CN116622734A - 一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg0964800基因及其用途 - Google Patents
一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg0964800基因及其用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN116622734A CN116622734A CN202310642100.3A CN202310642100A CN116622734A CN 116622734 A CN116622734 A CN 116622734A CN 202310642100 A CN202310642100 A CN 202310642100A CN 116622734 A CN116622734 A CN 116622734A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- highland barley
- gene
- freeze
- tobacco
- application
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 title claims abstract description 55
- 235000007340 Hordeum vulgare Nutrition 0.000 title claims abstract description 40
- 230000009746 freeze damage Effects 0.000 title claims abstract description 31
- 240000005979 Hordeum vulgare Species 0.000 title claims description 3
- 235000002637 Nicotiana tabacum Nutrition 0.000 claims abstract description 31
- 241000208125 Nicotiana Species 0.000 claims abstract description 30
- 241000196324 Embryophyta Species 0.000 claims abstract description 24
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims abstract description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims abstract description 8
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 13
- 241000589158 Agrobacterium Species 0.000 claims description 10
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 10
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 10
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 10
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 claims description 8
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 claims description 5
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 3
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 239000011575 calcium Substances 0.000 claims description 2
- 238000000975 co-precipitation Methods 0.000 claims description 2
- 239000002502 liposome Substances 0.000 claims description 2
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 claims description 2
- 241000209219 Hordeum Species 0.000 abstract description 38
- 230000006378 damage Effects 0.000 abstract description 15
- 238000007710 freezing Methods 0.000 abstract description 12
- 230000008014 freezing Effects 0.000 abstract description 12
- 208000027418 Wounds and injury Diseases 0.000 abstract description 11
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 abstract description 11
- 208000014674 injury Diseases 0.000 abstract description 11
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 abstract description 10
- 238000009825 accumulation Methods 0.000 abstract description 4
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 abstract description 2
- 230000002018 overexpression Effects 0.000 abstract description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 20
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 5
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 239000000047 product Substances 0.000 description 4
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 230000010474 transient expression Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000207746 Nicotiana benthamiana Species 0.000 description 2
- 241001052560 Thallis Species 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000000706 filtrate Substances 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000012466 permeate Substances 0.000 description 2
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 2
- 238000011160 research Methods 0.000 description 2
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 2
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- HJYQCZVMQAYTMN-ACHWKMRWSA-N (9z,14z)-octadeca-9,14-dien-12-ynoic acid Chemical compound CCC\C=C/C#CC\C=C/CCCCCCCC(O)=O HJYQCZVMQAYTMN-ACHWKMRWSA-N 0.000 description 1
- JDSRHVWSAMTSSN-BSZOFBHHSA-N 13-HPODE Chemical compound CCCCCC(OO)\C=C\C=C/CCCCCCCC(O)=O JDSRHVWSAMTSSN-BSZOFBHHSA-N 0.000 description 1
- FBUKMFOXMZRGRB-JXMROGBWSA-N 9,10-epoxy-12-octadecenoic acid Chemical compound CCCCC\C=C\CC1OC1CCCCCCCC(O)=O FBUKMFOXMZRGRB-JXMROGBWSA-N 0.000 description 1
- -1 9HOTrE Chemical class 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- 244000061176 Nicotiana tabacum Species 0.000 description 1
- 241000209504 Poaceae Species 0.000 description 1
- 238000003559 RNA-seq method Methods 0.000 description 1
- 229910000831 Steel Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000040945 Transcription factor Human genes 0.000 description 1
- 108091023040 Transcription factor Proteins 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N UDP-alpha-D-glucose Chemical compound O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@H]1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]1[C@@H](O)[C@@H](O)[C@H](N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-JZMIEXBBSA-N 0.000 description 1
- HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N Uridindiphosphoglukose Natural products OC1C(O)C(O)C(CO)OC1OP(O)(=O)OP(O)(=O)OCC1C(O)C(O)C(N2C(NC(=O)C=C2)=O)O1 HSCJRCZFDFQWRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 238000012271 agricultural production Methods 0.000 description 1
- 230000004075 alteration Effects 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000003963 antioxidant agent Substances 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 239000012496 blank sample Substances 0.000 description 1
- 238000009835 boiling Methods 0.000 description 1
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 1
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 description 1
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000001816 cooling Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000004108 freeze drying Methods 0.000 description 1
- 238000005286 illumination Methods 0.000 description 1
- 238000001764 infiltration Methods 0.000 description 1
- 230000008595 infiltration Effects 0.000 description 1
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 238000004811 liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 239000012982 microporous membrane Substances 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229910052757 nitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 1
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 1
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 1
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 1
- 230000035790 physiological processes and functions Effects 0.000 description 1
- 239000011148 porous material Substances 0.000 description 1
- 239000000843 powder Substances 0.000 description 1
- 238000003825 pressing Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 description 1
- 230000001932 seasonal effect Effects 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000010959 steel Substances 0.000 description 1
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 1
- 238000001308 synthesis method Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000001052 transient effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 238000005303 weighing Methods 0.000 description 1
- 239000012224 working solution Substances 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/415—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from plants
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/82—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for plant cells, e.g. plant artificial chromosomes (PACs)
- C12N15/8241—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology
- C12N15/8261—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield
- C12N15/8271—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance
- C12N15/8273—Phenotypically and genetically modified plants via recombinant DNA technology with agronomic (input) traits, e.g. crop yield for stress resistance, e.g. heavy metal resistance for drought, cold, salt resistance
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Botany (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Cell Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Breeding Of Plants And Reproduction By Means Of Culturing (AREA)
Abstract
本发明提供了一种与青稞耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途，属于基因工程技术领域，本发明HOVUSG0964800基因核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。本发明发现青稞在遭遇冻害胁迫后，青稞中HOVUSG0964800基因的表达急剧增加，且耐冻害青稞的表达水平显著高于冻害敏感型青稞。将HOVUSG0964800在烟草中进行过表达后，发现烟草叶片中多种脂质积累水平显著增加，且过表达烟草在冷处理后，相对电导率较野生型显著降低。因此，基因HOVUSG0964800在植物抵御冻害胁迫中具有重要的意义。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种与青稞耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途。
背景技术
低温伤害是农业生产中一种最严重的自然灾害,也是西北农作物区域性分布和季节性生长的主要限定因素，因而筛选抗寒型品种是提高作物产量的重要方法。已有研究结果表明，农作物在低温冻害锻炼过程中，膜保护酶活性、细胞质膜透性和抗氧化剂、碳水化合物、脂类、蛋白质和核酸等代谢物质会发生显著的改变。这些物质均参与植物抵御抗寒的生理过程，与植物的抗寒能力密切的相关。
青稞属于禾本科(Gramineae)大麦属(Hordeum)作物,是大麦(Hordeum vulgareL.)的变种群,又称裸大麦，具有独特的耐寒特性,某些品种的苗期可以耐-9.0～-7.3℃的低温。青海省栽培青稞的3叶生长期在每年的4～5月,易受天气突然变化影响，导致严重的减产。
因此，研究青稞耐冻害相关基因有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因及其用途。
本发明提供了一种基因片段，其特征在于：所述基因片段的核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
本发明还提供了一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含核苷酸序列如SEQID NO.1所示的基因片段。
进一步地，所述重组载体是重组表达载体pEAQ。
本发明还提供了一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含上述的重组载体。
进一步地，所述重组菌为重组农杆菌EHA105。
本发明还提供了一种耐冻害蛋白，其特征在于：所述耐冻害蛋白的氨基酸序列如EQ ID NO.2所示。
本发明还提供了上述的基因片段、上述的重组载体、上述的重组菌或上述的耐冻害蛋白在制备耐冻害的植物的用途；所述植物优选为青稞、烟草。
本发明还提供了一种耐冻害的转基因植物的构建方法，其特征在于：取核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段，转入植物中，获得表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白的植株，即可。
进一步地，所述转基因植物为转基因烟草。
进一步地，所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法和磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种。
本发明首次发现了青稞中的一种新的耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；该耐冻害胁迫相关的HOVUSG0964800基因表达的蛋白，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明发现HOVUSG0964800基因，可以提高青稞耐冻害能力。并且本发明将该基因转移到烟草中，使得烟草植株中表达HOVUSG0964800基因，在HOVUSG0964800基因过表达烟草受到冻害胁迫时，发现提高了烟草中脂质积累量，同时提高了烟草的耐冻害能力。本发明提供的新的基因，及其重组载体、重组菌、转基因植物均具有良好的应用前景。
本发明的新的基因，及其重组载体、重组菌可以用来提高青稞耐冻害胁迫能力，提高了青稞的耐冻害能力。
本发明的转基因植物构建方法，为青稞的耐冻害改良提供了重要的参考。
显然，根据本发明的上述内容，按照本领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
以下通过实施例形式的具体实施方式，对本发明的上述内容再作进一步的详细说明。但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实例。凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
附图说明
图1为不同低温胁迫下，耐寒冻型青稞(A)和温度敏感型青稞(B)中HOVUSG0964800基因表达量分析。注：24℃为正常生长温度。
图2与对照组相比，烟草瞬时超表达HOVUSG0964800基因后，多种脂质含量显著提高(A)；HOVUSG0964800基因过表达OE组(实验组)和WT组(对照组：野生型)下，相对电导率变化对比(B)。
具体实施方式
本发明所用原料与设备均为已知产品，通过购买市售产品所得。
本申请发现了一种新的与耐冻害胁迫相关的转录因子(HOVUSG0964800基因)，该基因序列如SEQ ID NO.1所示，该基因可以通过常规的基因合成手段直接合成，也可以采用其他常规方式制备。
SEQ ID NO.1：
ATGGACATGGGCGAGGTCTCGAGCTCTCCCCCCTCCTCTTCCAACGAG
AACGCGTCGGGACGGTCGTCGACGGCCAAGCGCCCGGCGGGGCGCAC
TAAGTTCCGCGAGACAAGGCACCCGGTGTACCGCGGCGTGCGGCGCCG
GGGCAACGCCGAACGGTGGGTATGCGAGGTGCGCGTCCCCGGCAAGC
GCGGCGCTCGGCTCTGGCTCGGGACTTACGCCACGGCCGAGATCGCAG
CGCGCGCGAACGATGCCGCAATGCTCGCCCTGGGCGGCCGCTCCGCCG
CGCGCCTCAACTTCTCGGACTCCGCGTGGCTGCTCGCCGTGCCGTCCG
CGCACTCCGATCTCGCCGACGTCCGGCGCGCGGCGGTCGAGGCCGTCT
CGGATTTGCAGCGACGGGAGGCTGCCGGTGGGTCCATCAGCGCCACGG
TCGACGAGGAGGCCTCCTGTGGCGCTCCTGCAGAATCGTCGTCTGAGT
CTGACGGTGCCGGCTCGTCGGAGACGTCGAAACCTTCCGCGGATGGAG
ACTTGGCGGTACCGGTCGGAATGGACATCGAAATGTTCAGGCTTGACTT
CTTCCCGGAAATGGAGTTTGGCTCGTACTACGCGAGCCTCGCGGAGGC
GCTGCTGATGGACCCGCCGCCGGTGGCGAACAGCACGGGCGCGTACTG
GGATAACGGAGAATTCGGGGAGGTGGCAA
CCGAGTTCGCGCTGTGGAGCTAG
SEQ ID NO.2：
MDMGEVSSSPPSSSNENASGRSSTAKRPAGRTKFRETRHPVYRGVRRRGN
AERWVCEVRVPGKRGARLWLGTYATAEIAARANDAAMLALGGRSAARL
NFSDSAWLLAVPSAHSDLADVRRAAVEAVSDLQRREAAGGSISATVDEEA
SCGAPAESSSESDGAGSSETSKPSADGDLAVPVGMDIEMFRLDFFPEMEFG
SYYASLAEALLMDPPPVANSTGAYWDNGEFGEVATEFALWS
实施例1、HOVUSG0964800基因在耐冻害青稞中的表达
一、实验方法
对青稞品种进行筛选，筛选得到耐冻害的青稞品种和冻害敏感的青稞。将两种不同抗性级别的青稞幼苗(4周龄)，分别在24(青稞正常生长的温度)、12、5、0、-5，-8℃的环境下生长24h。
测定方法：采集上述六种温度处理后的叶片通过RNA-seq对HOVUSG0964800的表达量进行分析。
二、实验结果
结果如图1，耐冻害青稞中HOVUSG0964800在正常温度(24℃)基本不表达，然而在0℃和-5℃的低温胁迫下，HOVUSG0964800的表达明显增加，分别为130.0和227.3。冻害敏感型青稞同样在0℃以上时，HOVUSG0964800基因几乎不表达，在0℃和-5℃的低温胁迫下HOVUSG0964800的表达量分别仅为62.3和108.2。
可见在0～-5℃低温胁迫下，耐冻害青稞HOVUSG0964800的表达增量约是冻害敏感型青稞的2倍。
实验结果说明，在低温时耐冻害青稞中HOVUSG0964800表达明显高于冻害敏感型青稞品种，HOVUSG0964800的表达能提高青稞耐冻害能力。
实施例2HOVUSG0964800基因瞬时表达对烟草耐冻害的影响
一、实验方法
(一)含有目标基因的表达载体烟草的制备方法：
1、烟草材料
4-5周大的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)
2、含有目标基因的表达载体烟草的制备过程：
①将含有目标基因(基因序列如SEQ ID NO.1所示)的瞬时表达载体(瞬时表达载体pEAQ，来自John Innes Centre)转化农杆菌(EHA105)；
②挑取阳性农杆菌克隆于500μl含有相应抗生素(kn)的LB中，培养20-24小时；
③转接200μl于5ml含有相应抗生素(kn)的LB中，28℃摇床220rpm至吸光率(OD)＝2.0左右。
④10000rpm常温离心2min收集菌体，用提前配制转化缓冲液进行菌体的重悬，摇床震荡3h；缓冲液工作液成分以及浓度如下：10mM MES(pH5.7)，10mM MgCl2，100μUDP-葡萄糖。
⑤拿准备好的1ml的注射器，去掉针头，选取出口光滑的注射器吸入菌液，取1月龄的本氏烟草(Nicotiana benthamiana)，用手按住叶片，从叶片反面注射，使农杆菌渗透进去。给烟草注射过的地方做好标记，可在叶片上圈出农杆菌渗透的区域，并选取注射了转化缓冲液的烟草做对照。
⑥注射了农杆菌的烟草黑暗培养24h，然后移至烟草培养箱中光照培养24-48小时即可取样(注意注射的烟草不可直接在叶片上喷洒水)。
(二)检测方法
1、产物收集和纯化
剪取农杆菌渗透区域的叶片，放在已称重的装有钢珠的EP管中，做好标记后，迅速放置液氮中，进行冻干。冻干后的样本，利用研磨仪(MM 400,Retsch)在30Hz条件下研磨60s得到样品粉末，将样本粉末装入2ml EP管内。
用电子天平称取每个EP管的重量并记录；将已研磨好的样本取适量(范围30-60mg)于EP管中，称量并记录，算出所有EP管中样本的净重。
已知每份样本的净重，按体积V＝样本净重(mg)*12μL/mg在4℃冰上操作加入70％甲醇(MeOH)溶液。混匀，涡旋15s，每隔半小时涡旋一次，共涡旋4次，放4℃冰箱内提取12h以上，得到样品提取液。
先将离心机开机预冷到4℃，设置时间10min和转速12000rpm，将样本涡旋后放入离心，使用离心机注意对称平衡，离心后吸取上清液，得到样品提取液上清液。将上清液用微孔滤膜(0.22μm pore size)过滤，得到样品过滤液，装入上样瓶中，准备液相色谱质谱联用仪(LC-MS)检测。
2、目的产物检测
1)脂质含量检测
将装有样品过滤液的进样瓶放入自动进样器内的样品盘，并记录每个进样瓶编号所对应的进样孔位置。同时打开软件Analyst Software，双击Hardware Configuration，选择LCMS-V(有切换阀模式)，点击Activate Profile，并选择Acquire Mode模式，点击Acquire，点击图上方的Equilibrate键，一般设定时间为3min，此操作目的是预热仪器，使高压输液泵、色谱柱、柱温箱、离子源温度等达到方法中设置的条件。待各仪器部件状态Ready后，功能区Start Sample键成为可点击状态，此时表明仪器正常，分析条件正常，然后点击Start Sample开始跑样，首次跑样前先提交4针空白样。
2)相对电导率(Electrolyte leakage,EL)检测：
采集经冻害胁迫处理后的植株上的新鲜叶片，用去离子水冲洗干净，滤纸吸干后分别放在一个含有20毫升ddH2O的微量离心管中，以离心管中装满相同体积的水作为空白对照。
测试样品和空白对照管在室温下在摇床(中国)上摇晃1h(20rpm)，然后使用电导率计(DSS-307，SPSIC，中国)测量样品的初始电导率(C1)和空白对照的初始电导率(CK1)。然后将试管煮沸10min，并在室温下冷却，然后煮沸后的测试样品电导率(C2)和空白对照电导率(CK2)。
最后测试样品的相对电导率，采用公式C(％)＝(C1-CK1)/(C2-CK2)×100来计算。
2、结果
实验结果说明，本发明将基因HOVUSG0964800转移到烟草中，诱导烟草积累了多种脂质，包括9HOTrE、14,15-Dehydrocrepenynic acid、9,10-EODE、Punicic acid、LysoPC18:3、LysoPE 14:0、LysoPC 15:0、LysoPE 16:0和LysoPC16:0，13-HPODE(图2A)；其中LysoPC16:0提升最为明显。
电导率变化幅度越小，植物抗寒能力越强，即本发明中的相对电导率越小，植物抗寒能力越强。
可从图2B中看出，在冻害胁迫下，过表达植株(OE组)的相对电导率显著低于野生型(WT)，表明HOVUSG0964800可通过调控脂质的积累正向调控青稞的抗寒性。
综上，本发明研究发现在冻害胁迫后，HOVUSG0964800基因表达急剧增加，并诱导烟草积累多种脂质，显著调控青稞抗性品种中脂质的积累水平从而提高青稞的耐冻害能力。将基因HOVUSG0964800在烟草中进行过表达后，烟草叶片中脂质的含量显著增加，烟草耐冻害能力提高。因此，HOVUSG0964800基因在植物抵御冻害胁迫中具有重要的意义。
Claims (10)
1.一种基因片段，其特征在于：所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种重组载体，其特征在于：所述重组载体包含核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示的基因片段。
3.根据权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体是pEAQ。
4.一种重组菌，其特征在于：所述重组菌包含权利要求2所述的重组载体。
5.根据权利要求4所述的重组菌，其特征在于：所述重组菌为重组农杆菌EHA105。
6.一种耐冻害蛋白，其特征在于：所述耐冻害蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
7.权利要求1所述的基因片段、权利要求2或3所述的重组载体、权利要求4或5所述的重组菌或权利要求6所述的耐冻害蛋白在制备耐冻害的植物的用途；
优选地，所述植物为青稞、烟草。
8.一种表达耐冻害的转基因植物的构建方法，其特征在于：取核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示的基因片段，转入植物中，获得表达氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示的蛋白的植株，即可。
9.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：所述转基因植物为转基因烟草。
10.根据权利要求8所述的构建方法，其特征在于：所述转入植物的方法是农杆菌法、基因枪法、电转法、PEG介导法、脂质体法和磷酸钙-DNA共沉淀法中的一种。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310642100.3A CN116622734B (zh) | 2023-05-31 | 2023-05-31 | 一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg0964800基因及其用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN202310642100.3A CN116622734B (zh) | 2023-05-31 | 2023-05-31 | 一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg0964800基因及其用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN116622734A true CN116622734A (zh) | 2023-08-22 |
| CN116622734B CN116622734B (zh) | 2024-05-31 |
Family
ID=87641574
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN202310642100.3A Active CN116622734B (zh) | 2023-05-31 | 2023-05-31 | 一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg0964800基因及其用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN116622734B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117904155A (zh) * | 2024-01-17 | 2024-04-19 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞芹黄素7-o葡萄糖转移酶基因及其用途 |
Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373223A (zh) * | 2010-08-27 | 2012-03-14 | 中国科学院成都生物研究所 | 抗旱青稞lea3蛋白编码基因核酸序列及其应用 |
| CN106636132A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-05-10 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞的紫外胁迫相关基因及其应用 |
| KR101803500B1 (ko) * | 2016-09-30 | 2017-11-30 | 한국해양과학기술원 | 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 |
| WO2021223725A1 (zh) * | 2020-05-07 | 2021-11-11 | 海南波莲水稻基因科技有限公司 | 一种用于农作物遗传智能化育种制种载体 |
-
2023
- 2023-05-31 CN CN202310642100.3A patent/CN116622734B/zh active Active
Patent Citations (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN102373223A (zh) * | 2010-08-27 | 2012-03-14 | 中国科学院成都生物研究所 | 抗旱青稞lea3蛋白编码基因核酸序列及其应用 |
| KR101803500B1 (ko) * | 2016-09-30 | 2017-11-30 | 한국해양과학기술원 | 식물의 냉해 스트레스 내성과 관련된 신규 유전자 및 그의 용도 |
| CN106636132A (zh) * | 2016-12-13 | 2017-05-10 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞的紫外胁迫相关基因及其应用 |
| WO2021223725A1 (zh) * | 2020-05-07 | 2021-11-11 | 海南波莲水稻基因科技有限公司 | 一种用于农作物遗传智能化育种制种载体 |
Non-Patent Citations (3)
| Title |
|---|
| 巴桑玉珍等: ""青藏高原青稞耐寒种质资源基于SSR标记的遗传多样性及群体结构分析"", 《麦类作物学报》, vol. 37, no. 01, 3 January 2017 (2017-01-03), pages 40 - 47 * |
| 扎桑等: ""盐碱胁迫下青稞全转录组分析"", 《西南农业学报》, vol. 34, no. 07, 28 July 2021 (2021-07-28), pages 1375 - 1385 * |
| 无: ""NCBI Reference Sequence: GenBank: KAE8813864.1"", 《GENBANK》, 29 November 2019 (2019-11-29) * |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN117904155A (zh) * | 2024-01-17 | 2024-04-19 | 西藏自治区农牧科学院农业研究所 | 一种青稞芹黄素7-o葡萄糖转移酶基因及其用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN116622734B (zh) | 2024-05-31 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN116622734B (zh) | 一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg0964800基因及其用途 | |
| CN111675755B (zh) | 调控植物耐盐性的狗牙根转录因子CdWRKY50及其应用 | |
| CN104302773A (zh) | 增加植物对热胁迫的耐受性及氨基酸含量的方法 | |
| CN105524152B (zh) | 水稻抗高温基因及其在作物抗高温育种中的应用 | |
| Nada et al. | Contrasting root traits and native regulation of aquaporin differentially determine the outcome of overexpressing a single aquaporin (OsPIP2; 4) in two rice cultivars | |
| CN109295070A (zh) | 一种与水稻抗逆相关基因OsDTH1及其编码蛋白与应用 | |
| CN116574742B (zh) | 一种与青稞耐冻害胁迫相关的hovusg4853900基因及其用途 | |
| CN105087508A (zh) | 茄子黄烷酮3-羟化酶SmF3H及其基因和应用 | |
| CN104745560A (zh) | 茄子查尔酮合成酶SmCHS1蛋白及其编码基因 | |
| CN115947810B (zh) | 转录因子hy5在提升石斛品质中的应用和提升石斛品质的方法 | |
| CN113604475B (zh) | 棉花gh_d03g1517基因在促进抗旱和耐盐中的应用 | |
| CN105037514A (zh) | 狗牙根‘Tifway’脱水素蛋白Dehydrin-L及其编码基因和探针 | |
| CN109439677A (zh) | BnGLIP1基因在增强植物抗病性中的用途 | |
| CN102533804B (zh) | 白沙蒿Δ12脂肪酸脱氢酶(As FAD2)基因及用途 | |
| CN116003546A (zh) | 一种紫花苜蓿nac转录因子及其应用 | |
| CN113388621A (zh) | 一种地黄WRKY转录因子RgWRKY37基因及其应用 | |
| CN116814658B (zh) | 一种与耐盐碱胁迫相关的抗坏血酸过氧化物酶基因及其用途 | |
| CN117305330B (zh) | 一种与耐盐碱胁迫相关的苹果酸过氧化物酶基因及其用途 | |
| Huimin et al. | Using Proline Synthetase and BT gene to improve soybean (Glycine max) drought and insect resistance | |
| CN109810984A (zh) | 一种抗旱相关的芝麻基因SiGolS6及其应用 | |
| CN104498508A (zh) | 小麦渐渗系应答非生物胁迫调控基因TaGBF及其应用 | |
| Chen et al. | Molecular mechanisms regulating storage root formation in plants | |
| CN114703221B (zh) | 一种提高水稻的糖代谢水平和抗旱性的pOsHAK1:OsFLN2表达载体及其应用 | |
| CN116987716B (zh) | 一种表达载体、OsSUT1基因的用途和转基因水稻 | |
| CN113444732B (zh) | 基因TaPT16在提高植物对白粉菌抗性方面的应用 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |