CN116626010B - 白酒中醇类物质以及金属汞的检测方法 - Google Patents

Abstract

白酒中醇类物质以及金属汞的检测方法，它涉及检测领域。本发明的目的是提供一种采用阿莫西林碳纳米点鉴别和定量检测白酒中甲醇等醇类物质、金属汞及其含量方法。本发明以阿莫西林为唯一前驱体，采用一步微波法快速合成了阿莫西林碳纳米点。阿莫西林碳纳米点保留了阿莫西林的部分结构和抗菌性能，具有低生物毒性、良好的抗菌活性和较好的稳定性。同时，阿莫西林碳纳米点可以通过荧光强度变化快速简便实现汞的检测，检出限为1.07μM。也可以定性定量区分一元醇和邻位二元醇类化合物及含量，特别是在一定范围内鉴别和定量检测乙醇中甲醇及其含量。抗菌阿莫西林碳纳米点的多种功能在抗菌及汞，甲醇及其他几种醇类检测方面具有良好的应用前景。

Description

白酒中醇类物质以及金属汞的检测方法

技术领域

本发明属于检测领域，具体涉及白酒中醇类物质以及金属汞的检测方法。

背景技术

抗生素是临床中应用最广泛的抗菌治疗药。它们主要作用于细菌的生长过程(如抑制细胞壁的合成，干扰重要的蛋白质、DNA和RNA的合成)。目前，抗菌纳米药物因其独特的尺寸、微观特性、抑菌活性和较低的细菌耐药性而受到广泛的关注和研究。阿莫西林又名安莫西林或安默西林，是一种最常用的青霉素类广谱β-内酰胺类抗生素，具有抗菌活性高，生物毒性低的特点。

随着人们生活水平、质量日益提高，白酒成为人们不可或缺的食品之一，但利用工业白酒对白酒进行勾兑，导致白酒中甲醇含量超标，对人体健康造成了较为严重的伤害。如果长期饮用含有大量甲醇的白酒，将对人体视神经系统、视网膜和内脏造成极大的危害，轻则恶心、头痛，重则失明甚至死亡。气相色谱法、高效液相色谱法、比色法是常用的几种测定白酒中甲醇含量的检测方法，较为复杂。

专利公开号CN114813672A，一种利用红光碳量子点荧光探针检测白酒乙醇浓度的方法，公开了以对苯二胺(PPD)和柠檬酸(CA)作为原料，在高温高压的条件下通过一步水热法直接制备获得了碳量子点，该碳量子点的最佳激发波长是500nm，发射波长为620nm，在紫外灯(365nm)的照射下该碳量子点发红光；将该碳量子点用于白酒的酒精度检测。通过补偿调控白酒的pH值，该碳量子点可作为荧光探针用于白酒酒精度的精确检测。

该专利采用的碳量子点并不具备抗菌，低生物毒性特点，且仅能用于检测白酒中的乙醇。

重金属污染对环境和人类的身体健康构成了严重威胁，如何简便、快速、有效地检测环境中有毒重金属的含量已经成为一个亟待解决的问题。汞作为最常见的有毒重金属,其来源主要集中在以化石燃料为动力的行业及火力发电等。在Hg²⁺检测方面，有Li等用未经修饰的碳点(直径约为3.8nm，通过热分解乙二胺四乙酸二钠[EDTA]制备得到)对金属Hg²⁺进行了检测。近年来，荧光传感技术由于具有无损检测、超灵敏、响应速度快等优点，其应用受到了广泛的关注，已经开发出部分传感器实现了Hg²⁺的灵敏、选择性检测。具有独特荧光特性的碳纳米点由于其制备来源广泛、成本低、环境友好、生物相容性高、生物毒性低，近十年来被广泛应用于疾病治疗、药物输送、生物成像和化学传感器等领域。以碳纳米点为基础材料构建的荧光传感器得到更广泛的关注与检测应用。

如专利公开号CN115520853A，一种碳纳米点及其制备方法与在检测汞离子中的应用，公开了：将陈皮粉加入超纯水中，搅拌混合，加热，冷却，离心，用透析膜透析。一种检测汞离子的方法包括：将碳纳米点溶于去离子水中得到浓度为0.6mg/mL的碳纳米点溶液，将碳纳米点溶液加入磷酸盐缓冲溶液中，再加入待测样品，孵化，用340nm的激发波长记录荧光发射光谱。本发明的碳纳米点的制备方法具有原料便宜、环境友好、反应条件温和等优点。碳纳米点具有良好的光稳定性及较强的抗光漂白能力。检测汞离子的方法不仅能精确检测到汞离子的浓度，还能够让汞离子的回收率达93～112％。该专利采用陈皮制备的碳纳米点并不具有抗菌以及低生物毒性的特点。

发明内容

本发明的目的是为了解决目前白酒中醇类物质，以及金属汞检测中并不具有能够检测出白酒中多种醇类物质且具有抗菌以及低生物毒性的碳纳米点的问题，而提供一种采用阿莫西林碳纳米点鉴别和定量检测白酒中甲醇等醇类物质以及金属汞的检测方法。

本发明的白酒中醇类物质的检测方法，所述的检测方法是采用阿莫西林碳纳米点实现的，具体检测方法：

阿莫西林碳纳米点溶液与白酒共混，在380nm或420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，检出限为1.07μM。

进一步地，所述的阿莫西林溶液的浓度为0.1～2mg/mL。

进一步地，所述的阿莫西林碳纳米点是通过如下方式制备的：

在450～900W的微波功率下，加热处理阿莫西林溶液3～20min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管进行两次离心，得到黄色的阿莫西林碳纳米点溶液，4℃保存备用。

进一步地，所述的微波功率为720W。

进一步地，所述的加热处理阿莫西林溶液10min。

进一步地，所述的醇类物质为甲醇、乙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇或异丙醇。

本发明金属汞的检测方法，所述的检测方法是采用阿莫西林碳纳米点实现的，具体检测方法：

阿莫西林碳纳米点溶液与含汞溶液共混，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，检出限为1.07μM。

进一步地，所述的阿莫西林碳纳米点是通过如下方式制备的：

在450～900W的微波功率下，加热处理阿莫西林溶液3～20min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管进行两次离心，得到黄色的阿莫西林碳纳米点溶液，4℃保存备用。

进一步地，所述的阿莫西林碳纳米点溶液浓度为4mg/mL；所述的含汞溶液中汞的浓度为4～200μmol/L。

本发明所制备的阿莫西林碳纳米点用于制备提高抑菌效果且持续抑菌、低细胞毒性的试剂；或者，所制备的阿莫西林碳纳米点用于制备耐盐性、抗光漂白性的碳纳米点。

本发明包含以下有益效果：

本发明以阿莫西林为唯一前驱体，采用一步微波法快速合成了阿莫西林碳纳米点。阿莫西林碳纳米点保留了阿莫西林的部分结构和抗菌性能，具有低生物毒性、良好的抗菌活性和较好的稳定性。同时，阿莫西林碳纳米点可以通过荧光强度变化快速简便实现汞的检测，检出限为1.07μM。也可以定性定量区分一元醇和邻位二元醇类化合物及含量(如，1，3-丙二醇质量分数检出限为1％，1，2-戊二醇质量分数检出限10％，1，2-己二醇质量分数检出限为5％)，特别是在一定范围内鉴别和定量检测白酒中甲醇及其含量。抗菌阿莫西林碳纳米点的多种功能在抗菌及汞、甲醇及其他几种醇类检测方面具有良好的应用前景。

本发明阿莫西林碳纳米点的直径集中在1.78±0.59nm，细胞毒性低，并表现出明显碳点的激发依赖特性。由于阿莫西林碳纳米点在形成过程中保留了阿莫西林的部分结构，因此它具有良好的抗菌活性和较低的生物毒性。同时，基于荧光传感特性，阿莫西林碳纳米点可以快速检测金属汞、一元醇和邻位二元醇类化合物及含量。为进一步检测区分甲醇及其他几种醇类提供一种新的检测材料。

附图说明

图1为阿莫西林碳纳米点的表征分析图；(a)制备的阿莫西林碳纳米点的TEM图像和尺寸分布图；(b)阿莫西林碳纳米点在330～450nm不同激发波长下的归一化荧光光谱；(c)阿莫西林碳纳米点的荧光衰减曲线；(d)阿莫西林(黑线)和阿莫西林碳纳米点(红线)在水溶液中的紫外-可见吸收光谱；(e)阿莫西林(黑线)和阿莫西林碳纳米点(红线)的FT-IR光谱；(f)阿莫西林碳纳米点的XPS谱：高分辨阿莫西林碳纳米点的高分辨XPS光谱C1s谱(g)、O1s谱(h)、N1s谱(i)、S2p谱(j)；(k)高分辨阿莫西林碳纳米点的高分辨XPS光谱O1s谱；

图2阿莫西林碳纳米点的紫外、可见光照片，紫外-可见吸收光谱以及荧光光谱图；(a)不同时间(3、5、10、15和20min)合成的阿莫西林碳纳米点在可见光(左)和365nm紫外灯下(右)的照片；(b)阿莫西林碳纳米点在不同合成时间(3、5、15和20min)下，在330～450nm的不同激发波长下的荧光光谱图；(c)阿莫西林碳纳米点在不同合成时间(3、5、15和20min)下，在水溶液中的紫外-可见吸收光谱；

图3阿莫西林碳纳米点的抗菌效果图；(a)用不同合成时间(3、5、10、15和20min)的阿莫西林碳纳米点和阿莫西林对大肠杆菌进行抗菌平板实验的照片，比例尺为1cm；(b)前述抑菌平板对应的抑菌区直径简图；

图4大肠杆菌与阿莫西林、阿莫西林碳纳米点共孵育6h的荧光成像图(左)，激发波长为488nm(右)，比例尺为200μm；

图5阿莫西林碳纳米点的体外生物毒性图；(a)LO2、HEK293T、HCM和MC3T3-E1细胞在不同浓度的阿莫西林碳纳米点(0、50、100、150和200μg/mL)培养48h；(b)MC3T3-E1细胞与阿莫西林碳纳米点共孵育6、12和24h的荧光成像图(左)，激发波长为488nm(右)，比例尺为200μm；

图6阿莫西林碳纳米点共培养及处理大肠杆菌的透射电镜图；(a)监测下列各组溶液在0-48h内的OD值变化：LB培养基、大肠杆菌溶液、大肠杆菌与阿莫西林共培养(50μg/mL和100μg/mL)溶液、大肠杆菌与不同浓度(30、50、80和100μg/mL)阿莫西林碳纳米点共培养溶液；(b)不同时间下(0、1、2、3、4、6、8、12、24h)用500μg/mL阿莫西林和阿莫西林碳纳米点处理后的大肠杆菌的透射电镜图像，比例尺为500nm；

图7阿莫西林碳纳米点稳定性实验图；(a)不同浓度NaCl对阿莫西林碳纳米点荧光强度的影响图；(b)不同浓度KCl对阿莫西林碳纳米点荧光强度的影响；(c)室温放置阿莫西林碳纳米点荧光强度与时间的关系；(d)阿莫西林碳纳米点在420nm激发下505nm处的荧光随紫外照射时间变化；

图8阿莫西林碳纳米点稳定性实验图；(a)不同浓度NaCl对阿莫西林碳纳米点荧光光谱图；(b)不同浓度KCl对阿莫西林碳纳米点荧光光谱；(c)室温放置阿莫西林碳纳米点荧光强度与时间的荧光光谱图；(d)阿莫西林碳纳米点紫外照射的荧光光谱；

图9阿莫西林碳纳米点金属离子响应情况图；(a)阿莫西林碳纳米点对50μmol/mL不同金属离子荧光响应图；(b)阿莫西林碳纳米点对100μmol/mL不同金属离子荧光响应；

图10阿莫西林碳纳米点金属离子响应情况图；(a)阿莫西林碳纳米点对50μmol/mL不同金属离子荧光光谱；(b)阿莫西林碳纳米点对100μmol/mL不同金属离子荧光光谱；

图11阿莫西林碳纳米点随Hg浓度荧光变化情况图；(a)阿莫西林碳纳米点随Hg浓度荧光变化情况图；(b)阿莫西林碳纳米点随Hg浓度线性变化图；

图12不同溶剂对阿莫西林碳纳米点荧光影响图；

图13阿莫西林碳纳米点紫外、可见光照片和荧光响应图；(a)阿莫西林碳纳米点与不同醇溶剂混合在365nm紫外灯下(上)和可见光(下)的照片；(b)阿莫西林碳纳米点与不同醇溶剂混合的荧光响应；

图14阿莫西林碳纳米点不同激发波长下的荧光光谱图；(a)阿莫西林碳纳米点、阿莫西林碳纳米点在(b)甲醇、(c)乙醇、(d)1，3-丙二醇、(e)1，2-戊二醇和(f)1，2-己二醇下，在310～470nm的不同激发波长下的荧光光谱图；

图15阿莫西林碳纳米点在(a)甲醇、乙醇，不同质量分数(10％、30％、50％)(b)1，3-丙二醇、(c)1，2-戊二醇、(d)1，2-己二醇下，在水溶液中的紫外-可见吸收光谱；

图16阿莫西林碳纳米点与1，3-丙二醇(a)、1，2-戊二醇(b)和1，2-己二醇(c)混合溶液在365nm紫外灯下(上)和可见光(下)的照片；阿莫西林碳纳米与1，3-丙二醇(d)、1，2-戊二醇(e)和1，2-己二醇(f)的荧光光谱图；

图17不同阿莫西林碳纳米点：乙醇：甲醇：水比例荧光光谱图。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚明白，下面将详细叙述本发明所揭示内容的精神，任何所属技术领域技术人员在了解本发明内容的实施例后，当可由本发明内容所教示的技术，加以改变及修饰，其并不脱离本发明内容的精神与范围。

本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但并不作为对本发明的限定。

实施例1

1)设备：使用TecnaiF20电子显微镜(FEI公司，荷兰)获得阿莫西林碳纳米点的透射电子显微镜(TEM)图像。利用岛津UV-2550紫外-可见分光光度计获得了紫外-可见吸收光谱。采用日立F-2700荧光分光光度计获得荧光光谱。红外光谱由VECTOR33傅里叶变换红外光谱仪(Bruker，德国)获得。使用FLS920稳态/瞬态荧光光谱仪(爱丁堡，苏格兰)来获得荧光寿命和量子产率。X射线光电子能谱是通过ESCALAB 250X光电子能谱仪(热科学，美国)获得的。使用Bruker500型核磁共振仪(Bruker，瑞士)获得了核磁共振碳谱。

2)材料：阿莫西林(>92％)购自湖北威德利化学科技有限公司(中国)。阿莫西林(98％)购自上海源叶生物科技有限公司。CCK-8试剂盒购自武汉博士德技术有限公司(中国)。抗荧光衰减安装片购自北京索拉比奥科技有限公司。DMEM培养基、RPMI1640培养基、青链霉素混合液(双抗)、磷酸盐缓冲盐水和特级胎牛血清购自以色列生物工业科技公司。LB培养基购自阿拉丁试剂有限公司(中国，上海)。乙醇购自国药集团化学试剂有限公司。丙酮购自北京试剂。丙三醇、异丙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇购自上海麦克林生化科技有限公司。镁国家标准溶液购自国家钢铁材料测试中心。钠单元素标准溶液购自国家标准物质研究中心。钾单元素标准溶液购自中国计量科学研究院。钼标液、钡标液、购自天津市光复精细化工研究所。铅溶液、锰溶液、汞、镍溶液、铬单元素标准溶液购自环境保护部标准样品研究所。所有实验用水均为超纯水。

3)阿莫西林碳纳米点的制备：采用一步微波辅助法合成了阿莫西林碳纳米点。首先，将30mL阿莫西林溶液(1mg/mL)转移到一个干净的100mL烧杯中，在720W的家用微波炉中加热3min、5min、10min、15min和20min。反应结束后，用0.22μm聚醚砜膜粗过滤溶液，去除较大的产物。然后将过滤后的溶液加入到超滤管(10000MWCO)中，离心两次(5000rpm，5min)。最后，得到0.1～30mg/mL黄色的阿莫西林碳纳米点溶液，并在4℃的冰箱中保存。

细菌培养将大肠杆菌(E.coli，ATCC25922)从LB固体培养基转移到LB液体培养基中，在37℃、200rpm下培养8h，达到对数生长阶段。

为了在阿莫西林碳纳米点的形成过程中尽可能保持阿莫西林分子的抗菌结构和活性，采用3、5、10、15、20min五种不同的反应时间制备了碳纳米点，并对其荧光性能和抗菌活性进行了初步研究。当合成功率为10min时，得到的阿莫西林碳纳米点表现出最佳的荧光性能和抗菌效果。用10min合成的阿莫西林碳纳米点的直径集中在1.78±0.59nm处，尺寸相对均匀(图1a)。阿莫西林碳纳米点表现出明显的荧光激发依赖性特性。在最佳激发波长为420nm时，阿莫西林碳纳米点的最佳发射波长为505nm。

根据用三阶衰减指数函数进行拟合得到的阿莫西林碳纳米点荧光衰减曲线(图1c)。获得了3个荧光寿命(τ)，表明阿莫西林碳纳米点有3个荧光中心(表1)，表1与三阶衰减指数函数拟合后(图1c)，得到了阿莫西林碳纳米点的三个荧光寿命(τ)。平均寿命为4.58ns，头量子产率为0.72％。阿莫西林碳纳米点水溶液为黄色，在365nm的紫外光照射下，呈明亮的蓝绿色荧光。

表1

图1d是阿莫西林碳纳米点的紫外-可见吸收光。图1e是阿莫西林碳纳米点的红外光谱。XPS光谱显示，阿莫西林碳纳米点由C、O、N和S四种元素组成，与阿莫西林的组成相对应(图1f)，图1g为C1s光谱，图1h为O1s光谱，图1i为N1s谱，图1j为S2p光谱。

本实施例制备的阿莫西林碳纳米点溶液均为黄色。随着反应时间的增加，溶液的颜色逐渐变深。在365nm紫外光照射下，均发出蓝绿色荧光(图2a)。阿莫西林随着反应时间的增加，紫外吸光度增大(图2c)。当反应时间为3min时，阿莫西林碳纳米点的最佳激发波长为～380nm，最佳发射波长为～475nm；当反应时间为5min时，阿莫西林碳纳米点的最佳激发波长为～380nm，最佳发射波长为～475nm；当反应时间为15min时，阿莫西林碳纳米点的最佳激发波长为～420nm，最佳发射波长为～510nm；当反应时间为20min时，阿莫西林碳纳米点的最佳激发波长为～420nm，最佳发射波长为～515nm(图2b)。结合图2b的结果，随着反应时间的增加，阿莫西林碳纳米点的荧光发射峰呈红移趋势。

4)透射电镜测定阿莫西林碳纳米点在细菌中的分布：将处于对数生长期的大肠杆菌分别与100μg-2000μg相同浓度的阿莫西林碳纳米点一起孵育0、1、2、3、4、6、8、12、24h。离心、固定、脱水、包膜、切片染色后，用TEM对大肠杆菌进行成像。阿莫西林组实验同上。

细胞培养所有细胞均来自美国模式培养物研究所(ATCC,Manassas,VA,US)。小鼠胚胎成骨细胞前体细胞(MC3T3-E1)、人心肌细胞(HCM)和人胚胎肾293T细胞(HEK293T)在DMEM培养基中培养。人正常肝细胞(LO2)在RPMI1640培养基中培养。所有细胞均在含有37℃、5％CO₂的培养箱中培养。

5)抑制圈试验：首先，将直径为6毫米的滤纸放入阿莫西林碳纳米点中浸泡过夜。而后在LB固体培养基上涂满大肠杆菌。最后，将每张浸泡过的滤纸置于琼脂平板的中间处。培养条件为：37℃恒温恒湿度培养箱中孵育过夜。24h后拍照并记录抑菌圈的直径。

抑菌曲线试验将LB培养基、大肠杆菌溶液、大肠杆菌与阿莫西林(50μg/mL和100μg/mL)共培养，并与不同浓度的阿莫西林碳纳米点(30μg/mL、50μg/mL、80μg/mL和100μg/mL)共培养，在37℃水浴恒温摇床中共孵育。0、2、4、6、8、10、12、24、48h后，吸取200μL溶液，转移到96孔无菌板中，测量体系OD值的变化。

结果：

为了检验不同时间(3、5、10、15和20min)合成的碳纳米点的抑菌效果，在相同的条件下进行抑菌平板实验(图3a)。通过比较抗菌圈的直径，可以确定在10min条件下合成的碳纳米点抗菌性能最强(图3b)。

6)通过细胞计数试剂盒CCK-8检测法检测阿莫西林碳纳米点的体外细胞毒性采用CCK-8法检测阿莫西林碳纳米点对细胞的毒性。以MC3T3-E1细胞为例，将MC3T3-E1细胞培养到对数生长期，适当的细胞密度为3000～5000个细胞/孔。然后，将MC3T3-E1细胞转移到96孔细胞培养板中培养。然后，将每孔180μL的细胞悬液置于含有5％CO₂的培养箱中在37℃。当细胞完全附着在细胞瓶壁上时，加入20μL不同浓度的阿莫西林碳纳米点。接下来，每孔细胞的阿莫西林碳纳米点浓度分别为0、50、100、150、200μg/mL(每个浓度有6个多孔)。阿莫西林碳纳米点和MC3T3-E1细胞孵育48h后，每孔加入20μLCCK-8。将96孔细胞培养板置于培养箱中30min，用酶标仪(InfiniteM200PRO，瑞士，帝肯公司)在450nm波长下测量光密度(OD)。根据OD值计算MC3T3-E1细胞活力。

采用CCK-8法检测另外三个细胞(HCM、LO2、HEK293T)与阿莫西林碳纳米点孵育后的活力，实验步骤相同。

结果：

阿莫西林碳纳米点的体外生物毒性和抗菌试验。为了研究阿莫西林碳纳米点在抑菌过程中的荧光性能，将阿莫西林、阿莫西林碳纳米点与大肠杆菌在室温下共孵育6h后，获得了荧光图像(图4)。在488nm波长的激发下，与阿莫西林共孵育的大肠杆菌无荧光，而与阿莫西林碳纳米点共孵育的大肠杆菌，在大肠杆菌中显示出明亮的绿色荧光，显示出阿莫西林碳纳米点具有一定的荧光探针的功能。低细胞毒性是阿莫西林碳纳米点在生物医学方面应用的重要因素。本发明采用细胞增殖和活性检测试剂盒(CCK-8)方法检测制备的阿莫西林碳纳米点对4种正常细胞(LO2、HEK293T、HCM和MC3T3-E1)的细胞毒性。与200μg/mL阿莫西林碳纳米点孵育48h后，LO2、HEK293T、HCM和MC3T3-E1细胞未见抑制(图5a)。结果表明，所制备的阿莫西林碳纳米点具有较低的生物毒性。200μg/mL阿莫西林碳纳米点与MC3T3-E1细胞共孵育6、12和24h后，获得了荧光图像(图5b)。在488nm波长的激发下，在MC3T3-E1细胞中显示出明亮的绿色荧光，随着时间的增加，MC3T3-E1细胞荧光越强，显示出阿莫西林碳纳米点具有一定的荧光探针的功能。

7)细菌成像：选择大肠杆菌来评价阿莫西林碳纳米点的细菌成像能力。大肠杆菌(约1×10⁶至1×10⁷CFU/mL)，与阿莫西林碳纳米点(1000μg/mL)混合，在37℃的条件下共孵育6h。4000rpm离心5min收集大肠杆菌，用PBS缓冲液洗涤3次，转移到载玻片中，加入10μL抗荧光淬灭剂，而后用盖玻片盖住。最后用共聚焦激光扫描显微镜对其进行成像。阿莫西林与大肠杆菌孵育后的成像，实验步骤相同。

细胞成像选择MC3T3-E1细胞来评价阿莫西林碳纳米点的细胞成像能力。将MC3T3-E1细胞培养到对数生长期，适当的细胞密度为10-15万个细胞/孔。然后，先取细胞爬片放入6孔细胞培养板，将MC3T3-E1细胞转移到6孔细胞培养板中培养。然后，将每孔2mL的细胞悬液置于含有5％ CO₂的培养箱中在37℃。当细胞完全附着在细胞瓶壁上时，培养基全部析出，加入2mL 200μg/mL的阿莫西林碳纳米点。孵育6、12、24h，孵育结束后，吸出培养基，用PBS清洗3次，每次1-3min。1mL多聚甲醛固定15min，弃去多聚甲醛，用PBS再次清洗3次，每次1-3min。用镊子夹起细胞爬片扣在滴加抗荧光猝灭剂的载玻片上，最后用共聚焦激光扫描显微镜对其进行成像。

结果：

阿莫西林碳纳米点的抗菌性能是另一个重要的研究目标。在相同的条件下监测LB培养基、大肠杆菌溶液、大肠杆菌与阿莫西林共培养(50μg/mL和100μg/mL)溶液、以及大肠杆菌与不同浓度阿莫西林碳纳米点(30、50、80和100μg/mL)共培养溶液8组溶液在0至48h内的OD值变化(图6a)。LB培养基的OD值随时间变化不大。大肠杆菌悬液的OD值迅速上升到平台期。在48h孵育期间，随着阿莫西林碳纳米点浓度的增加(从30-100μg/mL)，溶液的OD值显著降低。阿莫西林碳纳米点在50μg/mL条件下的抑菌作用与阿莫西林在50μg/mL时的抑菌效果几乎相同，但阿莫西林碳纳米点在10h时，抑菌效果明显强于阿莫西林。结果表明，阿莫西林碳纳米点可以持续有效地抑制细菌的生长。为研究阿莫西林碳纳米点抗菌机制的变化，采用透射电镜观察相同条件下阿莫西林和阿莫西林碳纳米点孵育后大肠杆菌的形态变化。大肠杆菌与500μg·mL^-1(μg/mL)孵育分别处理阿莫西林和阿莫西林碳纳米点0～24h，处理0、1、2、4、6、8、12、24h的细菌样品，透射电镜观察并拍照(图6b)。从透射电镜图像上看，阿莫西林组和阿莫西林碳纳米点组在0h和2h时细胞壁光滑。其生长状态良好，形态完整。随着孵育时间的延长，两组大肠杆菌的结构受损程度越来越严重。值得注意的是，在孵育6h、12h和24h后，阿莫西林组和阿莫西林碳纳米点组被破坏的大肠杆菌的形态有显著差异。阿莫西林碳纳米点组中的部分大肠杆菌被大孔穿透。阿莫西林组的大肠杆菌从细胞壁上被破坏，孔隙较小。显然，两组的抗菌机制有着显著差异。

8)稳定性实验：将4mg/mL阿莫西林碳纳米点与氯化钠溶液共混，使氯化钠终浓度分别为0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.5、2.0mol/L，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。氯化钾溶液与阿莫西林碳纳米点共混，实验步骤相同。将2mg/mL阿莫西林碳纳米点在室温放置六天，分别对0、1、2、3、4、5、6day进行测量，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。将2mg/mL阿莫西林碳纳米点紫外照射40、50、60、70、80、90、100、110、120、130、140、150、160、170、180min，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。

结果：

为研究阿莫西林碳纳米点是否稳定，对不同浓度NaCl、不同浓度KCl、室温放置和紫外照射测荧光强度(图7与图8)。当NaCl浓度增加到2.0mol/L时，阿莫西林碳纳米点荧光强度基本保持不变(图7a与图8a)，当KCl浓度增加到2.0mol/L时，阿莫西林碳纳米点荧光强度基本保持不变(图7b与图8b)，表现出阿莫西林碳纳米点具有优异的耐盐性。当阿莫西林碳纳米点溶液室温放置6day后，阿莫西林碳纳米点荧光强度有小幅度增强(图7c与图8c)，说明阿莫西林碳纳米点具有良好的光稳定性。紫外照射180min后，阿莫西林碳纳米点荧光强度变化较小(图7d与图8d)，说明其具有良好的抗光漂白性。

9)金属离子检测：将4mg/mL阿莫西林碳纳米点分别与Fe²⁺、K、Ni、Mn、Fe³⁺、Na、Mg、Mo、Cr、Ba、Pb、Hg共混，使其终浓度为50μmol/mL、100μmol/mL，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。将4mg/mL阿莫西林碳纳米点与汞溶液共混，使汞溶液终浓度分别为4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、60、70、80、90、100、200μmol/L，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。

结果：

为探索阿莫西林碳纳米点对金属离子响应，在相同条件下测量了50μmol/mL、100μmol/mL不同金属离子对阿莫西林碳纳米点荧光的影响(图9与图10)。50μmol/mL Hg使阿莫西林碳纳米点荧光降低(图5a与图10a)，100μmol/mL Hg使阿莫西林碳纳米点荧光猝灭(图9b与图10b)。说明阿莫西林碳纳米点对Hg具有高灵敏度和高选择性。对Hg进行更细致的研究(图11)，检测阿莫西林碳纳米点对Hg的检出线为1.07μmol/mL，高浓度Hg会使阿莫西林碳纳米点荧光猝灭。推测Hg²⁺和表面富含电子的碳纳米点之间通过强吸引力使二者形成了CDs-Hg²⁺复合物，通过电荷转移极大促进了非辐射复合并引起了荧光的淬灭；另一方面，Hg^{2 +}引起碳点表面的功能基团-CONH-从内酰胺到开环酰胺的结构改变也是荧光淬灭的一个重要原因。

10)醇类化合物检测：将4mg/mL阿莫西林碳纳米点分别与甲醇、乙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇、异丙醇共混，在420nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。将4mg/mL阿莫西林碳纳米点分别与1，3-丙二醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇共混，使1，3-丙二醇在混合溶液质量分数占比为1％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％，1，2-戊二醇在混合溶液质量分数占比为10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％，1，2-己二醇在混合溶液质量分数占比为5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％，在380nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。将4mg/mL阿莫西林碳纳米点、乙醇、甲醇、水共混，使阿莫西林碳纳米点：乙醇：甲醇：水为1：0.5：0.5：0、1：0.5：0.4：0.1、1：0.5：0.3：0.2、1：0.5：0.2：0.3、1：0.5：0.1：0.4、1：0.5：0.05：0.45、1：0.5：0.01：0.49、1：1：0：0，在380nm激发波长下测定溶液的荧光光谱。

结果：

阿莫西林碳纳米点对醇类化合物也有较高响应。不同溶剂对阿莫西林碳纳米点荧光有所影响(图12)。三氯甲烷和甲苯使阿莫西林碳纳米点荧光猝灭，推测可能是由于氢键断裂导致荧光猝灭，而甲醇、乙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇、异丙醇都使阿莫西林碳纳米点荧光增强，推测可能是由于基于质子耦合/非耦合电子转移的纳米团簇和质子溶剂之间的电子转移引起的。对醇类化合物进行研究，可以看出，1，2-己二醇、1，2-戊二醇、1，3-丙二醇、乙醇、甲醇荧光依次降低(图13)。根据其荧光强度，可以初步判断醇类化合物为几元醇(图13b)。对这五种醇重新测激发依赖(图14)，可以看出阿莫西林碳纳米点与醇类化合物混合之后，由最佳激发420nm强于380nm变为最佳激发380nm强于420nm，阿莫西林碳纳米点与醇混合之后，荧光发生蓝移。在甲醇、乙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇和1，2-己二醇与阿莫西林碳纳米点共混溶液的紫外-可见吸收光谱中，甲醇、乙醇吸光度依次增强(图15a)，说明可能产生溶剂效应，并可通过紫外吸收光谱定性分析溶剂体系。还构建了荧光强度与甲醇乙醇溶剂比的关系(图16)，随着混合溶液体系甲醇溶剂的降低，阿莫西林碳纳米点荧光强度逐渐增强，这种荧光发射的增强也可以通过拍摄紫外线照射下的溶液来观察到(图13a)，阿莫西林碳纳米点的荧光强度与甲醇的含量高度相关，推测溶剂分子间氢键多，给与阿莫西林碳纳米点相互作用的氢键越少，荧光强度越弱，而溶剂分子间氢键少，给与阿莫西林碳纳米点相互作用的氢键越多，荧光强度越强。1，3-丙二醇(图15b与图16d)、1，2-戊二醇(图15c与图16e)、1，2-己二醇(图15d与图16f)随醇质量分数的增强，吸光度与荧光强度逐渐上升，推测可能由于加入的醇越多，与阿莫西林碳纳米点作用的氢键越多，荧光强度越强，故可以定量分析醇占混合溶液比例。阿莫西林碳纳米点可以快速准确区分甲醇、乙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇和1，2-己二醇，也可定量检测其含量。本发明对检测微量甲醇提供了新的方法。

Claims (7)

1.白酒中醇类物质的检测方法，其特征在于所述的检测方法是采用阿莫西林碳纳米点实现的，具体检测方法：

阿莫西林碳纳米点溶液与白酒共混，在380 nm或420 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，检出限为1.07 μM；

所述的醇类物质为甲醇、乙醇、1，3-丙二醇、1，2-戊二醇、1，2-己二醇、丙三醇或异丙醇；

所述的阿莫西林碳纳米点是通过如下方式制备的：

在450~900 W的微波功率下，加热处理阿莫西林溶液3~20 min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管进行两次离心，得到黄色的阿莫西林碳纳米点溶液，4℃保存备用。

2.根据权利要求1所述的白酒中醇类物质的检测方法，其特征在于所述的阿莫西林溶液的浓度为0.1~2 mg/mL。

3.根据权利要求1所述的白酒中醇类物质的检测方法，其特征在于所述的微波功率为720 W。

4.根据权利要求1所述的白酒中醇类物质的检测方法，其特征在于所述的加热处理阿莫西林溶液10 min。

5.金属汞的检测方法，其特征在于所述的检测方法是采用阿莫西林碳纳米点实现的，具体检测方法：

阿莫西林碳纳米点溶液与含汞溶液共混，在420 nm激发波长下测定溶液的荧光光谱，检出限为1.07 μM；所述的阿莫西林碳纳米点是通过如下方式制备的：

在450~900 W的微波功率下，加热处理阿莫西林溶液3~20 min，然后采用过滤膜过滤，加入到超滤管进行两次离心，得到黄色的阿莫西林碳纳米点溶液，4℃保存备用。

6.根据权利要求5所述的金属汞的检测方法，其特征在于所述的阿莫西林碳纳米点溶液浓度为4 mg/mL；所述的含汞溶液中汞的浓度为4~200 μmol/L。

7.根据权利要求5所述的金属汞的检测方法，其特征在于所制备的阿莫西林碳纳米点用于制备提高抑菌效果且持续抑菌、低细胞毒性的试剂；或者，所制备的阿莫西林碳纳米点用于制备耐盐性、抗光漂白性的碳纳米点。