CN116621900A - 一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物及其应用 - Google Patents

一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种基于调控Mucin型O‑糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物及其应用。本发明通过对化合物的结构进行设计，合成了轴向两侧拥有不对称结构的四个四价铂氨基己糖配合物R7‑R10，以实现其活性好、毒性低的抗肿瘤疗效。本发明所述四价铂氨基己糖配合物对前列腺癌细胞具有较高的选择性，尤其是R10对雄激素非依赖性的前列腺癌细胞的杀伤作用达到纳摩尔级别。所述化合物R10在前列腺癌小鼠体内具有较高的抗肿瘤活性和抗转移能力，生物安全性高。氨基己糖类似物作为糖代谢药物研究的新趋势，通过将氨基己糖与药物进行缀合，发挥其双重功效的模式，成为研究者的重视。

Description

一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖 配合物及其应用
技术领域
本发明属于药物化学技术领域，具体涉及一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物及其应用。
背景技术
随着癌症发病率的逐年提升，化学疗法是当前治疗癌症的主要方法之一，二价铂类药物和新型的四价铂类药物在癌症的治疗中占据主导地位，但因其毒副作用和耐药性在临床上的应用受到了限制。近几年，可口服的四价铂类抗肿瘤药物作为二价铂类药物的前药成为铂类药物研究开发的重点。发明人长期致力于开发新型四价铂配合物，通过引入生物活性配体来增强其抗肿瘤活性，降低铂类药物的毒副作用。然而，前期的研究成果仅实现了对铂类药物的靶向性修饰，并未能干扰肿瘤细胞的糖代谢水平增强耐药细胞对铂类药物的敏感性。
前列腺癌是男性中发病率较高的一种恶性肿瘤。雄激素在前列腺上皮细胞的增殖和分化中发挥着至关重要的作用，因此早期前列腺癌患者的主要治疗手段为雄激素阻断治疗，然而多数患者会产生雄激素受体突变发展成为去势抵抗性前列腺癌(Castration-Resistant Prostate Cancer，CRPC)，这种前列腺癌患者对雄激素的封锁作用使其对于大多数的治疗方式均不敏感，至今没有一种有效的治疗方案。CRPC患者的治疗一直是困扰世界的难题，因此研发新的药物用于治疗雄激素非依赖性前列腺癌迫在眉睫。
粘蛋白1(MUC1)是一种单通道I型跨膜蛋白，具有高度糖基化的胞外结构域。全长MUC1由两个亚基组成，N端亚基(MUC1-N)和C端亚基(MUC1-C)，在乳腺、肺和前列腺的腺上皮或管腔上皮细胞中通常低水平表达。前列腺分泌液为大量不同类型的O-糖基化修饰的糖蛋白MUC1及PSA(Prostate-specific antigen)，且其在血浆中的变化目前已成为CRPC进展的重要标志物，且O-糖基化修饰的糖蛋白MUC1如s-Tn-Mucin-1、Tn-Mucin-1及SLeX等已经成潜在的治疗靶点。这些O-糖基化修饰的糖蛋白在CRPC的黏附、迁移、免疫监视、细胞信号传导及代谢中起着至关重要的作用.控制MUC1型O-糖基化修饰将成为靶向CRPC及CSCs并控制免疫抑制细胞MDSCs重要的“糖代谢检查点”。
氟代乙酰氨基己糖在细胞水平的研究已有大量报道，研究表明4-F-GlcNAc可以降低前列腺癌细胞膜表面高分支N-糖链以及O-糖链的种类，还可以影响T细胞和NK细胞的生物功能。
药物的脂水分配对药物进入细胞有着重要的影响，研究表明，在四价铂的轴向配体引入烷基脂肪链可有效增强药物与HSA结合能力，避免药物在血液中暴露过多，降低其进入血液后被还原性物质及含硫蛋白等毒化的概率，提高药物的稳定性，从而提高药物的生物利用度。
本发明首次将氨基己糖类似物引入到四价铂轴向配体，选择两种临床使用较多的二价铂药物顺铂和奥沙利铂，进而比较不同母体铂对抗肿瘤活性的影响。
发明内容
基于现有技术中存在的不足，本发明目的在于提出一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物，通过对化合物的结构进行设计，合成了轴向两侧拥有不对称结构的四个四价铂氨基己糖配合物R7-R10，以实现其活性好、毒性低的抗肿瘤疗效。
本发明还提供了所述基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物在制备肿瘤治疗药物中的应用。
为达到上述目的，本发明创造的技术方案是这样实现的：
一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物，其结构通式如式I所示：
具体的，式中R为：
式中Sug为：
具体的，所述四价铂氨基己糖配合物中，母核为顺铂、卡铂、庚铂、奈达铂、奥沙利铂、洛铂、米铂、吡铂、NDDP中的任一种，优选为顺铂或奥沙利铂：
具体的，所述轴向两侧拥有不对称结构的四价铂氨基己糖配合物的结构式如下R7-R10所示：
具体的，所述四价铂氨基己糖配合物R7、R8、R9、R10的制备方法，包括如下步骤：
采用化合物L4或L13与化合物1C或2C经HATU缩合反应即可得到目标化合物R7、R8、R9或R10。
具体的，制备化合物R7时，化合物L4与化合物2C的质量比为(0.8-0.9)：1，优选为0.85：1。具体的，制备化合物R8时，化合物L13与化合物2C的质量比为(0.6-0.8)：1，优选为0.65：1。具体的，制备化合物R9时，所述化合物L4与化合物1C的质量比为1：(1-1.2)，优选为1：1.04。具体的，制备化合物R10时，所述化合物L13与化合物1C的质量比为1：(1-1.5)，优选为1：1.17。
具体的合成路线如下式所示：
具体的，化合物L4的制备方法为：
乙酰氨基葡萄糖首先经乙酸酐和乙酸钠作用得到全乙酰基保护的葡萄糖L1，L1在路易斯酸的催化下与5-氯-1-戊醇在无水1，2-二氯乙烷中，加热得到产物L2，后经叠氮钠叠氮化并经钯碳还原后得到葡萄糖1位胺取代的衍生物L4。具体的合成路线如下式所示：
具体的，化合物L13的制备方法为：
乙酰氨基半乳糖首先在苯甲醇和盐酸作用下升温得1位苄基保护的乙酰氨基半乳糖L5，接着L5在二氯甲烷与苯甲酰氯在吡啶的催化下，冰浴滴加可得到产物L6，化合物L6在二氯甲烷中与二乙氨基三氟化硫在低温条件下反应，得到被保护的4-氟乙酰氨基葡萄糖L7，后经甲醇和甲醇钠脱苯甲酰基得到L8，L8经钯碳还原后得到4-氟乙酰氨基葡萄糖L9；L9经乙酸酐和吡啶作用得全乙酰基保护的4-氟乙酰氨基葡萄糖L10，在路易斯酸的催化下与5-氯-1-戊醇在无水1，2-二氯乙烷中，加热得到产物L11，后经叠氮钠叠氮化并经钯碳还原后得到全乙酰基保护的4-氟乙酰氨基葡萄糖1位胺取代的衍生物L13。具体的合成路线如下式所示：
具体的，化合物1C的制备方法为：
顺铂通过氧化得四价铂1A，再和棕榈酸酐在DMSO中反应7天可得1B，最后再和丁二酸酐在DMSO中过夜反应，即得1C。具体的合成路线如下式所示：
具体的，化合物2C的制备方法为：
奥沙利铂通过氧化得四价铂2A，再和棕榈酸酐在DMSO中反应7天可得2B，最后再和丁二酸酐在DMSO中过夜反应，即得2C。具体的合成路线如下式所示：
进一步的，本发明还提供了所述四价铂氨基己糖配合物、或者所述四价铂氨基己糖配合物联合顺铂或奥沙利铂或5-氟尿嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。
具体的，所述肿瘤包括但不限于人子宫颈癌、人乳腺癌、人肺腺癌、人肝癌、人结肠癌、耐顺铂人肺腺癌或人前列腺癌。
进一步的，本发明还提供了单独使用所述四价铂氨基己糖配合物在制备抑制肿瘤细胞增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡药物中的应用，所述肿瘤细胞为人前列腺癌细胞DU145、PC3、LNCap、VCap或RM-1，或者人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT116。
具体的，应用时，当所述四价铂氨基己糖配合物的终浓度为(5-10)μM，处理时间为24-48h时，能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡。
优选的，应用时，当所述四价铂氨基己糖配合物的终浓度为5μM或10μM，处理时间为24h时，能够抑制肿瘤细胞的增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡。
进一步的，所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)在联合应用时，所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶既可以混合后使用也可以单独分开使用。
具体的，所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)在联合应用时，所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶一次性添加使用或分多次连续添加使用。
具体的，当所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)一次性添加使用时，所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)摩尔比为1：(2-10)，处理时间为24-48h。
优选的，当所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶(或顺铂、或奥沙利铂)一次性添加使用时，所述四价铂氨基己糖配合物和顺铂摩尔比为1：2、1：4、1：6、1：8或1：10，处理时间为24h。
本发明所述四价铂氨基己糖配合物和5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)联用具有协同抗肿瘤作用，为此，本发明还提供了所述四价铂氨基己糖配合物联合5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)在制备抑制肿瘤细胞增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡药物中的应用，所述肿瘤细胞为人前列腺癌细胞DU145、PC3、LNCap、VCap或RM-1，或者人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT116。
具体的，在所述四价铂氨基己糖配合物浓度为(0.25-4)μM，5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)浓度为(0.5-20)μM，处理时间为24-48h时，能够抑制癌细胞的增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡。
优选的，在所述四价铂氨基己糖配合物浓度为0.25μM、0.5μM、1μM、2μM或4μM，5-氟尿嘧啶(或者顺铂、奥沙利铂)浓度为0.5μM、1μM、1.5μM、2μM、2.5μM、3μM、4μM、5μM、6μM、8μM、10μM、12μM、16μM或20μM，处理时间为24h时，能够抑制癌细胞的增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡。
进一步的，本发明还提供了所述四价铂氨基己糖配合物在制备抑制前列腺癌鼠源转移模型肿瘤生长药物中的应用。具体的，所述鼠源采用的小鼠为C57BL/6小鼠。
具体的，所述四价铂氨基己糖配合物在用量为0.4-0.95mg/kg/天，共给药五次时能抑制前列腺癌鼠源转移模型肿瘤的转移。
优选的，所述四价铂氨基己糖配合物在用量为每两天0.93mg Pt/kg或1.86mg Pt/kg，共给药五次时能抑制前列腺癌鼠源转移模型肿瘤的转移。
进一步的，本发明还提供了一种含有所述四价铂氨基己糖配合物的抗肿瘤药物组合物，包括所述四价铂氨基己糖配合物，以及5-氟尿嘧啶、顺铂或奥沙利铂。
与现有技术相比较，本发明的有益效果在于：
1、本发明所述四价铂氨基己糖配合物对前列腺癌细胞具有较高的选择性，尤其是R10对雄激素非依赖性的前列腺癌细胞的杀伤作用达到纳摩尔级别。所述化合物R10在前列腺癌小鼠体内具有较高的抗肿瘤活性和抗转移能力，生物安全性高。
2、所述化合物R10在前列腺癌细胞中铂摄取量及与DNA结合的铂水平都优于顺铂和奥沙利铂，并且该过程不借助糖转运蛋白。
3、所述化合物R10通过上调p53、Caspase-3和磷酸组蛋白H2A-X的表达水平，以及阻滞细胞G1/S期，显著上调p53和细胞周期信号通路，从而增强抗前列腺癌活性。
4、所述化合物R10通过降低MYC转录因子的表达，增加miR-26a的转录水平，从而显著降低GALNT3蛋白的表达；然后通过降低GALNT3蛋白的表达，降低MUCI-C的表达，进而显著降低Mucin类型的O-glycan生物合成；然后通过降低GALNT3蛋白的表达，降低趋化因子CXCL1的转录水平和分泌蛋白的表达，从而减少肿瘤细胞对MDCS细胞的浸润，增强其抗肿瘤活性。
附图说明
图1为伤口愈合实验中不同浓度的R7、顺铂和奥沙利铂在PC3细胞中，孵育24小时后，细胞迁移的抑制情况；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图2为Transwell小室实验中不同浓度的R7、顺铂和奥沙利铂对PC3细胞孵育24小时后，细胞迁移的抑制情况；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图3为孵育24小时后，不同浓度R7与浓度为10μM顺铂诱导PC3细胞凋亡的定量分析；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图4为R10、顺铂和奥沙利铂在转运蛋白抑制剂根皮素(100μM)和EDG(50μM)存在下对前列腺癌细胞的IC50值的影响；其中，A为根皮素对PC3细胞IC50值的影响；B为EDG对PC3细胞IC50值的影响；C为根皮素对DU145细胞IC50值的影响；D为EDG对DU145细胞IC50值的影响；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图5为浓度为10μM的R10、顺铂和奥沙利铂作用DU145和PC3细胞后，采用ICP-MS检测细胞中铂含量；A为药物在DU145和PC3细胞中孵育8h后，细胞的铂含量；B为在不同温度下，药物在PC3细胞中孵育2h后，细胞的铂含量；C为药物在PC3细胞中孵育8h后，DNA、线粒体、内质网以及溶酶体中的铂含量；D为药物在DU145细胞中孵育8h后，DNA、线粒体、内质网以及溶酶体中的铂含量；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图6为伤口愈合实验中不同浓度的R10、顺铂和奥沙利铂在PC3细胞中，孵育24小时后，细胞迁移的抑制情况；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图7为Transwell小室实验中不同浓度的R10、顺铂和奥沙利铂对PC3细胞孵育24小时后，细胞迁移的抑制情况；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图8为RM-1前列腺癌荷瘤小鼠模型示意图；
图9为R10、顺铂和奥沙利铂对RM-1前列腺癌小鼠的抗肿瘤活性；A为治疗期间小鼠的体重变化曲线；B为实验结束后各组肿瘤的重量；C为肿瘤生长与时间的变化曲线；D为实验结束时的肿瘤图片；E为实验结束后各组小鼠的脏器指数统计(心、肝、脾、肺、肾)；F为实验结束后各组小鼠心、肝、脾、肺、肾和肿瘤的HE染色；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图10为R10、顺铂和奥沙利铂治疗RM-1前列腺癌小鼠实体瘤后各组织的铂含量分布以及对肝肾毒性评价；A为在心、肝、脾、肺、肾和血液中的铂含量；B为在肿瘤组织中的铂含量；C、D为药物治疗后肾脏BUN和SCr含量变化；E、F为药物治疗后肝脏AST和ALT活性的变化；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图11为RM-1前列腺癌荷瘤小鼠肺转移模型示意图；
图12为不同浓度R10、顺铂和奥沙利铂在RM-1前列腺癌肿瘤中的体内抗肿瘤转移活性；A为实验结束后小鼠肺转移结节的代表性图像；B为治疗期间小鼠的体重变化曲线；C为实验结束后小鼠的肺转移结节的统计数据；D为实验结束后各组小鼠的脏器指数统计；E为实验结束后小鼠的肺组织HE染色；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图13为孵育24小时后，不同浓度R10与浓度为10μM顺铂诱导PC3细胞凋亡的定量分析；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图14为孵育24小时后，不同浓度的R10、顺铂对PC3细胞中phospho-histone H2A.X(Ser139)蛋白表达的影响；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001；
图15为孵育24小时后，不同浓度的R10、L10和顺铂对PC3细胞中Caspase3和p53蛋白表达的影响；*P<0.05；**P<0.01；***P＜0.001。
具体实施方式
以下通过具体实施例对本发明的技术方案作进一步详细描述，但本发明的保护范围并不局限于此。
除了特别说明，本文中提及的各种试剂均来自市售满足实验要求的高纯度试剂。
本发明实施例中涉及到的简称包括：Ac为乙酰基，Bn为苄基，Me为甲基，Bz为苯甲酰基，DMSO为二甲基亚砜，DMF为二甲基甲酰胺，DCM为二氯甲烷，Boc为叔丁氧羰基，DAST为二乙胺基三氟化硫，Pyridine为吡啶，HATU为2-(7-氮杂苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯，DIPEA为N,N-二异丙基乙胺，Cis.为顺铂，Oxp.为奥沙利铂，AF为氨萘非特。所述顺铂、奥沙利铂、2-乙酰氨基葡萄糖、2-乙酰氨基半乳糖均为市售产品。
实施例1化合物1C的合成
(一)取1g的顺铂溶解到30mL蒸馏水中，搅拌使之完全分散，逐滴加入60mL的30％过氧化氢水溶液，设置温度为60℃，反应4小时使其完全溶解澄清后，悬干溶剂。再次加入100mL的蒸馏水继续搅拌溶解，升温至80℃，待再次完全溶解澄清后，停止反应，于4℃冰箱中过夜析出黄色结晶，倒出溶剂，蒸干结晶，即可得黄色固体1A，产率为80％。
(二)在100mL圆底烧瓶中加入0.3g的化合物1A，0.31g的棕榈酸酐，密封后抽真空，在氮气保护下加入无水DMSO 30mL，于室温下搅拌反应7天，反应结束后用油泵抽除溶剂。加入少量丙酮会析出大量淡黄色粉末，用丙酮溶液反复清洗两次，用抽滤漏斗抽滤，即可得淡黄色粉末1B，产率为87％。
(三)在100mL圆底烧瓶中加入0.35g化合物1B，0.0613g丁二酸酐，在氮气保护下加入无水DMSO 30mL，于室温下搅拌过夜，用油泵蒸除溶剂。加入少量丙酮析出大量淡黄色粉末，用抽滤漏斗抽滤，即可得淡黄色粉末1C，产率为87％。
实施例2化合物2C的合成
(一)取1g的奥沙利铂至250mL的圆底烧瓶中，加入30mL蒸馏水搅拌，逐滴加入60mL的30％过氧化氢水溶液，60℃反应4小时使其完全溶解澄清后，悬干溶剂。在圆底烧瓶中加入100mL的蒸馏水继续搅拌，并升温至80℃，待圆底烧瓶中固体再次完全溶解澄清后，停止反应，于4℃冰箱中过夜析出大量白色针状结晶，倒出溶剂，蒸干结晶，即可得白色固体2A，产率为85％。
(二)在100mL圆底烧瓶中加入0.3g的化合物2A，0.31g的棕榈酸酐，密封后抽真空，在氮气保护下加入无水DMSO 30mL，于室温搅拌反应7天，反应结束后用油泵抽除溶剂。加入少量丙酮会析出大量白色粉末，用丙酮溶液反复清洗两次，用抽滤漏斗抽滤，即可得白色粉末2B，产率为89％。
(三)在100mL圆底烧瓶中加入0.35g化合物2B，0.063g丁二酸酐，在氮气保护下加入无水DMSO 30mL，于室温下搅拌过夜，用油泵蒸除溶剂。加入少量丙酮析出大量淡黄色粉末，用抽滤漏斗抽滤，即可得白色粉末2C，产率为90％。
实施例3化合物L4的合成
化合物L1的合成
在250mL圆底烧瓶中加入2-乙酰氨基葡萄糖25g，乙酸钠15g并且加入82mL乙酸酐，在80℃加热条件下反应8h。反应后将反应液加入冰水中，用二氯甲烷提取并溶解产物，加入饱和NaHCO3洗，无水MgSO4干燥后浓缩，乙醇重结晶后得白色固体L1，收率为91％。
化合物L4的合成
1、将3g的L1放入100mL圆底烧瓶中，用30mL的1，2-二氯乙烷溶解，然后加入0.87g的路易斯酸Yb(CF3SO3)3和2.8mL的5-氯-1-戊醇，插上冷凝管，抽真空通入N2，升温到100℃搅拌过夜，点板检测反应。将反应完全的的体系用水泵浓缩至油状液滴，柱层析分离得到白色固体L2，收率80％。
2、取2g的L2溶解在DMF中，用纸槽取0.6g的NaN3加入其中，放置于搅拌器中，并升温到70℃反应过夜，TLC监测，用DCM/H2O洗，有机层浓缩后经柱层析分离得到1.6g的L3，收率87％。
3、取100mL的圆底烧瓶将0.6g的L3溶解在20mL的甲醇溶液中，加入0.1g的Pd/C，抽真空，加入0.5mL的稀盐酸，通入氢气后在室温反应2小时，TLC监测，用硅藻土过滤除去Pd/C，用甲醇溶解产物，彻底蒸干后即可得到0.56g的L4，直接用于下一步反应，收率90％。
实施例4化合物L13的合成
化合物L5的合成
在500mL的圆底烧瓶中加入30g的2-乙酰氨基半乳糖，加入300mL的苯甲醇充分搅拌溶解后，缓慢加入盐酸7mL，升温至60℃，搅拌反应过夜，TLC点板监测反应，待反应完全后冷却至室温加入乙醚洗涤数次，用抽滤漏斗抽滤即可得到42g的白色固体L5，收率91％。
化合物L13的合成
1、在500mL圆底烧瓶中加入10g的L5，加入100mL的DCM和10mL的吡啶，在冰浴-20℃搅拌，待完全溶解后，逐滴加入苯甲酰氯8.5mL待完全加入后逐渐恢复至室温搅拌过夜，TLC点板监测反应，待反应完全后加入1mL甲醇终止反应，用500mL的分液漏斗加入DCM和H2O进行萃取，在上层萃取液中加入无水Na2SO4进行干燥后，浓缩，用柱层析进行分离纯化，得到9.5g的淡黄色产物L6，收率87％。
2、取5g的L6放在100mL圆底烧瓶中，抽真空在N2保护下加入50mL超干DCM，在低温泵-20℃搅拌20min，待完全溶解后加入3.85mL的DAST，反应30min后恢复室温搅拌过夜，TLC监测，待反应完全后加5mL的甲醇终止反应，浓缩柱层析进行分离纯化，即可得到6.3g的淡黄色产物L7，收率89％。
3、在100mL圆底烧瓶中加入10g的L7，加入60mL甲醇溶解，待完全溶解后少量多次加入甲醇钠调节PH，直到PH为9～10即可，反应4小时后加入阳离子树脂终止反应，浓缩柱层析即可得到7.2g的产物L8，收率97％。
4、将7g的L8放入100mL的圆底烧瓶中，加入钯碳后溶解在甲醇溶液中，抽真空,加入1mL的稀盐酸，通入氢气后在室温搅拌反应24小时，TLC监测，反应完全后，用硅藻土过滤除去钯碳，甲醇洗涤，彻底蒸干后即可得到5.2g的L9直接用于下一步反应，收率83％。
5、在100mL圆底烧瓶中加入5g的L9，加入40mL的吡啶溶解L9，待完全溶解后加入5mL乙酸酐，室温搅拌过夜。反应后将反应液加入冰水中，用二氯甲烷萃取并溶解产物，分离有机层用无水Na2SO4干燥后浓缩，柱层析后得6.3g的淡黄色油状L10，收率为92％。
6、将5g的L10放入100mL圆底烧瓶中，用20mL的1，2-二氯乙烷溶解，然后加入路易斯酸和5-氯-1-戊醇，插上冷凝管，抽真空通入N2，升温到100℃搅拌过夜，点板检测反应是否完全。将反应完全的的体系用水泵浓缩至油状液滴，柱层析分离得到4.5g的淡黄色油状L11，收率83％。
7、将3g的L11溶解在DMF中，用纸槽取0.98g的NaN3加入其中,升温到70℃反应过夜，TLC监测，用DCM/H2O洗，有机层浓缩后柱层析分离得到2.2g的产物L12，收率87％。
8、将0.5g的L12溶解在20mL的甲醇溶液中，加入0.1g的Pd/C,通入氢气后在室温反应2小时，TLC监测，硅藻土过滤除去Pd/C，甲醇洗涤，彻底蒸干后即可得到0.48g的L13直接用于下一步反应，收率90％。
实施例5化合物R7的合成
在100mL圆底烧瓶中加入300mg的2C，密封抽真空，在氮气保护下，向圆底烧瓶中加入20mL无水DMF，搅拌使之完全溶解。将240mg的HATU用5mL的无水DMF溶解备用，向圆底烧瓶中加入溶解后的DMF溶液，反应20min，称取255mg的L4并用无水DMF溶解，取0.12mL的DIPEA加入到溶解后的L4溶液中，20min后，向圆底烧瓶中加入L4与DIPEA的混合溶液，反应24小时，TLC监测反应，反应结束后浓缩得黄色油状液滴，柱层析分离即可得到淡黄色油状R7，收率37％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.02(t,J＝10.0Hz,1H),4.89(d,J＝9.7Hz,1H),4.64(t,1H),4.22–3.99(m,2H),3.89(d,J＝12.3Hz,1H),3.77(t,1H),3.62–3.42(m,2H),3.00(t,J＝7.3Hz,2H),2.50–2.17(m,6H),2.08(t,2H),1.90(s,3H),1.84(s,3H),1.82(s,3H),1.79(s,3H),1.44(s,4H),1.39–1.21(m,20H),1.05(s,16H),0.67(t,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ184.10,182.09,172.84,171.05,170.70,170.62,169.44,164.33,164.23,97.06,97.03,71.18,68.47,68.23,67.39,62.06,51.63,39.13,36.35,32.07,31.81,31.75,29.55,29.50,29.42,29.25,29.19,29.07,28.94,28.70,25.62,23.88,23.35,22.84,22.52,20.60,20.51,13.98.HRMS:Calcd.for C47H80N4O18Pt(M+H):1184.5115,found:1184.5183.
实施例6化合物R8的合成
在100mL圆底烧瓶中加入460mg的2C，密封抽真空，在氮气保护下，向圆底烧瓶中加入20mL无水DMF，搅拌使之完全溶解。将343mg的HATU用5mL的无水DMF溶解备用，向圆底烧瓶中加入溶解后的DMF溶液，反应20min，称取300mg的L13并用无水DMF溶解，取0.25mL的DIPEA加入到溶解后的L13溶液中，20min后，向圆底烧瓶中加入L13与DIPEA的混合溶液，反应24小时，浓缩得黄色油状液滴，柱层析分离即可得到淡黄色产物R8，收率41％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ5.26(d,J＝22.4,10.9Hz,1H),4.73(s,1H),4.57–4.28(m,2H),4.20(d,J＝11.7Hz,2H),3.94(s,1H),3.77–3.55(m,2H),3.26–3.02(m,2H),2.57–2.45(m,2H),2.39(s,4H),2.22(t,J＝6.3Hz,2H),2.05(s,3H),2.03(s,3H),1.93(s,3H),1.56(s,6H),1.50–1.37(m,10H),1.19(s,24H),0.80(t,J＝6.8Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ184.26,182.15,172.79,171.17,170.72,164.40,164.23,97.10,88.21,85.74,71.42,71.17,68.47,67.24,66.93,62.17,53.89,39.29,36.45,32.03,31.89,31.75,29.70,29.63,29.58,29.40,29.33,29.26,29.07,28.80,25.75,23.99,23.47,23.04,22.65,20.86,20.76,14.09.19FNMR(376MHz,CDCl3)δ-196.89.HRMS:Calcd.for C45H77FN4O16Pt(M-H):1142.4893,found:1142.4917.
实施例7化合物R9的合成
在100mL圆底烧瓶中加入208mg的1C，密封抽真空，在氮气保护下，向圆底烧瓶中加入20mL无水DMF，搅拌使之完全溶解。将179mg的HATU用5mL的无水DMF溶解，加入到圆底烧瓶中，反应20min，称取200mg的L4并用无水DMF溶解，取0.2mL的DIPEA加入到溶解后的L4溶液中，20min后，向圆底烧瓶中加入L4与DIPEA的混合溶液，室温反应24小时，TLC监测反应，反应结束后浓缩得黄色油状液滴，柱层析分离即可得到淡黄色产物R9，收率31％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.93–6.57(m,2H),6.25(s,4H),5.17(dt,J＝65.9,9.5Hz,2H),4.70(d,J＝8.3Hz,1H),4.30(d,J＝6.8Hz,1H),4.12(d,J＝11.1Hz,1H),3.90(d,J＝8.9Hz,1H),3.78(s,1H),3.68–3.42(m,1H),3.19(s,2H),2.62(d,J＝13.1Hz,2H),2.51(s,2H),2.46–2.31(m,2H),2.09(s,3H),2.04(s,3H),2.03(s,3H),1.98(s,3H),1.54(s,6H),1.26(d,J＝5.5Hz,26H),0.88(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ183.77,182.37,173.55,171.52,171.03,170.92,169.58,100.86,72.49,71.71,69.61,68.84,62.25,53.81,39.65,36.38,31.95,29.79,29.71,29.53,29.40,29.29,29.19,28.79,26.10,23.51,23.30,22.72,20.89,20.85,20.71,14.16.HRMS:Calcd.for C39H72Cl2N4O14Pt(M-H):1085.3987,found:1085.4269.
实施例8化合物R10的合成
在100mL圆底烧瓶中加入350mg的1C，密封抽真空，在氮气保护下，向圆底烧瓶中加入20mL无水DMF，置于搅拌器上搅拌使其完全溶解。将303mg的HATU用5mL的无水DMF溶解，加入到圆底烧瓶中，反应20min后，称取300mg的L13并用无水DMF溶解，取0.22mL的DIPEA加入到溶解后的L13溶液中，向圆底烧瓶中加入L13与DIPEA的混合溶液，室温反应24小时，反应结束后浓缩得黄色油状液滴，柱层析分离即可得到淡黄色产物R10，收率36％。1H NMR(300MHz,CDCl3)δ6.92(s,1H),6.49–6.08(m,5H),5.27(dt,J＝14.2,9.7Hz,1H),4.75(s,1H),4.54(d,J＝9.4Hz,1H),4.33(d,1H),4.22(d,J＝3.4Hz,2H),3.94(s,1H),3.75–3.54(m,2H),3.52–3.29(m,2H),3.24–3.06(m,1H),2.58(s,2H),2.46(s,2H),2.32(s,2H),2.07(s,3H),2.05(s,3H),1.95(s,3H),1.44(s,9H),1.42(s,8H),1.19(d,J＝3.7Hz,16H),0.82(t,J＝6.6Hz,3H).13C NMR(75MHz,CDCl3)δ183.58,181.95,173.51,171.37,170.81,170.70,97.07,88.12,85.65,71.37,71.13,68.41,67.27,66.97,62.14,54.00,39.61,36.42,32.40,31.94,29.74,29.68,29.46,29.38,29.33,28.97,28.88,26.03,23.63,23.28,22.70,20.97,20.87,14.15.19F NMR(376MHz,MeOD)δ-198.32.HRMS:Calcd.forC37H69Cl2FN4O12Pt(M-H):1045.3837,found:1045.3855.
试验例1：体外抗肿瘤活性测试
采用MTT法测试了前述实施例合成的四价铂杂合体R7、R8、R9、R10以及氨基己糖配体L10在八株人源癌细胞系包括HepG2、Huh-7、MDA-MB-231、MCF-7、A549、A549cisR、HCT116、HT29以及四株前列腺癌细胞包括雄激素非依赖性前列腺癌细胞DU145和PC3、雄激素依赖性前列腺癌细胞LNCap和VCap中的体外抗肿瘤活性，测试结果如表1和表2所示，选择阳性药顺铂和奥沙利铂为对照。
表1四价铂氨基己糖配合物的体外抗肿瘤活性[e]
注释：[a]The RF(resistance factor)is defined as the IC50 value in PC3divided by the IC50value in LNCap.；[b]The RF(resistance factor)is defined asthe IC50 value in DU145 divided by the IC50 value in LNCap；[c]FI(foldincrease)is defined as IC50(cisplatin)/IC50(R10)；[d]FI(fold increase)isdefined as IC50(oxaliplatin)/IC50(R10)；[e]An average of three measurements.ND＝not determined.
表2四价铂氨基己糖配合物的体外抗肿瘤活性[d]
注释：[a]The RF(resistance factor)is defined as the IC50 value inA549cisR divided by the IC50 value in A549；[b]FI(fold increase)is defined asIC50(cisplatin)/IC50(R10)；[c]FI(fold increase)is defined as IC50(oxaliplatin)/IC50(R10).An average of three measurements；[d]An average of threemeasurements.ND＝not determined.
从表1、表2的实验结果可以看出，本发明中四价铂杂合体在所有参与活性测试的癌细胞中，四价铂杂合体R7、R8、R9和R10均优于L10以及阳性对照药顺铂和奥沙利铂。基于奥沙利铂为母核的四价铂杂合体R7和R8的活性明显低于以顺铂为母核具有相同轴向基团结构的四价铂杂合体R9和R10。而作为拥有相同母核的R9和R10来说，轴向基团为L10的抑制肿瘤生长的活性要高于L1配体结构，尤其是在前列腺癌细胞中。R7、R8、R9和R10对雄激素非依赖性的前列腺癌PC3和DU145细胞的抑制作用要优于雄激素依赖性的前列腺癌LNCap和VCap细胞。同样配体修饰下，以顺铂为母核的四价铂杂合体R10对PC3和DU145前列腺癌细胞的IC50值均达到了纳摩水平。值得注意的是R10的RF值(RF＝0.30)远低于顺铂(RF＝1.21)，说明R10对雄激素非依赖性前列腺癌细胞有较高的选择性，具有逆转雄激素非依赖性前列腺癌细胞的潜质，显示出糖基化后的四价铂类抗肿瘤药物在前列腺癌治疗中可能会有较好的前景。
试验例2：R7、R10对前列腺癌细胞迁移能力的影响
(1)伤口愈合实验
为了评价R7、R10对前列腺癌细胞迁移的抑制作用，本申请采用伤口愈合实验检测了R7、R10对PC3前列腺癌细胞迁移能力的影响。结果如图1、图6所示，与顺铂相比，化合物R7、R10对前列腺癌细胞迁移的抑制作用明显高于顺铂和奥沙利铂，并且抑制作用具有浓度依赖性。四价铂萘酰亚胺配合物的还原研究及与细胞核靶点DNA结合能力。
(2)Transwell小室实验
为了进一步验证R7、R10抑制前列腺癌细胞迁移能力，本申请采用Transwell实验检测了R7、R10对PC3细胞的迁移能力影响，结果如图2、图7所示。化合物R7对前列腺癌细胞有抑制作用，并且呈剂量依赖性增强。化合物R10对前列腺癌细胞迁移的抑制作用明显强于顺铂和奥沙利铂，并且呈剂量依赖性增强。
试验例3：R7、R10诱导前列腺癌细胞凋亡
为了研究R7、R10的抗肿瘤活性与细胞凋亡之间所存在的关系，本申请采用Annexin V/PI双染的方法，测试了R7、R10及阳性药物顺铂诱导PC3前列腺癌细胞凋亡的情况。本申请用浓度为5μM和10μM的R7(或R10)及10μM的顺铂分别与PC3细胞孵育24小时，收集细胞，之后采用流式细胞术对化合物诱导细胞凋亡的情况进行分析。结果如图3、图13所示，R7(R10)诱导前列腺癌细胞的凋亡比例与浓度呈正相关，即浓度为5μM的R7(或R10)早期凋亡细胞比例为12.20％，晚期凋亡细胞比例为4.76％，10μM的R7(或R10)早期凋亡细胞比例为30.12％，晚期凋亡细胞比例为16.41％，均高于顺铂早期凋亡比例5.02％和晚期凋亡比例5.33％，表明R7(或R10)强于顺铂的体外细胞毒性和诱导细胞凋亡的能力。
试验例4：R10与5-Fu联药实验
本试验通过将R10与5-Fu(5-氟尿嘧啶)联药的体外抗肿瘤活性如表3和表4和表5所示。采用MTT法测试了四价铂杂合体R10与5-Fu在不同浓度下对三株人源癌细胞系A549、A549cisR、HCT116的抗性，处理时间为24h，本试验通过将R10与5-Fu联药，利用两者共用时的协同作用，使得在低浓度的情况下，仍可达到客观的治疗水平，具有显著的细胞毒性。
表3R10与5-Fu联药的体外抗肿瘤活性
从表3中可以看出，在HCT116中，当R10(0.5μM)+5-Fu(1μM)＝1:2情况下，仍可达到客观的治疗水平，具有显著的细胞毒性。
表4 R10与5-Fu联药的体外抗肿瘤活性
从表4中可以看出，在A549中，当R10μM)+5-Fu(12μM)＝1:6情况下，FA＝0.72，仍可达到客观的治疗水平，具有显著的细胞毒性。
表5 R10与5-Fu联药的体外抗肿瘤活性
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从表5中可以看出，在A549CisR中，当R10(0.5μM)+5-Fu(4μM)＝1:8，FA＝0.89情况下，仍可达到客观的治疗水平，具有显著的细胞毒性。
试验例5：转运蛋白抑制剂实验
四价铂杂合体的MTT实验显示，四价铂杂合体在肿瘤细胞中具有较高的细胞毒性，猜想其是否可以通过肿瘤细胞膜表面的糖转运蛋白跨膜进入细胞发挥作用，为了研究糖转运蛋白与四价铂杂合体之间的关系，本申请在细胞培养时，分别加入葡萄糖转运蛋白GLUT1的抑制剂4,6-Oethylidene-α-d-glucose(EDG)和根皮素(phloretin)。根据MTT实验显示本申请选用了DU145细胞和PC3细胞，测试了R10、顺铂和奥沙利铂在葡萄糖转运蛋白抑制剂作用下IC50值的变化，结果如图4所示。化合物R10与顺铂和奥沙利铂一样，在葡萄糖转运蛋白抑制剂的存在下IC50值没有明显变化，证明R10不依赖细胞膜表面糖转运蛋白发挥对肿瘤细胞的杀伤作用。
试验例6：R10在前列腺癌细胞中铂的摄入量
药物的生物活性与它在癌细胞中的积累程度有密切的关系，糖基配体可增强药物的靶向性并提高细胞对药物的摄入量，因此本申请利用ICP-MS定量检测R10在细胞中铂的含量。本申请用浓度为10μM的化合物作用雄激素非依赖性前列腺癌细胞DU145和PC3孵育8h，用相应的试剂盒分离各细胞器和核DNA，加硝酸酸化后，用ICP-MS测定细胞DNA以及几种细胞器中的铂含量，结果如图5所示。在DU145和PC3细胞中R10的铂积累几乎是顺铂和奥沙利铂的10倍。其中每2×105个细胞中DU145和PC3的DNA铂元素水平分别是53.23ng Pt和51.82ng Pt明显高于顺铂和奥沙利铂2-3倍。
试验结果发现，R10在内质网、溶酶体和线粒体中均有不少铂的分布，尤其是在内质网中，猜想R10克服雄激素非依赖性前列腺癌的原因可能不仅是比阳性药顺铂和奥沙利铂有较高的DNA结合率，而且其他细胞器中高摄入的药物也发挥了作用。
试验例7：R10在体内抗肿瘤活性与抗转移效果
(1)R10抑制荷前列腺癌细胞小鼠原位实体瘤的生长
体外实验证明R10对前列腺癌细胞具有良好的杀伤作用，为了验证R10的体内抗肿瘤活性。本申请将RM-1前列腺癌细胞注射到C57BL/6小鼠的腋下创建实体瘤模型，待小鼠平均瘤体积为80-100mm3，将小鼠随机分为阴性组，配体L10(10mg/kg)组，奥沙利铂(2.46mgPt/kg)组，顺铂(1.95mg Pt/kg)组，顺铂(1.95mg Pt/kg)+配体L10(10mg/kg)组，R10(0.93mg Pt/kg)组和R10(1.86mg Pt/kg)组，采用腹腔给药方式，每两天给药一次，共给药五次，结果如图8所示。隔天记录小鼠的体重和瘤体积的变化，给药结束后观察5天，随后采集小鼠的眼球血，并将小鼠脱臼处死，取出肿瘤及脏器组织并称重，实验结果如图9。肿瘤生长曲线(图9B)显示，肿瘤生长的第13天，对照组的平均肿瘤体积为1800mm3，R10(1.86mgPt/kg)组的体积为500mm3，比对照组和顺铂组低72％和40％。实体瘤重量统计图(图9C)表明，经R10(1.86mg Pt/kg)组治疗后，实体瘤重量降低到了阴性对照组的18.8％，R10(0.93mg Pt/kg)组的抑制率为74.46％，R10(1.86mg Pt/kg)组的抑制率为85.12％，抑制效果均优于顺铂(67.01％)和奥沙利铂(56.63％)组。同时本申请对小鼠给药后的体重变化进行了监测(图9A)，最后一次给药后R10(1.86mg Pt/kg)组的小鼠体重恢复到原始体重的104％-107％，顺铂组和顺铂+L10组小鼠的体重是初始重量85％左右，并且顺铂+L10组有死亡，表明顺铂对小鼠有严重的毒副作用，而R10几乎没有毒性。R10处理组的小鼠脏器指数(图9E)显示，除了对小鼠的脾脏有明显的抑制，其他脏器指数无明显的变化。采用HE染色法检测对主要脏器的毒副作用，R10处理后未见明显异常和明显器官损伤。以上结果表明，R10在体内有效的抑制了肿瘤生长，抑制率高达85.12％，并且对小鼠几乎没有毒副作用。
(2)R10治疗后药物在荷前列腺癌小鼠体内组织的分布
体外实验显示R10对前列腺癌细胞有较高的选择性，并且细胞中的铂积累量高于顺铂和奥沙利铂，为了了解R10在体内是否对前列腺癌肿瘤组织有很好的靶向性，本申请检测了R10治疗后各脏器中的药物分布。取等量实体瘤模型给药5天后的组织，硝酸酸化后，用ICP-MS检测各组织中的铂含量，结果如图10A和B所示。经R10治疗后，肿瘤组织的铂积累量要高于顺铂和奥沙利铂的2倍，其中R10(1.86mg Pt/kg)组治疗后每克组织中铂的含量可达4000ng，高于顺铂治疗后肿瘤组织中的铂含量1800ng Pt/g。
除此之外，还发现R10在小鼠肝脏和肾脏中的铂量也很高，为了评价是否对肝脏和肾脏造成损伤，在动物试验结束后，本申请用相应的试剂盒测定了小鼠血液中的尿素氮(BUN)和肌酐(SCr)含量以及谷丙转氨酶(ALT)和谷草转氨酶(AST)活性。如图10C和图10D所示，与对照组相比，经顺铂和奥沙利铂治疗后的小鼠血液中BUN和SCr的含量高于对照组的2倍，而ALT和AST含量略微升高，表明顺铂和奥沙利铂对肾脏和肝脏均有一定的毒性。而R10治疗后的小鼠各组几乎没有变化，说明R10没有肝脏和肾脏毒性，其在肝脏和肾脏中高分布的铂含量可能与体内药物代谢有关。
(3)R10抑制荷前列腺癌小鼠的肺转移实验
体外实验证明，R10对前列腺癌细胞具有抑制迁移作用。为了进一步验证这一结果，本申请进行体内荷瘤实验来研究R10的体内抗肿瘤转移活性。将实验用小鼠采用鼠源的RM-1前列腺癌细胞尾静脉接瘤，创建肺转移小鼠模型。七天后动物模型创建成功。将小鼠随机分为阴性对照组，配体L10(10mg/kg)组，奥沙利铂(2.46mg Pt/kg)组，顺铂(1.95mg Pt/kg)组，顺铂+配体L10(1.95mg Pt/kg+10mg/kg)组，R10(0.93mg Pt/kg)组，R10(1.86mg Pt/kg)组，采用腹腔注射方式，隔天给药，共给药五次，最后一次给药结束后观察5天，将各组小鼠脱臼处死，取出各脏器，结果如图11所示。每天记录小鼠的体重，将取出的肺组织称重并拍照。如图12B和图12C所示。与阴性对照组相比，药物治疗后的小鼠肺结节数目明显减少，尤其是R10(1.86mg Pt/kg)组的抑制率高达82.01％，明显优于顺铂(36.87％)和奥沙利铂(17.46％)组。此外，经R10治疗后小鼠的体重和脏器指数无显著变化。肺组织HE染色切片显示(图12E)，与阳性对照药物相比，经R10治疗后肺组织的损伤明显减少。以上实验结果表明R10在体内表现出较好的抗前列腺癌肺转移效果。
试验例8：R10对磷酸化组蛋白H2A.X表达的影响
组蛋白H2A.X属于H2A组蛋白家族大众成员，包含一个进化保守区域SQ位于真核细胞的C末端，这个保守区的139位丝氨酸能快速磷酸化形成已知的γ-H2A.X来指示双链DNA损伤和凋亡。本申请通过Western bloting实验检测了磷酸化组蛋白H2A.X(Ser139)的表达水平，确定R10能否引起DNA损伤。结果如图14所示，与顺铂相比，磷酸化组蛋白H2A.X(Ser139)的表达随R10浓度的增加而增加，表明R10与DNA结合的铂含量的增加明显增强了DNA的损伤程度。
试验例9：R10对凋亡相关蛋白表达的影响
p53基因是与人类肿瘤关联度最高的基因之一，p53在顺铂诱导的细胞凋亡机制十分重要，肿瘤对铂类药物耐药的原因之一是长期给药后肿瘤细的p53基因会失活。Caspase家族在细胞凋亡过程中发挥着重要作用，其中，Caspase-3作为关键的执行分子，在介导蛋白剪切、凋亡信号转导等方面起到关键作用。因此，细胞早期凋亡情况可以根据Caspase-3活性进行判断。猜想R10诱导细胞凋亡是否与p53信号通路相关。因此。本申请通过Westernbloting实验检测了R10作用前列腺癌细胞PC3后的Caspase-3和p53的蛋白表达情况，结果如图15所示。与顺铂相比，R10可以明显增加Caspase-3和p53蛋白水平的表达，并伴有浓度依赖性。这一结果表明R10通过激活p53通路诱导前列腺癌细胞凋亡。
综上所述，本发明对所合成的目标化合物进行活性筛选，确定先导化合物。通过体内体外实验，阐明四价铂氨基己糖配合物的抗肿瘤活性，通过对四价铂氨基己糖配合物的机制研究，阐明其抗肿瘤作用机制及对肿瘤内部糖代谢的影响。本发明主要得到以下结论：
1.采用MTT法对四价铂氨基己糖配合物进行体外活性筛选，结果表明，四价铂氨基己糖配合物对肿瘤细胞的杀伤力明显优于阳性对照药物顺铂和奥沙利铂。并且对前列腺癌细胞有较高的选择性。通过筛选，本申请发现了作用效果最好的R10在雄激素非依赖性前列腺癌的IC50达到了纳摩尔级别。
2.通过MTT实验发现加入糖转运蛋白抑制剂后，R10的IC50并没有明显的变化，表明R10的细胞毒性不依赖肿瘤细胞膜表面高表达的糖转运蛋白跨膜发挥作用，可能与某些有机离子转运蛋白相关。
3.通过ICP-MS测试化合物R10的细胞摄取和DNA的结合水平发现，R10在前列腺癌细胞中的摄取及与DNA的结合水平明显高于顺铂和奥沙利铂，表明化合物在氟代乙酰氨基己糖的引入后提高了铂在细胞中的富集程度，克服了顺铂耐药性。
4.通过建立体内前列腺癌实体瘤模型，发现化合物R10对前列腺癌肿瘤的生长有较高的抑制效果，并且药物在肿瘤组织中的积累量要高于顺铂和奥沙利铂，并且对小鼠的体重没有影响，表明R10具有安全性较高的抗肿瘤活性。
5.伤口愈合实验和Transwell实验证明了R10能有效的抑制前列腺癌细胞的迁移。通过建立体内前列腺癌转移模型，发现化合物R10与顺铂相比，在引入氨基己糖后极大的增强了其体内抗转移效果。
6.通过生物信息学分析发现R10作用RM-1细胞后，显著上调p53和细胞周期信号通路，下调由GALNT3蛋白降低引起的Mucin类型的O-glycan生物合成通路，该结果为接下来的机制研究提供了思路。

Claims (10)

1.一种基于调控Mucin型O-糖基化靶向CRPC的四价铂氨基己糖配合物，其特征在于，所述四价铂氨基己糖配合物的结构式如下所示：
2.权利要求1所述的四价铂氨基己糖配合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：采用化合物L4或L13与化合物1C或2C经HATU缩合反应即可得到目标化合物R7、R8、R9或R10，其中，化合物1C、2C、L4、L13的结构如下：
3.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，化合物L4通过如下步骤制备得到：
乙酰氨基葡萄糖首先经乙酸酐和乙酸钠作用得到全乙酰基保护的葡萄糖L1，L1在路易斯酸的催化下与5-氯-1-戊醇在无水1，2-二氯乙烷中，加热得到产物L2，后经叠氮钠叠氮化并经钯碳还原后得到葡萄糖1位胺取代的衍生物L4。
4.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，化合物L13通过如下步骤制备得到：
乙酰氨基半乳糖首先在苯甲醇和盐酸作用下升温得1位苄基保护的乙酰氨基半乳糖L5，接着L5在二氯甲烷与苯甲酰氯在吡啶的催化下，冰浴滴加可得到产物L6，化合物L6在二氯甲烷中与二乙氨基三氟化硫在低温条件下反应，得到被保护的4-氟乙酰氨基葡萄糖L7，后经甲醇和甲醇钠脱苯甲酰基得到L8，L8经钯碳还原后得到4-氟乙酰氨基葡萄糖L9；L9经乙酸酐和吡啶作用得全乙酰基保护的4-氟乙酰氨基葡萄糖L10，在路易斯酸的催化下与5-氯-1-戊醇在无水1，2-二氯乙烷中，加热得到产物L11，后经叠氮钠叠氮化并经钯碳还原后得到全乙酰基保护的4-氟乙酰氨基葡萄糖1位胺取代的衍生物L13。
5.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，化合物1C通过如下步骤制备得到：
顺铂通过氧化得四价铂1A，再和棕榈酸酐在DMSO中反应7天可得1B，最后再和丁二酸酐在DMSO中过夜反应，即得1C，其中，化合物1A、1B结构如下：
6.根据权利2所述的制备方法，其特征在于，化合物2C通过如下步骤制备得到：
奥沙利铂通过氧化得四价铂2A，再和棕榈酸酐在DMSO中反应7天可得2B，最后再和丁二酸酐在DMSO中过夜反应，即得2C，其中，化合物2A、2B结构如下：
7.权利要求1所述四价铂氨基己糖配合物、或者所述四价铂氨基己糖配合物联合顺铂或奥沙利铂或5-氟尿嘧啶在制备抗肿瘤药物中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述肿瘤是指人子宫颈癌、人乳腺癌、人肺腺癌、人肝癌、人结肠癌、耐顺铂人肺腺癌或人前列腺癌。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，单独使用所述四价铂氨基己糖配合物，或者所述四价铂氨基己糖配合物联合5-氟尿嘧啶、顺铂或奥沙利铂在制备抑制肿瘤细胞增殖、诱导其焦亡或促进其凋亡药物中的应用，所述肿瘤细胞为人前列腺癌细胞DU145、PC3、LNCap、VCap或RM-1，或者人肺癌细胞A549、人结肠癌细胞HCT116。
10.权利要求1所述四价铂氨基己糖配合物在制备抑制前列腺癌鼠源转移模型肿瘤生长药物中的应用。
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