CN116621999A - 一种香蕉花多糖的提取及其对晚期糖基化终末产物的抑制作用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于植物多糖领域，具体涉及一种香蕉花多糖的提取及其对晚期糖基化终末产物的抑制作用。本发明所述的香蕉花多糖的提取方法，通过对香蕉花粉末进行处理，香蕉花粗多糖的产率可以达到40.06%。通过采用蒸馏水和不同浓度的NaCl洗脱，获得了组分MSBP1，进一步纯化获得的MSBP11和MSBP12。经验证，MSBP1和MSBP11、MSBP12均对晚期糖基化终末产物的具有显著抑制活性，其中MSBP11d的活性显著高于MSBP1和MSBP12。
Description
技术领域
本发明属于植物多糖领域，具体涉及一种香蕉花多糖的提取及其对晚期糖基化终末产物的抑制作用。
背景技术
在香蕉栽培过程中，大量的香蕉花常常作为废料处理，不仅污染香蕉园环境，而且造成了极大的资源浪费。因此如何提高香蕉废弃物的综合利用是目前香蕉产业待解决的问题之一。
晚期糖基化终末产物(advanced glycation end products AGEs)是过量的糖和蛋白质结合的产物。AGEs能够和身体的组织细胞相组合并破坏它们，从而危害人体的健康。因此，研究香蕉花对于AGEs的抑制活性不仅可以解决香蕉花的污染问题，同时可以为AGEs的研究提供新的药物资源。
发明内容
本发明提供了一种香蕉花多糖的提取及其对晚期糖基化终末产物的抑制作用，利用香蕉花作为多糖的提取原料。从香蕉花中提取的多糖具有显著的抑制AGEs活性。
本发明的技术方案是这样实现的：
一种香蕉花多糖的提取方法，包括以下步骤：
(1)取新鲜香蕉花，烘干之后粉碎获得香蕉花粉末；
(2)将香蕉花粉末与去离子水混合，并在100℃下提取3h；
(3)将上清液通过过滤器以除去杂质，通过添加无水乙醇进行浓缩和沉淀，并在4℃下储存过夜；
(4)残余物用蒸馏水重新溶解，加入Sevag试剂，摇动并静置5分钟除去蛋白质沉淀得粗多糖，将多糖透析(Mw＝1000Da)48小时并冻干，即获得香蕉花粗多糖(Musaspp.blossom，简写为MSBP)；
(5)MSBP用蒸馏水溶解，并在充分搅拌后以12000g离心5分钟；在平衡的纤维素DEAE-52柱上以15ml/min的流速用NaCl溶液梯度洗脱纯化上清液，以获得四个级分：MSBP1、MSBP2、MSBP3和MSBP4；
(6)获得的主要部分MSBP1通过Sephacryl-400填充凝胶柱进一步纯化，洗脱缓冲液为0.2M NaCl，流速为1.0ml/min；洗脱液透析(Mw＝3500Da)后，浓缩纯化MSBP1级分MSBP11和MSBP12并冻干。
进一步，所述的步骤(2)中，新鲜香蕉花在50℃烘干12h；香蕉花粉末与去离子水的w/v为1:10。
进一步，所述的步骤(2)中，香蕉花粉末重复提取3次。
进一步，所述的步骤(3)中，上清液与无水乙醇的w/v为1:4。
进一步，所述的步骤(5)中，纤维素DEAE-52柱为直径1.6cm，长度50cm，所述NaCl溶液的摩尔浓度为0、0.2、0.5、1.0mol/L。
进一步，所述的步骤(6)中Sephacryl-400填充凝胶柱直径2.6cm，长度为100cm。
以上制得的MSBP1、和/或MSBP11、和/或MSBP12在制备抑制糖基化终末产物的制剂上的应用。
进一步，所述的应用中，MSBP11的质量浓度为0.5-5.0mg/mL。
进一步，所述的应用中，MSBP1和MSBP12的质量浓度均为5.0mg/mL。
以上制得的MSBP1、和/或MSBP11、和/或MSBP12在制备抗氧化的制剂上的应用。
进一步，所述的应用中，MSBP1、MSBP11、MSBP12的质量浓度均为5mg/mL。
本发明的有益效果：
本发明所述的香蕉花多糖的提取方法，通过对香蕉花粉末进行处理，香蕉花粗多糖的产率可以达到4g/100g。通过采用蒸馏水和不同浓度的NaCl洗脱，获得了组分MSBP1、MSBP2、MSBP3和MSBP4，进一步纯化MSBP1获得了MSBP11和MSBP12。经验证，MSBP1和MSBP11、MSBP12以及抗氧化活性。其中，对晚期糖基化终末产物具有显著抑制活性，MSBP11活性显著高于MSBP1和MSBP12；而抗氧化活性，MSBP1高于MSBP11和MSBP12。上述实验结果为香蕉花的综合利用提供了数据的基础，为香蕉花的综合利用提供了新的途径。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动性的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。图1为MSBP11和MSBP12的分离和纯化。(A)粗MSBP的DEAE-52柱层析；(B)通过HPGPC法进行分子量和纯度分析；(C)MSBP11的纯度分析。图2为MSBP11对BSA-FRU(A-B)和BSA-GLU(C-D)模型中荧光AGEs、二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸和非荧光AGEs形成的影响。不同字母的数据差异显著(P<0.05)。
图3为MSBP11对GO和MGO的捕获。(A)MSBP11的GO和MGO去除率；(B)MSBP11与GO和MGO的加合物的质谱。不同字母的数据差异显著(P<0.05)。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
实施例1
1.材料及试剂
从中国热带农业科学院海口试验站丹州热带果树试验场(中国海南省丹州市)采集新鲜香蕉花。甲基乙二醛(MGO，40％在水中)和乙二醛(“GO”，40％在水中)购自上海阿拉丁生化有限公司(中国上海)。D-(–)-果糖(FRU)、D-(–)-葡萄糖(GLU)和磷酸盐缓冲液(PBS)从上海麦克林生化有限公司(中国上海)获得。Nε-羧甲基赖氨酸(CML)、CML-d4、Nε-Carboxyethylysine(CEL)和CEL-d4购自多伦多研究化学公司(加拿大安大略省北约克市)。牛白蛋白(BSA，≥98％)、超高效液相色谱-串联质谱仪(UPLC-MS/MS)级溶剂、用于气相色谱-质谱(GC-MS)分析的单糖标准、用于相对分子量(Mw)测定的标准葡聚糖和其他化学试剂购自Sigma-Aldrich(密苏里州圣路易斯)。所有试剂均为最高等级。
2.香蕉花多糖的分离和纯化
取新鲜的香蕉花，50℃烘干12h，获得香蕉花粉末。将香蕉花粉末(500g)与去离子水(1:10，w/v)混合，并在100℃下提取3h。提取过程重复三次。将上清液通过过滤器以除去杂质，通过添加无水乙醇(1:4，w/v)进行浓缩和沉淀，并在4℃下储存过夜。残余物用蒸馏水重新溶解，加入Sevag试剂，摇动并静置5分钟。蛋白质层在多糖溶液和Sevag试剂之间的界面处沉淀，去除蛋白质层后重复步骤，直到没有蛋白质沉淀。除去蛋白质后，将多糖透析(Mw＝1000Da)48小时并冻干以获得粗香蕉花(Musa spp.blossom)多糖(MSBP)。粗MSBP的产率通过以下公式计算：
产率(％)＝粗多糖重量(g)/原料重量(g)x100％
粗MSBP用蒸馏水溶解，并在充分搅拌后以12000g离心5分钟。在平衡的纤维素DEAE-52柱(1.6×50cm)上以15ml/min的流速用NaCl溶液(0、0.2、0.5、1.0m)梯度洗脱纯化上清液，以获得四个级分(MSBP1、MSBP2、MSBP3和MSBP4)。苯酚-硫酸法在490nm处通过酶标仪跟踪进行检测，并基于以下计算产率：
产率(％)＝级分重量(g)/粗多糖重量(g)x100％
获得的主要部分(MSBP1)通过Sephacryl-400填充凝胶柱(2.6×100cm)进一步纯化，洗脱缓冲液为0.2M NaCl，流速为1.0ml/min。洗脱液透析(Mw＝3500Da)后，使用旋转蒸发器(R-1001VN，中国郑州长城)浓缩纯化的MSBP1级分MSBP11和MSBP12并冻干。
3.不同级分对化学模型中AGEss形成的影响
反应体系包含60mg/mL BSA、1.5M FRU或0.8M GLU，其在50mM PBS(含有0.02％NaN3，pH 7.4)中制备。各样品按照5.0mg/mL的剂量添加。试管在37℃的培养箱(SPX-250B-Z，中国上海博讯)中培养7天。通过荧光分光光度计(日本东京日立F-7000)在325/440nm的激发/发射波长下测定荧光强度，比较AGEs的差异，计算各级分的抑制率。
抑制率(％)＝(λ对照-λ样品)/λ对照×100％
其中，λ对照为培养后对照组的荧光强度，λ对照为培养后对照组的荧光强度。
4.MSBP1、MSBP11和MSBP12的抗糖基化活性分析
4.1BSA-FRU/GLU模型中AGEs形成的影响
如前述“3”所述，按照5.0mg/mL的剂量，分别将MSBP1、MSBP11和MSBP12加入BSA-FRU和BSA-GLU化学模型系统。在系统中测定MSBP1、MSBP11和MSBP12对AGEs(荧光AGEs、CML和CEL)和二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸的抑制率。
通过在325/440nm的激发/发射波长下测量样品的荧光强度来确定反应体系中荧光AGEs的浓度。在330/415、365/480和325/434nm的激发/发射波长下分别检测到二酪氨酸、犬尿氨酸和N'-甲酰基犬尿氨酸。
将与200μL 800ng/mL CML-d4和CEL-D5混合的样品通过固相萃取柱(CleanertPCX，150mg/6mL)。使用SCIEX Triple Quad 6500+UPLC-MS/MS和X-Bridge C18柱(4.6×150mm，5μm)在30℃下测定每个系统中的CML和CEL含量。溶液A是0.3％(v/v)甲酸水溶液，溶液B是甲醇。溶剂组成为：0-0.4分钟，90％A；0.4-3.5分钟，90-40％A；和3.5-6.0分钟，90％A。流速为0.3ml/min，注射量为2μL。用于定量CML、CML-d4、CEL和CEL-D5的过渡离子为m/z205/84、m/z 209/88、m/Z219/84和m/z 223/134。
4.2GO和MGO的去除率
按照5.0mg/mL的剂量，分别将MSBP1、MSBP11和MSBP12与2mL 10mmol/LGO或MGO在螺旋盖试管中混合，在170℃的油浴(DF-101S，中国郑州天辰)中加热10分钟，并立即置于冰上冷却。GO和MGO的各待测样品的俘获率计算如下：
“GO/MGO捕集率”＝(C0-C1)/C0×100％，其中C0和C1分别是反应前后系统中GO或MGO的浓度。
4.3.MSBP11抗糖基化活性分析
(1)BSA-FRU/GLU模型中AGEs形成的影响
将不同浓度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL)的MSBP11加入BSA-FRU和BSA-GLU化学模型系统。按照“4.1”中的方法，在化学模型系统中测定不同浓度MSBP11对系统中AGEs(荧光AGEs、CML和CEL)和二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸的抑制率。
(2)二羰基化合物(GO和MGO)的去除率
按照“4.2”中的方法，将不同浓度(0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mg/mL)的MSBP11与2mL 10mmol/L GO或MGO在螺旋盖试管中混合，在170℃的油浴(DF-101S，中国郑州天辰)中加热10分钟，并立即置于冰上冷却。计算MSBP11对GO和MGO的去除率。
为了进一步确定MSBP11抑制AGEs形成的机制，使用UPLC-MS/MS鉴定了MSBP11与二羰基化合物的加成产物。具体操作如下：将MSBP11加热，与GO/MGO反应，并在25℃下注入UPLC-MS/MS。溶液A是0.1％(v/v)甲酸，溶液B是含有0.1％甲酸的甲醇。梯度洗脱为：0-0.1min，5％A；0.1-0.9分钟，5％-80％A；0.9-2.0分钟，80％-70％A；质量扫描范围为m/z100-1000。
5.不同提取级分抗氧化活性测得
如Shen等人(2018)和Wang等人(2018年)所述，通过测定浓度均为5.0mg/mL下，MSBP1、MSBP11和MSBP12对1,1-二苯基-2-吡啶基肼(DPPH)、羟基和ABTS自由基清除活性，比较MSBP1及MSBP11、MSBP12的抗氧化活性。抗坏血酸(VC)用作阳性对照。以下等式用于计算每个自由基的清除活性。
DPPH清除活性(“％”)＝[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100％
其中A对照、A样品和空白分别为混合物(样品用去离子水代替)、含DPPH的多糖溶液和不含DPPH多糖溶液的吸光度。
OH清除活性(“％”)＝[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100％，
其中，样品反应溶液、单独样品溶液和不含样品的试剂的吸光度分别为样品、烧蚀和对照。
ABTS清除活性(“％”)＝[1-(Asample-Ablank)/Acontrol]×100％，
其中，样本、Ablank和Acontrol分别为受试样品、无ABTS的样品和无样品的试剂空白的吸光度。
6.结果和讨论
6.1.产率、纯度和分子量
对500g香蕉花粉末进行一系列处理以获得20.03g粗MSBP，产率为4g/100g。在用蒸馏水和不同浓度的NaCl洗脱后，四个级分MSBP1、MSBP2、MSBP3、MSBP4的产率分别为30％、17％、3％和3％(图1A)。收集MSBP1用于进一步纯化。MSBP1主要由MSBP11和MSBP12组成，分别占17.40％和65.5％(图1B)。高效凝胶色谱图显示MSBP11和MSBP12以单对称峰洗脱，表明样品纯度高(图1C)。基于不同葡聚糖标准物的标准曲线，计算出MSBP11和MSBP12的分子量分别为214.43和25.08kDa。MSBP11和MSBP12的Mw/Mn分别为1.66和1.42(<2)，表明两种样品的分子量分布较窄。
6.2不同级分抗糖基化活性比较
选择经典的蛋白质糖基化模型(BSA-FRU)。MSBP1、MSBP2、MSBP3、MSBP4、MSBP11和MSBP12均显著减少了两种化学模型中AGEs的形成(表1)。
表1不同级分AGEs抑制率比较(％)
在BSA-FRU模型中，MSBP1(8.64％)、MSBP11(11.22％)和MSBP12(7.24％)均表现出对AGEs抑制活性，而MSBP11和MSBP12对AGEs的形成抑制活性存在显著差异，MSBP11表现出更强的AGEs抑制活性。
6.3MSBP1、MSBP11和MSBP12的抗糖基化活性分析结果
6.3.1MSBP1、MSBP11和MSBP12对化学模型中AGEs形成的影响
将5.0mg/mL的MSBP1、MSBP11和MSBP12分别添加到BSA-FRU和BSA-GLU模型系统中，以评估剂量对抑制AGEs形成的影响。如表2所示，各组分对模型系统中的荧光和非荧光(CML，CEL)AGEs抑制作用存在较大的差异。
表2各组分对模型中不同物质的抑制率比较(％)
由表2可以看出，添加了MSBP11的模型，荧光AGEs和二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸的降低比率，相对于MSBP1和MSBP12均有不同程度的提高。说明MSBP11对于荧光AGEs和各二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸均有显著的抑制作用，其抑制率相对于MSBP1和MSBP12均有不同程度的提升。
6.3.2二羰基化合物(GO和MGO)的去除率比较
MSBP1、MSBP11和MSBP12对于GO和MGO的去除率如表3所示。
表3 GO和MGO去除率比较(％)
| 测定指标 | MSBP1 | MSBP11 | MSBP12 |
| GO去除率 | 10.90 | 11.68 | 9.25 |
| MGO去除率 | 21.98 | 25.16 | 24.77 |
由表3可以看出，MSBP11对于GO和MGO去除率显著高于MSBP1和MSBP12。
综合上述两部分的数据可知，MSBP11的抗糖基化活性明显高于MSBP1和MSBP12。因此，选择MSBP11做进一步的活性测定。
6.4MSBP11抗糖基化活性分析结果
(1)BSA-FRU/GLU模型中AGEs形成的分析
在BSA-FRU模型中，AGEs的荧光强度随着MSBP11剂量的增加而降低(图2A)。在5.0mg/mL的剂量下，与对照组相比，模型系统中的荧光AGEs水平降低了17.46％。BSA-GLU模型中不同水平的MSBP11对荧光AGEs的抑制活性与BSA-FRU模型一致，最大抑制率为14.32％(图2B)。这两种模型的实验结果说明，MSBP11对AGEs的不同抑制率可能是由于FRU的活性羰基比GLU更高(Jung，Park，Min，Jung，Islam&Choi，2015)。由于蛋白质氧化通常伴随着AGEs的形成，因此二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸的浓度可以作为AGEs形成的一个指标。在AGEs生成过程中，蛋白质被氧化为二酪氨酸、kynurenine和N’-甲酰基kynurene(Izabela、Sabina和Grzegorz，2014)。在BSA-FRU模型中，5mg/mL MSBP11对二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸的抑制作用分别达到14.32％、20.36％和13.65％。MSBP11对二酪氨酸，犬尿氨酸和N’-甲酰犬尿氨酸的强抑制活性证实了其抗氧化活性。在BSA-GLU中也观察到相同的抑制活性。CML和CEL通常被选为定量非荧光AGEs的测定目标，因为这些化合物可以代表反应体系中的非荧光AGEs总水平(Chao、Hsu和Yin，2009；Charissou、Ait Ameur和Birlouez-Aragon，2007)。BSA-FRU模型中的CML和CEL浓度分别为88.62ng/mL和34.44ng/mL。与对照组相比，仅在含有5mg/mL MSBP11的系统中观察到CML和CEL的显著降低(P<0.05)，分别降低13.16％和5.04％(图2C)。如图2D所示，在浓度为3.0–5.0mg/mL的BSA-GLU反应系统中，MSBP11对CML具有显著的抑制作用(P<0.05)。相反，MSBP11对CEL的抑制作用不显著(P>0.05)。抑制活性的差异可能归因于MSBP11和两种非荧光AGEs中间体之间的不同相互作用(Lan等人，2020)。
(2)MSBP11捕获二羰基化合物(MGO和GO)
二羰基化合物(MGO和GO)是AGEs的重要前体物质。MSBP11以剂量依赖性的方式捕获MGO和GO(图3A)，这与化学模型结果一致，并表明MSBP11表现出对AGEs前体物质的优异清除能力，以阻断糖基化反应。在5.0mg/mL的剂量下，MSBP11对MGO和GO的去除率最高，分别为25.16％和11.68％。这一结果与MSBP11抑制CML和CEL的趋势一致，这证实了抑制剂对不同二羰基化合物的不同效力。
如图3B所示，a[M-H]-质谱中在m/z 1560.38处观察到峰。该峰归因于一个单位的MSBP11。在MSBP11与GO反应后观察到新的峰(m/z 1618.42、m/z 1675.46和m/z 1732.5)，归因于MSBP11分别与1、2和3个GO分子形成加合物(MwGO＝58)。类似地，MSBP11–MGO、MSBP11-2MGO和MSBP11-3MGO具有的[M–H]-峰值分别位于m/z 1632.44、m/z1703.51和m/z1774.57。我们假设MSBP11通过羟基捕获GO或MGO，类似于酚类化合物(Sheng等人，2016)，并且一个MSBP11单元与1-3个GO或MGO分子形成加合物。然而，MSBP11和GO/MGO之间的加合反应的确切途径仍然没有确定。未来的研究检查了MSBP11对AGEs前体物质的去除动力学，并结合NMR数据，应提供更准确的途径表征。总之，我们的结果表明，MSBP11通过捕获MGO/GO形成加合物有效抑制了AGEs的形成。
6.5不同级分抗氧化活性
不同级分对于DPPH、羟基自由基和ABTS自由基清除率如表4所示。
表4不同级分清除率比较(％)
| MSBP1 | MSBP11 | MSBP12 | |
| DPPH自由基清除率 | 62.58 | 45.59 | 43.89 |
| 羟基自由基清除率 | 20.44 | 30.18 | 39.86 |
| ABTS自由基清除率 | 54.08 | 29.91 | 20.58 |
由表1可以看出，在测定浓度条件下，MSBP11对于DPPH、羟基自由基和ABTS自由基均有清除作用，且结果显示MSBP11的抗氧化活性不如MSBP1。上述结果与抗糖基化活性测定结果不一致，说明经过分离，MSBP11的抗糖基化活性显著提高，而抗氧化活性反而下降。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种香蕉花多糖的提取方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)取新鲜香蕉花，烘干之后粉碎获得香蕉花粉末；
(2)将香蕉花粉末与去离子水混合，并在100℃下提取3h；
(3)将上清液通过过滤器以除去杂质，通过添加无水乙醇进行浓缩和沉淀，并在4℃下储存过夜；
(4)残余物用蒸馏水重新溶解，加入Sevag试剂，摇动并静置5分钟除去蛋白质沉淀得粗多糖，将多糖透析(Mw＝1000Da)48小时并冻干，即获得香蕉花粗多糖，简写为MSBP；
(5)MSBP用蒸馏水溶解，并在充分搅拌后以12000g离心5分钟；在平衡的纤维素DEAE-52柱上以15ml/min的流速用NaCl溶液梯度洗脱纯化上清液，以获得四个级分：MSBP1、MSBP2、MSBP3和MSBP4；
(6)获得的主要部分MSBP1通过Sephacryl-400填充凝胶柱进一步纯化，洗脱缓冲液为0.2M NaCl，流速为1.0ml/min；洗脱液透析(Mw＝3500Da)后，浓缩纯化的MSBP1级分MSBP11和MSBP12并冻干。
2.如权利要求1所述的一种香蕉花多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤(2)中，新鲜香蕉花在50℃烘干12h；香蕉花粉末与去离子水的w/v为1:10；香蕉花粉末重复提取3次。
3.如权利要求1所述的一种香蕉花多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤(3)中，上清液与无水乙醇的w/v为1:4。
4.如权利要求1所述的一种香蕉花多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤(5)中，纤维素DEAE-52柱为直径1.6cm，长度50cm，所述NaCl溶液的摩尔浓度为0、0.2、0.5、1.0mol/L。
5.如权利要求1所述的一种香蕉花多糖的提取方法，其特征在于，所述的步骤(6)中Sephacryl-400填充凝胶柱直径2.6cm，长度为100cm。
6.如权利要求1-5任一项所述的提取方法制得的MSBP1、和/或MSBP11、和/或MSBP12在制备抑制晚期糖基化终末产物的制剂上的应用。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：MSBP11的质量浓度为0.5-5.0mg/mL。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述MSBP1和MSBP12的质量浓度均为5.0mg/mL。
9.如权利要求1-6任一项所述的提取方法制得的MSBP1、和/或MSBP11、和/或MSBP12在制备抗氧化的制剂上的应用。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于：MSBP1、MSBP11、MSBP12的质量浓度均为5mg/mL。
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| 刘旭光等: "香蕉花功能饮料工艺研究", 农产品加工, no. 2, 30 January 2016 (2016-01-30), pages 29 - 32 * |
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