燥30分钟。通过制备型HPLC(30-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到DBCO-NH-suc-NH-VC-PAB-MMAE(68.00mg，40.9μmol，85％UV纯度，93％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝2.18min,m/z＝1412[M+H]+。
酸性-PEG1-VC-PAB-MMAE(化合物022)的制备：
步骤1.将H2N-VC-PAB-MMAE(105.93mg，90.0μmol，1.05eq.)和3-(3-(叔丁氧基)-3-氧代丙氧基)丙酸(20.0mg，90.0μmol，1.0eq.)用DMF(1mL)稀释。在室温下，添加DIEA(60μL，360μmol，4.0eq.)，随后添加HATU(51.22mg，130μmol，1.5eq.)。在室温下搅拌30分钟后，用水稀释反应混合物。通过过滤收集所得沉淀物。通过制备型HPLC(30-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色固体的tBuOOC-PEG1-VC-PAB-MMAE(87mg，64.1μmol，98％UV纯度，71％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝2.12min,m/z＝1324[M+H]+,1322[M-H]-。
步骤2.将三氟乙酸(0.25mL)添加至tBuOOC-PEG1-VC-PAB-MMAE(78.00mg，60.0μmol，1.0eq.)的DCM(0.5mL)溶液中。在室温下搅拌35分钟后，将反应混合物真空浓缩。在C18(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)上纯化，冷冻干燥后得到白色固体的酸性-PEG1-VC-PAB-MMAE(42.00mg，31.3μmol，95％UV纯度，53％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.85min,m/z＝1268[M+H]+,1266[M-H]-。
多(DM1)2-PEG15(化合物024)的制备：
步骤1.将预先装有碘化铜(I)(5.98mg，31.4μmol，1.0eq.)、THPTA(13.63mg，31.4μmol，1.0eq.)、ma-PEG5-(Lys(Poc)-PEG5-Arg)-(Lys(Poc)-PEG15-Arg)-Gly-CONH2*2TFA(80.0mg，31.4μmol，1.0eq.)和H-Cit-ε-叠氮基-Nle-Tyr-OH(54.22mg，62.7μmol，2.0eq.)的施伦克试管用N2净化三次，然后将脱气的DMF(2mL)添加至反应混合物。在室温下搅拌16小时后，添加ACN/水/TFA的混合物(1:1:0.5％，1mL)。通过制备型HPLC(5-50％的ACN+0.1％的TFA水溶液+0.1％的TFA)纯化，冷冻干燥后得到黄色粉末的化合物023(75.4mg，20.9μmol，98％的UV纯度，67％的产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.44min,m/z＝1769[M+2H]2+,1767[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将DIEA(7.7μl，44.4μmol，8.0eq.)添加至化合物023(20.0mg，5.5μmol，1.0eq.)和化合物012(12.38mg，11.1μmol，2.0eq.)的DMF(0.5mL)混合物中。在室温下搅拌2小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，在冷冻干燥后得到白色粉末的化合物024(8.50mg，1.7μmol，99％UV纯度，30％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.45min,m/z＝1698[M+3H]3+,1696[M-3H]3-。
多-(DM1)-K(PEG24)-(DM1)(化合物026)的制备：
在室温下,将DIEA(1.3μL，7.20μmol，4.0eq.)添加至化合物025(5.0mg，1.8μmol，1.0eq.)和化合物012(3.39mg，3.6μmol，2.0eq.)的DMF(0.2mL)混合物中。在室温下搅拌1.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％的ACN+0.1％的TFA水溶液+0.1％的TFA)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的化合物026(5.10mg，1.10mol，97％的UV纯度，63％的产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.59min,m/z＝1064[M+4H]4+。
PNU-OPFP(化合物027)的制备：
在室温下，将五滴TEA添加至PNU-159682(85.0mg，132.5μmol，1.0eq.)和双(全氟苯基)碳酸酯(242.2mg，59.6μmol，4.5eq.)的DCM(1.7mL)和THF(1.7mL)混合物中。在室温下搅拌1小时后，在室温下向反应混合物中添加四滴TFA。将反应混合物真空浓缩(30℃浴)。将残留物溶解在DMF(6mL)中，然后通过制备型HPLC(水中40-100％的ACN)纯化，冷冻干燥后得到橙色粉末的PNU-OPFP(化合物027)(87.2mg，102.4μmol，100％UV纯度，77％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝2.39min,m/z＝852[M+H]+,850[M-H]-。
实施例5：含DOTA-碳酸酯的反应性偶联物的制备
通过将化合物006或007偶联至相应Fc-结合载体侧链的氨基，将实施例1中制备的Fc-结合载体转化为式(1)的反应性偶联物。化合物D1K-DOTA的合成在下面的方案中示出。其他DOTA-碳酸酯-肽偶联物以类似的方式制备。实施例5中制备的含DOTA的反应性偶联物的结构如下表所示。
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*-由D个氨基酸组成的序列
表5：含DOTA的反应性偶联物的结构
为了制备表5中列出的反应性偶联物，将碳酸酯衍生物(1.5eq.；化合物006或007)的DMF溶液添加至HATU.HPF6(1.4eq.)并搅拌1分钟，随后添加DIEA(2eq.)。3分钟后，将预活化的碳酸酯衍生物添加至Fc-结合载体中，并在室温下搅拌反应混合物1至4小时。通过UPLC-MS监测反应的完成。如果反应没有完成，则添加额外量的预活化碳酸酯衍生物(约1eq.)，并将混合物进一步搅拌1至2小时。反应行偶联物用冷乙醚沉淀。
随后，通过在室温下用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，v/v/v)处理1-3小时来去除DOTA部分的叔丁基保护基团，随后用冷乙醚沉淀。
肽反应性偶联物通过制备型反相HPLC、在C18柱(/>5μm，150x10.0mm；Phenomenex Helvetia)上、使用溶剂系统A(水中0.1％TFA)和使用溶剂系统B(ACN中0.1％TFA)、以8mL/min的流速、25min内15-55％的B梯度范围来纯化。在214nm的波长下监测肽洗脱。冷冻干燥前通过UPLC-MS分析合适的级分。
反应性偶联物的纯度通过UPLC-MS测定(如上所述)。结果如下表所示。
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*-由D个氨基酸组成的序列
表6：反应性偶联物的表征
实施例6：含FITC-碳酸酯反应性偶联物的制备
通过将化合物009偶联至相应Fc-结合配体侧链的氨基，将实施例1中制备的Fc-结合载体转化为式(1)的反应性偶联物。化合物H5Dab-FITC的合成在下面的方案中示出。其他FITC-碳酸酯-肽偶联物以类似的方式制备。下表示出了含FITC的反应性偶联物。
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表7：含FITC-碳酸酯的反应性偶联物的结构
为了制备反应性偶联物，将化合物009(1.4eq.)的DMF溶液添加至HATU.HPF6(1.3eq.)并搅拌1分钟，随后添加DIEA(1.5eq.)。3分钟后，将预活化的碳酸酯衍生物添加至Fc-结合载体中(Fc-结合载体在反应混合物中的最终浓度为20-70mg/ml)，并在室温下搅拌反应混合物1-4小时。通过UPLC-MS监测反应的完成。如果反应未完成，则添加额外量的通过将化合物009与HATU.HPF6(0.9eq.)和DIEA(1.1eq.)的DMF溶液混合而制备的预活化的化合物009(约1eq.)，并将混合物进一步搅拌1至2小时。如实施例5所述，用冷乙醚沉淀反应性偶联物并通过HPLC纯化。
反应性偶联物的纯度通过UPLC-MS测定(如上所述)。结果如下表所示。
表8：FITC反应性偶联物的表征
实施例7：含其它有效载荷碳酸酯活性偶联物的制备
通过将不同有效载荷(DTPA、PCTA、NODA-GA、Bn-NOTA、DOTA-GA、DFO、FITC、FAM、TZ、TCO、N3、DBCO、BCN、马来酰亚胺、DM1、DM4、维汀)偶联至相应Fc-结合载体侧链的氨基上，将实施例1中制备的Fc-结合载体转化为反应性偶联物。在下表中示出了在实施例7中制备的含这些有效载荷的反应性偶联物的结构。
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§-FAM为5-FAM和6-FAM区域异构体的混合物
表9：含其它有效载荷碳酸酯的反应性偶联物的结构
L6Orn-碳酸酯-NH2的制备：
步骤1.在室温下，将2-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]乙基(4-氟羰基苯基)碳酸酯(71mg，0.19mmol，2.0eq.)的DMF溶液(储备溶液1mg/40μl)添加至L6Orn-NH2(150mg，1.0eq.)。在室温下搅拌1分钟后，将DIEA(30μL，0.19mmol，2.0eq.)添加至反应混合物中。在室温下搅拌10分钟后，将反应混合物真空浓缩。通过制备型HPLC(5％至95％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA，超过24min)纯化，得到L6Orn-碳酸酯-NHBoc(117mg，61μmol，90％UV纯度，57％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.48min,m/z＝962[M+2H]2+,960[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将TFA(2.1mL)添加至L6Orn-碳酸酯-NHBoc(117mg，61μmol，1.0eq.)。在室温下搅拌5分钟后，将反应混合物真空浓缩。将残留物溶解在ACN(2mL升)和H2O(2mL)的混合物中并冷冻干燥，得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-NH2(131mg，90％UV纯度)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.77min,m/z＝913[M+2H]2+,911[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-二氨基二甲苯的制备：
步骤1.在室温下，将HATU.HPF6(8.1mg，21.4μmol，1.3eq.)添加至DIEA(11.5μL，65.8μmol，4.0eq)和3,5-双-(((叔丁氧羰基)氨基)甲基)苯甲酸(9.9mg，24.7μmol，1.5eq.)的DMF(0.6mL)溶液中。在室温下搅拌7分钟后，将L6Orn-碳酸酯-NH2(30.0mg，16.4μmol，1.0eq.)添加至反应混合物中。在室温下搅拌55分钟后，逐滴添加TFA，直到达到酸性pH。在C18 biotage柱(30g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上通过反相自动快速色谱法纯化，得到白色冻干物的L6Orn-碳酸酯-二(boc-氨基)二甲苯(16.7mg，7.6μmol，46％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.99min,m/z＝1043[M-Boc+2H]2+,1091[M-2H]2-。
步骤2.将TFA(2mL)添加至在L6Orn-碳酸酯-二(boc-氨基)二甲苯(16.7mg，7.6μmol，1.0eq)的DCM(2mL)溶液中。在室温下搅拌12分钟后，在真空下浓缩反应混合物。添加ACN/H2O混合物(1:1，18mL)，并且将混合物冷冻干燥，以得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-二氨基二甲苯(19.3mg，7.6μmol，UV纯度78％，产率99％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.79min,m/z＝662[M+3H]3+,992[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-S-Mmt的制备：
在室温下，将DIEA(21μL，123μmol，4.0eq.)添加至化合物005(14.6mg，30.7μmol，1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(81.1mg，30.7μmol，1.0eq.)的DMF(1.6mL)混合物中。在室温下搅拌2小时后，向反应混合物中添加更多的DIEA(10μL，61μmol，2.0eq)。在室温下搅拌3小时后，向反应混合物中添加更多的化合物005(7.3mg，15.4μmol，0.5eq)。在室温下搅拌30分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过反相制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色固体的L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(43.7mg，19.0μmol，UV纯度95％，62％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.13min,m/z＝1104[M+H+Na]2+,1090[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-PEG5-NH2的制备：
步骤1.将EDC.HCl(84.20mg，493.2μmol，2.7eq.)、其次是N-羟基琥珀酰亚胺(50.50mg，438.8μmol，2.7eq.)添加至Boc-NH-PEG5-COOH(66.00mg，161.2mmol，1.0eq.)的DCM(1.5mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌2小时，然后真空浓缩。通过制备型HPLC(10至70％ ACN+0.1％ TFA水溶液+0.1％ TFA)纯化，冷冻干燥后得到无色油状的Boc-NH-PEG5-OSu(65.20mg,128.7μmol,100％ UV纯度，80％产率)。UPLC-MS(方法：3)：Rt＝1.43min,m/z＝451[M-(tBu)+H]+,408[M-Boc+H]+,505[M-H]-,551[M+FA-H]-；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ5.04(br s,1H),3.84(t,J＝6.5Hz,2H),3.65-3.59(m,16H),3.53(t,2H),3.30(brs,2H),2.90(t,J＝6.5Hz,2H),2.83(br s,4H),1.44(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ169.3,167.0,156.4,79.6,71.0,70.98,70.93,70.91,70.86,70.84,70.60,70.55,66.0,32.5,28.8,25.9。
步骤2.将DIEA(54μL，314.4μmol，2.0eq.)添加至在DMF(1.4mL)中的Boc-NH-PEG5-OSu(65.20mg，159.2μmol，1.0eq.)和4-(((2-(2-氨基乙氧基)乙氧基)碳酸酯基)氧基)苯甲酸(42.60mg，158.2μmol，1.0eq.)的溶液。在室温下搅拌3小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-70％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到无色油状的HOOC-碳酸酯-PEG1-CO-PEG5-NH-Boc(59.00mg，89.3μmol，100％UV纯度，56％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.45,m/z＝661[M+H]+,561[M-Boc+H]+,659[M-H]-；1H NMR(CDCl3,400MHz)δ8.06(d,J＝8.7Hz,2H),7.22(d,J＝8.7Hz,2H),6.86(br s,1H),5.07(br s,1H),4.36-4.34(m,2H),3.71-3.69(m,2H),3.67(t,J＝5.8Hz,2H),3.58-3.53(m,18H),3.47(t,J＝5.2Hz,2H),3.42(q,J＝5.4Hz,2H),2.44(t,J＝5.8Hz,2H),1.37(s,9H)；13C NMR(CDCl3,100MHz)δ172.5,169.0,154.7,153.0,131.8,127.8,121.0,79.3,70.54,70.51,70.48,70.32,70.23,69.73,68.49,67.78,67.1,39.3,36.6,28.4。
步骤3.在室温下，将HATU.HPF6(10.74mg，28.2μmol，1.1eq.)、其次是DIEA(20μL，114.8μmol，4.5eq.)添加至HOOC-碳酸酯-PEG1-CO-PEG5-NH-Boc(20.37mg，30.8μmol，1.2eq.)的DMF(0.9mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将L6Orn(40.44mg，25.7mmol，1.0eq.)和DIEA(20μL，114.8μmol，4.5eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌2小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-PEG5-NH-Boc(33.10mg，13.4μmol，90％UV纯度，52％产率)。UPLC-MS(方法：5)：Rt＝1.30min,m/z＝1058[M-Boc+2H]2+,706[M-Boc+3H]3+,1106[M-2H]2-。
步骤4.在室温下，将TFA(1mL)添加至L6Orn-碳酸酯-PEG5-NH-Boc(33.10mg，14.9μmol，1.0eq.)的溶液DCM(2mL)中。将反应混合物在室温下搅拌30分钟，然后真空浓缩。添加水(7.5mL)和ACN(7.5mL)并冷冻干燥混合物，以得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-PEG5-NH2(40.00mg，14.2μmol，100％UV纯度，95％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.03,m/z＝1824[M+H]+,912[M+2H]2+,1822[M-H]-,910[M-2H]2-。
PEG20-L6Orn-碳酸酯-NH2的制备：
步骤1.在室温下，将HATU(3.97mg，10.5μmol，1.1eq.)、其次是DIEA(10μL，57.0μmol，6.0eq.)添加至4-[2-[2-(叔丁氧基碳酸羰基氨基)乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸(4.21mg，11.4μmol，1.2eq.)的DMF(0.8mL)溶液中。室温搅拌5分钟后，将PEG20-L6Orn(24.0mg，9.5μmol，1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的PEG20-L6Orn-碳酸酯-NHBoc(19.2mg，6.6μmol，99％UV纯度，70％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.44min,m/z＝1439[M+2H]2+,1437[M-2H]2-。
步骤2.将三氟乙酸(1mL)添加至PEG20-L6Orn-碳酸酯-NHBoc(19.2mg，6.6μmol，1.0eq.)的DCM(1mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟后，将反应混合物真空浓缩。添加ACN/水的混合物(10mL，1:1)，并将混合物冷冻干燥，以得到白色粉末的PEG20-L6Orn-碳酸酯-NH2(20.1mg，6.6μmol，100％UV纯度，定量)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.92min,m/z＝1389[M+2H]2+,1387[M-2H]2-。
PEG24-L6Orn-碳酸酯-NH2的制备：
步骤1.将2-(2-氨基乙氧基)乙基(4-氟羰基苯基)碳酸酯(14.4mg，38.7μmol，2.0eq.)和DIEA(19.0μL，38.1μmol，2.0eq.)添加至PEG24-L6Orn(50.9mg，19.0μmol，1.0eq.)的0.4mL DMF溶液中。在室温下搅拌4小时后，用9.0mL冷醚沉淀反应混合物。UPLC-MS(方法：2)：Rt＝2.82min,m/z＝1514[M+2H]2+。
步骤2.在室温下，将TFA/TIS/H2O(570/15/15μL)添加至PEG24-L6Orn-碳酸酯-NHBoc(57.6mg，19.0μmol，1.0eq.)沉淀物(pellet)中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后用5.4mL冷醚沉淀。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.39,m/z＝976[M+3H]3+。
PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NH2的制备：
步骤1.在室温下，将HATU(17.49mg，46.0μmol，1.1eq.)、其次是DIEA(29μL，167.3μmol，4.0eq.)添加至BocHN-PEG3-碳酸酯-COOH(28.7mg，50.2μmol，1.2eq.)的DMF(4ml)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将PEG24-L6Orn(110.0mg，41.8μmol，1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(20-60％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)进行纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NHBoc(108.0mg，33.8μmol，96％UV纯度，81％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.42min,m/z＝1533[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将三氟乙酸(1.6mL)添加至在PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NHBoc(108.0mg，33.8μmol，1.0eq.)的DCM(1.6mL)溶液中。在室温下搅拌15分钟后，将反应混合物真空浓缩。添加ACN/水的混合物(12mL，1:1)，然后将混合物冷冻干燥，以得到白色粉末的PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NH2(117.2mg，33.5μmol，93％UV纯度，定量)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.19min,m/z＝1485[M+2H]2+,1483[M-2H]2-。
L6Orn(-碳酸酯-NH2)-PEG24的制备:
步骤1.在室温下，将HATU(3.79mg，10.0μmol，1.1eq.)、其次是DIEA(9.5μL，54.4μmol，6.0eq.)添加至在4-[2-[2-(叔丁氧基碳酸羰基氨基)乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸(4.00mg，10.9μmol，1.2eq.)的DMF(0.8mL)溶液中。室温搅拌5分钟后，将L6Orn-PEG24(25.0mg，9.1μmol，1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5至100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn(-碳酸酯-NHBoc)-PEG24(21.8mg，6.9μmol，100％UV纯度，77％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.45min,m/z＝1555[M+2H]2+,1553[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将三氟乙酸(1mL)添加至L6Orn(-碳酸酯-NHBoc)-PEG24(21.8mg，6.9μmol，1.0eq)的DCM(1mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟后，将反应混合物真空浓缩。添加ACN/水的混合物(10mL，1:1)，并将混合物冷冻干燥，以得到白色粉末的L6Orn(-碳酸酯-NH2)-PEG24(22.0mg，6.9μmol，100％UV纯度，定量)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.95min,m/z＝1506[M+2H]2+,1504[M-2H]2-。
RGNCAYHK(NHS-N3)GQIIWCTYH的制备：
步骤1.在室温下，将DIEA(3.9μL，22.3μmol，1.9eq.)添加至2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐溶液(2.2mg，16.0μmol，1.4eq.)，随后添加在0.235mL的RGNCAYHKGQIIWCTYH(24.5mg，11.7μmol，1.0eq.)的DMSO。反应在室温下搅拌2小时30分钟，该产物而无需进一步纯化即可使用。UPLC-MS(方法2)：Rt＝1.94min,m/z＝1096.3[M+2H]2+。
步骤2.将N-羟基马来酰亚胺(3.6mg，32.0μmol，2.8eq.)添加至RGNCAYHK(SH)GQIIWCTYH(25.5mg，11.7μmol，1.0eq.)的DMSO(0.255mL)溶液中，并在室温下搅拌1小时。通过制备型HPLC(12-32％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色固体的RGNCAYHK(SuOH)GQIIWCTYH(11.5mg，5.0μmol，99％UV纯度，43％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝1.91min,m/z＝1152.8[M+2H]2+。
步骤3.在室温下，将6-Cl-HOBt(4.4mg，3.3μmol，1.0eq)、其次是EDCl(5.6μL，3.3μmol，1.0eq.)添加至4-叠氮苯甲酸(0.64mg，3.9μmol，1.2eq.)的DMF(20μL)溶液中。在室温下搅拌1分钟后，将RGNCAYHK(SuOH)GQIIWCTYH(7.5mg，3.3μmol，1.0eq.)的DMF(0.16mL)溶液添加至反应混合物。反应在室温下搅拌4小时，产生RGNCAYHK(NHS-N3)GQIIWCTYH形成物，其无需进一步纯化即可使用。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.25min,m/z＝1225[M+2H]2+。
RGNCAYHK(碳酸酯-N3)GQIIWCTYH的制备：
在室温下，将HATU(1.5mg，4.0μmol，1.4eq)、其次是DIEA(14.4μL，28.7μmol，10.0eq.)添加至化合物018(1.17mg，4.7μmol，1.5eq.)的DMF(21.5μL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将RGNCAYHKGQIIWCTYH(6mg，2.9μmol，1.0eq.)的DMF(0.3mL)添加至反应混合物。反应在室温下搅拌4小时。使用RGNCAYHK(碳酸酯-N3)GQIIWCTYH而无需进一步纯化。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.25min,m/z＝1162[M+2H]2+。
RGNCAYHOrn(NHS-N3)GQIIWCTYH的制备：
步骤1.在室温下，将DIEA(3.4μL，19.6μmol，2.3eq.)添加至2-亚氨基硫杂环戊烷盐酸盐(1.8mg，13.1μmol，1.5eq.)的溶液中，随后添加0.16mL的RGNCAYHOrnGQIIWCTYH(18.1mg，8.7μmol，1.0eq.)的DMSO溶液。反应在室温下搅拌2小时，产物无需进一步纯化即可使用。UPLC-MS(方法2)：Rt＝1.90min,m/z＝1088.8[M+2H]2+。
步骤2.在室温下，将N-羟基马来酰亚胺(3.9mg,34.2μmol,3.9eq.)添加至RGNCAYHOrn(SH)GQIIWCTYH(19.1mg,8.7μmol,1.0eq.)的DMSO(0.19mL)溶液中，并搅拌1小时通过制备型HPLC(16-26％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色固体的RGNCAYHOrn(SuOH)GQIIWCTYH(7.1mg，3.1μmol，99％UV纯度，36％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝1.87min,m/z＝1145.4[M+2H]2+。
步骤3.在室温下，将6-Cl-HOBt(0.3mg,2.1μmol,1.0eq)、其次是EDCl(0.4μL,2.1μmol,1.0eq.)添加至4-叠氮苯甲酸(0.4mg,2.5μmol,1.2eq.)的DMF(13μL)溶液中。在室温下搅拌1分钟后，将RGNCAYHOrn(SuOH)GQIIWCTYH(4.8mg,2.1μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液添加至反应混合物。反应在室温下搅拌4小时，产生RGNCAYHOrn(NHS-N3)GQIIWCTYH形成物，其无需进一步纯化即可使用。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.25min,m/z＝1218.9[M+2H]2+。
RGNCAYHK(碳酸酯-NH2)GQIIWCTYH的制备：
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步骤1.将2-(2-氨基乙氧基)乙基(4-氟羰基苯基)碳酸酯(5.1mg,13.7μmol,1.9eq.)和DIEA(12.7μL,25.4μmol,3.5eq.)添加至RGNCAYHKGQIIWCTYH(17.5mg,7.2μmol,1.0eq.)溶液中。在室温下搅拌5小时后，用4.7mL冷醚沉淀反应混合物。UPLC-MS(方法：2)：Rt＝2.29min,m/z＝1221.2[M+2H]2+。
步骤2.在室温下，将TFA/TIS/H2O(190/5/5μL)添加至RGNCAYHK(碳酸酯-NHBoc)GQIIWCTYH(33.10mg,7.2μmol,1.0eq.)的沉淀物。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后用1.8mL冷醚沉淀。UPLC-MS(方法2)：Rt＝1.90,m/z＝1170.8[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-DTPA的制备：
在室温下，将p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA.3HCl(19.1mg,27.2μmol,1.0eq)添加至L6Orn-碳酸酯-NH2(49.6mg,27.2μmol,1.0eq.)和TEA(22μL,160mmol,6.0eq.)的DMF(0.4mL)溶液中。在室温下搅拌3小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18 biotage柱(30g，25至60％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上通过反相型自动快速色谱法纯化，得到L6Orn-碳酸酯-DTPA(45.2mg，10.6μmol，90％UV纯度，62％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.11min,m/z＝1210[M+2H]2+,1208[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-PCTA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至p-SCN-Bn-PCTA.3HCl(1.75mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，将TFA(4μL)添加至反应混合物。在C18上通过制备型HPLC(24至36％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，得到L6Orn-碳酸酯-PCTA(2.26mg，0.96μmol，96％UV纯度，34％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.46min,m/z＝1176.4[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-NODA-GA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至NODA-GA-NHS酯.TFA.HPF6(1.97mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌3.5小时后，在室温下将NODA-GA-NHS酯.TFA.HPF6(1.97mg,2.7μmol,1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌1小时后，将TFA(4μL)添加至反应混合物。在C18上通过制备型HPLC(21至33％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，得到L6Orn-碳酸酯-NODA-GA(1.44mg，0.66μmol，87％UV纯度，21％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.303min,m/z＝1091.4[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-Bn-NOTA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,11.0μmol,4.0eq.)添加至p-SCN-Bn-NOTA(1.53mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％的ACN+0.1％TFA水溶液+10.1％的TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-NOTA(4.2mg，1.8μmol，UV纯度100％，67％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.12min,m/z＝1138[M+2H]2+,1136[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-DOTA-GA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,11.0μmol,4.0eq.)添加至DOTA-GA(OtBu)4(2.1mg,3.0μmol,1.1eq.)和HATU.HPF6(1.15mg,3.0μmol,1.1eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，在室温下将反应混合物添加至L6Orn-碳酸酯NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌20分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％的TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-DOTA-GA(OtBu)4(4.1mg，1.6μmol，UV纯度99％，59％产率)。将后一种化合物溶解在DCM(0.5mL)和TFA(0.5mL)中并在室温下搅拌。在室温下搅拌21小时后，将反应混合物真空浓缩，然后在C18(12g，20-50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过10CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-DOTA-GA(0.7mg，0.2μmol，UV纯度74％，14％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.85min,m/z＝761[M+3H]3+,1140[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-DFO的制备：
在室温下，向L6Orn-碳酸酯-NH2(8.0mg,4.4μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中添加DFO-SCN(3.3mg,4.4μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(6.1μL,35.1μmol,8.0eq.)。在室温下搅拌2.5小时后，添加DIEA(3.0μL,17.5μmol,4.0eq.)。在室温下搅拌45分钟后，添加5滴0.1％TFA水溶液，并在室温下搅拌反应混合物5分钟。通过制备型HPLC(5至100％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-DFO(2.0mg，0.6μmol，80％UV纯度，14％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.27min,m/z＝860[M+3H]3+,1287[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-三唑-dbco-DFO的制备：
在室温下，将DBCO-DFO(2.13mg,2.5μmol,1.0eq.)添加至L6Orn-碳酸酯-N3(4.8mg,2.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌50分钟后，将更多的L6Orn-碳酸酯-N3(0.5mg,0.1eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌1.5小时后，将L6Orn-碳酸酯-N3(0.5mg,0.1eq.)添加至反应混合物中。在室温下搅拌3.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20-80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-三唑-dbco-DFO(0.9mg，0.3μmol，UV纯度84％，产率11％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.34min,m/z＝919[M+3H]3+,1376[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-S-马来酰亚胺-DFO的制备：
将脱气的TFA(4μL)和DCM(196μL)混合物添加至L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(3.0mg,1.4μmol,1.0eq.)溶液。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加ma-DFO(1.46mg,2.1μmol,1.5eq.)、其次是DIEA(3.6μL,20.6μmol,15eq.)。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过反相制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-S-马来酰亚胺-DFO(1.3mg，0.5μmol，UV纯度98％，产率35％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.11min,m/z＝1313[M+2H]2+,1311[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-FAM的制备：
在室温下，将HATU.HPF6(5.58μL,3.02μmol,1.1eq.)添加至5(6)-羧基荧光素(FAM)(1.24mg,3.3μmol,1.2eq.)的溶液中并搅拌1分钟，随后添加DIEA(1.64μL,3.3μmol,1.2eq.)。在室温下搅拌3分钟后，将L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(50μL)溶液添加至反应混合物，并在室温下搅拌2h。通过UPLC-MS监测反应的完成。在C18上通过制备型HPLC(26至38％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，在冷冻干燥后得到黄色粉末的L6Orn-碳酸酯-FAM(0.5mg，0.23μmol，96％UV纯度，8％产率)。UPLC-MS(方法1)：Rt＝1.9min,m/z＝1091.61[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-TZ的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,11.0μmol,4.0eq.)添加至L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)和TZ-PEG5-NHS酯(1.66mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌2小时后，将更多的TZ-PEG5-NHS酯(1.66mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(50μL)溶液添加至反应混合物。在室温下搅拌3小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18 biotage柱上通过反相自动快速色谱(12g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)纯化，冷冻干燥后得到淡粉色粉末的L6Orn-碳酸酯-Tz(6.2mg，2.4μmol，UV纯度91％，89％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.29min,m/z＝1157[M+2H]2+,1155[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-TCO的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至TCO-NHS酯(0.72mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，将TFA(4μL)添加至反应混合物。在C18(12g，10至50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-TCO(2.8mg，1.10μmol，UV纯度80％，41％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.75min,m/z＝988[M+2H]2+,986[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-N3的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至(2,5-二氧代吡咯烷-1-基)2-叠氮基乙酸酯(0.53mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌3小时后，将TFA(4μL)添加至反应混合物。在C18 biotage柱上通过反相自动快速色谱(12g，10至50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-N3(2.7mg，1.3μmol，UV纯度94％，49％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.16min,m/z＝954[M+2H]2+,952[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-DBCO的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至DBCO-NHS酯(1.12mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，将TFA(4μL)添加至反应混合物。在C18(32至44％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-DBCO(2.27mg，1.07μmol，UV纯度97％，38％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.79min,m/z＝1056[M+2H]2+,1055[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-BCN的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至BCN-NHS酯(0.83mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌2.5小时后，将TFA(4μL)添加至反应混合物。在C18(34-46％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-BCN(2.03mg，1.01μmol，UV纯度95％，35％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.903min,m/z＝1000.8[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-马来酰亚胺的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2h-吡咯-1(5h)-基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(1.2mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.1mL)溶液中。在室温下搅拌2小时后，将更多的2,5-二氧代吡咯烷-1-基3-(2-(2-(3-(2,5-二氧代-2h-吡咯-1(5h)基)丙酰胺基)乙氧基)乙氧基)丙酸酯(1.2mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(50μL)溶液添加至反应混合物。在室温下搅拌3小时后，将TFA(4mL)添加至反应混合物。在C18(12g，10至50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-马来酰亚胺(1.6mg，0.7μmol，UV纯度91％，产率25％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.07min,m/z＝1067[M+2H]2+,1065[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-MCC-DM1的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,10.8μmol,4.0eq.)添加至DM1-SMCC(2.79mg,2.7μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.2mL)溶液中。在室温下搅拌70分钟后，将TFA(4mL)添加至反应混合物。在C18 biotage柱上通过反相自动快速色谱(12g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-MCC-DM1(5.23mg，1.80μmol，UV纯度96％，69％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.80min,1390[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-SPDB-DM4的制备：
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(4.28mg,5.5μmol,1.0eq.)和SPDB(0.89mg,2.7μmol,0.5eq.)的DMA(0.75mL)混合物。在室温下搅拌110分钟后，在室温下将SPDB(0.89mg,2.7μmol,0.5eq.)的DMA(0.2mL)溶液添加至反应混合物。在室温下搅拌10分钟后，在室温下将反应混合物添加至L6Orn-碳酸酯-NH2(10.0mg,5.5μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(30g，20至80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％的TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色产物L6Orn-碳酸酯-SPDB-DM4(10.7mg，3.9μmol，UV纯度99％，产率71％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.99min,m/z＝1351[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-二氨基二甲苯(-SPDB-DM4)2的制备：
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(3.93mg,5.0μmol,2.0eq.)和SPDB(1.64mg,5.0μmol,2.0eq.)的DMA(0.75mL)混合物中。在室温下搅拌5分钟后，在室温下将反应混合物添加至L6Orn-碳酸酯-二氨基二甲苯(5.0mg，肽含量50％，1.25μmol，0.5eq.)。在室温下搅拌2小时后，将更多的L6Orn-碳酸酯-二氨基二甲苯(5.0mg，肽含量50％，1.25mmol，0.5eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌40分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(30g，20-80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色产物L6Orn-碳酸酯-(SPDB-DM4)2(2.0mg，0.5mmol，UV纯度87％，18％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.49min,m/z＝1873[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-维汀的制备：
将脱气的TFA(20μL)和DCM(80μL)混合物添加至L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(8.0mg,3.6μmol,1.2eq.)溶液。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加维汀(4.0mg,3.0μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(37μL,0.21μmol,70eq.)。在室温下搅拌20分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18 biotage柱上通过反相自动快速色谱法(12g，20-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过13CV)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-维汀(6.0mg，1.7mol，UV纯度94％，57％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.01min,m/z＝1077[M+3H]3+,1613[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-(维汀)2的制备：
在室温下，将HATU.HPF6(0.61mg,1.6μmol,1.1eq.)和DIEA(1.0mL,5.9μmol,4.0eq.)添加至二氢天冬氨酸-(维汀)2(5.1mg,1.8μmol,1.2eq.)的DMF(0.2mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将反应混合物添加至L6Orn-碳酸酯-NH2(4.46mg,1.5μmol,1.0eq.)中。在室温下搅拌30分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18 biotage柱上通过反相自动快速色谱法(12g，20至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA，超过12CV)纯化，得到白色冻干物的L6Orn-碳酸酯-(维汀)2(2.69mg，0.6μmol，UV纯度97％，产率39％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.49min,m/z＝1148[M+4H]4+,1531[M+3H]3+,1529[M-3H]3-。
L6Orn-碳酸酯-多DM1的制备：
将脱气的DCM(245μL)和TFA(5μL)的混合物添加至L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(2.35mg,1.1μmol,1.2eq.)溶液。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加化合物012(1.5mg,0.9μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(11μL,62.8μmol,70eq.)。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)进行纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-多-DM1(0.7mg，0.2μmol，UV纯度98％，产率22％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.06min,m/z＝1792[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-多-(DM1)2的制备：
将脱气的TFA(10μL)和DCM(0.49mL)混合物添加至L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(1.25mg,0.6μmol,1.2eq.)溶液。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加化合物016(2.45mg,0.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)溶液、其次是DIEA(14.7μL,0.08mmol,176eq.)。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过反相制备HPLC(5-50％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，得到白色冻干物的L6Orn-碳酸酯-多(DM1)2(0.8mg，0.1μmol，UV纯度97％，产率26％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.59min,m/z＝1568.8[M+4H]4+。
L6Orn-碳酸酯-PEG5-BN-NOTA的制备：
在室温下，将DIEA(88.0μL,50.0μmol,10.0eq.)添加至p-SCN-Bn-NOTA(3.03mg,5.4μmol,1.2eq.)和L6Orn-碳酸酯-PEG5-NH2(9.80mg,4.6μmol,1.0eq.)的DMF(0.4mL)溶液中。在室温下搅拌1.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-PEG5-BN-NOTA(1.83mg，0.6μmol，86％UV纯度，13％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.12min,m/z＝856[M+3H]3+,1282[M-2H]2-。
A3hK(-碳酸酯-DOTA)-E8Orn(-碳酸酯-DOTA)的制备：
步骤1.在室温下，将HATU(2.57mg,6.8μmol,2.2eq.)、其次是DIEA(3.2μL,18.4μmol,6.0eq.)添加至化合物006(6.07mg,7.4μmol,2.4eq.)的DMF(0.8mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将A3hK-E8Orn(5.00mg,3.1μmol,1.0eq.)添加至反应混合物中。在室温下搅拌2.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(10-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的A3hK(-碳酸酯-DOTA(OtBu)3)-E8Orn(-碳酸酯-DOTA(OtBu)3)(6.10mg，1.7μmol，90％UV纯度，55％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.02min,m/z＝1080[M+3H]3+,1619[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将TFA添加至A3hK(-碳酸酯-DOTA(OtBu)3)-E8Orn(-碳酸酯-DOTA(OtBu)3)(6.1mg,1.9μmol,1.0eq.)溶液。在室温下搅拌10分钟后，将反应混合物真空浓缩。通过制备型HPLC(10-60％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的A3hK(-碳酸酯-DOTA)-E8Orn(-碳酸酯-DOTA)(3.70mg，1.3mol，100％UV纯度，68％产率)，为白色粉末。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.86min,m/z＝1452[M+2H]2+,1450[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-Bn-NODAGA的制备：
将DIEA(16.0μL,91.9μmol,8.4eq.)添加至L6Orn-碳酸酯-NH2(20.00mg,11.0μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-NODA-GA(6.00mg,11.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.4mL)溶液中。在室温下搅拌3小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-Bn-NODA-GA(17.16mg，7.3μmol，100％UV纯度，25％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.08min,m/z＝1173[M+2H]2+,782[M+3H]3+,1172[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-Bn-TCMC的制备：
将DIEA(30.12μL,60.2μmol,11.0eq.)添加至L6Orn-碳酸酯-NH2(10.00mg,5.48μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-TCMC(5.70mg,8.22μmol,1.5eq.)的DMF(0.13mL)溶液中。在室温下搅拌1小时后，添加HCl，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(18-32％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-Bn-TCMC(3.91mg，1.5mol，98％UV纯度，28％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.17min,m/z＝1186[M+2H]2+,791.5[M+3H]3+。
A3hK(-碳酸酯-N3)-E8Orn(-碳酸酯-N3)的制备：
在室温下，将HATU(4.50mg,11.8μmol,2.8eq.)、其次是DIEA(4.5μL,25.8μmol,6.0eq.)添加至4-[2-[2-[(2-叠氮乙酰基)氨基]乙氧基]乙氧基碳酸羰基氧基]苯甲酸(3.60mg,10.2μmol,2.4eq.)的DMF(0.6mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将A3hK-E8Orn(7.00mg,4.3μmol,1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌2.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的A3hK(-碳酸酯-N3)-E8Orn(-碳酸酯-N3)(4.30mg，1.9μmol，100％UV纯度，44％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.43min,m/z＝1150[M+2H]2+,1147[M-2H]2-。
L6Orn-碳酸酯-mPEG37的制备:
将DIEA(23.0μL,131.4μmol,8.0eq.)添加至m-PEG37-NHS酯(29.16mg,16.3μmol,1.0eq.)和L6Orn-碳酸酯-NH2(30.06mg,16.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.6mL)溶液中。在室温下搅拌2.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-mPEG37(20.80mg，5.4μmol，90％UV纯度，33％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.31min,m/z＝1746[M-2H]2-。
L6Orn-二氨基-(mPEG37 ) 2的制备:
将DIEA(6.4μL,36.8μmol,5.0eq.)添加至mPEG37-NHS酯(9.80mg,16.7μmol,2.3eq.)和L6Orn-碳酸酯-二氨基二甲苯(14.61mg,7.4μmol,1.0eq.)的DMF(0.5mL)溶液中。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(25-75％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-二氨基-(mPEG37)2(10.20mg，1.90μmol，100％UV纯度，26％产率)。UPLC-MS(方法5)：Rt＝1.37min,m/z＝1066[M+5H]5+,889[M+6H]6+。
L6Orn-碳酸酯-PEG5-PDB-DM4的制备:
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(2.83mg,3.6μmol,1.0eq.)和SPDB(1.18mg,3.6μmol,1.0eq.)的DMA(0.6mL)混合物中。在室温下搅拌10分钟后，在室温下将反应混合物添加至FCIII-L6Orn-PEG5-NH2(10.1mg,3.6μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌50分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn-碳酸酯-PEG5-PDB-DM4(3.20mg，1.1μmol，100％UV纯度，29％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.76min,m/z＝1497[M-2H]2-。
L6Orn(-碳酸酯-PDB-DM4)-PEG24的制备:
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(1.22mg,1.6μmol,1.0eq.)和SPDB(0.51mg,1.6μmol,1.0eq.)的DMA(0.75mL)混合物中。在室温下搅拌10分钟后，在室温下将反应混合物添加至L6Orn(-碳酸酯-NH2)-PEG24(5.00mg,1.6μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5至100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn(-碳酸酯-PDB-DM4)-PEG24(3.93mg，1.0μmol，100％UV纯度，64％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.81min,m/z＝1297[M+3H]3+,1944[M-2H]2-。
L6Orn(-碳酸酯-维汀)-PEG24的制备：
在室温下，将L6Orn(-碳酸酯-NH2)-PEG24(10.0mg，3.1μmol，1.0eq.)添加至化合物005(1.49mg,3.1μmol,1.0eq.)和DIEA(0.5μL,3.1μmol,1.0eq.)的DMF(0.6mL)混合物中。在室温下搅拌15分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(20-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn(-碳酸酯-S-Mmt)-PEG24(8.7mg，2.6μmol，100％UV纯度，82％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.96min,m/z＝1684[M-2H]2-。
在室温下，将脱气的三氟乙酸(40μL)和DCM(0.96mL)的混合物添加至维汀(2.60mg，2.0μmol，1.0eq.)的混合物。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，添加L6Orn(-碳酸酯-S-Mmt)-PEG24(8.65mg,2.6μmol,1.3eq.)、其次是DIEA(0.3μL,2.0μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到观察到酸性pH。通过制备型HPLC(10-70％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn(-碳酸酯-维汀)-PEG24(6.70mg，1.5μmol，100％UV纯度，77％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.83min,m/z＝1472[M+3H]3+,1105[M+4H]4+。
PEG20-L6Orn-碳酸酯-PDB-DM4的制备:
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(1.28mg,1.6μmol,1.0eq.)和SPDB(0.53mg,1.6μmol,1.0eq.)的DMA(0.75mL)混合物中。在室温下搅拌10分钟后，在室温下将反应混合物添加至PEG20-L6Orn-碳酸酯-NH2(5.00mg,1.6μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(5-100％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的PEG20-L6Orn-碳酸酯-PDB-DM4(3.45mg，0.9μmol，100％UV纯度，58％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.83min,m/z＝1826[M-2H]2-。
PEG20-L6Orn-碳酸酯-维汀的制备：
在室温下，将DIEA(0.9μL,4.9μmol,1.0eq.)添加至PEG20-L6Orn-碳酸酯-NH2(15.0mg,4.9μmol,1.0eq.)和化合物005(2.34mg,4.9μmol,1.0eq.)的DMF(1mL)混合物中。在室温下搅拌15分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(20-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的PEG20-L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(13.9mg，4.4μmol，100％UV纯度，90％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.97min,m/z＝1567[M-2H]2-。
在室温下，将脱气的三氟乙酸(10μL)和DCM(0.49mL)的混合物添加至PEG20-L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(6.60mg,2.1μmol,1.3eq.)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加维汀(2.20mg,1.6μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(0.3μL,1.6μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌25分钟后，添加TFA，直到观察到酸性pH。通过制备型HPLC(10-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的PEG20-L6Orn-碳酸酯-维汀(4.50mg，1.1μmol，100％UV纯度，66％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.85min,m/z＝1395[M+3H]3+,1046[M+4H]4+。
PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-DM4的制备:
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(4.47mg,5.7μmol,1.0eq.)和SPDB(1.87mg,5.7μmol,1.0eq.)的DMA(2mL)混合物中。在室温下搅拌5分钟后，在室温下将反应混合物添加至mPEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NH2(20.00mg,5.7mmol,1.0eq.)。在室温下搅拌40分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(30g，20至80％的ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％的TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色产物mPEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-PDB-DM4(11.7mg，3.0μmol，100％的UV纯度，53％的产率)。UPLC-MS(方法6)：Rt＝1.19min,m/z＝1923[M-2H]2-。
PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-(suc-VC-PAB-MMAE)的制备：
在室温下，将DIEA(4.1μL,20.0μmol,4.0eq.)添加至NHS-suc-NH-VC-PAB-MMAE(8.20mg,5.8μmol,1.0eq.)和PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NH2(19.6mg,5.6μmol,0.96eq.)的DMF(1mL)混合物。在室温下搅拌1小时后，将PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-NH2(4.08mg,1.2μmol,0.2eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(20-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的PEG24-L6Orn-碳酸酯-PEG3-(suc-NH-VC-PAB-MMAE)(13.2mg，3.2μmol，100％UV纯度，54％产率)。UPLC-MS(方法6)：Rt＝1.44min,m/z＝1392[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-suc-VC-PAB-MMAE的制备：
在室温下，将DIEA(13μL,26.0μmol,3.0eq.)添加至450μLNHS-suc-NH-VC-PAB-MMAE(12.6mg,9.5μmol,1.1eq.)的DMF和86μLL6Orn-碳酸酯-NH2(15.8mg,8.7μmol,1.0eq.)的DMF的混合物中。在室温下搅拌2小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(34-50％的ACN、含0.1％TFA的水溶液)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-suc-VC-PAB–MMAE(17.1mg，5.6μmol，99％的UV纯度，65％的产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.98min,m/z＝1516[M+2H]2+。
PEG24-L6Orn-碳酸酯-suc-VC-PAB-MMAE的制备：
将DIEA(20μL,114.0μmol,20.0eq.)添加至在235μL的NHS-suc-NH-VC-PAB-MMAE(7.4mg,5.6μmol,1.0eq.)的DMF和150μL的PEG24-L6Orn-碳酸酯-NH2(16.5mg,5.6μmol,1.0eq.)的DMF。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(35-55％的ACN、含0.1％TFA的水溶液)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的PEG24-L6Orn-碳酸酯-suc-VC-PAB-MMAE(8.7mg，2.1μmol，99％的UV纯度，37％的产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝3.03min,m/z＝1378[M+2H]2+。
L6Orn-碳酸酯-PNU的制备：
在室温下，将DIEA(11.5μL，65.8μmol，4.0eq.)添加至L6Orn-碳酸酯-NH2溶液(30.0mg，16.4μmol，1.0eq.)和PNU-OPFP(化合物027)(14.0mg,16.4μmol,1.0eq.)的DMF(1mL)溶液中。在室温下搅拌2.5小时后，在室温下将TFA(5μL)添加至反应混合物。通过制备型HPLC(20-60％的ACN水溶液)纯化，冷冻干燥后得到橙色粉末的L6Orn-碳酸酯-PNU(18.9mg，5.8μmol，77％UV纯度，35％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.47min,m/z＝1247[M+2H]2+,1244[M-2H]2-。
PEG24-L6Orn-碳酸酯-PNU的制备：
在室温下，将DIEA(12μL,68.7μmol,4.0eq.)添加至PNU-OPFP(15.5mg,18.2μmol,1.05eq.)和PEG24-L6Orn-碳酸酯-NH2(49.5mg,17.2μmol,1.0eq.)的DMF(2mL)溶液中。在室温下搅拌1小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(30-60％的ACN水溶液)纯化，冷冻干燥后得到橙色粉末的PEG24-L6Orn-碳酸酯-PNU(24.3mg，5.7μmol，83％UV纯度，33％产率)。UPLC-MS(方法3)：Rt＝1.52min,m/z＝1775[M+2H]2+,1773[M-2H]2-。
PEG20-L6Orn-碳酸酯-多-(DM1)2的制备:
在室温下，将脱气的三氟乙酸(10μL)和DCM(490μL)的混合物添加至PEG20-L6Orn-碳酸酯-S-MMT(5.18mg,1.7μmol,1.2eq.)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加化合物016(6.00mg,1.4μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(20μL,90μmol,70eq.)。在室温下搅拌25分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。过滤反应混合物。通过制备型HPLC(10-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的PEG20-L6Orn-碳酸酯-多(DM1)2(3.50mg，0.40μmol，90％UV纯度，32％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.52min,m/z＝1807[M+4H]4+,1442[M+5H]5+,1204[M+6H]6+。
L6Orn-碳酸酯-多(DM1)2-PEG15的制备:
在室温下，将脱气的三氟乙酸(10μL)和DCM(490μL)的混合物添加至L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(3.27mg,1.5μmol,1.2eq.)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加化合物024(6.35mg,1.2μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(20μL,87.3μmol,70eq.)。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。过滤反应混合物。通过制备型HPLC(10-80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-多(DM1)2-PEG15(3.70mg，0.50μmol，100％UV纯度，产率42％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.43min,m/z＝1751[M+4H]4+,1398[M+5H]5+。
L6Orn-碳酸酯-多-(DM1)-K(PEG24)-(DM1)的制备：
在室温下，将脱气的三氟乙酸(12μL)和DCM(564μL)的混合物添加至L6Orn-碳酸酯-S-Mmt(3.52mg,1.6μmol,1.2eq.)。将反应混合物在室温下搅拌5分钟，然后添加化合物026(6.00mg,1.3μmol,1.0eq.)、其次是DIEA(16μL,94μmol,70eq.)。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(10至80％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-碳酸酯-多-(DM1)-K(PEG24)-(DM1)(6.25mg，1.0μmol，98％UV纯度，73％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.18min,m/z＝1542[M+4H]4+。
RGNCAYHK(NHS-N3-DBCO-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH的制备：
将DBCO-VC-PAB-MMAE(6.6mg,4.7μmol,1.4eq.)添加至RGNCAYHK(NHS-N3)GQIIWCTYH(8.0mg,3.3μmol,1.0eq.)的DMF(190μL)溶液中。在室温下搅拌4小时后，通过制备型HPLC(30至50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的RGNCAYHK(NHS-N3-DBCO-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH(1.20mg，0.3μmol，96％UV纯度，10％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.84min,m/z＝1287.7[M+2H]2+。
RGNCAYHOrn(NHS-N3-DBCO-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH的制备：
将DBCO-VC-PAB-MMAE(6.3mg,4.5μmol,1.4eq.)添加至RGNCAYHOrn(NHS-N3)GQIIWCTYH(7.6mg,3.1μmol,1.0eq.)的DMF(140μL)溶液中并在室温下搅拌过夜。通过制备型HPLC(30至50％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的RGNCAYHOrn(NHS-N3-DBCO-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH(2.10mg，0.3μmol，96％UV纯度，10％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.84min,m/z＝1287.7[M+2H]2+。
RGNCAYHK(NHS-PEG1-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH的制备：
在室温下，将6-Cl-HOBt(0.4mg,3.0μmol,1.0eq)、其次是EDCl(0.5mg,3.0μmol,1.0eq.)添加化合物022(4.6mg,3.6μmol,1.2eq.)的DMF(73μL)溶液中。在室温下搅拌2分钟后，将RGNCAYHK(SuOH)GQIIWCTYH(7.0mg,3.0μmol,1.0eq.)的DMF(0.15mL)添加至反应混合物。反应在室温下搅拌4小时。通过制备型HPLC(26至46％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的RGNCAYHK(NHS-PEG1-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH(1.60mg，0.5μmol，96％UV纯度，15％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.59min,m/z＝1185[M+2H]2+。
RGNCAYHK(碳酸酯-N3-DBCO-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH的制备：
将DBCO-VC-PAB-MMAE(9.1mg,6.5μmol,64.5μL,3.9eq.)添加至RGNCAYHK(碳酸酯-N3)GQIIWCTYH(6.6mg,2.9μmol,1.0eq.)的DMF(70μL)溶液中。在室温下搅拌4小时后，通过制备型HPLC(29至49％ACN+0.1％TFA水溶液+0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的RGNCAYHK(碳酸酯-N3-DBCO-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH(4.40mg，1.2μmol，100％UV纯度，41％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.81min,m/z＝1245[M+2H]2+。
RGNCAYHK(碳酸酯-suc-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH的制备：
将DIEA(66μL,379μmol,53.0eq.)添加至430μL的NHS-suc-NH-VC-PAB-MMAE(11.4mg,8.6μmol,1.2eq)的DMF和150μL的RGNCAYHK(碳酸酯-NH2)GQIIWCTYH(16.8mg,7.2μmol,1.0eq.)DMF。在室温下搅拌3.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(26至42％的ACN的水溶液、含0.1％TFA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的RGNCAYHK(碳酸酯-suc-VC-PAB-MMAE)GQIIWCTYH(11.8mg，3.3μmol，99％UV纯度，46％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.62min,m/z＝1183[M+2H]2+。
下表显示了实施例7中描述的肽偶联物的MS特征。MS数据通过ESI在正模式下测量获得。
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表10：肽反应性偶联物的特征
实施例8：其它含有效载荷的活性偶联物的制备
通过将化合物008或有效载荷硫酯/酯偶联至相应Fc-结合载体侧链的氨基，从而将实施例1中制备的Fc-结合载体转化为反应性偶联物。实施例8中制备的含有效载荷-硫酯/酯的反应性偶联物的结构在下表中示出。
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表11：含有效载荷硫酯/酯反应性偶联物的结构
A3K/L6Dap-E8Q/L6Dab/L6Orn/L6K-硫酯-DOTA的制备：
在室温下，将HATU.HPF6(1.3eq.)添加至化合物008(1.4eq.)的溶液并搅拌1分钟，随后添加DIEA(3.0eq.)。在室温下搅拌3分钟后，将预活化的化合物008添加至A3K/L6Dap-E8Q/L6Dab/L6Orn/L6K肽(1.0eq.)中并在室温下搅拌1-3小时。通过UPLC-MS监测反应的完成。反应性偶联物用冷乙醚沉淀。
随后，通过在室温下用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，v/v/v)处理1-3小时来除去DOTA部分的叔丁基保护基团，随后用冷乙醚沉淀并通过HPLC纯化(如实施例6)。
L6Dap-硫酯-NH2的制备：
步骤1.在室温下，将HATU.HPF6(10.3mg,26.1μmol,1.2eq.)、其次是DIEA(9μL,52.2μmol,2.4eq.)添加至在3[4[3[2(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基硫酰基]苯基]丙酸(9.1mg,21.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.22mL)溶液。在室温下搅拌5分钟后，将L6Dap-硫酯-NH2(40.3mg,26.1μmol,1.2eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌55分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过反相制备型HPLC(洗脱剂：5-100％的ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，在冷冻干燥后得到白色固体的L6Dap-硫酯-NHBoc(21.8mg，10.8μmol，95％UV纯度，49％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.63min,m/z＝912[M-Boc+2H]2+,1924[M+H]+,961[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将TFA(1mL)添加至L6Dap-硫酯-NHBoc(21.8mg，11.3μmol，1.0eq)的溶液中。将反应混合物在室温下搅拌7分钟，然后真空浓缩。添加水(0.5mL)和ACN(0.5mL)并冷冻干燥混合物，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-NH2(23.0mg，11.3μmol，90％UV纯度，定量产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.90min,m/z＝912[M+2H]2+,1824[M+H]+。
L6Dap-硫酯-DOTA的制备：
在室温下，将DIEA(3.1μL,18μmol,4.0eq.)添加至1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸单-N-羟基琥珀酰亚胺酯HPF6 TFA(3.4mg,4.5μmol,1.0eq.)和L6Dap-硫酯-NH2(8.2mg,4.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后添加两滴TFA。通过反相制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-DOTA(1.7mg，0.8μmol，99％UV纯度，17％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.95min,m/z＝737[M+3H]3+,1104[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-DTPA的制备：
在室温下，将DIEA(3.1μL,17.5μmol,4.0eq.)添加至在L6Dap-硫酯-NH2(8.0mg,4.4μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA.3HCl(3.1mg,4.4μmol,1.0eq.)的DMF(0.2mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后添加两滴TFA。通过制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-DTPA(0.13mg，0.04μmol，80％UV纯度，1％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.30min,m/z＝807[M+3H]3+,1210[M+2H]2+。
L6Dap-硫酯-PCTA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,11.0μmol,4.0eq.)添加至L6Dap-硫酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-PCTA.3HCl(1.75mg,2.7μmol,1.0eq.)DMF(0.1mL)的溶液中。在室温下搅拌1小时后，加入TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的H2O+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-PCTA(0.5mg，0.21μmol，90％UV纯度，8％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.19min,m/z＝784[M+3H]3+,1174[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-Bn-NODA-GA的制备：
在室温下，将DIEA(1.3μL,7.5μmol,4.0eq.)添加至L6Dap-硫酯-NH2(3.4mg,1.9μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-NODA-GA(0.97mg,1.9μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌2小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(27-37％ACN+0.1％TFA的H2O+0.1％TFA)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-Bn-NODA-GA(0.1mg，42nmol，95％UV纯度，2.6％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝2.95min,m/z＝1173.3[M+2H]2+。
L6Dap-硫酯-Bn-NOTA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,11.0μmol,4.0eq.)添加至L6Dap-硫酯-NH2(5.0mg,2.7μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-NOTA(1.53mg,2.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌30分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-Bn-NOTA(1.1mg，0.5μmol，UV纯度100％，18％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.23min,m/z＝1138[M+2H]2+,1136[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-DOTA-GA的制备：
在室温下，将DIEA(1.9μL,11.0μmol,4.0eq.)添加至DOTA-GA(OtBu)4(2.1mg,3.0μmol,1.1eq.)和HATU.HPF6(1.15mg,3.0μmol,1.1eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，在室温下将反应混合物添加至L6Dap-硫酯-NH2(5.0mg，2.7μmol，1.0eq.)。在室温下搅拌10分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-DOTA-GA(OtBu)4(3.9mg，1.5μmol，UV纯度98％，56％产率)。将后一种化合物溶解在DCM(0.5mL)和TFA(0.5mL)中，并在室温下搅拌。在室温下搅拌21小时后，将反应混合物真空浓缩，然后在C18(12g，20-50％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过10CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-DOTA-GA(1.5mg，0.4μmol，UV纯度61％，27％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.96min,m/z＝761[M+3H]3+,1140[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-三唑-dbco-DFO的制备：
在室温下，将DBCO-DFO(1.53mg，1.8μmol，1.0eq.)添加至L6Dap-硫酯-N3(3.5mg，1.8μmol，1.0eq)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌75分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-三唑-dbco-DFO(3.4mg，1.2μmol，UV纯度99％，67％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.46min,m/z＝919[M+3H]3+,1376[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-N3的制备：
在室温下，将DIEA(7.6μL,43.8μmol,4.0eq.添加至L6Dap-硫酯-NH2(20.0mg,11.0μmol,1.0eq.)和(2,5-二氧吡咯烷-1-基)2-叠氮基乙酸酯(2.17mg,11.0μmol,1.0eq.)的DMF(1.2mL)混合物。在室温下搅拌75分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-N3(3.5mg，1.8μmol，UV纯度92％，15％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.30min,m/z＝954[M+2H]2+,952[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-FITC的制备：
在室温下，将DIEA(3.1μL,17.5μmol,4.0eq.)添加至L6Dap-硫酯-NH2(8.0.mg,4.4μmol,1.0eq.)和5-FITC(1.7mg,4.4μmol,1.0eq.)的DMF(0.2mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后添加两滴TFA。通过制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA的水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到黄色粉末的L6Dap-硫酯-FITC(4.4mg，1.6μmol，83％UV纯度，38％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.58min,m/z＝738[M+3H]3+,1107[M+2H]2+。
L6Dap-硫酯-MCC-DM1的制备：
在室温下，将DIEA(1.3μL,7.5μmol,4.0eq.)添加至L6Dap-硫酯-NH2(3.4mg,1.9μmol,1.0eq.)和DM1-SMCC(2.0mg,1.9μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌2小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(35-47％ACN+0.1％TFAH2O中+0.1％TFA)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-MCC-DM1(0.27mg，96nmol，92％UV纯度，5％产率)。UPLC-MS(方法2)：Rt＝3.06min,m/z＝1389.6[M-2H]2-。
L6Dap-硫酯-SPDB-DM4的制备：
在室温下，将饱和NaHCO3水溶液(83μL)添加至DM4(1.75mg,2.2μmol,1.0eq.)和SPDB(0.73mg,2.2μmol,1.0eq.)的DMA(0.4mL)混合物中。在室温下搅拌10分钟后，在室温下将反应混合物添加至L6Dap-硫酯-NH2(5.0mg,2.2μmol,1.0eq.)。在室温下搅拌15分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Dap-硫酯-SPDB-DM4(1.4mg，0.5μmol，UV纯度97％，22％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.06min,m/z＝1351[M-2H]2-。
L6Orn-酯-NH2的制备:
步骤1.在室温下，将HATU.HPF6(5.1mg,13.4μmol,1.1eq.)、其次是DIEA(5.1μL,29.3μmol,2.4eq.)添加至4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基氧基]苯甲酸(5.3mg,14.6μmol,1.2eq.)的DMF(0.5mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将L6Orn(19.2mg,12.2μmol,1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌20分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色固体的L6Orn-酯-NHBoc(21.5mg，7.3μmol，UV纯度65％，60％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.49min,m/z＝905[M+2H-Boc]2+,953[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将TFA(1.0mL)添加至L6Orn-酯-NHBoc(21.5mg，UV纯度65％，7.3μmol，1.0eq)溶液。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后真空浓缩。添加水(5mL)和ACN(5mL)，然后将混合物冷冻干燥，得到白色粉末的L6Orn-酯-NH2(23.5mg，6.8μmol，UV纯度52％，93％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.80min,m/z＝905[M+2H]2+,903[M-2H]2-。
L6Orn-酯-DOTA的制备：
在室温下，将DIEA(2.9μL,16.6μmol,6.6eq.)添加至L6Orn-酯-NH2(5.0mg,91％纯度,2.5μmol,1.0eq.)和DOTA-NHS酯.TFA.HPF6(2.1mg,2.8μmol,1.1eq.)的DMF(0.2mL)溶液中。在室温下搅拌2小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％的TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn-酯-DOTA(4.2mg，1.2μmol，UV纯度63％，48％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.80min,m/z＝1098[M+2H]2+,1096[M-2H]2-。
L6Orn-酯-DTPA的制备：
在室温下，将DIEA(2.9μL,16.6μmol,6.6eq.)添加至L6Orn-酯-NH2(5.0mg,91％纯度,2.5μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA.3HCl(1.95mg,2.8μmol,1.1eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌45分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过反相制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA的水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn-酯-DTPA(2.4mg，0.8μmol，UV纯度78％，产率32％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.09min,m/z＝1202[M+2H]2+,1200[M-2H]2-。
L6Orn-酯-PCTA的制备：
在室温下，将DIEA(2.9μL,16.6μmol,6.6eq.)添加至L6Orn-酯-NH2(5.0mg,91％纯度,2.5μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-PCTA.3HCl(1.76mg,2.8μmol,1.1eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌45分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过反相制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA的水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn-酯-PCTA(1.96mg，0.6μmol，UV纯度73％，24％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.04min,m/z＝1169[M+2H]2+,1167[M-2H]2-。
L6Orn-酯-Bn-NOTA的制备：
在室温下，将DIEA(1.6μL,9.6μmol,4.0eq.)添加至L6Orn-酯-NH2(5.0mg,2.4μmol,1.0eq.)和p-SCN-Bn-NOTA(1.35mg,2.4μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌30分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色粉末的L6Dap-硫酯-Bn-NOTA(2.9mg，1.2μmol，UV纯度91％，产率49％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.11min,m/z＝1130[M+2H]2+,1128[M-2H]2-。
L6Orn-酯-FITC的制备：
在室温下，将DIEA(2.6μL,15.1μmol,6.0eq.)添加至L6Orn-酯-NH2(5.0mg,91％纯度,2.5μmol,1.0eq.)和5-FITC(0.98mg,2.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。在室温下搅拌30分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18(12g，20至80％ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)上纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Orn-酯-FITC(3.3mg，1.5μmol，UV纯度100％，60％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.49min,m/z＝1099[M+2H]2+,1097[M-2H]2-。
L6Orn-酯-N3的制备:
在室温下，将DIEA(2μL,11.7μmol,4.0eq.)添加至2,5-二氧代吡咯烷-1-基2-叠氮乙酸酯(0.61mg,2.9μmol,1.0eq.)和L6Orn-酯-NH2(8mg,2.9μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)混合物中。在室温下搅拌35分钟后，添加TFA，直到达到酸性pH。通过制备型HPLC(2-100％ACN+0.1％FA的水溶液+0.1％FA中)纯化，在冷冻干燥后得到白色粉末的L6Orn-酯-N3(4.00mg，1.7mmol，82％UV纯度，59％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.14min,m/z＝946[M+2H]2+,944[M-2H]2-。
L6Orn-(CH2)2-酯-NH2的制备：
步骤1.在室温下，将HATU.HPF6(4.59mg,11.6μmol,1.2eq.)、其次是DIEA(4.1μL,23.3μmol,2.4eq.)添加至3-[4-[3-[2-(叔丁氧羰基氨基)乙氧基]丙酰基氧基]苯基]丙酸(3.7mg,9.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.8mL)溶液中。在室温下搅拌5分钟后，将L6Dap(15.0mg,9.7μmol,1.0eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌1.5小时后，添加TFA，直到达到酸性pH。在C18 biotage柱上通过反相自动快速色谱(30g，20至80％ ACN+0.1％TFA的水溶液+0.1％TFA，超过12CV)纯化，冷冻干燥后得到白色固体的L6Dap-(CH2)2-酯-NHBoc(11.4mg，6.0μmol，UV纯度86％，产率53％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.53min,m/z＝965[M+2H+Na]2+,952[M-2H]2-。
步骤2.在室温下，将TFA(4.6mL)添加至L6Dap-(CH2)2-酯-NHBoc(11.4mg，6.0μmol，1.0eq)溶液。将反应混合物在室温下搅拌10分钟，然后真空浓缩。添加水(1mL)和ACN(1mL)，然后冷冻干燥混合物，得到白色粉末的L6Dap-(CH2)2-酯-NH2(13.5mg，5.9μmol，UV纯度79％，产率99％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝1.82min,m/z＝904[M+2H]2+,903[M-2H]2-。
L6Orn-(CH2)2-酯-DOTA的制备：
在室温下，将DIEA(2.2μL,12.8μmol,4.0eq.)添加至L6Dap-(CH2)2-酯-NH2(5.8mg,3.2μmol,1.0eq.)和DOTA-NHS酯.HPF6.TFA(2.4mg,3.2μmol,1.0eq.)的DMF(0.3mL)溶液中。将反应混合物在室温下搅拌1小时，然后添加两滴TFA。通过制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA的水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Dap-(CH2)2-酯-DOTA(4.0mg，1.8μmol，UV纯度100％，产率57％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.82min,m/z＝732[M+3H]3+,1096[M-2H]2-。
L6Orn-(CH2)2-酯-DTPA的制备：
在室温下，将DIEA(3.7μL,21.0μmol,6.0eq.)添加至L6Dap-(CH2)2-酯-NH2(8.0.mg，79％纯度，3.5μmol，1.0eq.)和p-SCN-Bn-CHX-A”-DTPA.3HCl(2.46mg,3.5μmol,1.0eq.)DMF(0.2mL)。将反应混合物在室温下搅拌1.5小时，然后添加两滴TFA。通过反相制备型HPLC(5-50％ACN+0.1％FA的水溶液+0.1％FA)纯化，冷冻干燥后得到白色产物的L6Dap-(CH2)2-酯-DTPA(5.9mg，2.1μmol，UV纯度84％，59％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.82min,m/z＝801[M+3H]3+,1199[M-2H]2-。
实施例8的肽偶联物的MS表征在下表中示出。MS数据通过在正模式下测量的ESI获得。
/>
*-在负模式下测量肽偶联物，[M-2H]2-
表12：反应性偶联物的表征
实施例9：Fc结合载体的制备与表征(Tyr法)
使用标准的Fmoc/tBu类SPPS(包括在树脂上偶联和聚合策略)制备Fc结合载体。实施例9中制备的配体在下表13中(粗下划线表示在各自Cys残基的侧链之间存在二硫键)示出。
表13：Fc结合载体(Tyr法)
通过与实施例1相同的方案制备配体。实施例9的肽的MS表征在下表中示出。
表14：肽的表征(Tyr法)
实施例10：含DOTA的反应性偶联物的制备(酪氨酸法)
通过将化合物010偶联至各个Fc-结合载体的酪氨酸或高酪氨酸(hY)侧链的羟基而将实施例9中制备的Fc-结合载体转化为反应性偶联物。作为实施例，在下面的方案中示出了化合物L6Y-DOTA的合成。其他DOTA-碳酸酯-肽偶联物(Tyr法)以类似的方式制备。实施例10中制备的含DOTA的反应性偶联物的结构如下表所示。
/>
表15：含DOTA的反应性偶联物的结构(Tyr法)
为了制备反应性偶联物，将2eq.的DMAP添加至化合物010(2eq.)的DMF溶液并搅拌1分钟，然后添加Fc结合载体(1eq.)和DIEA(4eq.)。将反应混合物在室温下搅拌1-4小时。通过UPLC-MS监测反应的完成。反应性偶联物用冷乙醚沉淀。
随后，在室温下，DOTA部分的叔丁基保护基团通过用TFA/TIS/水(95/2.5/2.5，v/v/v)来处理1-3小时而除去，随后用冷乙醚沉淀并通过HPLC纯化(如实施例6所述)。
DOTA-肽偶联物的MS表征如下表所示。
表16：DOTA反应性偶联物的表征
实施例11：曲妥珠单抗-有效载荷偶联物的制备
使用曲妥珠单抗作为模型系统评估实施例5-8、10的反应性偶联物与抗体反应的倾向。
为了制备曲妥珠单抗有效载荷偶联物，将实施例5-8和10中制备的2eq的反应性偶联物(2.4nmol)的DMSO(最终反应混合物中的2-7％v/v)添加至在50mM的NaHCO3 pH 9.0(20-28μL)中稀释的曲妥珠单抗溶液(1eq，1.2nmol；可从罗氏公司获得的市售曲妥珠单抗在偶联前将曲妥珠单抗缓冲交换至磷酸盐缓冲盐水(PBS)中)，并将反应混合物(36μL)在室温下搅拌2小时。
有效载荷结合后，用64μL的0.1M甘氨酸pH 2.5稀释反应缓冲液。然后抗体偶联物使用用0.1M甘氨酸pH 2.5预平衡的Bio-spin P-30柱(床高：3.7cm，总长度：5cm；购自Bio-Rad，美国)通过胶过滤色谱法纯化，然后用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱。用1M的PBS pH 8.5(10μL)中和纯化的抗体偶联物级分。
通过HRMS分析(如上所描述的)评估有效载荷部分与曲妥珠单抗的偶联。通过用GingisKhan蛋白酶(在2mM半胱氨酸、0.1M Tris、pH 8.0的存在下，在37℃下，每μg抗体偶联物1个单位持续1小时)消化偶联物，并随后进行HRMS分析(如上所描述的)来评估Fc和F(ab)2之间的有效载荷载荷比(选择性)。基于HRMS分析的结果评估曲妥珠单抗-有效载荷偶联物的偶联度(DoC)(如上所描述的)。
HRMS分析的结果在下表17中示出。
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/>
/>
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#-由D个氨基酸构成的肽序列；*-曲妥珠单抗加赋形剂；ND-未确定；a-9eq.的肽-有效载荷偶联物、b-2.3eq.的肽-有效载荷偶联物、c-10eq.的肽-有效载荷偶联物、d-2.8eq.的肽-有效载荷偶联物、e-2.4eq.的肽-有效载荷偶联物、f-3eq.的肽-有效载荷偶联物、g-4eq.的肽-有效载荷偶联物、h-20eq.的肽-有效载荷偶联物(抗体偶联在pH 7.2的50mMHepes缓冲液中持续3小时)
表17：实施例11中制备的曲妥珠单抗-有效载荷偶联物的表征
用GingisKHANTM或FabRICATORTM酶消化抗体通常导致Fc亚基的有效载荷被裂解，从而导致较低的DoC。在这些情况下，推测Fc的DoC(粗体中的值)：
DoC Fc＝DoC-DoC F(ab)2；选择性Fc/F(ab)2＝(DoC-DoCF(ab)2)/Doc(Fab)2
这些结果表明，肽反应性偶联物可以产生对抗体的Fc区域具有优异选择性(例如，完全选择性)的曲妥珠单抗-有效载荷偶联物。
曲妥珠单抗-有效载荷偶联物被特定酶裂解，并通过串联MS/MS分析来确定曲妥珠单抗Fc片段中有效载荷的偶联位点。结果在下表18中示出。
/>
表18：通过肽映射确定曲妥珠单抗上有效载荷的偶联位点(粗体标记的赖氨酸是 曲妥珠单抗的主要标记位点)。
粗体标记的Fc区域的赖氨酸似乎几乎被定量标记，而在每个Fc区域带有3个有效载荷部分的具有较高DoC的偶联物中额外观察到其他赖氨酸的标记。
*-发现在大多数偶联物中，赖氨酸246和248出现在同一肽片段中。根据晶体结构信息(DeLano et al.Science 2000,287,1279-1283)，Fc-III L6与Fc K248之间的距离比Fc-III L5与K246之间的距离/>短，这得出的结论是，大多数修饰似乎位于K248处，但不能排除K246的标记/>
L6突体赖氨酸位置突变或间隔基长度的变化导致Fc区域中不同赖氨酸的修饰：K392、K248、K246、K274、K317。
实施例12：利用其它抗体制备抗体-DOTA/FITC偶联物
本发明的反应性偶联物与不同抗体反应的倾向使用市售的阿特珠单抗、利妥昔单抗、恩美曲妥珠单抗、本妥昔单抗、阿柏西普、帕尼单抗、派姆单抗和仅Fc区域进行评估。使用肽偶联物(如表19所示)和上面描述的抗体，根据与上述实施例11相同的方法制备抗体-DOTA/FITC偶联物。
HRMS分析的结果在下表19中示出。
/>
用GingisKHANTM或FabRICATORTM酶消化抗体通常导致Fc亚基的有效载荷被裂解，从而导致较低的DoC。在这些情况下，推测Fc的DoC(粗体中的值)：
DoC Fc＝DoC–DoC F(ab)2；选择性Fc/F(ab)2＝(DoC–DoC F(ab)2)/Doc(Fab)2
在某些情况下，由于其Fc-有效载荷片段在酶处理条件下较差的稳定性，因此不可能确定阿特珠单抗的标记选择性。
发现化合物L6Orn-碳酸酯-DOTA、L6Orn-碳酸酯-FITC、L6Orn-碳酸酯-NOTA、L6Orn-碳酸酯-NODAGA导致与曲妥珠单抗相当的DoC有效的Fc区域标记。
实施例13：固定化含FITC/DOTA的反应性偶联物的制备及曲妥珠单抗的固相修饰
制备固定在固体支承物上的反应性偶联物，并评估其与曲妥珠单抗反应的倾向。
表20：用于固体支承物固定的含肽叠氮化物或生物素的结构。
用于固体支承物固定化的化合物肽的制备：
使用Rink Amide AM树脂(负载量：0.57mmol/g)和Liberty BlueTM自动微波肽合成器(购自CEM公司，德国)通过标准的Fmoc/tBu类SPPS制备肽。
在室温下，使用在用0.5M的DIC和1M的的DMF预活化的0.2M的Fmoc-氨基酸进行用于酰胺键形成的偶联反应持续4分钟。用10％哌嗪的DMF(v/v)进行Fmoc去保护。
合成完成后，用DMF和DCM洗涤树脂(0.2mmol)。然后，将L6Orn、L6Orn(-H)-K和L6K的树脂在DMF(14mL)中溶胀。将叠氮化物-PEG12-NHS或生物素-PEG12-NHS(1eq)添加至树脂、其次是DIEA(1eq)并在室温下搅拌72小时。用DMF和DCM洗涤树脂。
通过用TFA/TIS/水(90/5/5，v/v/v)处理，在室温下在温和搅拌下手动将肽从树脂上裂解1.5小时。在用氮气流过滤和蒸发裂解混合物后，用冷乙醚沉淀粗肽，离心，用冷乙醚洗涤并干燥。
为了形成二硫键，将粗肽(0.1mmol)重悬于10ml的DMSO中，然后添加2eq的2M的NH3的甲醇溶液和50eq的过氧化氢，并在室温下搅拌30分钟。通过分析UPLC-MS监测氧化过程。将10ml的0.1％TFA酸水溶液添加至溶液、以停止反应。在HPLC纯化后分离肽(如实施例1所描述的)。
L6Orn(-H)-N3)的制备：
步骤1.在室温下，将Boc2O(5.4mg,24.7μmol,1.1eq.)和TEA(18.3μL,134.9μmol,6.0eq.)添加至H-Fc-III-(OtBu)2-L6Orn-OH(39.1mg,22.5μmol,1.0eq.)的DMF(0.23mL)溶液。在室温下搅拌3小时后，将冷乙醚添加至反应混合物以沉淀肽。离心后，除去上清液，将粗产物用于下一步，假设定量产率。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.96min,m/z＝1787[M+H]+,1785[M-H]-。
步骤2.在室温下，将DIEA(20.2μL,118.5μmol,6.0eq.)和HATU.HPF6(10.8mg,27.6μmol,1.4eq.)添加至Fc-III-(OtBu)2-L6Orn(Boc)-OH(40.1mg,19.7μmol,1.0eq.)的DMF(0.2mL)溶液。将反应混合物在室温下搅拌1分钟，然后添加N3-PEG11-NH2(13.5mg,23.7μmol,1.2eq.)。在室温下搅拌2小时后，将HATU.HPF6(3.1mg,7.9μmol,0.4eq.)添加至反应混合物。在室温下搅拌2.5小时后，用TFA中和反应混合物，然后通过HPLC制备型(25-60％ACN+0.1％FA的H2O溶液+0.1％FA中)纯化，得到白色粉末的BocHN-Fc-III-(OtBu)2-L6Orn-PEG11-N3(19.4mg，7.9mol，UV纯度95％，产率40％)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝3.21min,m/z＝1170[M+2H]2+,1168[M-2H]2-。
步骤3.将BocHN-Fc-III-(OtBu)2-L6Orn-PEG11-N3(19.4mg，UV纯度95％，7.9μmol，1.0eq.)溶解在TFA(0.1mL)中。在室温下搅拌20分钟后，在真空下浓缩反应混合物，添加水(4mL)和ACN(4mL)并冷冻干燥混合物，得到白色粉末的L6Orn-PEG11-N3(17.7mg，5.4mmol，UV纯度75％，51％产率)。UPLC-MS(方法4)：Rt＝2.15min,m/z＝1064[M+2H]2+,1062[M-2H]2-。
用于固体支承物固定化的肽的MS表征在下表中示出。
表21：用于固体支承物固定化的肽的表征
根据与实施例6或5中所述相同的程序，分别通过将化合物006或009偶联至肽侧链的氨基，将具有叠氮化物或生物素的Fc结合配体转化为反应性偶联物，以用于固体支承物固定化。实施例13中制备的化合物的结构在下表中示出。
表22：用于固体支承物固定化的含FITC/DOTA的反应性偶联物的结构。
用于固体支承物固定化的含FITC/DOTA的反应性偶联物的MS表征在下表中示出。
表23：用于固体支承物固定化的含FITC/DOTA的反应性偶联物的表征
使用曲妥珠单抗作为模型系统，评估用于固体支承物固定化的反应性含FITC/DOTA的反应性偶联物与抗体反应的倾向。首先用与实施例11相同的方法在溶液中制备曲妥珠单抗-FITC/DOTA偶联物。
HRMS分析结果在下表24中示出。
为了将生物素化的反应性偶联物固定在固体支承物上，将NeutrAvidin琼脂糖树脂(赛默飞世尔)填充到柱(飞世尔科技)中，并用结合缓冲液(0.1M磷酸盐缓冲液，0.15M氯化钠，pH 7.2)洗涤。将本发明化合物(2.1nmol)与洗涤的NeutrAvidin琼脂糖珠(40μl珠：7.5μg肽)在室温下温育30分钟。
用结合缓冲液洗涤珠4次，然后添加50mM的NaHCO3 pH 9.0以增加pH。将曲妥珠单抗的PBS pH 7.0(2.1nmol)溶液添加至珠中，混合物在室温下搅拌2小时，然后用结合缓冲液洗涤3-4次。将标记的曲妥珠单抗洗脱(100μl，0.1M甘氨酸，pH 2.5)至包含1：10体积比的中和缓冲液(1M磷酸盐缓冲液，pH 8.5)的收集管中。重复洗脱步骤，并合并级分。然后使用30kDa的MWCO 500离心浓缩器将洗脱的标记曲妥珠单抗用pH 7.0的PBS进行缓冲液交换。/>
序列表
<110> 德彪药业国际股份公司
<120> 反应性偶联物
<130> 239708
<140> EP PCT/EP2021/078181
<141> 2021-10-12
<160> 3
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 化合物的肽部分，如提交的申请中的式（7a）所示
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 其他基团或原子，Z1和Y1，如提交的申请的第XY-XY页所述
<220>
<221> 变体
<222> (2)..(2)
<223> 表示单个共价键或三官能氨基酸，诸如二氨基羧酸
<220>
<221> 变体
<222> (3)..(3)
<223> 表示氨基酸、二羧酸或所提交的申请的第XY页上由式（8a）表示的肽部分
<220>
<221> 二硫化物
<222> (4)..(14)
<223>
<220>
<221> 变体
<222> (5)..(5)
<223> 表示代表所提交的申请的第XY页所述的氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (6)..(10)
<223> 每个独立地代表氨基酸
<220>
<221> 变体
<222> (15)..(15)
<223> 表示氨基酸或所提交的申请的第XY页上由式（8b）表示的肽部分
<220>
<221> 变体
<222> (16)..(16)
<223> 表示单个共价键或三官能氨基酸，诸如二氨基羧酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 其他基团或原子，Z2和Y2，如提交的申请的XY-XY页所述
<400> 1
Xaa Xaa Xaa Cys Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Leu Val Trp Cys Xaa Xaa Xaa
1 5 10 15
<210> 2
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Fc-III-FAM, 如提交的申请的第XYZ页所示
<220>
<221> 二硫化物
<222> (2)..(12)
<223>
<220>
<221> MOD_RES
<222> (13)..(13)
<223> FAM 标记, 如提交的申请的第XYZ页所示
<400> 3
Asp Cys Ala Trp His Leu Gly Glu Leu Val Trp Cys Thr
1 5 10
<210> 3
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 参考载体，如提交的申请的第XYZ页所示
<220>
<221> MOD_RES
<222> (1)..(1)
<223> 乙酰化
<220>
<221> 变体
<222> (8)..(8)
<223> 代表赖氨酸或鸟氨酸
<220>
<221> MOD_RES
<222> (17)..(17)
<223> 酰胺化
<400> 1
Arg Gly Asn Cys Ala Tyr His Xaa Gly Gln Ile Ile Trp Cys Thr Tyr His
1 5 10 15

Claims (33)

1.一种式(1)的化合物：
V-(Y-P)n
(1)
其中，
V为包含载体的肽，所述载体能够与抗体或其片段的可结晶片段(Fc)区域相互作用，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中；
P为包括一个或多个有效载荷P1的基团；
Y为能够与氨基酸、优选赖氨酸的侧链反应的反应性部分，其中Y共价附接至包含在V中的氨基酸的侧链；以及
n为1至3的整数、优选1或2、最优选1。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，P为P1，或者P由下式(2a)、(2b)和(2c)中的一者表示：
P1-L-＊
(2a)
(P1-L)n’-K-＊
(2b)
(P1)n’-K-＊
(2c)
其中，
P1为有效载荷；
L为接头，其中所述接头任选地是可裂解的，并且其中优选所述接头包含选自碳、氮、氧、磷和硫的一个或多个原子；
K为支化基团，所述支化基团共价结合至基团Y、以及式(2b)中的两个或多个接头(L)或式(2c)中的两个或多个有效载荷(P1)，以形成树枝状结构；
n′为2至8的整数、优选2至4的整数、以及更优选为2；以及
*表示与反应性部分(Y)共价附接。
3.根据权利要求1或2所述的化合物，其中，P1选自：
(i)衍生自以下的部分
·发色团，其中所述发色团优选选自
ο磷光团，和
ο荧光团，诸如荧光素或罗丹明，
·标记部分，所述标记部分可以包括放射性核素，其中所述标记部分优选为含有或能够含有放射性核素的部分、更优选选自
o含有或能够含有诸如125I、123I、131I、11C、15O、18F的非金属放射性核素的标记部分，诸如衍生自含有诸如125I、123I或131I的放射性核素的4-羟基苯基丙酸酯的部分，以及
o螯合剂，所述螯合剂任选地包含螯合放射性核素，诸如衍生自二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、环己基二亚乙基三胺五乙酸(CH-X-DTPA)、去铁胺(DFO)、N1-(27-氨基-11,22-二羟基-7,10,18,21-四氧代-6,11,17,22-四氮杂二十七烷基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO')、N1-(5-(3-(4-氨基丁基)-1-羟基-2-氧代哌啶-3-羧酰胺基)戊基)-N1-羟基-N4-(5-(N-羟基-4-((5-(N-羟基乙酰胺基)戊基)氨基)-4-氧代丁酰胺基)戊基)琥珀酰亚胺(DFO-cyclo')、1-(1,3-羧丙基)-4,7-羧甲基-1,4,7-四乙酸(NODAGA)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1-戊二酸-4,7,10-三乙酸(DOTAGA)、2,2'-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4-二基)二乙酸盐(酯)(NO2A)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸(DOTA)、巯基乙酰-甘氨酰基-甘氨酰基-甘氨酸(maGGG)、巯基乙酰-丝氨酸-丝氨酸-丝氨酸(maSSS)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7,10-四乙酸-甲硫氨酸(DOTA-Met)、1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三乙酸(NOTA)、乙二胺四乙酸(EDTA)、乙二胺二乙酸、三亚乙基四胺六乙酸(TTHA)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷(环拉胺)、1,4,8,11-四氮杂环十四烷-1,4,8,11-四乙酸(TETA)、1,4,8,11-四氮杂双环[6.6.2]十六烷-4,11-二乙酸(CB-TE2A)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(DO3AM)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷-1,7-二乙酸(DO2A)、1,5,9-三氮杂环十二烷(TACD)、(3a1s,5a1s)-十二氢-3a,5a,8a,10a-四氮杂芘(顺式-乙二醛-环拉胺)、1,4,7-三氮杂环壬烷(TACN)、1,4,7,10-四氮杂环十二烷(轮环藤宁)、三(羟基吡啶酮)(THP)、3-(((4,7-双((羟基(羟甲基)磷酰基)甲基)-1,4,7-三唑烷-1-基)甲基)(羟基)磷酰基)丙酸(NOPO)、3,6,9,15-四氮杂双环[9.3.1]十五-1(15),11,13-三烯-3,6,9-三乙酸(PCTA)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酸(TRITA)、2,2',2”,2”'-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7,10-四基)四乙酰胺(TRITAM)、2,2',2”-(1,4,7,10-四氮杂环十三烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(TRITRAM)、反式-N-二甲基环拉胺、2,2',2”-(1,4,7-三氮杂环壬烷-1,4,7-三基)三乙酰胺(NOTAM)、氧环拉胺、二氧环拉胺、1,7-二氧杂-4,10-二氮杂环十二烷、交联桥环拉胺(CB-环拉胺)、三氮杂环壬烷次膦酸盐(酯)(TRAP)、双吡哆酸基二磷酸盐(酯)(DPDP)、内消旋-四-(4-磺酰基苯基)卟啉(TPPS4)、亚乙基双羟基苯基甘氨酸(EHPG)、六亚甲基二胺四乙酸、二甲基膦基甲烷(DMPE)、亚甲基二磷酸、二巯基琥珀酸(DMPA)、1,4,7,10-四氮杂-1,4,7,10-四(2-氨基甲酰基甲基)环十二烷(TCMC)或其衍生物；
(ii)包含选自以下的偶联基团的部分：任选取代的共轭二烯；任选取代的四嗪(TZ)；任选取代的炔烃或叠氮化物；任选取代的二苯并环辛烯(DBCO)；任选取代的反式-环辛烯(TCO)；任选取代的双环[6.1.0]壬炔(BCN)；任选取代的醛；任选取代的酮；任选取代的卤代乙酰胺；任选取代的马来酰亚胺；以及任选取代的或受保护的硫醇，所述硫醇优选用单甲氧基三苯甲基保护；
(iii)衍生自选自以下的药物的部分
·抗肿瘤剂，诸如
οDNA-烷化剂，诸如多卡霉素，
ο拓扑异构酶抑制剂，诸如多柔比星，
οRNA-聚合酶II抑制剂，诸如-鹅膏蕈碱，
οDNA裂解剂，诸如卡利奇霉素，
ο抗有丝分裂剂或微管干扰剂，诸如紫杉烷、澳瑞他汀或美登醇，
ο抗代谢物，诸如吉西他滨的衍生物，
ο纺锤体驱动蛋白抑制剂，诸如非兰尼塞，
ο激酶抑制剂，诸如帕他色替或吉非替尼，
ο烟酰胺磷酸核糖基转移酶抑制剂，诸如2241014-82-2，
ο基质金属肽酶9抑制剂，诸如CGS27023A的衍生物，
ο磷酸酶抑制剂，诸如微囊藻毒素-LR，
·免疫调节剂，诸如氟替卡松，
·抗感染性疾病剂，诸如利福霉素、克林霉素或瑞他莫林，以及
·上述任何物质的放射性同位素、代谢物、药学上可接受的盐和/或前药；
(iv)包含一个或多个增溶基团的部分，各增溶基团优选独立地选自由包含一个或多个离子基团的部分和聚环氧烷基团组成的基团，所述一个或多个离子基团诸如为铵基、硫酸盐基团或磺酸盐基团；其中所述部分优选包含一个或多个C2-3聚环氧烷基团，并且其中优选各C2-3聚环氧烷基团独立地包含4至600个、优选10至200个、更优选15至80个重复单元；
如果存在多于一个有效载荷(P1)，则各有效载荷P1独立地选自前述部分(i)至(iii)、或(i)至(iv)，所述有效载荷P1优选地是彼此相同的。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，P1是任选包含螯合放射性核素的螯合剂，所述螯合剂优选是衍生自DTPA、DOTA、DFO、NOTA、PCTA、CH-X-DTPA、NODAGA、DOTAGA、maSSS、maGGG或DOTA-甲硫氨酸的部分，更优选衍生自DOTA、DTPA、CH-X-DTPA、PCTA、NOTA或DFO的部分。
5.根据权利要求3或4所述的化合物，其中，所述放射性核素选自124I、131I、86Y、90Y、177Lu、111In、188Re、55Co、64Cu、67Cu、68Ga、89Zr、203Pb、212Pb、212Bi、213Bi、72As、211At、225Ac、223Ra、97Ru、149Tb、152Tb、161Tb、99mTc、226Th、227Th、201Tl、89Sr、44/43Sc、47Sc、153Sm、133Xe和Al18F，优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga、99mTc、203Pb、72As、55Co、97Ru、201Tl、152Tb、133Xe、86Y和Al18F，更优选选自89Zr、111In、64Cu、177Lu、68Ga和99mTc，最优选选自64Cu、99mTc和111In。
6.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，P1是衍生自以下的部分：依喜替康、DM 4、PNU-159682、鹅膏蕈碱、多卡霉素、澳瑞他汀、美登素、微管溶素、卡利奇霉素、SN-38、紫杉醇、微管溶素、道诺霉素、长春碱、多柔比星、甲氨蝶呤、吡咯并苯并二氮杂卓、吡咯类纺锤体驱动蛋白(KSP)抑制剂、吲哚啉苯并二氮杂卓二聚体或其放射性同位素和/或药学上可接受的盐；
如果存在多于一个的有效载荷(P1)，则各P1独立地选自权利要求3的前述部分(i)至(iii)、或(i)至(iv)，所述有效载荷优选地是彼此相同的。
7.根据权利要求1-3中任一项所述的化合物，其中，至少一个P1是衍生自包含一个或多个聚环氧乙烷基团的化合物的部分，其中优选各聚环氧乙烷基团独立地包含4-600个、更优选10-200个、甚至更优选15-80个重复单元；
P1优选是由下式(12c)表示的部分：
-X6-(CH2CH2O)n19’-X7 (12c)
其中，
n19′为4至600、优选10至200、更优选15至80的整数；
X6选自单个共价键、-(C＝O)-和-N(R)-，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；
X7表示具有1至6个碳原子的烷基，诸如甲基；含羰基的基团，诸如乙酰基或式-(CH2)n4-CO2H的基团；含硫代羰基的基团；式-(CH2)n4OR的基团；式-(CH2)n4-SO3H的基团；或含氨基的基团，诸如式-(CH2)n4-(C＝X)-N(R′)(R)或-(CH2)n4-N(R′)(R)；其中X为O或S，R和R′各自独立地选自氢原子、烷基或环烷基，n4为1至6的整数；
X7优选为-CH3，或由下式(12a′)表示的基团：
-(CH2)n5-(C＝X)N(R)-(CH2)n6-(C＝X)N(H)(R) (12a’)
其中，
各X独立地选自O和S，优选地为O，
各R独立地选自氢原子、烷基和环烷基，并且
n5和n6各自独立地为1至6的整数、优选为1或2；以及
X7最优选地为-CH3；
如果存在多于一个的有效载荷(P1)，则各P1独立地选自前述的权利要求3的部分(i)至(iv)，并且更优选地是上述式(12c)的部分，所述有效载荷优选地彼此相同。
8.根据权利要求2-7中任一项所述的化合物，其中，所述接头(L)选自：
(a1)具有1至12个碳原子的亚烷基，优选具有2至6个碳原子的亚烷基，例如亚丙基；
(b1)具有2或3个碳原子、且具有1至36个重复单元的聚环氧烷基团；优选由下式表示的基团
-NH-(CH2CH2O)n1-CH2CH2-
其中n1为0至35的整数，例如1至20的整数；
(c1)包含2至12个氨基酸的肽基团；
所述接头(L)优选为如上定义的(b1)基团；
如果式(1)的化合物包含多于一个的接头(L)，则各L独立地选自前述(a1)至(c1)基团，各接头(L)优选为(b1)基团。
9.根据权利要求2-8中任一项所述的化合物，其中，所述支化基团(K)由式*-CH(R1-**)(R2-**)(3a)、或下式(3b)表示，
其中，
R1和R2各自独立地选自由-(CH2)m1-**和-(CH2)m1R3-**组成的组；
R3选自由-NH-**、-(C＝X)R4-**和-NH(C＝X)R4-**组成的组，并且优选为-NH-**或-NH(C＝X)R4-**；
R4为-(CH2)m2-**、-(CH2)m2S-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH-**、或式(3c)芳基：
R5和R6各自独立地选自–(CH2)m2-**、-(CH2)m2S**-、-CH(CH2S-**)2、-(CH2)m2NH-**、-CH(R7-**)2、-(CH2)m2NH(C＝X)R8-**和-CH2(CH2)m2H-**；
R7为-CH2S-**、(CH2)m2-**或-(CH2)m2R9-**；
R8为-(CH2)m3S-**；
R9为-NH(C＝X)m3S-**；
各X独立地选自O和S，并且优选为O；
*表示与反应性部分(Y)共价附接，任选地经由接头(L2)附接；
**表示在式(2b)中与接头(L)共价附接，或在式(2c)中与有效载荷(P1)共价附接；
m1、m2和m3各自独立地选自0、1、2和3，条件是，如果K为式(3a)，则m1不为0；每个m1、m2和m3优选为1。
10.根据权利要求2-9中任一项所述的化合物，其中，所述支化基团(K)由下式(3d)至(3l)中的一个表示：
其中
m1为0、1、2或3，优选为1；
m2为1、2、3或4，优选为1；
m3为0、1、2或3，优选为1；
*表示与反应性部分(Y)共价附接；以及
**表示与接头(L)或有效载荷(P1)共价附接；
所述支化基团(K)优选由式(3d)表示。
11.根据权利要求2-8中任一项所述的化合物，其中，所述支化基团(K)由下式(3m)表示：
其中，
m4为1至10的整数、优选1至6的整数、更优选1、2或3；
各AA1独立地是衍生自三官能氨基酸、诸如，二氨基羧酸的部分，其中优选各AA1独立地是衍生自Orn、Lys、Dab或Dap的部分、更优选衍生自Orn或Lys的部分；源自三官能氨基酸的侧链共价附接至式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有效载荷(P1)；
G不存在，或表示选自以下的一者：
·氢原子，
·式–N(H)(R)的基团，其中R选自氢原子、烷基和环烷基；以及
·式–N(H)(R)–(CH2)n13–(C＝O)N(H)(R)的基团，其中各R独立地选自氢原子、烷基和环烷基，并且n13为1至6的整数，优选1或2；
如果G不存在，则所得到的游离价与式(2b)中的接头(L)或式(2c)中的有效载荷(P1)形成共价键；
*表示与反应性部分(Y)共价附接；以及
**表示与接头(L)或有效载荷(P1)共价附接；
条件是如果m4为1，则G不存在。
12.根据权利要求1-11中任一项所述的化合物，其中，所述反应性部分(Y)由下式(4a)和(4b)中的一个表示：
＊'-F1-RC-F2-＊＊＊ (4a)
＊'-(F1-RC-F2)-M-＊＊＊ (4b)
其中，
RC是反应中心，优选亲电反应中心，并且更优选选自C＝O和C＝S的基团；
F1为单个共价键、原子或原子基团；优选为CH2或NH原子基团或选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为CH2原子基团或选自O和S的原子；
F2表示原子或原子基团；优选为选自O和S的原子、或包含选自C、N、O和S的一个或多个原子的原子基团；更优选为选自O和S的原子；
M为能够调节F2的电子密度和稳定性的基团，优选为能够吸电子的基团；
*′表示与基团(P)共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接；
反应性部分(Y)优选由式(4b)表示。
13.根据权利要求12所述的化合物，其中，能够调节F2的电子密度和稳定性的基团(M)由下式(4c)表示：
＊＊＊‘--M’-B-E--＊＊＊ (4c)
其中，
M’为衍生自琥珀酰亚胺，或分别具有6、10或14元环和1、2或3个稠环的芳基，或具有5至20元环、1、2或3个稠环和独立选自N、O和S的1至4个杂原子的杂芳基的部分，各基团任选地被一个或多个取代基取代；优选为衍生自苯基、萘基、吡啶基、喹啉基、异喹啉基或苯并三唑基的二价基团，各基团任选被一个或多个取代基取代，并且各取代基优选选自-F、-Br、-Cl、-I、-NO2、-CN、-C1-6-烷基、-C1-6-烷氧基、诸如，-C(O)NH2的-C1-6-氨基、以及它们的组合，诸如-CCl3、-CF3或-CH2NO2；
B选自以下以及它们的任何组合：
·单个共价键、O、S或原子基团NR′，其中R′表示氢原子、-OH、烷基、环烷基、C2-6-亚烯基或C2-6-亚炔基；
·由通式(4d)表示的基团：
◆-X1-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-◆◆ (4d)
其中
X1为-C(＝O)NH-、-C(＝O)-、-NH-或-S-；优选为-C(＝O)NH-；
n2为1至24、优选为1至10、更优选为1至3的整数；
◆表示与M’共价附接，并且
◆◆表示与E共价附接；
·在主链中具有6至25个氨基酸、例如在主链中具有9个氨基酸的肽基团，各氨基酸优选选自Pro、Gly、Ala、Asn、Asp、Thr、Glu、Gln和Ser；更优选选自Pro、Gly和Ser；
其中，B优选为单个共价键、或具有通式(4d)的基团，更优选为单个共价键；
E为C＝O、C＝S或C(＝NR”)，其中R”表示氢原子、OH、烷基、环烷基、S＝O或S(＝O)2；优选E为C＝O；
***’表示与F2共价附接，并且
***表示与肽(V)共价附接。
14.根据权利要求12或13所述的化合物，其中，所述部分(F1-RC-F2)由以下式(4a’)至(4l’)中的一者表示、和/或所述基团(M)由以下式(5a’至(5i’)中的一者表示：
/>
其中，
*’表示与基团(P)共价附接，
***表示与肽(V)共价附接，或如果M存在，则与基团(M)共价附接，并且
***’表示与反应性部分(Y)的F2共价附接。
15.根据权利要求1-14中任一项所述的化合物，其中，所述反应性部分(Y)由下式(6a)-(6l’)中的一者表示：
/>
/>
其中，
*’表示与基团(P)共价附接；并且
***表示与肽(V)共价附接。
16.根据权利要求1-15中任一项所述的化合物，其中，所述肽(V)包含11至17个氨基酸、例如13至17个氨基酸的序列，所述肽优选为环状，更优选由下式(7a)表示：
其中，
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、高酪氨酸(hTyr)和间酪氨酸(mTyr)的氨基酸；优选选自Lys、高赖氨酸(hLys)、鸟氨酸(Orn)、2,3-二氨基丙酸(Dap)、2,4-二氨基丁酸(Dab)、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；更优选为Ala；
·Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx各自独立地表示氨基酸；
·Axx表示氨基酸、二羧酸或由下式(8a)表示的肽部分：
---Axx1–Axx2–Axx3---(8a)
其中，在式(8a)中，
Axx1表示单个共价键或氨基酸，诸如Arg；
Axx2表示氨基酸，诸如Gly或Cys、优选为Gly；以及
Axx3表示氨基酸，诸如Asp或Asn；
·Hxx表示氨基酸或由下式(8b)表示的肽部分：
---Hxx1–Hxx2–Hxx3---(8b)
其中，在式(8b)中，
Hxx1表示氨基酸，诸如Thr；
Hxx2表示单个共价键或氨基酸，诸如Tyr或Cys；以及
Hxx3表示单个共价键或氨基酸，诸如His；并且Axx2的侧链可以共价附接至Hxx2的侧链以形成环；
其中，优选Hxx2和Hxx3两者表示单个共价键；
·如果Axx2为Cys且Hxx2为Cys，则优选将Axx2和Hxx2的侧链链接在一起以形成式–(S–X3–S)–的基团，其中X3表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，例如二价马来酰亚胺基、二价丙酮基或二价亚芳基；优选X3表示单个共价键；
·Lxx1和Lxx2各自独立地表示单个共价键或三官能氨基酸，例如二氨基羧酸；条件是Lxx1和Lxx2中的至少一个是单个共价键；
·Z1表示
ο如果Lxx1为单个共价键，则Z1表示共价附接至Axx的N-末端的基团，所述基团选自氢原子、诸如乙酰基的含羰基的基团、含C2-3聚环氧烷的基团和衍生自含有偶联基团的化合物的基团，所述偶联基团诸如为生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
ο如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1附接至Lxx1的侧链，则Z1表示共价附接至Lxx1的N-末端的基团，所述基团选自氢原子、诸如乙酰基的含羰基的基团和含C2-3聚环氧烷的基团；并且
ο如果Lxx1为三官能氨基酸且Y1共价附接至Lxx1的N-末端，则Z1表示共价附接至Lxx1的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团；
·Z2表示
ο如果Lxx2是单个共价键，则Z2表示共价附接至Hxx的C-末端的基团，所述基团选自-N(H)(R)，其中R表示氢原子、烷基或环烷基、含C2-3聚环氧烷的基团、和衍生自含有偶联基团的化合物的基团，所述偶联基团诸如为生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺或硫醇，其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
ο如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的侧链，则Z2表示共价附接至Lxx2的C-末端的基团，所述基团优选为含C2-3聚环氧烷的基团、由N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；并且
ο如果Lxx2为三官能氨基酸且Y2共价附接至Lxx2的C-末端，则Z2表示共价附接至Lxx2的侧链的氢原子或含C2-3聚环氧烷的基团；
·Y1表示仅当Lxx1为三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z1附接至Lxx1的N-末端，则Y1共价附接至Lxx1的侧链，或者如果Z1附接至Lxx1的侧链，则Y1共价附接至Lxx1的N-末端；
其中Y1衍生自含有偶联基团的化合物，所述偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·Y2表示仅当Lxx2是三官能氨基酸时才存在的部分，其中如果Z2附接至Lxx2的C-末端，则Y2共价附接至Lxx2的侧链，或者如果Z2附接至Lxx2的侧链，则Y2共价附接至Lxx2的C-末端；
其中Y2衍生自含有偶联基团的化合物，所述偶联基团优选选自生物素、DBCO、TCO、TZ、BCN、炔烃、叠氮化物、溴乙酰胺、马来酰亚胺和硫醇，并且其中所述偶联基团任选地通过间隔基(S1)附接；
·S1是由下式(8c)表示的间隔基：
α-X4-(CH2CH2O)n2-CH2CH2-X5-β (8c)
其中
X4为NH、O或S；优选为NH；
如果X5共价附接至肽(V)，则X5为NH或C＝O，优选为C＝O；
n2为1至46、优选1至24、最优选1至12的整数；并且
如果X5共价附接至肽(V)，则α表示与Y1或Y2共价附接，或者如果X5共价附接至Y1或Y2，则α表示与肽(V)共价附接；并且
如果X4共价附接至Y1或Y2，则β表示与肽(V)共价附接，或者如果X4共价附接至肽(V)，则β表示与Y1或Y2共价附接；
·X2表示单个共价键或包含选自碳、氮和氧的一个或多个原子的二价基团，诸如二价马来酰亚胺基团、二价丙酮基团或二价亚芳基；优选为单个共价键；
·其中Axx、Bxx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx和Hxx中的至少一种、优选Bxx、Dxx、Exx、Fxx和Gxx中的一种或多种、更优选Bxx、Exx和Gxx中的一种或多种、最优选Bxx和/或Exx表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸，更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，所述氨基酸通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)；条件是所述肽(V)不包含多于三个具有含氨基侧链的氨基酸；并且
如果所述反应性部分(Y)通过Tyr、hTyr或mTyr附接到所述肽(V)，则所述反应性部分(Y)优选为权利要求10中定义的式(4a)的部分。
17.根据权利要求16所述的化合物，其中，Axx、Cxx、Dxx、Exx、Fxx、Gxx、Hxx、Lxx1和Lxx2中的至少一者如下定义：
Axx表示选自Ala、2,3-二氨基-丙酸(Dap)、Asp、Glu、2-氨基辛二酸、α-氨基丁酸、Asn和Gln的氨基酸，选自琥珀酸、戊二酸和己二酸的二羧酸，或者式(8a)的肽部分；Axx优选为Ala、Asp或Asn，更优选为Asp；其中Axx1是单个共价键，Axx2是Cys，且Axx3是Asp；
Cxx表示选自Trp、Phe、Tyr、苯基甘氨酸(Phg)、3-苯并噻吩-2-基-L-丙氨酸、3-萘-2-基-L-丙氨酸、3-联苯-4-基-L-丙氨酸和3-萘-1-基-L-丙氨酸的氨基酸；优选为Trp；
Dxx表示选自His、Ala、3-吡啶-2-基-L-丙氨酸、mTyr和Phe的氨基酸；优选为His、Ala或mTyr；更优选为His；
Exx表示选自Ala、2-氨基-丁酸(Abu)、Gly、Leu、Ile、Val、Met、环己基丙氨酸(Cha)、Phe、Thr、Cys、Tyr和正亮氨酸(Nle)的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；
Fxx表示选自Ala、Gly、Asn、Ser、Abu和Asp的氨基酸；优选为Ala或Gly；更优选为Gly；
Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；优选为Asp或Glu；更优选为Glu；
Hxx表示选自Thr、Ser、Ala、Asn、Val、Abu、Ile、Met、Leu、Pro、Gln和Cys的氨基酸，或者式(8b)的肽部分；Hxx优选为Thr或Ser，更优选为Thr；其中Hxx1为Thr，Hxx2为Cys，Hxx3为单个共价键；
Lxx1和Lxx2各自独立地表示选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸，优选为选自Dap、Dab、Lys、Orn和hLys的氨基酸；并且
如果Dxx或Exx表示通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，则Gxx优选为Glu、Gln、His、Arg或Asn，且更优选为Gln。
18.权利要求1-17中任一项的化合物，其中，所述肽(V)由下式(9a)表示：
其中，
·Z1、Z2、Bxx、Exx、Gxx和X2如权利要求16所定义的；以及
·Bxx、Exx和Gxx中的至少一者、优选Bxx和/或Exx表示具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr；优选具有含氨基侧链的氨基酸；且更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸；所述氨基酸通过其侧链共价结合至反应性部分(Y)；并且
·如果Exx表示具有通过其侧链共价附接至反应性部分(Y)的具有含氨基侧链的氨基酸、Tyr、hTyr或mTyr，优选具有含氨基侧链的氨基酸，并且更优选选自Lys、hLys、Orn、Dap和Dab的氨基酸，则Gxx优选为Glu、Gln、His、Arg或Asn，更优选为Gln；
并且优选地，Bxx、Exx和Gxx中的一个或两个如下定义：
·Bxx表示选自具有含氨基侧链的氨基酸、Ala、Tyr、hTyr和mTyr的氨基酸；优选为Lys、hLys、Orn、Dap、Dab、Ala、Tyr、hTyr或mTyr；
更优选为Ala；
·Exx表示选自Ala、Abu、Gly、Leu、Ile、Val、Met、Cha、Phe、Thr、Cys、Tyr和Nle的氨基酸；优选为Ala、Nle或Leu；更优选为Leu；并且
·Gxx表示选自Ala、Glu、Asp、Gln、His、Arg、Ser和Asn的氨基酸；优选为Asp或Glu；更优选为Glu。
19.根据权利要求1-18中任一项所述的化合物，其中，所述肽(V)由下式(10a)-(10v)、(10b’)和(10g’)中的一者表示：
/>
/>
/>
其中，
Z1、Z2和X2如权利要求14所定义的；并且
在式(10a)至(10v)、(10b’)和(10g’)中，所述肽(V)通过包含在V中的Tyr、Lys、hLys、Orn、Dap或Dab的侧链共价附接至所述反应性部分(Y)；
所述肽(V)优选由式(10a)、(10b)、(10b’)(10c)、(10e)、(10f)、(10g)、(10g’)(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10m)、(10n)、(10p)、(10q)、(10s)、(10t)和(10u)中的任一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任一者表示，且甚至更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任一者表示。
20.根据权利要求16-19中任一项所述的化合物，其中，Z1和Z2中的至少一者是含C2-3聚环氧烷的基团，优选为含聚环氧乙烷的基团，所述含C2-3聚环氧烷的基团优选包含4至600个、更优选10至200个、甚至更优选15至80个重复单元；
其中，
Z1优选由下式(13a)表示：
X8-(OCH2CH2)n7-X9- (13a)
其中
X8表示具有1至6个碳原子的烷基、例如，乙基，或者含氨基的基团；优选为式(CH2)n8–N(H)(R)的基团，其中R选自氢原子、烷基、环烷基和诸如乙酰基的含羰基的基团，n8为1至6的整数，优选为2；
X9表示-(C＝X)-，X选自O和S，优选为O；并且
n7为4至100、优选为10至80、更优选为15至40的整数、最优选为20或24；
和/或
Z2优选由下式(13b)表示：
-X10-(CH2CH2O)n9-X11 (13b)
其中
n9为4至100、优选10至80、更优选15至40的整数；
X10为单个共价键NH、O或S；优选NH；
X11表示：具有1至6个碳原子的烷基，诸如甲基；含羰基的基团，诸如，乙酰基或式-(CH2)n10-CO2H的基团；含硫代羰基的基团；式-(CH2)n10OR的基团；式-(CH2)n10-SO3H的基团；或含氨基的基团，诸如式-(CH2)n10-(C＝X)-N(R’)(R)或-(CH2)n10-N(R’)(R)，其中X为O或S，R和R’各自独立地选自氢原子、烷基或环烷基，且n10为1至6的整数；
X11优选为甲基，或由-CH3或下式(13b’)表示的基团：
-(CH2)n11-(C＝X)N(R)-(CH2)n12-(C＝X)N(H)(R) (13b’)
其中
各X独立地选自O和S，优选为O；
各R独立地选自氢原子、烷基和环烷基；并且
n11和n12各自独立地为1至6的整数、优选为1或2、更优选为2；
X11最优选为-CH3。
21.根据权利要求20所述的化合物，其中Z1是包含10-200个、优选15-80个重复单元的含聚环氧乙烷的基团，更优选权利要求20中定义的式(13a)基团，并且Z2是由-N(H)(R)表示的基团，其中R表示氢原子、烷基或环烷基；以及
其中，所述肽(V)优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)、(10k)、(10t)和(10u)中的任一者表示，更优选由式(10e)、(10f)、(10g)、(10h)、(10i)、(10j)和(10k)中的任一者表示，且甚至更优选由式(10f)表示。
22.根据权利要求1-21中任一项所述的化合物，所述化合物选自由以下组成的组
/>
/>
/>
23.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，所述试剂盒包含权利要求1-22中任一项所述的化合物、以及缓冲液；其中缓冲液的pH优选为5.5至11、更优选为7.0至9.5。
24.根据权利要求23所述的用于区域选择性修饰抗体或其片段的试剂盒，其中，所述化合物被固定在固相基质上，优选其中所述化合物通过生物素-链霉亲和素相互作用、通过炔烃和叠氮化物之间的点击反应获得的共价键、通过硫醇和乙酰胺之间的反应获得的共价键、通过TCO的衍生物和TZ的衍生物之间的反应获得的共价键或通过硫醇和马来酰亚胺之间的反应获得的共价键而固定在固体支承物上。
25.一种用于区域选择性修饰抗体或其片段的方法，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，所述方法包括使抗体或其片段与权利要求1-22中任一项所述的化合物反应。
26.根据权利要求25所述的方法，其中
·所述抗体是单克隆抗体，优选为选自以下组成的组的抗体：阿达木单抗、阿杜那单抗、阿仑单抗、喷替酸阿妥莫单抗、阿特珠单抗、阿奈妥单抗、阿维鲁单抗、巴匹组单抗、巴利昔单抗、贝妥莫单抗、贝迈奇单抗、贝西索单抗、贝伐珠单抗、贝洛托舒单抗、本妥昔单抗、维布妥昔单抗、布罗达单抗、卡妥索单抗、西米普利单抗、西妥昔单抗、辛帕奈单抗、克利妥珠单抗、克雷内治单抗、轮环藤宁四乙酸、达利珠单抗、达雷妥尤单抗、地诺单抗、地努妥昔单抗、德瓦鲁单抗、依决洛单抗、埃罗妥珠单抗、依帕伐单抗、恩弗妥单抗、维汀-恩弗妥单抗、依帕珠单抗、依帕珠单抗-SN38、埃达组单抗、吉妥珠单抗、吉妥珠单抗奥唑米星、吉妥昔单抗、戈奈单抗、替伊莫单抗、英比利珠单抗、英夫利昔单抗、英妥珠单抗、奥英妥珠单抗、伊匹单抗、艾萨妥昔单抗、伊西贝单抗、J591 PSMA-抗体、拉贝珠单抗、莱卡单抗、莫格利珠单抗、奈昔妥珠单抗、尼妥珠单抗、那他珠单抗、纳武单抗、奥瑞珠单抗、奥法木单抗、奥拉单抗、奥戈伏单抗、帕尼单抗、派姆单抗、帕妥珠单抗、泊洛妥珠单抗、维博妥珠单抗、普尼珠单抗、雷妥莫单抗、雷莫芦单抗、利妥昔单抗、赛妥珠单抗、戈沙妥组单抗、西瑞奈单抗、司妥昔单抗、茄尼醇单抗、他珠单抗、替妥木单抗、替拉奈单抗、托珠单抗、托西莫单抗、曲妥珠单抗、德喜曲妥珠单抗、恩美曲妥珠单抗、TS23、乌司奴单抗、维多珠单抗、伏妥莫单抗、泽格特奈单抗、扎芦木单抗、扎木单抗、及其片段和衍生物；更优选为阿特珠单抗、德瓦鲁单抗、派姆单抗、利妥昔单抗或曲妥珠单抗；或者
·将所述抗体片段掺入至Fc-融合蛋白中，所述Fc-融合蛋白优选选自贝拉西普、阿柏西普、ziv-阿柏西普、度拉糖肽、利钠西普、罗米司亭、阿巴西普和阿法西普。
27.一种修饰抗体或修饰抗体片段，所述修饰抗体或修饰抗体片段是通过使抗体或抗体片段与权利要求1-22中任一项的化合物反应可获得的，所述抗体片段任选地掺入Fc-融合蛋白中，其中所述抗体或抗体片段优选与权利要求26中所述的抗体或抗体片段相同。
28.根据权利要求27所述的修饰抗体或修饰抗体片段，所述修饰抗体或修饰抗体片段由下式(11)表示：
(P-W)p-A (11)
其中，
P为包含根据权利要求3至7中任一项指定的一种或多种有效载荷(P1)的基团，其中P优选是式(2a)的基团；
W为F1-RC’，其中F1附接至P上，且RC’是衍生自附接至A的反应中心(RC)的部分，F1和RC如式(4a)和(4b)所定义；
A为衍生自任选掺入Fc-融合蛋白中的抗体或抗体片段的部分，所述抗体或抗体片段为如上权利要求25或26指定的抗体或抗体片段；并且
p为1至5、优选p为1至3的整数，更优选为1或2。
29.根据权利要求27或28所述的修饰抗体或修饰抗体片段，所述修饰抗体或修饰抗体片段用于诊断、监测、成像或治疗疾病和/或监测或成像其治疗的方法，所述方法包括将所述修饰抗体或修饰抗体片段施用至受试者。
30.一种用于诊断、监测、成像或治疗疾病的方法，所述方法包括将根据权利要求27或28所述的修饰抗体或修饰抗体片段施用至有需要的受试者。
31.根据权利要求29所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据权利要求30所述的方法，其中，所述疾病是神经系统疾病、心血管疾病、自身免疫性疾病或癌症。
32.根据权利要求29或31所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据权利要求30或31所述的方法，其中，所述疾病或其治疗选自由以下组成的组：阿尔茨海默病、肌萎缩侧索硬化症、脑动脉硬化、脑病、亨廷顿氏病、多发性硬化症、帕金森病、进行性多灶性白质脑病、系统性红斑狼疮、系统性硬化症、包括不稳定型心绞痛的心绞痛、主动脉瘤、动脉粥样硬化、心脏移植、心脏毒性诊断、冠状动脉旁路移植术、包括心房颤动终止的收缩性心力衰竭的心脏衰竭、高胆固醇血症、缺血、心肌梗死、血栓栓塞、血栓形成、强直性脊柱炎、自身免疫性血细胞减少症、自身免疫性心肌炎、克罗恩病、移植物抗宿主病、肉芽肿病伴多血管炎、特发性血小板减少性紫癜、幼年关节炎、幼年糖尿病(T1型糖尿病)、狼疮、显微镜下多血管炎、多发性硬化、斑块型银屑病、银屑病、银屑病关节炎、类风湿性关节炎、溃疡性结肠炎(UC)、葡萄膜炎和血管炎。
33.根据权利要求29或31所述的用于使用的修饰抗体或修饰抗体片段，或根据权利要求30或31所述的方法，其中，所述疾病是癌症，并且所述疾病涉及选自以下的细胞：淋巴瘤细胞、骨髓瘤细胞、肾癌细胞、乳腺癌细胞、前列腺癌细胞的细胞、卵巢癌细胞、结直肠癌细胞、胃癌细胞、鳞状癌细胞、肺癌细胞、睾丸癌细胞、胰腺癌细胞、肝癌细胞、黑色素瘤、头颈癌细胞、以及以不受调节和加快速度生长和分裂而导致癌症的任何细胞；优选选自乳腺癌细胞、肺癌细胞、淋巴瘤细胞、结肠直肠癌细胞和头颈癌细胞。
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