CN116585252A - 一种无花果愈伤组织干粉及其制备方法与应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种无花果愈伤组织干粉及其制备方法和应用，涉及植物组织提取技术领域，其技术要点为：取新鲜的无花果愈伤组织进行冷冻干燥，然后研磨成粉末，得到无花果愈伤组织干粉。所述冷冻干燥步骤具体为：取新鲜的无花果愈伤组织在‑30℃恒温冰箱中预冻24h，然后放入真空冷冻干燥机中干燥48h，冷阱温度为‑60℃，冷冻仓温度为‑45℃—35℃，真空度为0‑10pa。所述研磨方式为液氮研磨，液氮温度为‑195℃，研磨后过200目筛。无花果愈伤组织优异的抗氧化和促修复能力开创了其在化妆品领域的应用。
Description
技术领域
本发明涉及植物组织提取技术领域，具体涉及一种无花果愈伤组织干粉及其制备方法与应用。
背景技术
愈伤组织是在植物细胞受到创伤刺激后，在伤口表面形成体积增大，脱分化的薄壁细胞，可起源于植物体任何器官内各种组织的活细胞。在植物体的创伤部分，愈伤组织可帮助伤口愈合；在嫁接中，可促使砧木与接穗愈合，并由新生的维管组织使砧木和接穗沟通；在扦插中，从伤口愈伤组织可分化出不定根或不定芽，进而形成完整植株。在植物器官、组织、细胞离体培养时，条件适宜也可以长出愈伤组织。其发生过程是：外植体中的活细胞经诱导，恢复其潜在的全能性，转变为分生细胞，继而其衍生的细胞分化为薄壁组织而形成愈伤组织。从植物器官、组织、细胞离体培养所产生的愈伤组织，在一定条件下可进一步诱导器官再生或胚状体而形成植株。
无花果原产于地中海沿岸，是世界上最古老的果树之一。无花果的根、茎、叶、果均可入药，含有补骨脂素、佛手苷内酯、苯甲醛、呋喃香豆素等多种药用成分。由于无花果提取液对癌细胞具有抑制作用，因此，也被认为是抗癌食品。
目前还没有对无花果愈伤组织性能的研究，本发明旨在研究无花果愈伤组织在化妆品领域的应用，鉴于此，申请本专利。
发明内容
本发明的目的是为了解决上述问题，提供一种无花果愈伤组织干粉及其制备方法与应用，研究无花果愈伤组织干粉的抗氧化和促修复的功效，开拓其在化妆品领域的应用。
本发明提供了一种无花果愈伤组织干粉的制备方法，取新鲜的无花果愈伤组织进行冷冻干燥，然后研磨成粉末，得到无花果愈伤组织干粉。
通过采用上述技术方案，新鲜的无花果愈伤组织进行冷冻干燥，而不采用常规的加热干燥方案，因为采用冷冻干燥可以保留更多的活性物质。
优选的，所述冷冻干燥步骤具体为：取新鲜的无花果愈伤组织在-30℃恒温冰箱中预冻24h，然后放入真空冷冻干燥机中干燥48h，冷阱温度为-60℃，冷冻仓温度为-45℃—35℃，真空度为0-10pa。
更优选的，在48h干燥过程中，冷冻仓温度与真空度随着冷冻时间逐渐变化，依次呈现如下趋势：程序1(1h，-45℃，真空度0)，程序2(0.5h，-45℃，真空度0)，程序3(0.5h，-45℃，真空度0-10pa)，程序4(0.5h，-30℃，真空度0-10pa)，程序5(1h，-10℃，真空度0-10pa)，程序6(5h，0℃，真空度0-10pa)，程序7(4h，5℃，真空度0-10pa)，程序8(3h，10℃，真空度0-10pa)，程序9(5h，15℃，真空度0-10pa)，程序10(5h，20℃，真空度0-10pa)，程序11(5h，25℃，真空度0-10pa)，程序12(5h，30℃，真空度0-10pa)，程序13(5h，30℃，真空度0-10pa)，程序14(7.5h，35℃，真空度0-10pa)。
通过采用上述技术方案，冷冻干燥前在-30℃下进行预冻24h，此时愈伤组织形成的晶核多，晶型小，冻品结构均一，升华速度快，产品的外观细腻，易于保持原有的结构，且复水性好。
优选的，所述研磨方式为液氮研磨，液氮温度为-195℃。更优选的，所述干粉研磨后过200目筛。
通过采用上述技术方案，液氮研磨既能使各种组织成分不易被破坏或降解，又能使组织变硬，脆性增加易于磨碎。进而，干粉过200目筛后可加入彩妆中进行应用。
本发明还提供了一种由上述制备方法制备得到的无花果愈伤组织干粉。
本发明还提供了一种由上述制备方法得到的无花果愈伤组织干粉或上述无花果愈伤组织干粉在制备化妆品中的应用。
优选的，所述化妆品为肤用化妆品。
本发明还提供了一种抗氧化的化妆品，包括由上述的制备方法得到的无花果愈伤组织干粉或上述的无花果愈伤组织干粉。
具体的，所述抗氧化的化妆品能够降低HaCaT细胞的氧化损伤。
本发明还提供了一种促修复的化妆品，包括无花果愈伤组织干粉。
具体的，所述促修复的化妆品能够促进HaCaT细胞的修复。
与现有技术相比，本发明的有益效果：
1、本发明通过验证，表明提取到的无花果愈伤组织干粉能够降低HaCaT细胞的氧化损伤。
2、本发明通过验证，表明提取到的无花果愈伤组织干粉能够促进HaCaT细胞的修复。
附图说明
图1是本发明试验1中无花果愈伤组织干粉的细胞活力测定结果；
图2是本发明试验2中无花果愈伤组织干粉对H2O2诱导的HaCaT细胞的氧化损伤保护作用测定结果。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将结合本发明的实施例及附图，对本发明的技术方案进行进一步详细地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
需要说明的是，在不冲突的情况下，本发明中的实施例及实施例中的特征可以相互组合。下面将结合实施例来详细说明本发明。
实验原料及仪器来源：
超声波清洗器(上海科导高频台式超声波清洗器，SK1200H)
高糖培养基(索莱宝，型号：12100)
MTT：3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5diphenyltetrazoliumbromide
HaCaT(humanimmortalizedkeratinocytes)
DMEM(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)
PBS(PhosphateBufferedSaline)
实施例1
取新鲜的无花果愈伤组织在-30℃恒温冰箱中预冻24h，然后放入真空冷冻干燥机中干燥，冷阱温度为-80℃，冷冻仓温度为-45℃—35℃，真空度为0-10pa，真空冷冻48h，在48h干燥过程中，冷冻仓温度与真空度随着冷冻时间逐渐变化，依次呈现如下趋势：程序1(1h，-45℃，真空度0)，程序2(0.5h，-45℃，真空度0)，程序3(0.5h，-45℃，真空度0-10pa)，程序4(0.5h，-30℃，真空度0-10pa)，程序5(1h，-10℃，真空度0-10pa)，程序6(5h，0℃，真空度0-10pa)，程序7(4h，5℃，真空度0-10pa)，程序8(3h，10℃，真空度0-10pa)，程序9(5h，15℃，真空度0-10pa)，程序10(5h，20℃，真空度0-10pa)，程序11(5h，25℃，真空度0-10pa)，程序12(5h，30℃，真空度0-10pa)，程序13(5h，30℃，真空度0-10pa)，程序14(7.5h，35℃，真空度0-10pa)。将冷冻干燥后的愈伤组织在液氮-195℃中研磨，10g愈伤组织加500mL液氮，研磨后过200目筛，即为无花果愈伤组织干粉。
对比例1
对比例1采用无花果组织，取无花果组织干粉在液氮中研磨成细腻的粉末，然后加入20％DMSO中，样品在提取溶剂中的体积占比为2.5％，涡旋10min混合均匀，继续超声30min，最后在转速15000rpm下离心10min，取上清即为制备好的20％DMSO无花果组织提取物。
试验1无花果愈伤组织干粉的细胞活力测定
愈伤组织干粉使用DMEM(Dulbecco'smodifiedeaglemedium)高糖培养基(索莱宝，型号：12100)进行稀释至0.25‰后，过滤除菌。
实验方法：采用MTT法测定细胞活力。将生长状态良好的细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔培养板中，于37℃，5％CO2环境中培养过夜。弃培养液，样品组加入经DMEM稀释的样品(稀释至0.1％)，样品组分别为：含2‰的DMSO的DMEM溶液稀释的干粉；含2‰的DMSO的DMEM溶液。对照组加入不加任何样品的纯DMEM培养液，每个处理设5个重复，培养24h。吸弃培养基，pH＝7.4的PBS(PhosphateBufferedSaline)缓冲液洗两次，加入100μLMTT(1.0g/L)溶液，放入37℃，5％CO2环境中培养4h后，弃液，加入100μLDMSO，37℃下放置30min后于490nm波长测定各孔吸光度值。
细胞活力：
OD样品：含有待测样反应体系的吸光度；OD空白对照：不含任何物质的空板吸光度；OD细胞对照：不含待测样反应体系的吸光度。
无花果愈伤组织干粉的细胞活力测定结果见图1所示。在相同实验方法下，测得20％DMSO无花果组织提取物在添加量为0.1％时，其细胞活力为103.28±3.49，添加量为1％时，其细胞活力为102.86±0.82。
结论：由图1可以看出，通过对比样品组和对照组，添加无花果愈伤组织干粉的组较不添加的组可以提高HaCaT细胞的活力，用含0.25‰的DMSO的DMEM溶液稀释的干粉较添加含2‰的DMSO的DMEM溶液可提升细胞活力17.28％，说明添加无花果愈伤组织干粉的组可以明显提高HaCaT细胞的活力，尤其是添加了含0.25‰的DMSO的DMEM溶液稀释的干粉的组，虽然添加20％DMSO无花果组织提取物的组相对于对照组提升了细胞活力，但效果明显不如添加无花果愈伤组织干粉的组。
试验2无花果愈伤组织干粉对H2O2诱导的HaCaT细胞的氧化损伤保护作用
选取细胞存活率在20％左右的H2O2浓度，建立H2O2诱导的HaCaT(humanimmortalizedkeratinocytes)细胞衰老模型。取对数生长期的HaCaT细胞，按5×103个/孔接种于96孔板，于37℃、5％CO2的培养箱中培养过夜，24h后去除培养液，PBS清洗2遍，加入无血清培养基培养过夜，24h后弃培养液，PBS清洗2遍，每孔加入不同浓度H2O2(25、50、100、150、200μmol/L)培养24h后；弃培养液，PBS清洗2遍，采用
MTT法于490nm波长下酶标仪测定各孔吸光值，计算细胞存活率：
细胞存活率在20％左右的H2O2浓度为50μmol/L。
设立空白组，模型组、样品组和对照组，分别为：不含任何物质的空板，DMEM培养液+50μmol/LH2O2；干粉用含2‰的DMSO的DMEM溶液稀释至0.25‰；含2‰的DMSO的DMEM溶液。对照组加入不加任何样品的纯DMEM培养液。
实验方法：取生长状态良好的细胞以每孔5×103个的密度接种于96孔培养板中，于37℃，5％CO2环境中培养过夜，弃培养液，按照模型组和样品组加入样品，每个处理设5个重复。培养24h后，加入50μmol/L的H2O2，继续培养24h后，吸弃培养基，pH＝7.4的PBS(PhosphateBufferedSaline)缓冲液洗两次，加入100μLMTT(1.0g/L)溶液，放入37℃，5％CO2环境中培养4h后，弃液，加入100μLDMSO，37℃下放置30min后于490nm波长下测定各孔吸光度值。
细胞活力：
OD样品：含有待测样反应体系的吸光度；DD空白对照：不含任何物质的空板吸光度；OD细胞对照：不含待测样反应体系的吸光度。
无花果愈伤组织干粉对H2O2诱导的HaCaT细胞的氧化损伤保护作用如图2所示。在相同实验方法下，测得20％DMSO无花果组织提取物在添加量为0.1％时，其细胞活力为25.71±0.41，添加量为1％时，其细胞活力为25.39±0.63。
结论：由图2可知，无花果愈伤组织干粉可以缓解H2O2诱导的HaCaT细胞的氧化损伤，用DMEM溶液稀释的干粉对H2O2诱导的HaCaT细胞的氧化损伤保护作用极显著，含0.25‰的DMSO的DMEM溶液稀释的干粉较仅添加含2‰的DMSO的DMEM溶液可提升细胞活力32.09％，虽然添加20％DMSO无花果组织提取物的组相对于对照组也提升了细胞活力，但效果明显不如添加无花果愈伤组织干粉的组。
试验3无花果愈伤组织干粉对HaCaT细胞迁移率的影响
将生长状态良好的人永生化角质形成细胞以每孔1x106个细胞接种于6孔板中，37℃，5％，CO2培养箱培养。第二天用10μl枪头比着直尺，垂直交叉画两条线(+字形)。PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，每孔加入2mL不同浓度样品，以无血清DMEM培养基为对照组。放入37℃，5％，CO2培养箱，分别在上样后0、6、12、24h后于倒置显微镜下观察，拍照。
使用ImageJ软件进行数据分析，计算细胞迁移率，细胞迁移率(％)＝(0h划痕面积-培养时间划痕面积)/0h划痕面积*100。
表1无花果愈伤组织干粉对HaCaT细胞迁移率的影响
结论：由表1可知，在相同培养时间下，添加无花果愈伤组织干粉的组比未添加的组的细胞迁移率更高，说明无花果愈伤组织干粉可以提高细胞划痕的修复能力，尤其是当添加量为0.1％、培养24h时，细胞迁移率相对于对照组提升了76.55％。
试验4无花果愈伤组织干粉中黄酮含量测定
芦丁标准品全波长扫描：0.5mL(0.2mg/mL)芦丁标准品25mL容量瓶，加1mL5％NaNO2(0.5g亚硝酸钠+9.5g离子水)，摇匀静置6min，加入1mL10％Al(NO3)3(1g硝酸铝+46.8mL水)，摇匀静置6min，加入10mL4％NaOH(3g氢氧化钠+72mL水)，加50％乙醇定容，摇匀静置20min，全波长扫描(400-600nm，采样间隔1nm)，确定最佳吸光度。
总黄酮测定：芦丁标准品10mg于50mL容量瓶，加入50％乙醇溶解，定容，取0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0mL分别置于25mL容量瓶，各加入50％乙醇至10mL(9.5、9、8、7、6、5、4mL)，加入1mL5％NaNO2(0.5g亚硝酸钠+9.5g离子水)，摇匀静置6min，加入1mL10％Al(NO3)3(1g硝酸铝+46.8mL水)，摇匀静置6min，加入10mL4％NaOH(3g氢氧化钠+72mL水)，加50％乙醇定容，摇匀静置。510nm测吸光值，制作标曲。
总黄酮溶液(XmL或Xg)加入50mL容量瓶，加50％无水乙醇定容，加入总黄酮溶液0.5mL于25mL容量瓶中(0.5mL50％乙醇为空白对照)，按上述测定步骤，测定吸光度。
黄酮提取量：
黄酮提取量见表2所示。
表2无花果愈伤组织干粉与无花果组织黄酮含量测定
| 黄酮提取量(mg/g) | |
| 50％乙醇无花果愈伤组织干粉 | 204.8969 |
| 50％乙醇无花果组织提取物 | 12.15022 |
由表2可知，无花果愈伤组织干粉中黄酮含量是无花果组织提取物中黄酮含量的17倍，说明无花果愈伤组织具有很强的抗氧化能力，能够清除氧自由基，相比于无花果组织，无花果愈伤组织在化妆品领域的应用具有意料不到的技术效果。
试验5无花果愈伤组织干粉中多酚含量测定
没食子酸标准液：称取没食子酸50mg充分溶于10mL无水乙醇，蒸馏水定容至100mL。分别取0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0mL于25mL容量瓶中定容。分别取不同质量浓度的没食子酸标液1.0mL，加5mL水，1mL福林酚试剂，震荡混匀，8min内加入3mL7.5％Na2CO3(7.5g碳酸钠+100mL水)避光反应2h，于765nm波长下测定吸光度值。
取稀释倍数后的样品1mL，加5mL水，1mLFC试剂，混匀震荡，8min内加入3mL7.5％Na2CO3避光反应2h，于765nm波长下测定吸光度值，代入标曲。
总酚含量：
总酚含量见表3所示。
表3无花果愈伤组织干粉与无花果组织总酚含量测定
| 多酚含量(mg/g) | |
| 50％乙醇无花果愈伤组织干粉 | 30.83 |
| 50％乙醇无花果组织提取物 | 0.80 |
由表3可知，无花果愈伤组织干粉中多酚含量是无花果组织提取物中黄酮含量的38倍，说明无花果愈伤组织具有很强的抗氧化能力，能够清除氧自由基，相比于无花果组织，无花果愈伤组织在化妆品领域的应用具有意料不到的技术效果。
以上具体实施例仅仅是对本发明的解释，其并不是对本发明的限制，本领域技术人员在阅读完本说明书后可以根据需要对本实施例做出没有创造性贡献的修改，但只要在本发明的权利要求范围内都受到专利法的保护。
Claims (8)
1.一种无花果愈伤组织干粉的制备方法，其特征在于，取新鲜的无花果愈伤组织进行冷冻干燥，然后研磨成粉末，得到无花果愈伤组织干粉。
2.如权利要求1所述的一种无花果愈伤组织干粉的制备方法，其特征在于，所述冷冻干燥步骤具体为：取新鲜的无花果愈伤组织在-30℃恒温冰箱中预冻24h，然后放入真空冷冻干燥机中干燥48h，冷阱温度为-60℃，冷冻仓温度为-45℃—35℃，真空度为0-10pa。
3.如权利要求1所述的一种无花果愈伤组织干粉的制备方法，其特征在于，所述研磨方式为液氮研磨，液氮温度为-195℃，研磨后过200目筛。
4.一种由权利要求1-3任一项所述的制备方法制备得到的无花果愈伤组织干粉。
5.一种由权利要求1-3任一项所述的制备方法得到的无花果愈伤组织干粉或权利要求4所述的无花果愈伤组织干粉在制备化妆品中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述化妆品为肤用化妆品。
7.一种抗氧化的化妆品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的制备方法得到的无花果愈伤组织干粉或权利要求4所述的无花果愈伤组织干粉。
8.一种促修复的化妆品，其特征在于，包括权利要求1-3任一项所述的制备方法得到的无花果愈伤组织干粉或权利要求4所述的无花果愈伤组织干粉。
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