CN116605906A - 硫化铋银纳米材料的合成方法及其抗病毒应用 - Google Patents

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Abstract

本发明揭示一种硫化铋银纳米材料的合成方法及其抗病毒应用。本领域中合成反应一般需要经历高温条件等，而本发明解决了这一问题，可在室温进行，并且反应时间短，处理简单。本领域中尚未发现硫化铋银的抗病毒作用，而本发明首次论证了硫化铋银纳米材料的抗病毒作用。

Description

硫化铋银纳米材料的合成方法及其抗病毒应用
技术领域
本发明属于纳米材料以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及硫化铋银纳米材料的合成方法及其抗病毒应用。
背景技术
以纳米材料为基础的新型生物材料在生物医学领域表现出独特的优势，因而受到研究人员的广泛关注。铋(bismuth,Bi)基纳米材料主要是指组分中含有铋元素的无机纳米材料。铋基纳米材料因其良好的生物相容性和优异的光学、电学等物理化学特性，在组织工程、生物传感、药物递送、肿瘤治疗等生物医学领域的应用已被研究和报道；特别地，在生物成像及癌症诊疗方面展现出广阔的应用潜力。
目前已报道的铋基纳米材料多种多样，从形态来看，主要有纳米颗粒、纳米棒、纳米花、纳米管、纳米片层、介孔状等类型；从组分来看，主要有铋单质(包括铋纳米颗粒、铋烯纳米片等)、铋基氧化物(包括Bi2O3,BiO2-x,(BiO)2CO3等)、铋基硫族化合物(Bi2S3，Bi2Se3等)、铋基卤化物(包括BiOCl，BiOBr，BiOI等)、铋基多金属化合物(Bi2WO6,BiP5W30,BiFeO3,BiGdO3,Cu3BiS3,Cu3BiSe3等)、铋基复合物等烈性。不同的组成、结构、形貌和尺寸将导致不同的光学、电学和磁学等性质。因此，设计制备具有不同功能的铋基纳米材料，可以满足其在生物成像、药物递送、抗菌、组织工程、生物传感、肿瘤治疗等领域的应用。
合成铋基纳米材料的方法包括水热/溶剂热法、高温热分解法、离子交换法、溶胶-凝胶法、微乳液法、化学还原法、微波/超声/光介导合成法等。不同的制备方法可以得到结构与性能完全不同的铋基纳米材料。
硫化铋银纳米材料为一种铋基纳米材料，现有的该材料的制备方法是较为复杂的，需要经由高温(如100℃)条件的处理，在合成效率以及产物质量方面也有待提高，并且合成的材料的粒径在纳米范围内方法较少。同时，硫化铋银纳米材料的应用方面，目前的研究论证也是局限的。
因此，本领域需要优化硫化铋银纳米材料的制备方法，以及开发其新的应用领域。
发明内容
本发明的目的在于提供一种硫化铋银纳米材料的合成方法及其抗病毒应用。
在本发明的第一方面，提供一种制备硫化铋银纳米材料的方法，所述方法包括：
(1)将硝酸铋和硝酸银混匀，进行反应；
(2)在(1)的反应体系中加入聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，继续反应；
(3)在(2)的反应体系中加入硫脲，反应后获得硫化铋银纳米材料；
其中，(1)～(3)的反应在15～35℃条件下进行。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，硝酸铋和硝酸银混合于有机溶剂中。
在一种或多种优选实施方式中，所述有机溶剂为乙二醇。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，加入时，硝酸铋在反应体系中的终浓度为0.001～0.1mol/L，较佳地0.003～0.01mol/L，如0.0061mol/L。
在一种或多种优选实施方式中，加入时，硝酸银在反应体系中的终浓度为0.001～0.1mol/L，较佳地0.003～0.01mol/L，如0.0061mol/L。
在一种或多种优选实施方式中，(1)～(3)的反应在18～32℃条件下进行；较佳地在20～30℃条件下进行；更佳地在22～28℃条件下进行，如在23、24、25、26、27℃条件下进行。
在一种或多种优选实施方式中，(1)～(3)的反应在室温条件进行。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，加入时，聚乙烯吡咯烷酮的量为10～20mg/mL溶液，较佳地12～18mg/mL溶液，如15mg/mL溶液。
在一种或多种优选实施方式中，(2)中，加入时，聚乙二醇的量为5～16mg/mL，较佳地7～14mg/mL，如10mg/mL。
在一种或多种优选实施方式中，(3)中，加入时，硫脲在反应体系中的终浓度为0.005～0.05mol/L，较佳地为0.007～0.03mol/L，如0.01mol/L。
在一种或多种优选实施方式中，硫脲溶于有机溶剂中，滴加于所述反应体系。
在一种或多种优选实施方式中，所述有机溶剂为乙醇与乙二醇的混合溶剂。
在一种或多种优选实施方式中，按照体积比，混合溶剂中乙醇:乙二醇＝2:(2.5～5)，如2:2.8、2:3、2:3.5、2:4、2:4.5等。
在一种或多种优选实施方式中，(1)中，反应时间为3～30min，如5、10、15、20、25min。
在一种或多种优选实施方式中，(3)中，反应时间为10～30min，如12、15、20、25min，较佳地15±3min。
在本发明的另一方面，提供一种硫化铋银纳米材料，其由任一所述的方法制备获得。
在一种或多种优选实施方式中，所述硫化铋银纳米材料的平均粒径为18.6nm，不规则圆形。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料的用途，用于制备抑制病毒感染的组合物。
在一种或多种优选实施方式中，所述的病毒包括：RNA病毒和DNA病毒；较佳地所述病毒包括(但不限于)：流感病毒，冠状病毒，副流感病毒、肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒、诺如病毒、登革热病毒、寨卡病毒、人类免疫缺陷病毒；较佳地，所述流感病毒包括(但不限于)：流感病毒A亚型、B亚型、C亚型；较佳地，所述冠状病毒包括(但不限于)：冠状病毒α亚型(229E)和β亚型(OC43)、冠状病毒HKU1和NL63、严重急性呼吸综合征病毒、中东呼吸道综合征病毒和新型冠状病毒。
在本发明的另一方面，提供一种组合物，所述组合物中含有：前面任一所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料；以及生物学上或药学上相容的载体或赋形剂。
在本发明的另一方面，提供一种抑制病毒的方法，所述方法包括：(a)提供所述的硫化铋银纳米材料或所述的组合物；(b)以(a)的硫化铋银纳米材料或组合物处理病毒或携带病毒的对象，从而抑制病毒。
在一种或多种实施方式中，所述抑制病毒的方法为不以治疗疾病为直接目的的方法，或为非治疗性的方法。
在一种或多种实施方式中，所述抑制病毒所针对的对象可以为附着病毒的场所、物品、器皿等。
在一种或多种实施方式中，所述抑制病毒所针对的对象可以为体外的细胞培养物。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、展示硫化铋银纳米颗粒合成方法的流程图。
图2、展示本发明方法合成的硫化铋银纳米颗粒抗病毒应用的示意图。
图3A-C、病毒与细胞预培养阶段纳米材料对流感病毒A亚型的抑制效果。
图4(a)、AgBiS2纳米材料的TEM图。
图4(b)、AgBiS2纳米材料的XRD图。
图4(c)、(c)AgBiS2、Bi2S3、Ag2S的红外分析。
具体实施方式
纳米材料的绿色合成逐渐变成合成材料的主流方向，现阶段的合成方案往往需要高温而且反应时间长。本发明人经过深入的研究，揭示一种新型的硫化铋银纳米材料的合成方法及其在抗病毒方面的应用。
本领域现有技术中，合成反应一般需要经历高温条件等，尚未发现有硫化铋银在温和条件下的合成方案。本发明方法在室温进行，并且反应时间短，处理简单。
本领域的现有技术中，尚未发现有硫化铋银在流感病毒和冠状病毒的抗病毒相关研究、属于空白，本发明首次进行硫化铋银纳米材料的抗流感和冠状病毒研究。
本发明制备硫化铋银纳米材料的方法包括：(1)将硝酸铋和硝酸银混匀，进行反应；(2)在(1)的反应体系中加入聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，继续反应；(3)在(2)的反应体系中加入硫脲，反应后获得硫化铋银纳米材料。
上述所有的步骤中，反应可在15～35℃条件下进行，不需要进行额外的高温处理。也即，室温条件即可完成所有的步骤。
硝酸铋和硝酸银混合于有机溶剂中；适合于溶解硝酸铋和硝酸银、且不会对两者以及它们的反应形成影响的有机溶剂可适用于本发明中。作为本发明的优选方式，所述有机溶剂为乙二醇，仅作为溶剂。
作为本发明的优选方式，在进行反应时，硝酸铋与硝酸银以0.9～1.2:1的比例(摩尔比)混合，并进行反应，这有利于反应的完全以及提高反应效率、控制成本。作为本发明的优选方式，加入时，硝酸铋在反应体系中的终浓度为0.001～0.1mol/L；和/或，硝酸银在反应体系中的终浓度为0.001～0.1mol/L。
作为本发明的优选方式，在进行反应时，加入时聚乙烯吡咯烷酮的量为10～20mg/mL。这样的添加浓度与前一步骤中的反应产物是相适应的，有利于确保反应的效率。
作为本发明的优选方式，硫脲在反应体系中的终浓度为0.005～0.05mol/L；较佳地，硫脲溶于有机溶剂中，滴加于所述反应体系；较佳地，所述有机溶剂为乙醇与乙二醇的混合溶剂；更佳地，按照体积比，混合溶剂中乙醇:乙二醇＝2:(2.5～5)(如2:2.8、2:3、2:3.5、2:4、2:4.5等)。
本发明提供的方法合成的为纳米尺寸的材料，因此在环境温度内形成硫化铋银晶体并且包裹聚乙烯吡咯烷酮，并非严格规整的金属晶体结构。
可以理解的是，所述的硝酸铋或硝酸银为铋盐或银盐。本发明中，也可以运用其它的铋盐或银盐，例如硫酸铋或硫酸银，此类铋盐或银盐也可被包含在本发明中。可以理解的是，所述的铋盐或银盐也可以是它们的类似物或衍生物。
可以理解的是，聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇或它们的类似物或衍生物均可以被应用于本发明中，这是由于它们均具有作为双亲性大分子能起到模板作用以及具有良好的生物相容性。
本发明中，也包括由本发明所述的方法制备获得的硫化铋银纳米材料。本领域技术人员可以理解的是，当反应的方法不同时，所形成的纳米材料存在较为显著的差异。因此，在本发明的方法具有独特性的情况下，所获得的纳米材料也是独特的。
本发明中，也包括含有本发明所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料的组合物。例如，将本发明所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料与适当的生物相容性的载体或赋形剂进行混合后，将获得如本发明的组合物。所述组合物中，以本发明所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料作为唯一的活性成分(活性组分)或主要的活性成分(活性组分)。
本发明中，所述的“含有”，“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
当所述组合物还包含本发明的硫化铋银纳米材料作为活性组分时，所述组合物可发挥抑制病毒的功能。
本文所述组合物作为药物使用时，也可以称为药物组合物，其还包含药学上可接受的辅料。“药学上可接受的辅料”是用于将本发明组合物中的活性组分(例如硫化铋银纳米材料)传送给动物或人的药学上或食品上可接受的载体、溶剂、悬浮剂或赋形剂。示例性的辅料可以是液体或固体，包括但不限于：pH调节剂，表面活性剂，碳水化合物，佐剂，抗氧化剂，螯合剂，离子强度增强剂、防腐剂、载剂、助流剂、甜味剂、染料/着色剂、增味剂、润湿剂、分散剂、悬浮剂、稳定剂、等渗剂、溶剂、乳化剂、喷雾剂、压缩空气或其它适宜的气体，或其它适宜的与药效化合物合用的非活性成分。更具体而言，合适的辅料可以是本领域常用于小分子化合物给药的辅料。辅料的示例包括各种乳糖、甘露醇，油类如玉米油，缓冲剂如PBS、盐水、聚乙二醇、甘油、聚丙二醇、二甲亚砜，酰胺如二甲基乙酰胺，蛋白质如白蛋白，和去污剂如吐温80，单糖和低聚多糖如葡萄糖、乳糖、环糊精和淀粉。
通常，组合物中含有治疗有效量的本文所述活性组分。治疗有效量是指可在受试者中实现治疗、预防、减轻和/或缓解疾病或病症的剂量。本发明所述的硫化铋银纳米材料的有效量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度等而变化。优选的有效量的选择可以由本领域普通技术人员根据各种因素来确定(例如通过临床试验)。所述的因素包括但不限于：所述的硫化铋银纳米材料的药代动力学参数例如生物利用率、代谢、半衰期等；患者所要治疗的疾病的严重程度、患者的体重、患者的免疫状况、给药的途径等。可根据患者年龄、性别、所患病症及其严重程度、患者的其它身体状况等因素确定治疗有效量。治疗有效量可作为单一剂量施用，或者可依据有效的治疗方案在多个剂量中给药。本文中，受试者或患者通常指哺乳动物，尤其指人。示例性地，所述组合物含有按照重量比例，例如为0.001-50％，优选0.01-30％，更优选0.05-10％的活性组分(例如硫化铋银纳米材料)。
本发明的药物组合物或混合物可以通过常规方法制成任何常规的制剂形式。剂型可以是多种多样的，只要是能够使活性成分有效地到达哺乳动物体内的剂型都是可以的。比如可选自：注射剂，输液剂，片剂，胶囊剂，丸剂。其中活性组分(例如硫化铋银纳米材料)可以存在于适宜的固体或液体的载体或稀释液中。本发明的活性组分的混合物或药物组合物也可储存在适宜于注射或滴注的消毒器具中。组合物中活性组分(例如硫化铋银纳米材料)的有效剂量可随给药的模式和待治疗的疾病的严重程度而变化，这可以根据临床医师的经验和建议。
本发明中，也包括含有本发明所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料的试剂盒或药盒；或含有本发明上述组合物的试剂盒或药盒。通常，所述的试剂盒或药盒中具有适当的容器或包装，用于容载所述的硫化铋银纳米材料或所述的组合物。
此外，所述的试剂盒或药盒中，还可包括说明本发明的硫化铋银纳米材料或含有其的组合物的使用方法的使用说明书或操作手册，以便于本领域技术人员的应用。
本发明中，也包括本发明所述的硫化铋银纳米材料或含有其的组合物的应用，用于抑制病毒。所述的病毒可以是RNA病毒、DNA病毒。作为本发明的优选方式，所述的病毒包括：流感病毒，冠状病毒，副流感病毒、肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒、诺如病毒、登革热病毒、寨卡病毒、人类免疫缺陷病毒等。
本发明中也提供了抑制病毒的方法，包括以本发明的硫化铋银纳米材料或组合物处理病毒或携带病毒的对象，从而抑制病毒。所述抑制病毒的方法可以为不易治疗疾病为直接目的的方法，或为非治疗性的方法。所述抑制病毒所针对的对象可以为附着病毒的场所、物品、器皿等。所述抑制病毒所针对的对象可以为体外的细胞培养物。可以理解的是，本发明中，对于所需抑制病毒的对象是没有特别限制的，潜在可能感染或附着病毒的任何对象均可作为本发明的抑制病毒的对象。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1、硫化铋银纳米材料合成方法1(应用PVP)
本实施例中，分三步进行硫化铋银纳米材料合成，步骤如下(示意图如图1)：
首先，在室温(25℃)下将硝酸铋和硝酸银加入20mL的乙二醇中形成均一溶液。其中，硝酸铋的终浓度为0.0061mol/L；硝酸银的终浓度为0.0061mol/L。反应5分钟。
其次，加入300mg(15mg/mL溶液)聚乙烯吡咯烷酮(PVP-k30)，室温搅拌均匀。
最后，将硫脲(CH4N2S)的乙醇/乙二醇(按照体积比，乙醇:乙二醇＝2:3)溶液(5mL)滴加入混合液中，室温搅拌15分钟，获得硫化铋银纳米材料。所述溶液中，硫脲在5mL的乙醇/乙二醇中的浓度为0.05mol/L，放在总体系(20+5ml)中的浓度是0.01mol/L。
硫化铋银纳米材料的形态鉴定：黑色，粒径均匀，平均粒径为18.6±0.3nm，不规则圆形，如图4(a)。
硫化铋银纳米材料的性能鉴定：经过XRD确定材料为硫化铋银纳米材料，并通过IR测定表面PVP，其分布状态良好，如图4(b)。
AgBiS2、Bi2S3、Ag2S的红外分析如图4(c)。
实施例2、硫化铋银纳米材料合成方法2(应用PEG)
本实施例中，分三步进行硫化铋银纳米材料合成，步骤如下(示意图如图1)：
首先，在28℃下将硝酸铋和硝酸银加入20mL的乙二醇中形成均一溶液。其中，硝酸铋的终浓度为0.0061mol/L；硝酸银的终浓度为0.0061mol/L。反应16分钟。
其次，加入200mg聚乙二醇(PEG；HO(CH2CH2O)nH，n为2000)，室温搅拌均匀。
最后，将CH4N2S的乙醇/乙二醇(按照体积比，乙醇:乙二醇＝2:3)溶液滴加入混合液中，室温搅拌15分钟，获得硫化铋银纳米材料。所述溶液中，硫脲在乙醇/乙二醇中的浓度为0.05mol/L。
硫化铋银纳米材料的形态鉴定：硫化铋银纳米材料的形态鉴定：黑色，粒径均匀，达到纳米级，不规则圆形。
硫化铋银纳米材料的性能鉴定：预期经过XRD确定材料为硫化铋银纳米材料，并通过IR测定表面PEG，其分布状态良好。
实施例3、抗流感病毒效果(病毒抑制效果)的评估
本实施例中，进行抗病毒效果(病毒抑制效果)的评估。一种硫化铋银纳米颗粒抗病毒验证的示意图如图2。
如实施例1所述的方法合成硫化铋银纳米材料。
病毒：流感病毒A亚型、B亚型。
细胞：Madin-Darby犬肾细胞(MDCK细胞)
1、设计不同的病毒感染以及抗病毒体系，测定所述材料的抗病毒效果
(1)直接杀伤实验(材料预先作用病毒)
使用96孔板以2×10^4个/孔密度过夜培养MDCK细胞，使用无血清培养基配制终浓度为100TCID50/mL的病毒与不同浓度的材料(0、10、20、50、100、150μg/mL)混合液，在室温培养1h。随后将96孔内上清吸弃，使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，加入100μL的病毒与材料混合液上清，将96孔板放在35℃培养1h，使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，随后加入100μL的病毒感染基(添加2％FBS和1％双抗的EMEM培养基)，35℃培养48h。最后离心收集孔内上清，提取上清中病毒RNA做荧光定量PCR检测和半数组织培养感染量(TCID50)的检测。
(2)共同培养抑制实验(病毒与材料共培养)
将MDCK细胞以2×10^4个/孔密度接种在96孔板37℃过夜培养，使用无血清培养基配制200TCID50/mL病毒和不同浓度纳米材料稀释液。取出96孔板，吸弃细胞上清，使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，同时加入终浓度为100TCID50/mL病毒和终浓度为0、10、20、50、100、150μg/mL的材料稀释液。将96孔板放在35℃培养1h，后使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，随后加入100μL的病毒感染基，35℃培养48h。最后离心收集孔内上清，提取上清中病毒RNA做荧光定量PCR检测和半数组织培养感染量(TCID50)的检测。
(3)材料与细胞预培养抑制实验
将MDCK细胞以2×10^4个/孔密度接种于96孔板中37℃过夜培养。使用无血清培养基配制浓度为0、10、20、50、100、150μg/mL的材料稀释液，取出96孔板，吸弃细胞上清，用PBS(pH＝7.4)洗板2次，加入100μL的材料稀释液，37℃培养3h。随后吸弃上清，使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，加入100μL无血清培养基配制的100TCID50/mL的病毒液，35℃培养1h，随后使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，加入100μL的病毒感染基，35℃培养48h。最后离心收集孔内上清，提取上清中病毒RNA做荧光定量PCR检测和半数组织培养感染量(TCID50)的检测。
(4)感染(病毒与细胞预培养)后抑制实验
将MDCK细胞以2×10^4个/孔密度接种于96孔板中37℃培养过夜。随后吸弃细胞上清，使用PBS(pH＝7.4)洗板2次，加入100μL无血清培养基配制的100TCID50/mL的病毒液，35℃培养1h。随后吸弃细胞上清，用PBS(pH＝7.4)洗板2次，加入100μL使用病毒感染基配制的浓度分别为0、10、20、50、100、150μg/mL的材料稀释液，35℃培养48h。最后离心收集孔内上清，提取上清中病毒RNA做荧光定量PCR检测和半数组织培养感染量(TCID50)的检测。
2、TCID50分析结果
以上不同的病毒感染以及抗病毒体系，以未添加纳米材料的病毒感染细胞的体系为对照，测得的TCID50差异结果如表1。
表1、病毒感染细胞不同阶段的病毒抑制效果(TCID50测定；单位TCID50/ml)
该结果说明，本发明的硫化铋银纳米材料在不同的病毒感染状态下，均表现出明显且稳定的感染抑制效果。
其中，当浓度为150μg/mL时，硫化铋银纳米材料在病毒与细胞预培养组的抑制作用最明显，表明其主要抑制阶段发生在病毒入侵过程及入侵细胞后，纳米材料干扰病毒内化及在细胞内的复制过程。
3、RT-qPCR测试
针对流感病毒B亚型的NS1基因片段，采用的引物序列为5’-TCCTCAACTCACTCTTCGAGCG-3’(SEQ ID NO:1)和5’-CGGTGCTCTTGACCAA ATTGG-3’(SEQ ID NO:2)，探针序列为5’-CCAATTCGAGCAGCTGAA ACTGCGGT-3’(SEQ ID NO:3)按照常规方法测定。针对流感病毒A亚型的M1基因片段，采用的引物序列为5’-GACCRATCCTGTCACCTCTGAC-3’(SEQ IDNO:4)和5’-AGGGCATTYTTGACAAAKCGTCTA-3’(SEQ ID NO:5)，探针序列为5’-TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG-3’(SEQ ID NO:6)按照常规方法测定。
测得的基因表达抑制率结果如表2和表3。
表2、病毒感染细胞不同阶段的病毒抑制效果(RT-qPCR测试)
表2结果说明，本发明的硫化铋银纳米材料在不同的流感病毒B亚型病毒感染状态下，均表现出明显且稳定的感染抑制效果。其中，当浓度为100～150μg/mL时，在病毒与细胞预培养阶段的抑制作用最高，高于90％，表明其主要抑制阶段发生在病毒入侵过程及入侵细胞后，纳米材料干扰病毒内化及在细胞内的复制过程。
表3、病毒与细胞预培养阶段纳米材料对流感病毒A亚型的抑制效果(浓度梯度效应RT-qPCR测定)
表3结果说明，随着纳米材料浓度的升高，流感病毒的抑制率呈现剂量依赖性的提高；然而，高于100μg/ml后，提高作用不再显著。
根据上述，流感病毒B亚型qRT-PCR检测纳米材料的抑制病毒结果与TCID50测定的结果一致。而且在病毒与细胞预培养阶段，流感病毒A亚型的qRT-PCR检测显示硫化铋银纳米材料的抑制效果与其抑制流感病毒B亚型的效果一致，同时。该结果进一步说明，本发明的硫化铋银纳米材料抑制病毒的效果发生在病毒入侵过程及入侵细胞后。
4、间接免疫荧光测定
针对流感病毒B亚型的HA蛋白，采用的抗体为Influenza B virus(B/Florida/4/2006)Hemagglutinin/HA Antibody(购自北京义翘神州科技股份有限公司，货号11053-T62-50)和Goat Anti-Rabbit lgG H&L(Alexa Fluor 488)(购自Abcam，货号ab150077)，按照常规方法测定，测得的蛋白表达结果如表4。
表4、病毒与细胞预培养阶段纳米材料对流感病毒A亚型的抑制效果(间接免疫荧光测定)
该结果说明，本发明的硫化铋银纳米材料通过抑制流感病毒B亚型的基因表达，从而抑制病毒相关蛋白的表达。其对病毒的抑制效应在基因和蛋白水平的结果是基本一致的。
实施例4、抗冠状病毒效果(病毒抑制效果)的评估
本实施例中，进行抗病毒效果(病毒抑制效果)的评估。
如实施例1所述的方法合成硫化铋银纳米材料。
病毒：冠状病毒α亚型(VR-740 229E)和β亚型(VR-1558OC43)
细胞：人肝癌Huh7细胞和横纹肌肉瘤RD细胞
细胞培养：人肝癌Huh7细胞和横纹肌肉瘤RD细胞均使用含10％胎牛血清和1％双抗的EMEM培养基，置于37℃含5％ CO2的恒温培养箱培养。
病毒感染：将冠状病毒α亚型(229E)和β亚型(OC43)与细胞在2％FBS和1％双抗的EMEM培养基(病毒感染基)中置于37℃，5％CO2培养1小时。
病毒胞内复制阶段(即病毒与细胞预培养)，在细胞培养液中加入硫化铋银纳米材料，终浓度为0μg/mL 12.5μg/mL、25μg/mL、50μg/mL、100μg/mL。培养48小时后，收获培养上清。
针对所获得的培养上清，通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)方法进行抗病毒效果(病毒抑制效果)的评估。
qRT-PCR测定：针对VR-740 229E病毒的N基因，采用的引物为5’-TCCTTCCCGGTCTCAGTCG-3’(SEQ ID NO:7)和5’-CTGTCACTT GAAGGATTCCGAG-3’(SEQ ID NO:8)，探针序列为5’-TCGCGGTCGTGGTGAATCCAAACCTCA-3’(SEQ ID NO:9)，按照常规方法测定。针对VR-1558OC43病毒的N基因，采用的引物为5’-TCGTTCTGGTAATGGCATCCT-3’(SEQ ID NO:10)和5’-CTGATGGTTGCTGAGAGGTAG-3’(SEQ ID NO:11)，探针序列为5’-CTAAACTGGTCGGACTGATCGGCCCA-3’(SEQ ID NO:12)，按照常规方法测定。测得的基因表达结果如表5。
表5、病毒与细胞预培养阶段纳米材料对流感病毒A亚型的抑制效果(浓度梯度效应RT-qPCR测定)
该结果进一步说明，本发明的硫化铋银纳米材料抑制病毒的效果发生在病毒入侵过程及入侵细胞后，其抑制效果随着纳米材料的浓度增加而增强，并呈现剂量依赖效应。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。同时，在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。

Claims (11)

1.一种制备硫化铋银纳米材料的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)将硝酸铋和硝酸银混匀，进行反应；
(2)在(1)的反应体系中加入聚乙烯吡咯烷酮或聚乙二醇，继续反应；
(3)在(2)的反应体系中加入硫脲，反应后获得硫化铋银纳米材料；
其中，(1)～(3)的反应在15～35℃条件下进行。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，硝酸铋和硝酸银混合于有机溶剂中；较佳地，所述有机溶剂为乙二醇。
3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，(1)中，加入时，硝酸铋在反应体系中的终浓度为0.001～0.1mol/L，较佳地0.003～0.01mol/L；或
(1)中，加入时，硝酸银在反应体系中的终浓度为0.001～0.1mol/L，较佳地0.003～0.01mol/L。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(2)中，加入时聚乙烯吡咯烷酮的量为10～20mg/mL，较佳地12～18mg/mL；或
(2)中，加入时聚乙二醇的量为5～16mg/mL，较佳地7～14mg/mL。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(3)中，加入时，硫脲在反应体系中的终浓度为0.005～0.05mol/L，较佳地为0.007～0.03mol/L；较佳地，硫脲溶于有机溶剂中，滴加于所述反应体系；较佳地，所述有机溶剂为乙醇与乙二醇的混合溶剂；更佳地，按照体积比，混合溶剂中乙醇:乙二醇＝2:(2.5～5)。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(1)中，反应时间为3～30min；或
(3)中，反应时间为10～30min，较佳地15±3min。
7.一种硫化铋银纳米材料，其特征在于，其由权利要求1～6任一所述的方法制备获得。
8.权利要求1～6任一所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料的用途，用于制备抑制病毒感染的组合物。
9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的病毒包括：RNA病毒和DNA病毒；较佳地所述病毒包括流感病毒，冠状病毒，副流感病毒、肠道病毒、腺病毒、疱疹病毒、诺如病毒、：流感病毒A亚型、B亚型、C亚型；较佳地，所述冠状病毒包括：冠状病毒α亚型和β亚型、冠状病毒HKU1和NL63、严重急性呼吸综合征病毒、中东呼吸道综合征病毒和新型冠状病毒。
10.一种组合物，其特征在于，所述组合物中含有：
权利要求1～6任一所述的方法制备获得硫化铋银纳米材料；和生物学上或药学上相容的载体或赋形剂。
11.一种抑制病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
(a)提供权利要求7所述的硫化铋银纳米材料或权利要求10所述的组合物；
(b)以(a)的硫化铋银纳米材料或组合物处理病毒或携带病毒的对象，从而抑制病毒。
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