CN116584390A - 一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，包括以下步骤：(1)将组培苗取出，切去根系部分，茎段不做切割，整丛放置于无菌组培玻璃瓶中，每瓶3丛；(2)加入蔗糖含量3％的MS3液体培养基，全暗下培养1周，温度25±2℃的组培间培养；(3)超净台上，吸去MS3，加入蔗糖含量8％的MS8液体培养基；(4)需要收获更多微型薯，继续换新鲜MS8液体培养，本专利要申请的是液体培养两步法高效诱导微型薯的方法。通过不含激素的MS液体培养基，应用3％和8％蔗糖浓度的组合，全暗和恒温条件下，在4周时间内可收获微型薯，解决马铃薯组织培养苗诱导微型薯过程中的周期长，成本高，培养条件复杂，操作复杂的问题。
Description
技术领域
本发明属于植物组织培养育种技术领域，具体涉及一种两步法诱导马铃薯微型薯方法。
背景技术
植物组织培养技术，是应用植物细胞所具有的全能性，利用植物的任何细胞或组织在离体条件下，无菌培养，在特定培养基上重新发育成为一个完整植株的技术。植物组织培养技术被广泛地应用在优良品种和稀有种质资源的快速繁殖上，生产人工种子，生产次生代谢物等，也是遗传育种创制新品种的技术基础。
马铃薯作为我国六大粮食作物之一，改良已有品种和创造新种质并将其产业化提到了新高度。马铃薯作为块茎植物，在连续种植几年后，块茎中的病毒会累积的越来越多，导致品种退化，产量和品质都下降。通过茎尖或根尖组织培养生产脱毒的微型薯，是防止马铃薯品种退化最重要的措施。
微型薯又称试管薯，具有生产不受季节限制，体积小，重量轻，便于运输和推广，容易交换和保存等优点。微型薯的诱导可以利用脱毒苗在大田进行，也可以在无菌条件下离体培养完成。不同品种在微型薯诱导方式，培养基组成，培养条件等方面也存在差异。
由马铃薯组培苗诱导微型薯，用于脱毒马铃薯原种的生产，也可以用微型薯作为遗传转化起始材料，用于常规的转基因或创制基因编辑新品种。微型薯也可以作为种质资源的保存形式。
迄今为止，关于马铃薯微型薯诱导的报道虽然很多，也有不少专利涉及微型薯的诱导。主要方法是用无菌苗茎切段通过固体培养，液体培养，或者固液结合的方式，应用光暗的调节和蔗糖浓度的提高，激素的组合，诱导微型薯的产生，市场上的马铃薯微型薯的诱导周期长，大多需要6-8周以上，培养基成分复杂，含有激素，成本高，而且会对后续微型薯的应用产生影响，需要特殊容器，费用高，诱导条件比较复杂，需要温度变化和光暗变化等等的组合。
发明内容
本发明的目的在于提供一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，旨在解决所述背景技术中存在的问题，解决马铃薯组织培养苗诱导微型薯过程中的周期长，成本高，培养条件复杂，操作复杂的问题。
为实现所述目的，本发明采用的技术方案是：一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，包括以下步骤：
(1)将组培苗取出，切去根系部分，茎段不做切割，整丛放置于无菌组培玻璃瓶中，每瓶3丛；
(2)加入蔗糖含量3％的MS3液体培养基，全暗下培养1周，温度25±2゜C的组培间培养，3天后就有少量微型薯产生；
(3)超净台上，吸去MS3，加入蔗糖含量8％的MS8液体培养基，培养条件同上一步，培养3周后，即可采收每瓶9-28个微型薯，微型薯直径5mm-20mm；
(4)需要收获更多微型薯：继续换新鲜MS8液体培养基，2周后，又可产生每瓶约10个左右的微型薯。
进一步地，所述MS3液体培养基的培养温度范围可以22-27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
进一步地，所述MS3液体培养基以MS为基本培养基，还包括蔗糖；所述蔗糖的浓度为30g/L，所述MS3液体培养基培养的时间为7天。
进一步地，所述MS8液体培养基包括：MS培养基,含蔗糖80g/L，培养条件为暗培养，温度为25±2℃，所述MS8液体培养基培养的时间为15-25天。
本发明的有益效果：通过采用上述技术方案，本发明是一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，本专利要申请的是液体培养两步法高效诱导微型薯的方法。通过不含激素的MS液体培养基，应用3％和8％蔗糖浓度的组合，全暗和恒温条件下，在4周时间内可收获微型薯，解决马铃薯组织培养苗诱导微型薯过程中的周期长，成本高，培养条件复杂，操作复杂的问题。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、目的和优点将会变得更明显：
图1为本发明的方法流程图；
图2为本发明的马铃薯5个品种组培苗诱导微型薯之前的生长状态图；
图3为本发明的马铃薯5个品种的液体培养微型薯生长状态图；
图4为本发明的马铃薯3个品种的MS8固体培养诱导微型薯图；
图5为本发明的微型薯2个品种的农杆菌遗传转化和筛选再生图；
图6为本发明的鲁引1号微型薯移栽种植图；
图7为本发明的鄂薯3号基因编辑种质保种图；
图8为本发明的微型薯萌芽扩繁图。
具体实施方式
为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。
如图1-8所示，本发明实施例提供了一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，包括以下步骤：
(1)将组培苗取出，切去根系部分，茎段不做切割，整丛放置于无菌组培玻璃瓶中，每瓶3丛；
(2)加入蔗糖含量3％的MS3液体培养基，全暗下培养1周，温度25±2゜C的组培间培养，3天后就有少量微型薯产生；
(3)超净台上，吸去MS3，加入蔗糖含量8％的MS8液体培养基，培养条件同上一步，培养3周后，即可采收每瓶9-28个微型薯，微型薯直径5mm-20mm；
(4)需要收获更多微型薯，继续换新鲜MS8液体培养基，2周后，又可产生10个左右的微型薯。
在本实施例中，组织培养苗：5个马铃薯品种(鄂3号、鲁引1号、大西洋、Desiree、陇薯19号)组培苗生长培养基MS培养基，不含激素，蔗糖3％，结冷胶5％,pH5.8。培养条件：温度25±2゜C，光照3000Lux左右，培育壮苗。继代时，8～10cm苗切成2～3cm含1～2个腋芽的茎段，5个茎切段每瓶，350ml容积玻璃组培瓶中装入50ml培养基。专门用于微型薯诱导的组培苗则置于温度25±2゜C、1000lux弱光条件下，培养2个月左右，直至长成丛生簇状。
微型薯的诱导结果，不同马铃薯品种微型薯产量表1(每瓶)
| 品种 | 4周微型薯总量 |
| Desiree | 14.2±3.1 |
| 鄂薯3号 | 24.3±3.7 |
| 鲁引1号 | 15.8±6.7 |
| 大西洋 | 15.5±3.5 |
| 陇薯19号 | 16.8±4.4 |
表1
经对比试验，如果将液体培养换成固体培养，则结薯量显著下降(图5)。
应用场景：场景1应用于农杆菌遗传转化，作为转化起始材料，创制基因编辑新种质(图5)。
场景2移栽入土，微型薯萌芽。经此液体培养的微型薯，无休眠期，可直接移栽萌芽(图6)。
场景3新品种和新种质资源的保存，节省保存空间，减少继代次数(图7)。茎段不经过MS3液体培养基预处理1周，直接进入MS8液体培养基诱导微型薯。
场景4微型薯用于扩繁，微型薯作为扩繁的起始材料，长出壮苗(图8)。
再生培养基中可变量：
1.最佳方案是MS3和MS8的组合处理，先MS3一周再MS8三周。但也可以不经MS3预处理一周，直接进入MS8的液体培养基中，但结薯数量急剧下降。
2.第二步蔗糖的浓度变化范围可以6％-10％，以8％最佳。
3.非丛生状的壮芽切成2-3cm的茎段可直接进入固体的含8％蔗糖的MS培养基诱导微型薯(图4)，作为长期保种用，但薯量降为5-10个每瓶。
4.培养温度范围可以22-27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
本发明中涉及的MS培养基，为常规培养基。MS盐混合物+MS有机混合物+蔗糖3％或8％，固体培养基加结冷胶0.5％，pH5.8.经121゜C,20min,灭菌后使用；其中MS培养基盐类及有机物混合物为表2：
表2MS培养基有机混合物为表3：
| 化合物 | 浓度(mg/L) |
| 肌醇 | 100 |
| 盐酸 | 0.5 |
| 盐酸吡哆醇 | 0.5 |
| 盐酸硫胺素 | 0.1 |
| 甘氨酸 | 2 |
表3
培养温度范围可以22-27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
图2和图3中品种顺序：鄂薯3号、鲁引1号、大西洋、Desiree、陇薯19号；图4中品种顺序：鄂薯3号、鲁引1号、Desiree；图5中品种顺序：鄂薯3号、鲁引1号；图6中品种为鲁引1号；图7中品种为鄂3；图8中品种顺序：鄂薯3号、鲁引1号、Desiree。
以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点,对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
Claims (4)
1.一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将组培苗取出，切去根系部分，茎段不做切割，整丛放置于无菌组培玻璃瓶中，每瓶3丛；
(2)加入蔗糖含量3％的MS3液体培养基，全暗下培养1周，温度25±2゜C的组培间培养，3天后就有少量微型薯产生；
(3)超净台上，吸去MS3，加入蔗糖含量8％的MS8液体培养基，培养条件同上一步，培养3周后，即可采收每瓶9-28个微型薯，微型薯直径5mm-20mm；
(4)需要收获更多微型薯，继续换新鲜MS8液体培养基，2周后，又可产生每瓶10个左右的微型薯。
2.根据权利要求1所述的一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，其特征在于：所述MS3液体培养基的培养温度范围可以22-27゜C，本发明不额外增添设备，与其它组培材料共享空间。
3.根据权利要求1所述的一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，其特征在于：所述MS3液体培养基以MS为基本培养基，还包括蔗糖30g/L，不含植物激素；，所述MS3液体培养基的培养条件为暗培养，温度为25±2°C，培养的时间为7天。
4.根据权利要求1所述的一种马铃薯微型薯的无激素液体培养诱导方法，其特征在于：所述MS8液体培养基包括：MS培养基，还包括蔗糖80g/L，不含植物激素培养条件为暗培养，温度为25±2℃，所述MS8液体培养基培养的时间为15-25天。
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