CN116622567A - 一种益生菌及其在血红素肽铁制备中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及血红素肽铁技术领域，尤其是一种益生菌及其在血红素肽铁制备中的应用，所述益生菌为植物乳杆菌YR07，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月18日，生物保藏编号为CCTCC NO：M20221303。该益生菌可用于制备血红素肽铁，制备的血红素肽铁抗氧化能力强，具有优良的感官品质及功能特性；制备方法采用酶解与发酵联用对血红蛋白进行酶解与发酵，酶解效果好，能有效地将血红蛋白酶解成小分子肽；进一步发酵有效降低了血红素肽铁的苦味，并提高了其抗氧化性、生物可及性等，且制备工艺简单、过程温和，较好地保留了血红素肽铁的多功能活性；所用原料为畜禽血液，产量高且价格低廉。

Description

一种益生菌及其在血红素肽铁制备中的应用
技术领域
本发明涉及生物医药技术领域，具体领域为一种益生菌及其在血红素肽铁制备中的应用。
背景技术
畜禽血液是动物屠宰后的主要副产物之一，可占到屠体的6％～8％。畜禽血营养价值较高，蛋白质含量17％～22％，血干物质蛋白质含量超过90％，其60％～65％为血红蛋白，还含大量的血红素铁、维生素、矿物质、激素、酶、抗体等活性物质，素有“液态肉”之称。长期以来，由于屠宰分散、技术落后等原因，畜禽血被收集利用的只有25％左右，大部分被作为废弃物排放，不仅未能很好地加工利用，还带来了环境污染隐患。
活性肽具有特异性高、毒性低等优点，在长期服用的治疗中极具潜力。抗氧化肽是活性肽中的一种，它能够有效清除自由基、螯合金属和减少氢过氧化物，减少人体由自由基引起的蛋白质变性、脂质过氧化，降低关节炎、糖尿病、高血压等多种疾病风险。食物来源的抗氧化肽通常在其天然结构中不具有活性，但它们可以在大分子水解后发挥其生物活性。它们可以防止脂质过氧化，维持体内自由基的平衡，从而提高机体抵抗氧化应激引起的一系列疾病的能力。目前，食品来源的抗氧化肽多从动物、植物蛋白和微生物中提取，其中动物来源的抗氧化肽占据主导地位。食物来源的抗氧化肽通常含有2-20个氨基酸残基，而肽的抗氧化活性与其氨基酸组成和序列密切相关。不同来源的蛋白质和制备方法可能直接影响多肽发挥其活性的效率。
畜禽血液经离心可分成血浆和血球(又称血细胞)两部分。其中血球约占血液总量的35％，以红细胞浓缩物为主，主要是血红蛋白。血红蛋白是一类含亚铁离子的复合变构蛋白，分子量为68kDa。每个血红蛋白分子是由四条各含有一分子血红素的多肽链(α链和β链)构成的球状结构，其中α链含有142个氨基酸残基，β链含有146个氨基酸残基，具有丰富的人体必需氨基酸。
血液、血球等传统加工工艺及其产品存在着固有缺陷。目前，国内外普遍采用的动物血液加工方法可分为普通法(蒸煮离心脱水法和喷雾干燥法)、化学法、发酵法和酶解法。血球在普通法加工过程中变硬，适口性差，不利于消化吸收；化学降解法是指用酸或碱水解血球蛋白的一种方法，该法操作简单，成本低且水解物溶解性较好，但水解程度和产物性质不易控制，存在副反应和蛋白损失等缺点；而发酵法制备的血球产品粗蛋白含量低且不稳定，发酵时间长，载体用量大；酶解法制备的水解血球蛋白，条件较为温和，但蛋白酶解过程中易产生苦味肽。
益生菌发酵可以增加食品的营养价值、改善口感和风味、调节肠道微生态平衡、增强身体免疫力等多种优点，对人体健康有着重要的积极意义。益生菌在发酵过程中，会释放出多种维生素、矿物质、氨基酸，有利于增加食品的营养价值；可以让食品变得更加酸甜可口，口感更为丰富，从而改善食品的口感和风味；会释放出大量有益菌群，如乳酸杆菌等，有助于增加肠道有益菌数量，消除肠道病菌；能够调节肠内微生物平衡，降低肠道pH值，抑制有害菌群的生长，改善肠道环境，能够刺激免疫系统，增强机体免疫力，预防和治疗某些疾病。益生菌发酵产生的有机酸和酶有助于消化和吸收食物中的营养物质，促进消化系统健康。益生菌发酵可以产生多种抗氧化物质，抑制自由基的产生和氧化反应的发生，从而具有抗氧化的作用，预防某些疾病的发生。
发明内容
本发明的第一目的是提供一种益生菌。
本发明的第二目的是提供一种益生菌在血红素肽铁制备中的用途，尤其是提供了一种畜禽血液活性物质高效分离提取方法，酶解与发酵联合工艺。
本发明筛选得到的益生菌——植物乳杆菌YR07用于发酵畜禽血液，可以高效降解血红蛋白，并降低水解产物苦味，改善风味，增强其活性物质功能性的方法，极大的提高畜禽血液附加值。
具体而言，本发明提供如下技术方案：
一种益生菌，为植物乳杆菌YR07，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月18日，生物保藏编号为CCTCC NO：M20221303。
本发明筛选得到的益生菌——植物乳杆菌YR07可用于血红素肽铁制备，其制备方法包括以下步骤：
(1)将畜禽血液离心，弃去上层血浆，用生理盐水洗涤红细胞后继续离心，重复洗涤三次，超声波法使红血球充分破壁，离心收集上清液为血红蛋白液；
(2)将所述血红蛋白液用碱性蛋白酶解，酶解后灭酶，离心取上清液，冷却至室温；
(3)制备发酵菌株植物乳杆菌YR07；
(4)向上清液中接种植物乳杆菌YR07进行发酵，发酵后过滤菌体，离心取上清液，获得血红素肽铁的发酵液；
(5)取发酵液进行超滤，获得不同分子量的血红素肽铁发酵液；
(6)将不同分子量的血红素肽铁发酵液进行冷冻干燥后，得到血红素肽铁。
其中，所述步骤(1)具体为，取一定体积新鲜抗凝畜禽血液，4℃3000-5000×g离心10-15min后血液分层，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤三次，获得新鲜红细胞；
量取40mL红细胞液加入170mL的蒸馏水(1:4.25)，在超声功率200-300W，超声时间10-15min、脉冲激发与间歇时间比2∶1下破碎红细胞，破碎过程中采用碎冰降温。破碎液在8000-10000×g下离心30min，弃下层细胞碎片收集上清液为血红蛋白提取液，真空冷冻干燥(冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h)备用。
其中，所述步骤(2)具体为，取10g破壁红细胞，按体积比1:10.87添加蒸馏水100mL，将溶液pH调节至pH 10.0，按照酶活力6280.52U/g的添加量添加碱性蛋白酶，使用恒温振荡水浴锅在45℃下酶解4.75h，然后在85℃高温处理15min灭酶，用冷水降温后在5000r/min，4℃条件下离心10min取上清液测可溶性肽含量及亚铁血红素含量。其中，所述碱性蛋白酶的酶活力约为200000U。
其中，所述步骤(3)具体为，将植物乳杆菌YR07以1％的接种量接种于灭菌后的MRS液体培养基中，在28-37℃的培养箱培养24h，连续三次传代，完成菌种的活化；
用移液管吸取1mL活化好的菌，接种于含100mL液体培养基的锥形瓶中，摇床转速为120-180r/min，30-37℃培养12-24h，测量生长曲线，进行菌落计数，得到试验用菌液。
其中，所述步骤(4)具体为，向酶解上清液中添加适量葡萄糖，灭菌后接种8％的植物乳杆菌YR07，将发酵液放在转速为150r/min、37℃条件下的培养箱中发酵12-72h；发酵完成后滤掉菌体，在4℃条件下，转速为3000-5000r/min，离心10-15min后取上清液，获得发酵液。
其中，所述步骤(6)中，冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
(1)本发明筛选得到了一种用于发酵畜禽血液的益生菌——植物乳杆菌YR07，其制备的血红素肽铁抗氧化能力强，具有优良的感官品质及功能特性，可应用于食品、保健品、制药、饲料等领域。
(2)本发明血红素肽铁的制备方法采用酶解与发酵联用对血红蛋白进行酶解与发酵，酶解效果好，能有效地将血红蛋白酶解成小分子肽；进一步发酵有效降低了血红素肽铁的苦味，并提高了其抗氧化性、生物可及性等，且制备工艺简单、过程温和，较好地保留了血红素肽铁的多功能活性；所用原料为畜禽血液，产量高且价格低廉。
(3)本发明制得的血红素肽铁具有良好的抗氧化活性，可以作为补铁剂、天然抗氧化剂和营养膳食补充剂，应用食品工业、制药工业、饲料工业等。
(4)本发明的制备过程未涉及任何有机溶剂，操作条件温和，最大程度地保留了血红素肽铁的活性，保证了产品的安全性。
(5)本发明的制备过程操作简便、成本低，适合工业化生产；既为畜禽血资源的利用提供了新途径，又对补铁剂与天然抗氧化剂的开发与应用具有重要意义。
附图说明
图1为不同蛋白酶的筛选结果；
图2为料液比对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响；
图3为酶解时间对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响；
图4为酶活力对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响；
图5为pH对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响；
图6为不同益生菌对不同发酵时间发酵液可溶性肽含量的影响；
图7为不同益生菌对不同发酵时间发酵液亚铁血红素含量的影响；
图8为不同益生菌对不同发酵时间发酵液DPPH自由基清除率的影响；
图9为不同加工阶段对血红素肽铁的影响。
生物保藏说明
植物乳杆菌YR07保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，保藏机构简称：CCTCC，保藏日期为2022年8月18日，生物保藏编号为CCTCC NO：M20221303。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
一种植物乳杆菌YR07协同酶解血红素肽铁的制备方法，包括以下步骤：
(1)超声波处理提取血红蛋白
取一定体积新鲜抗凝畜禽血液，4℃3000-5000×g离心10-15min后血液分层，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤三次，获得新鲜红细胞；
量取40mL红细胞液加入170mL的蒸馏水(1:4.25)，在超声功率200-300W，超声时间10-15min、脉冲激发与间歇时间比2：1下破碎红细胞，破碎过程中采用碎冰降温。破碎液在8000-10000×g下离心30min，弃下层细胞碎片收集上清液为血红蛋白提取液，真空冷冻干燥(冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h)备用。
(2)取10g破壁红细胞，按体积比1:10添加蒸馏水100mL，将溶液pH调节至pH 10.0，按照酶活力6000U/g的添加量添加碱性蛋白酶，使用恒温振荡水浴锅在45℃下酶解5h，然后在85℃高温处理15min灭酶，用冷水降温后在5000r/min，4℃条件下离心10min取上清液测可溶性肽含量及亚铁血红素含量。其中，所述碱性蛋白酶的酶活力约为200000U。
(3)将植物乳杆菌YR07以1％的接种量接种于灭菌后的MRS液体培养基中，在28-37℃的培养箱培养24h，连续三次传代，完成菌种的活化。
用移液管吸取1mL活化好的菌，接种于含100mL液体培养基的锥形瓶中，摇床转速为120-180r/min，30-37℃培养12-24h，测量生长曲线，进行菌落计数，得到试验用菌液。
(4)向酶解上清液中添加适量葡萄糖，灭菌后接种8％的植物乳杆菌YR07，将发酵液放在转速为150r/min、37℃条件下的培养箱中发酵12-72h；发酵完成后滤掉菌体，在4℃条件下，转速为3000-5000r/min，离心10-15min后取上清液，获得发酵液。
(5)取发酵液进行超滤，获得不同分子量的血红素肽铁发酵液。
(6)将不同分子量的血红素肽铁发酵液进行冷冻干燥后，得到血红素肽铁；其中，冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h。
以下实施例和对比例均以鸡血为原料，实际生产中并不限于鸡血，任何畜禽血液均可适用。
实施例鸡血中血红素肽铁的制备方法
(1)血红蛋白粉的制备
取1L新鲜抗凝鸡血(抗凝剂为0.4％的柠檬酸钠)，高速冷冻离心机设置温度为4℃，转速为5000×g离心10min后血液分层，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤三次，获得新鲜红细胞；
将上述得到的红细胞按照体积比为1:4.25加入蒸馏水，使用超声波细胞粉碎机设置超声功率300W，超声时间10min、脉冲激发与间歇时间比2∶1下破碎红细胞，破碎过程中采用碎冰降温。破碎液在10000×g下离心30min，弃下层细胞碎片收集上清液为血红蛋白提取液，真空冷冻干燥(冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h)成血红蛋白粉备用。
(2)血红蛋白的酶解工艺
取10g破壁红细胞，按体积比1:10添加蒸馏水100mL，将溶液pH调节至pH 10.0，按照酶活力6000U/g添加量碱性蛋白酶(酶活力约200000U)，使用恒温振荡水浴锅在45℃下酶解5h，然后在85℃高温处理15min灭酶，用冷水降温后在5000r/min，4℃条件下离心10min取上清液测可溶性肽含量及亚铁血红素含量。
(3)酶解液的发酵工艺
向酶解上清液中添加适量葡萄糖，灭菌后接种8％的植物乳杆菌YR07，将发酵液放在转速为150r/min、37℃条件下的培养箱中发酵12-72h。发酵完成后滤掉菌体，离心取上清液，测量可溶性肽含量、亚铁血红素含量、抗氧化活性等指标。
(4)取发酵液进行超滤，获得不同分子量的血红素肽铁发酵液；即，通过超滤分成＞10000Da，3000-10000Da，＜3000Da三个组分的血红素肽铁发酵液。
(5)将不同分子量的血红素肽铁发酵液进行冷冻干燥后，得到血红素肽铁；其中，冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h。
为了证明本发明筛选的植物乳杆菌YR07的效果，还进行了以下对比例。
对比例鸡血中血红素肽铁的制备方法
(1)血红蛋白粉的制备
取1L新鲜抗凝鸡血(抗凝剂为0.4％的柠檬酸钠)，高速冷冻离心机设置温度为4℃，转速为5000×g离心10min后血液分层，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤三次，获得新鲜红细胞；
将上述得到的红细胞按照体积比为1:4.25加入蒸馏水，使用超声波细胞粉碎机设置超声功率300W，超声时间10min、脉冲激发与间歇时间比2∶1下破碎红细胞，破碎过程中采用碎冰降温。破碎液在10000×g下离心30min，弃下层细胞碎片收集上清液为血红蛋白提取液，真空冷冻干燥(冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h)成血红蛋白粉备用。
(2)血红蛋白的酶解工艺
取10g破壁红细胞，按体积比1:10添加蒸馏水100mL，将溶液pH调节至pH 10.0，按照酶活力6000U/g添加量碱性蛋白酶(酶活力约200000U)，使用恒温振荡水浴锅在45℃下酶解5h，然后在85℃高温处理15min灭酶，用冷水降温后在5000r/min，4℃条件下离心10min取上清液测可溶性肽含量及亚铁血红素含量。
(3)酶解液的发酵工艺
向酶解上清液中添加适量葡萄糖，灭菌后接种8％的益生菌(清酒乳杆菌、戊糖片球菌P.p、枯草芽孢杆菌)，将发酵液放在转速为150r/min、37℃条件下的培养箱中发酵12-72h。发酵完成后滤掉菌体，离心取上清液，测量可溶性肽含量、亚铁血红素含量、抗氧化活性等指标。
(4)取发酵液进行超滤，获得不同分子量的血红素肽铁发酵液；即，通过超滤分成＞10000Da，3000-10000Da，＜3000Da三个组分的血红素肽铁发酵液。
(5)将不同分子量的血红素肽铁发酵液进行冷冻干燥后，得到血红素肽铁；其中，冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h。
其中，针对蛋白酶及酶解工艺进行了优化实验，并对实施例及对比例的不同菌种进行对比实验。使用邻苯二甲醛(OPA)测定法测量可溶性肽(Clara S.F.Bah，Alaa El-DinA.Bekhit,Michelle A.McConnell，Alan Carne.Generation of bioactive peptidehydrolysates fromcattle plasma using plant and fungal proteases[J].FoodChemistry，2016，213.)。
亚铁血红素测定法参见《亚铁血红素寡肽的制备及其微胶囊化》(林晓楠.亚铁血红素寡肽的制备及其微胶囊化[D].华南农业大学，2018)。
金属螯合率测定(Li Gaoshang，Zhan Junqi，Hu Lingping，Yuan Chunhong，Takaki Koichi，Ying Xiaoguo，Hu Yaqin.Identification of a new antioxidantpeptide from porcine plasma by in vitro digestion and its cytoprotectiveeffect on H2O2 induced HepG2 model[J].Journal of Functional Foods，2021，86)。
还原力测定(Zhaojun Zheng，Dayong Si，Baseer Ahmad，Zhongxuan Li，RijunZhang.A novel antioxidative peptide derived from chicken blood corpusclehydrolysate[J].Food Research International，2018，106)。
DPPH自由基清除率测定(Jing Yang，Jichao Huang，Xiaoli Dong，Yali Zhang，Xinghu Zhou，Ming Huang，Guanghong Zhou.Purification and identification ofantioxidant peptides from duck plasma proteins[J].Food Chemistry，2020，319)。
羟基自由基清除率测定(Cui Lei，Yang Guo，Lu Shuyi，Zeng Xiaoqun，He Jun，Guo Yuxing，Pan Daodong，Wu Zhen.Antioxidant peptides derived from hydrolyzedmilk proteins by Lactobacillus strains:A BIOPEP-UWM database-based analysis[J].Food Research International，2022，156)。
相关实验及结果分析如下：
A、碱性蛋白酶的筛选实验
1)测定不同酶的酶活力
中性蛋白酶、碱性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶的酶活力测定参考紫外分光光度计法，测量平行三次求平均值。
2)蛋白酶的筛选
选取碱性蛋白酶、中性蛋白酶、酸性蛋白酶、风味蛋白酶，在料液比1:10，酶活力6000U/g，酶解时间6h，不同蛋白酶的最适条件下进行酶解。以可溶性肽的含量、亚铁血红素含量、抗氧化活性为指标，结果显示碱性蛋白酶酶解液的可溶性肽的含量、亚铁血红素含量最高，其金属螯合率、DPPH自由基清除率也最高。
3)碱性蛋白酶酶解工艺的单因素试验设计
3.1料液比对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
取10g破壁红细胞，添加不同比例的水，料液比取5个水平：1:5、1:10、1:15、1:20、1:25，溶液pH调节至最适pH 10.0，酶活力为6000U/g，水浴锅45℃下均速搅拌酶解5h，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定最优料液比。
3.2酶解时间对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
取10g破壁血细胞，按上述确定的最优料液比添加水，溶液pH调节至最适pH 10.0，酶活力为6000U/g，水浴锅45℃下，均速搅拌酶解时间取5个水平：2h、3.5h、5h、6.5h、8h，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优酶解时间。更优选的，酶解时间5h。
3.3酶活力对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
取10g破壁血细胞，按上述确定的最优料液比添加水，溶液pH调节至最适pH 10.0，酶活力取5个水平：2000U/g、4000U/g、6000U/g、8000U/g、10000U/g，水浴锅45℃下均速搅拌酶解时间5h，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优酶活力。更优选的，酶活力为6000U/g。
3.4pH对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
取10g破壁血细胞，按上述确定的最优料液比添加水，溶液pH调节至5个水平：pH8.0、pH 9.0、pH 10.0、pH 11.0、pH 12.0，酶活力为6000U/g，水浴锅45℃下酶解5h，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优pH。更优选的，pH 10.0。
4)碱性蛋白酶酶解工艺的响应面优化试验
根据单因素试验的结果，得出血红素肽铁的主要影响因素是料液比、酶活力和酶解时间。以料液比(A)、酶活力(B)、酶解时间(C)为自变量，可溶性肽含量、亚铁血红素含量作为响应值(Y)，进行响应面优化试验。
表1响应曲面法因素水平
实验结果分析：
(1)蛋白酶的筛选
以可溶性肽的含量、亚铁血红素含量、抗氧化活性为指标，结果如图1所示。碱性蛋白酶酶解液的可溶性肽的含量、亚铁血红素含量最高，其金属螯合率、DPPH自由基清除率也最高。这是由于碱性蛋白酶是内切酶，具有更多的酶切位点，可以形成更多更小的肽段，故选用碱性蛋白酶做后续优化。
(2)碱性蛋白酶单因素试验
①料液比对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
酶解过程中当加水量较少时，酶的活性中心接近饱和，限制了血红蛋白与碱性蛋白酶的接触反应；相反，当加水量过多时，血红蛋白肽没有完全占据酶的活性中心，水解速度较慢。结果如图2所示，在料液比为1:10时，碱性性蛋白酶酶解的血红素肽铁可溶性肽含量和亚铁血红素含量最高。
②酶解时间对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
随着反应时间的增加，底物浓度减小的同时伴随着产物的积累，部分酶失活，从而导致反应速率下降。结果如图3所示，在酶解5h时，碱性性蛋白酶酶解的血红素肽铁可溶性肽含量和亚铁血红素含量最高。
③酶活力对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
由于酶的添加量增加会加快反应速率，但酶的添加量过多会使碱性蛋白酶的活性中心呈现一种饱和状态，饱和的酶之间会形成竞争关系，从而抑制水解能力。结果如图4所示，在酶活力为6000U/g时，碱性性蛋白酶酶解的亚铁血红素肽可溶性肽含量和亚铁血红素含量最高。
④pH对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
pH能影响酶分子活性中心上必需基团的解离，酶在最适pH时，活性中心、底物等均处于最适合的解离状态，有利于酶与底物结合，并催化底物释放出产物，酶促反应速度最大；远离最适pH时会使酶变性失活，酶促反应故而不能很好地进行。结果如图5所示，在pH为10时，碱性性蛋白酶酶解的亚铁血红素肽可溶性肽含量和亚铁血红素含量最高。
(3)碱性蛋白酶响应面优化试验设计及结果
根据单因素试验的结果，得出亚铁血红素肽的主要影响因素是料液比、酶活力和酶解时间。以料液比(A)、酶活力(B)、酶解时间(C)为自变量，可溶性肽含量、亚铁血红素含量作为响应值(Y)，进行响应面优化试验。
根据Design-Expert 8.0.6软件程序对酶解工艺条件进行优化，得到最佳酶解工艺条件为料液比为1:10.87、酶解时间为4.75h，酶活力为6280.52U/g，在此工艺条件下，可溶性肽含量的预测值为2.137mg/ml，亚铁血红素含量预测值为3.349mg/ml，在上述最佳水解工艺条件下进行3次平行实验后取平均值，获得实际可溶性肽含量为2.12mg/ml，与预测值相差0.80％，误差率为0.9％，获得实际亚铁血红素含量为3.256mg/ml，与预测值相差2.78％，误差率为1.9％，说明响应面分析法对于酶解工艺的优化结果可靠。
B、益生菌的对比实验
1)菌种的活化
选取四种益生菌：
植物乳杆菌YR07(Lactiplantibacillus plantarum，保藏编号CCTCC NO：M20221303)；
清酒乳杆菌(Lactobacillus sakei，购自中国工业微生物菌种保藏中心)；
戊糖片球菌(Pediococcus pentosaceus)P.p分离自上海昊岳实业有限公司的意大利萨科(SACCO)发酵剂LyocarniTHM-17；
枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis 24225，购自中国工业微生物菌种保藏中心)。
植物乳杆菌YR07、清酒乳杆菌、戊糖片球菌P.p 3种菌株以1％的接种量接种于灭菌后的MRS液体培养基中，枯草芽孢杆菌以1％的接种量接种于灭菌后的LB液体培养基中，在28-37℃的培养箱培养24h，连续三次传代。
2)培养基的制备及方法
MRS固体培养基：葡萄糖20g/L，蛋白胨10g/L，酵母粉4g/L，牛肉粉5g/L，吐温801mL，磷酸氢二钾2g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，琼脂15g/L，pH值6.2±0.2，121℃灭菌15min。
LB固体培养基：胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，琼脂15g/L，pH值7.0±0.2，121℃灭菌15min。
MRS液体培养基：葡萄糖20g/L，酪蛋白酶消化物10g/L，酵母膏粉4g/L，牛肉膏粉10g/L，吐温80 1.08mL，磷酸氢二钾2g/L，乙酸钠5g/L，柠檬酸三铵2g/L，硫酸镁0.2g/L，硫酸锰0.05g/L，pH值5.7±0.2，121℃灭菌15min。
LB液体培养基：胰化蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L，酵母浸粉5g/L，pH值7.0±0.2，121℃灭菌15min。
3)试验用菌种的制备
用移液管吸取1mL活化好的菌，接种于含100mL液体培养基的锥形瓶中，摇床转速为120-180r/min，30-37℃培养12-24h，测量生长曲线，进行菌落计数，得到试验用菌液1×107CFU/mL。
4)不同益生菌对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
在酶解液中接种相同接种量的四种益生菌，在最适条件下培养12-72h，每隔12h测可溶性肽含量、亚铁血红素含量、抗氧化活性。
5)血红素肽铁发酵工艺的单因素试验设计
5.1发酵时间对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
葡萄糖添加量为2％，在装液量60mL、接种量8％、起始pH值7.0、转速150r/min、28-37℃条件下，分别培养12h、24h、36h、48h、72h。离心取上清液，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优发酵时间。
5.2葡萄糖添加量对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
葡萄糖添加量选定0％、1％、2％、3％、4％五个水平，在装液量60mL、接种量8％、起始pH值7.0、转速150r/min、28-37℃条件下培养36h。离心取上清液，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优葡萄糖浓度。
5.3起始pH对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
葡萄糖添加量为2％，在装液量60mL、接种量8％、选定起始pH值6.0、6.5、7.0、7.5、8.0五个水平，转速150r/min、28-37℃条件下培养36h。离心取上清液，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优起始pH。
5.4接种量对酶解液可溶性肽含量及亚铁血红素含量的影响
葡萄糖添加量为2％，在装液量60mL、选定接种量为4％、6％、8％、10％、12％、起始pH值7.0、转速150r/min、28-37℃条件下培养36h。离心取上清液，以可溶性肽含量及亚铁血红素含量为指标，确定较优接种量。
6)发酵工艺的响应面优化试验
根据单因素试验的结果，得出血红素肽铁的主要影响因素是接种量、起始pH和发酵时间。以接种量(A)、起始pH(B)、发酵时间(C)为自变量，可溶性肽含量、亚铁血红素含量作为响应值(Y)，进行响应面优化试验。
实验结果分析：
(1)不同益生菌的发酵效果
结果如图6-7所示，在最适条件下，4种益生菌发酵产物的可溶性肽含量与亚铁血红素含量随着时间的延长都呈先增加后降低的趋势，总体来看植物乳杆菌YR07的发酵效果最好。
通过图8可以看出经植物乳杆菌YR07发酵得到的发酵液DPPH自由基清除率显著高于其他三种菌株，具有极强的抗氧化能力。参考GB 5009.124-2016《食品安全国家标准食品中氨基酸的测定》测定了不同发酵产物的游离氨基酸含量。
表2发酵前后血红素肽铁游离氨基酸含量变化
注：同行不同的上标字母表示组间差异显著(P<0.05)。鲜味氨基酸包括谷氨酸、天冬氨酸；苦味氨基酸包括组氨酸、赖氨酸、缬氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸、异亮氨酸、亮氨酸、精氨酸；甜味氨基酸包括丙氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、脯氨酸；咸味氨基酸包括半胱氨酸、甲硫氨酸(蛋氨酸)。
由表2发酵前后血红素肽铁游离氨基酸含量变化可以看出，酶解液经发酵后游离氨基酸含量显著(P<0.05)增加，从而提升了血红素肽铁的营养价值。植物乳杆菌YR07发酵产物中甜味氨基酸(19.88％)、咸味氨基酸(10.39％)含量显著高于未发酵的酶解产物甜味氨基酸(12.73％)、咸味氨基酸(10.11％)含量，植物乳杆菌YR07发酵产物的鲜味氨基酸(17.83％)、苦味氨基酸(51.90％)含量显著低于未发酵的酶解产物中鲜味氨基酸(24.99％)、苦味氨基酸(52.21％)。发酵工艺显著降低了血红素肽铁的血腥味与苦味，对其风味进行了极大的提升，植物乳杆菌YR07与其他菌株相比苦味最低，风味最好。
(2)不同加工阶段对血红素肽铁的抗氧化活性影响
由图9可知，血红蛋白粉在酶解的基础上进行发酵，血红素肽铁的羟基自由基清除率、DPPH自由基清除率、金属螯合率、还原力分别提升了206.49％、104.62％、80.18％、45.63％。
(3)不同分子量对血红素肽铁的可溶性肽及亚铁血红素含量影响
超滤后血红素肽铁分子量在3000-10000Da可溶性肽含量最高，3000Da以下的次之，10000Da以上最低；血红素肽铁分子量在10000Da以上的亚铁血红素含量最高，3000-10000Da次之，3000Da以下的最低。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (9)

1.一种益生菌，其特征在于：为植物乳杆菌YR07，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2022年8月18日，生物保藏编号为CCTCC NO：M20221303。
2.权利要求1所述益生菌在血红素肽铁制备中的应用。
3.根据权利要求2所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：其制备方法包括以下步骤：
(1)将畜禽血液离心，弃去上层血浆，用生理盐水洗涤红细胞后继续离心，重复洗涤三次，超声波法使红血球充分破壁，离心收集上清液为血红蛋白液；
(2)将所述血红蛋白液用碱性蛋白酶解，酶解后灭酶，离心取上清液，冷却至室温；
(3)制备发酵菌株植物乳杆菌YR07；
(4)向上清液中接种植物乳杆菌YR07进行发酵，发酵后过滤菌体，离心取上清液，获得血红素肽铁的发酵液；
(5)取发酵液进行超滤，获得不同分子量的血红素肽铁发酵液；
(6)将不同分子量的血红素肽铁发酵液进行冷冻干燥后，得到血红素肽铁。
4.根据权利要求3所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：所述步骤(1)具体为，取一定体积新鲜抗凝畜禽血液，4℃3000-5000×g离心后血液分层，收集下层红细胞，用生理盐水洗涤，获得新鲜红细胞；
量取40mL红细胞液加入170mL的蒸馏水，在超声功率200-300W，超声时间10-15min、脉冲激发与间歇时间比2：1下破碎红细胞，破碎过程中采用碎冰降温；破碎液在8000-10000×g下离心，弃下层细胞碎片收集上清液为血红蛋白提取液，真空冷冻干燥备用。
5.根据权利要求3所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：所述步骤(2)具体为，取10g破壁红细胞，按体积比1:10.87添加蒸馏水100mL，将溶液pH调节至pH10.0，按照酶活力6280.52U/g的添加量添加碱性蛋白酶，使用恒温振荡水浴锅在45℃下酶解4.75h，然后在85℃高温处理15min灭酶，用冷水降温后在5000r/min，4℃条件下离心10min取上清液测可溶性肽含量及亚铁血红素含量。
6.根据权利要求5所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：所述碱性蛋白酶的酶活力为200000U。
7.根据权利要求3所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：所述步骤(3)具体为，将植物乳杆菌YR07以1％的接种量接种于灭菌后的MRS液体培养基中，在28-37℃的培养箱培养24h，连续三次传代，完成菌种的活化；
用移液管吸取1mL活化好的菌，接种于含100mL液体培养基的锥形瓶中，摇床转速为120-180r/min，30-37℃培养12-24h，测量生长曲线，进行菌落计数，得到试验用菌液。
8.根据权利要求3所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：所述步骤(4)具体为，向酶解上清液中添加适量葡萄糖，灭菌后接种8％的植物乳杆菌YR07，将发酵液放在转速为150r/min、37℃条件下的培养箱中发酵12-72h；发酵完成后滤掉菌体，在4℃条件下，转速为3000-5000r/min，离心10-15min后取上清液，获得发酵液。
9.根据权利要求3所述的益生菌在血红素肽铁制备中的应用，其特征在于：所述步骤(6)中，冻干条件为：冷阱温度-60℃以下、真空度＜10.0Pa、干燥时间＞24h。
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