CN116574144B - 一种从山茱萸叶中制备山茱萸新苷f的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及从山茱萸叶中制备山茱萸新苷F的方法及其应用，可有效解决从山茱萸叶中提取山茱萸新苷F，并有效用于制备抗黑色素瘤的药物问题，方法是，干燥山茱萸叶粉碎，用含水丙酮进行组织破碎提取，提取液减压浓缩，再加水分散溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，正丁醇部位加水溶解过滤，上Diaion HP‑20大孔吸附树脂柱色谱，得组分Fr.1～Fr.7；组分Fr.6上硅胶柱，用二氯甲烷‑甲醇梯度洗脱，所得流分Fr.6‑3甲醇溶解，上ODS中亚制备柱，用水、甲醇洗脱，组分Fr.6‑3‑5用半制备HPLC分离，收集保留时间tR=22.0~24.0 min的流份，浓缩干燥，得化合物山茱萸新苷F，具有抗黑色素瘤活性，特别是抑制A375细胞毒活性，其IC50为11.2±2.0μM，原料丰富，制备方法易操作。
Description
技术领域
本发明涉及医药，特别是一种从山茱萸叶中制备山茱萸新苷F的方法及其应用。
背景技术
山茱萸(Cornus officinalis Sieb.et Zucc)为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸的干燥成熟果实，我国传统名贵中药材之一，始载于《神农本草经》，具有补益肝肾，涩精固脱的作用。主产于河南、山西、陕西、浙江等地，其中以河南西峡所产山茱萸具有产量大、品质好等优点，为山茱萸的主产区。但是在山茱萸资源开发利用过程中，除了果实之外，其他资源未得到充分合理的应用，造成资源的极大浪费。研究发现，山茱萸叶含有很好的药学活性成分，但如何从中提取出来，并用于制备治疗相关疾病，至今未见有公开报导。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之缺陷，本发明之目的就是提供一种从山茱萸叶中制备山茱萸新苷F的方法及其应用，可有效解决从山茱萸叶中提取山茱萸新苷F，并有效用于制备抗黑色素瘤的药物问题。
本发明解决的技术方案是，一种从山茱萸叶中制备山茱萸新苷F的方法，所述的山茱萸新苷F是从山茱萸叶中提取得到，分子结构式为：
制备方法是：干燥山茱萸叶粉碎，用含水丙酮进行组织破碎提取，提取液沉降一周，过滤除去泥沙残渣，经减压浓缩，得到总浸膏，总浸膏加水分散溶解，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，分别得到石油醚部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
正丁醇部位加水溶解过滤，上Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用水、乙醇-水系统进行梯度洗脱，各部位洗脱液经减压浓缩，冷冻干燥，得到组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6以及Fr.7；
组分Fr.6硅胶拌样，上硅胶柱，用二氯甲烷-甲醇梯度洗脱，得流分Fr.6-1、Fr.6-2、Fr.6-3、Fr.6-4、Fr.6-5、Fr.6-6；
流分Fr.6-3甲醇溶解，上ODS中亚制备柱，依次用水、甲醇洗脱，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每100mL检识一次，合并相同流份，得到流分Fr.6-3-1、Fr.6-3-2、Fr.6-3-3、Fr.6-3-4、Fr.6-3-5、Fr.6-3-6、Fr.6-3-7、Fr.6-3-8；
Fr.6-3-5用半制备HPLC分离，上色谱柱，流动相为体积比乙腈：三氟乙酸水溶液＝18:82，收集保留时间tR＝22.0～24.0min的流份，浓缩干燥，得到化合物山茱萸新苷F。
本发明方法制备的山茱萸新苷F具有抗黑色素瘤活性，可有效用于制备抑制黑色素瘤的药物，实现山茱萸新苷F在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
本发明以山茱萸传统非药用部位山茱萸叶作为原料，采用独特的制备方法，从而得到一个新的化合物山茱萸新苷F，具有抗黑色素瘤活性，特别是抑制A375细胞毒活性，其IC50为11.2±2.0μM，原料丰富，制备方法易操作，充分利用山茱萸叶制备山茱萸新苷F，废物利用，节约资源，开拓了山茱萸叶的药物价值，为制备抑制A375细胞的药物提供了技术支持，有显著的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明化合物山茱萸新苷F的结构式图。
图2为本发明化合物山茱萸新苷F的1H NMR(500MHz,CD3OD)谱图。
图3为本发明化合物山茱萸新苷F的13C NMR(125MHz,CD3OD)谱图。
图4为本发明化合物山茱萸新苷F的DEPT谱图。
图5为本发明化合物山茱萸新苷F的1H 1H COSY相关谱图。
图6为本发明化合物山茱萸新苷F的HSQC相关谱图。
图7为本发明化合物山茱萸新苷F的HMBC相关谱图。
图8为本发明化合物山茱萸新苷F的HR-ESI-MS谱图。
图9为本发明化合物山茱萸新苷F的UV谱图。
图10为本发明化合物山茱萸新苷F的IR谱图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式作详细说明。
本发明一种从山茱萸叶中制备山茱萸新苷F的方法，所述的山茱萸新苷F是从山茱萸叶中提取得到，分子结构式为：
制备方法是：干燥山茱萸叶10Kg，粉碎，采用体积浓度50％含水丙酮进行组织破碎提取3次，每次用量为山茱萸叶重量体积的2倍，每次1h，重量体积是指固体以Kg计，液体以L计，合并3次提取液，沉降一周，过滤除去泥沙残渣，经减压浓缩，得到总浸膏2.4Kg，总浸膏加水10L分散溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，每次用量均为10L，分别得到石油醚部位(50.2g)、乙酸乙酯部位(255.0g)、正丁醇部位(334.0g)；
正丁醇部位(334.0g)加水溶解过滤，上Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用水、体积浓度10％、20％、30％、50％、70％、95％的乙醇-水系统进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，流速800mL/min，各部位洗脱液经减压浓缩，冷冻干燥，得到组分Fr.1(20.4g)、Fr.2(26.7g)、Fr.3(63.2g)、Fr.4(52.6g)、Fr.5(72.7g)、Fr.6(79.1g)以及Fr.7(19.0g)；
组分Fr.6(79.1g)用80g硅胶拌样，上硅胶柱，用体积比二氯甲烷-甲醇为70:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1进行梯度洗脱，每个梯度洗脱部位用量为柱体积的2倍，流速20mL/min，得到相应的六个流分Fr.6-1、Fr.6-2、Fr.6-3、Fr.6-4、Fr.6-5、Fr.6-6；
流分Fr.6-3(5.62g)甲醇溶解，上ODS中亚制备柱、依次用水、体积浓度10％、20％、30％、40％、70％甲醇洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，流速3mL/min，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每100mL检识一次，合并相同流份，得到流分Fr.6-3-1、Fr.6-3-2、Fr.6-3-3、Fr.6-3-4、Fr.6-3-5、Fr.6-3-6、Fr.6-3-7、Fr.6-3-8；
Fr.6-3-5用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为体积比乙腈：三氟乙酸水溶液＝18:82，所述三氟乙酸水溶液的质量含量为万分之二，流速3mL/min，收集保留时间tR＝22.0～24.0min的流份，浓缩干燥，得到化合物山茱萸新苷F。
上述给出的仅是实施例，是用于说明本发明的具体实施方式，并不是用于限制本发明的保护范围，凡是采用等同、等效替代技术手段所作出的技术方案，在本质上与本发明相同，均属于本发明的保护范围。
该化合物山茱萸新苷F具有抗黑色素瘤活性，特别是抑制A375细胞毒活性，实现山茱萸新苷F在制备抑制A375细胞药物中的应用，并经实验取得非常好的有益技术效果，有关实验资料如下：
1仪器与试药
核磁共振用Bruker AVANCEⅢ500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)，红外光谱用Nicolet is 10Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨质谱用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光谱用Shimadzu UV-2401PC apparatus，高效液相色谱用Waters Alliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，Empower3色谱数据工作站，LC50型高压制备液相色谱仪，UV200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×10mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，A-1000S型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，FDU-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，AB204-N万分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)，二氧化碳培养箱(上海STIK)，超净工作台(苏净集团)，Arium 611VF超级组合型超纯水器(SARTORIUS)，倒置显微镜(Nikon)，PB-10酸度计(德国赛多利斯集团)，SORVALL ST16R Centrifuge高速低温冷冻离心机(Thermo Fisher Scientific公司)；酶标仪(BIO-RAD 680)；超净工作台(江苏苏净集团)；90-3磁力搅拌器(上海振捷实验设备有限公司)；RD-7080全自动新型鼓风干燥箱(上海智城分析仪器制造有限公司)；微量加样器(Nichipet EX PLUS)；AB204-N电子读数分析天平(梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司产品)；10cm培养皿、96孔培养板、冻存管(Corning)；普通手术器械。
柱层析填料Diaion HP-20、MCI Gel CHP-20(日本三菱化学公司)，Toyopearl HW-40(日本TOSOH公司)，Sephadex LH-20(Parmacia Biotech公司)，柱层析所用硅胶H(160-200目)为青岛海洋化工厂生产，培养皿、96孔培养板、细胞冻存管(Corning公司)，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。
人恶性黑色素瘤A375细胞购自Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.；DMEM高糖培养基(Gibco)；胎牛血清((Gibco)；胰蛋白酶(Gibco)，DMSO(Solarbio)；MTT(Biosharp)；氨苄青霉素、Tris碱(Sigma)；Griess reagent(Sigma)；水为超纯水，PBS缓冲液等为自配。
本实验所选的山茱萸叶，采自河南西峡，经河南中医药大学董诚明教授鉴定为山茱萸科山茱萸属植物山茱萸的干燥叶。
2结构鉴定
山茱萸新苷F，白色固体粉末，易溶于甲醇，丙酮等溶剂。HR-ESI-MS m/z:561.1566[M+Na]+(calcd.for C25H30O13Na)，确定化合物的分子式为C25H30O13。UV(CH3OH)λmax(logε):209(4.82)，234(1.79)，325(0.67)nm；IR(iTR)νmax cm-1：3380，1678，1488，1206，1073，1030cm-1等吸收。
表1山茱萸新苷F的NMR数据归属(in CD3OD)
3.活性检测
人黑色素瘤A375细胞购自Procell Life Science&Technology Co.,Ltd.，在添加10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM中，37℃，5％ CO2培养箱中培养。选取对数生长期细胞，PBS洗一次，加入DMEM培养基吹打均匀，以4000个/孔密度接种于E-Plate 16板中，培养24h待贴壁后，细胞分为正常组、山茱萸新苷F组(0.1μM、1μM、5μM、10μM、50μM)，采用RTCA法测定化合物对A375细胞的IC50值。实验重复进行3次，取3次(n＝3)独立实验的平均值。结果显示，其IC50为11.2±2.0μM，表明化合物山茱萸新苷F具有很好的抗黑色素瘤活性，特别是抑制黑色素瘤A375细胞，实现山茱萸新苷F在制备抗黑色素瘤药物中应用。
由上述可以清楚看出，本发明以山茱萸传统非药用部位山茱萸叶作为原料，采用独特的制备方法，从而得到一个新的化合物山茱萸新苷F，具有抗黑色素瘤活性，特别是抑制A375细胞毒活性，其IC50为11.2±2.0μM，原料丰富，制备方法易操作，充分利用山茱萸叶制备山茱萸新苷F，废物利用，节约资源，开拓了山茱萸叶的药物价值，为制备抑制A375细胞的药物提供了技术支持，有显著的经济和社会效益。
Claims (3)
1.一种从山茱萸叶中制备山茱萸新苷F的方法，所述的山茱萸新苷F是从山茱萸叶中提取得到，分子结构式为：
制备方法是：干燥山茱萸叶10Kg，粉碎，采用体积浓度50％含水丙酮进行组织破碎提取3次，每次用量为山茱萸叶重量体积的2倍，每次1h，重量体积是指固体以Kg计，液体以L计，合并3次提取液，沉降一周，过滤除去泥沙残渣，经减压浓缩，得到总浸膏2.4Kg，总浸膏加水10L分散溶解后，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取4次，每次用量均为10L，分别得到石油醚部位50.2g、乙酸乙酯部位255.0g、正丁醇部位334.0g；
正丁醇部位加水溶解过滤，上Diaion HP-20大孔吸附树脂柱色谱，依次用水、体积浓度10％、20％、30％、50％、70％、95％的乙醇-水系统进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，流速800mL/min，各部位洗脱液经减压浓缩，冷冻干燥，得到组分Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6以及Fr.7；
组分Fr.6用80g硅胶拌样，上硅胶柱，用体积比二氯甲烷-甲醇为70:1、50:1、30:1、20:1、10:1、5:1进行梯度洗脱，每个梯度洗脱部位用量为柱体积的2倍，流速20mL/min，得到相应的六个流分Fr.6-1、Fr.6-2、Fr.6-3、Fr.6-4、Fr.6-5、Fr.6-6；
流分Fr.6-3甲醇溶解，上ODS中亚制备柱、依次用水、体积浓度10％、20％、30％、40％、70％甲醇洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，流速3mL/min，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每100mL检识一次，合并相同流份，得到流分Fr.6-3-1、Fr.6-3-2、Fr.6-3-3、Fr.6-3-4、Fr.6-3-5、Fr.6-3-6、Fr.6-3-7、Fr.6-3-8；
Fr.6-3-5用半制备HPLC分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的YMC-Pack ODS-AA色谱柱，流动相为体积比乙腈：三氟乙酸水溶液＝18:82，所述三氟乙酸水溶液的质量含量为万分之二，流速3mL/min，收集保留时间tR＝22.0～24.0min的流份，浓缩干燥，得到化合物山茱萸新苷F。
2.权利要求1所述方法制备的山茱萸新苷F在制备抗黑色素瘤药物中的应用。
3.根据权利要求2所述的山茱萸新苷F在制备抗黑色素瘤药物中的应用，其特征在于，所述的黑色素瘤为A375细胞。
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