CN118420688A - 一种从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物的方法及其应用 - Google Patents
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Abstract
一种从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物的方法及其应用，取草麻黄干燥根及根茎为原料，加水，煎煮提取，浓缩得浸膏，用水分散，洗脱，拌样，分离，检识，上色谱柱，收集流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M；草麻黄根加热回流提取，浓缩得浸膏，用水分散，分离，洗脱，检识合并分离，上色谱柱，收集流份，浓缩干燥，分离纯化，得到麻黄根酚I；进一步分离，上色谱柱，收集流份，浓缩干燥，收集暗斑色带，洗脱，干燥，得到麻黄根酚J，本发明方法易操作，产品纯度高，具有抗抑郁活性，有效用于制备治疗抑郁症药物，开拓了麻黄根的药用价值，经济和社会效益巨大。
Description
技术领域
本发明涉及中医药领域，特别是特别是新的糖苷类化合物和新的黄烷醇类化合物及其在制备抗抑郁症药物中应用的一种从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物的方法及其应用。
背景技术
抑郁症作为一种精神类疾病，是社会、心理和生物因素综合作用的结果。其临床特征主要包括；情绪功能的紊乱、思维的迟缓、意志力的削弱、认知功能的损害以及社会功能的障碍。对人类的生命和日常生活质量构成了严重的威胁。在最新的临床研究中，发现抑郁症的严重程度与皮质酮水平有着密切的联系，抑郁症患者的血浆皮质酮水平普遍偏高。对于重症抑郁症患者，抗糖皮质激素治疗展现出了显著的治疗效果，治疗后他们的血浆皮质酮水平得以降低。进一步的研究还表明，血浆及脑脊液中皮质酮水平的持续升高可能在抑郁症的发病过程中发挥着关键的作用。因此，寻找潜在的抗抑郁活性的天然产物是医药学科研工作者迫切解决的技术问题。
麻黄根别名苦椿菜，为麻黄科(Ephedraceae Dumortier)麻黄属(Ephedra Tournex Linn.)植物草麻黄(Ephedra sinica Stapf.)或中麻黄(Ephedra intermedia Schrenket C.A.Mey.)的干燥根和根茎，在我国，主要分布在山西、陕西、四川等地，为传统中药，收载于《中国药典》。始见于《神农本草经》，具有治疗中风，伤寒头痛，温疟，发表出汗，去邪热气，止咳逆上气，除寒热，破积聚的功效。随着现代中医药与化学技术的快速发展，对于麻黄的研究也越来越全面。但目前对于麻黄的研究多集中在麻黄的地上部分，对麻黄的地下部分研究相对较少，而文献记载相对较早。为进一步研究麻黄根化学成分，阐明其药效物质基础，促进麻黄根的进一步开发与利用，对其化学成分进行分离和鉴定，从中分离得到2个新的糖苷类化合物和2个新的黄烷醇类化合物，采用皮质酮诱导PC-12细胞损伤模型进行化合物活性筛选，能显著改善皮质酮诱导的PC-12细胞损伤，发挥潜在的抗抑郁活性，实现在制备治疗抑郁症药物中的应用，但至今未见有公开报道。
发明内容
针对上述情况，为克服现有技术之不足，本发明之目的在于，提供一种从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物的方法及其应用，可有效解决从从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物，实现在制备治疗抑郁症药物中的应用问题。
本发明解决的技术方案是：一种从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物，该酚类化合物为糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J，黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M，其分子结构式分别为：
其中麻黄根酚I和麻黄根酚J是分子式相同的一对。
其制备方法是：取清除杂质的草麻黄干燥根及根茎，作为原料，加入原料重量体积15倍量的水，重量体积是指固体以kg计，液体以L计，采用煎煮法提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩至原料重量体积的0.100-0.102倍，得第一浸膏，第一浸膏用水分散，经Diaion HP-20大孔吸附树脂柱，依次用水和乙醇进行梯度洗脱，得到水部位、体积浓度10％乙醇部位、体积浓度20％乙醇部位、体积浓度30％乙醇部位、体积浓度40％乙醇部位、体积浓度50％乙醇部位、体积浓度70％乙醇部位、体积浓度95％乙醇部位；
将50％乙醇部位用甲醇溶解后，采用硅胶柱层析法以体积比的样品：硅胶为1:1.2拌样，然后用体积比的二氯甲烷-甲醇系统：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，2-3天/每梯度，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每50ml检识一次，合并相同流份，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6，将组分Fr.3经100～200目的硅胶柱色谱分离，以体积比的石油醚-乙酸乙酯：10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC检识，合并相同流分得组份Fr.3.1、Fr.3.2、Fr.3.3、Fr.3.4、Fr.3.5、Fr.3.6，将组分Fr.3.4用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝54:46，流速3ml/min，收集保留时间tR＝16-18min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚K；收集保留时间tR＝20-22min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-2；收集保留时间tR＝35-37min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-3；化合物MHG-50-5-3-4-2用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝27:73，流速3ml/min，收集保留时间tR＝40-42min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚M；
经水煎煮提取后的草麻黄根再用体积浓度95％乙醇用加热回流装置提取2次，每次1kg麻黄根加4L乙醇，加热回流2h，合并提取液，减压浓缩得原料重量体积1/4的第二浸膏，用水分散溶解，再依次用石油醚萃取5次，每次用量为浸膏重量体积的0.7倍，用二氯甲烷萃取10次，每次用量为浸膏重量体积的1倍，用乙酸乙酯萃取12次，每次用量为浸膏重量体积的1倍，用正丁醇萃取6次，每次用量为浸膏重量体积的0.6倍，回收溶剂，得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
将乙酸乙酯部位进行硅胶柱色谱分离，采用体积比的二氯甲烷-甲醇：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行梯度洗脱，3-4天/每梯度，TLC检识并合并相同流分得到组分E1、E2～E9，将组分E9减压浓缩，使用Toyopearl HW-40C凝胶柱色谱，依次用体积浓度70％、80％、85％甲醇梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每10ml检识一次，合并相同流份，得到组份E9-1、E9-2、E9-3、E9-4～E9-8；组分E9-4减压浓缩，使用Toyopearl HW-40C凝胶柱色谱，用体积浓度70％甲醇洗脱，用量为柱体积的7倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每5ml检识一次，合并相同流份，得到组份Er；组份Er用半制备HPLC粗分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝42:58，流速3ml/min，收集保留时间tR＝8-10min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-1，收集保留时间tR＝13-16min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2，收集保留时间tR＝18-21min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-3，收集保留时间tR＝24-26min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-4；Er-3用半制备HPLC进一步分离纯化，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝40:60，流速3ml/min，收集保留时间tR＝17-19min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚I；组分Er-2用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝35:65，流速3ml/min，收集保留时间tR＝28-30min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2-3；组分Er-2-3用制备薄层色谱分离，展开剂为体积比的二氯甲烷：甲醇＝5:1，收集Rf最小的暗斑色带，使用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合液6ml洗脱，洗脱液浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚J。
该方法所制备的糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J、黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M在制备抗抑郁药物中的应用。
本发明原料丰富，制备方法易操作，产品质量好，提取效果好，纯度高，所得化合物具有抗抑郁活性，实现在制备治疗抑郁症药物中的应用，开拓了麻黄根的药用价值，有巨大的经济和社会效益。
附图说明
图1为本发明麻黄根酚I的1H-NMR谱(in 500MHz,DMSO-d6)图。
图2为本发明麻黄根酚I的13C-NMR谱(in 125MHz,DMSO-d6)图。
图3为本发明麻黄根酚I的HR-ESI-MS谱(in MeOH)图。
图4为本发明麻黄根酚I的IR谱(in MeOH)图。
图5为本发明麻黄根酚I的UV谱(in MeOH)图。
图6为本发明麻黄根酚J的1H-NMR谱(in 500MHz,DMSO-d6)图。
图7为本发明麻黄根酚J的13C-NMR谱(in 125MHz,DMSO-d6)图。
图8为本发明麻黄根酚J的HR-ESI-MS谱(in MeOH)图。
图9为本发明麻黄根酚J的IR谱(in MeOH)图。
图10为本发明麻黄根酚J的UV谱(in MeOH)图。
图11为本发明麻黄根酚K的1H-NMR谱(in 500MHz,CD3OD)图。
图12为本发明麻黄根酚K的13C-NMR谱(in 125MHz,CD3OD)图。
图13为本发明麻黄根酚K的HR-ESI-MS谱(in MeOH)图。
图14为本发明麻黄根酚K的UV谱(in MeOH)图。
图15为本发明麻黄根酚K的IR谱(in MeOH)图。
图16为本发明麻黄根酚M的1H-NMR谱(in 500MHz,CD3OD)图。
图17为本发明麻黄根酚M的13C-NMR谱(in 125MHz,CD3OD)图。
图18为本发明麻黄根酚M的HR-ESI-MS谱图。
图19为本发明麻黄根酚M的UV谱图。
图20为本发明麻黄根酚M的IR谱图。
图21为本发明麻黄根酚I、麻黄根酚J、麻黄根酚K、麻黄根酚M的分子结构式图。
图22为本发明化合物1(麻黄根酚I)、化合物2(麻黄根酚J)对皮质酮诱导的PC-12细胞损伤模型中细胞存活率的影响.n＝4.##P<0.01vs CORT；*P<0.05,**P<0.01vsCORT图。
图23为本发明化合物3(麻黄根酚K)、化合物4(麻黄根酚M)对皮质酮诱导的PC-12细胞损伤模型中细胞存活率的影响.n＝4.##P<0.01vs CORT；*P<0.05,**P<0.01vsCORT图。
具体实施方式
以下结合实施例和具体情况对本发明的具体实施方式予以详细说明。
本发明在具体实施中可由以下实施例给出：
一种从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物，该酚类化合物为糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J，黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M，其分子式为：麻黄根酚I：C20H20O9，麻黄根酚J：C20H20O9，麻黄根酚K：C22H18O7，麻黄根酚M：C24H18O7，其分子结构式分别为：
其制备方法是：取清除杂质的草麻黄干燥根及根茎40kg，作为原料，每次加入600L水煎煮提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩后得第一浸膏4.07kg，第一浸膏用水分散，经Diaion HP-20大孔吸附树脂柱，依次用水和不同体积浓度的乙醇进行梯度洗脱，得到水部位3.06kg、体积浓度10％乙醇部位191.82g、体积浓度20％乙醇部位180.05g、体积浓度30％乙醇部位120.12g、体积浓度40％乙醇部位147.45g、体积浓度50％乙醇部位97.80g、体积浓度70％乙醇部位53.40g、体积浓度95％乙醇部位8.73g；
50％乙醇部位97.80g用甲醇溶解，采用硅胶柱层析法以体积比的样品：硅胶＝1:1.2拌样，然后用体积比的二氯甲烷-甲醇系统：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为3.5L，2-3天/每梯度，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每50ml检识一次，合并相同流份，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6，将组分Fr.3 0.10g经硅胶柱色谱分离，以体积比的石油醚-乙酸乙酯：10:1、5:1、3:1梯度洗脱，每个梯度0.5L，3-4h/每梯度，TLC检识，合并相同流分得到组份Fr.3.1、Fr.3.2、Fr.3.3、Fr.3.4、Fr.3.5、Fr.3.6，；将组分Fr.3.462.03mg用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝54:46，流速3ml/min，收集保留时间tR＝16-18min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚K 3.06mg；收集保留时间tR＝20-22min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-2；收集保留时间tR＝35-37min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-3；化合物MHG-50-5-3-4-3(62.03mg)用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水＝27:73，流速3ml/min，收集保留时间tR＝40-42min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚M1.61mg；
经水煎煮提取后的草麻黄根再用95％乙醇使用10L的加热回流装置提取2次，每次1kg麻黄根加4L乙醇，加热回流2h，提取液减压浓缩得总浸膏10.0kg，用水分散溶解，依次用石油醚萃取5次，每次7L、二氯甲烷萃取10次，每次10L、乙酸乙酯萃取12次，每次10L，正丁醇萃取6次，每次6L，回收溶剂后得到石油醚部位211.6g、二氯甲烷部位245.1g、乙酸乙酯部位335.5g、正丁醇部位62.5g；
将乙酸乙酯部位335.5g进行硅胶柱色谱分离，采用体积比的二氯甲烷-甲醇体系：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行梯度洗脱，每个梯度6.3L，3-4天/每梯度，TLC检识并合并相同流分得到组分E1、E2～E9，E9 50.0g减压浓缩至20ml，使用Toyopearl HW-40C凝胶柱色谱，依次用体积浓度70％、80％、85％甲醇依次洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每10ml检识一次，合并相同流份，得到组份E9-1、E9-2、E9-3、E9-4～E9-8，将组分E9-4 1.25g减压浓缩至20ml，使用Toyopearl HW-40C凝胶柱色谱，用70％甲醇洗脱，用量为柱体积的7倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每5ml检识一次，合并相同流份，得到组份Er；组份Er 223.08mg用半制备HPLC粗分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝42:58，流速3ml/min收集保留时间tR＝8-10min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-1，收集保留时间tR＝13-16min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2，收集保留时间tR＝18-21min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-3，收集保留时间tR＝24-26min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-4；Er-3 10.59mg用半制备HPLC进一步分离纯化，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝40:60，流速3ml/min，收集保留时间tR＝17-19min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚I 5.58mg；组分Er-2 28.47mg用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm,孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水＝35:65，流速3ml/min，收集保留时间tR＝28-30min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2-3，Er-2-3 10.01mg用制备薄层色谱分离，展开剂为体积比的二氯甲烷：甲醇＝5:1，收集Rf最小的暗斑色带，使用体积比为二氯甲烷：甲醇＝1:1的混合液6ml洗脱1h，洗脱液浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚J 3.52mg。
按上述实施例给出的组合物，根据需要可以制得任意量的中药物，所给出的实施例仅是用于说明本发明的具体实施方式，而不是用于限制本发明的保护范围，本发明保护的技术核心是中药组合物，该中药组合物可根据实际需求，还可制成任意所需量的糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J，黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M。
本发明原料丰富，制备方法易操作，得率高，质量好，纯度高，制备的糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J，黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M具有抗抑郁活性，可有效用于治疗抑郁症，实现在制备治疗抑郁症药物中的应用，并经试验取得了非常好的有益技术效果，有关资料如下：
一、实验仪器与试药。
核磁共振用Bruker AVANCEⅢ500核磁共振仪(TMS内标)(Bruker)，红外光谱用Nicolet is 10Microscope Spectrometer(Thermo Scientific,USA)，高分辨质谱用Bruker maxis HD mass spectrometer，紫外光谱用Shimadzu UV-2401PC apparatus，高效液相色谱用Waters Alliance系列2695高效液相系统，配备2998型二极管阵列检测器，Empower3色谱数据工作站，LC50型高压制备液相色谱仪，UV200型紫外检测器[赛谱锐思(北京)科技有限公司]，YMC-Pack ODS-A色谱柱(250×10mm.D.S-5mm,12mm)(YMC有限公司)，其余有N-1100型旋转蒸发仪(上海爱朗仪器有限公司)，A-1000S型水流抽气机(上海爱朗仪器有限公司)，N-1111型冷冻水循环装置(上海爱朗仪器有限公司)，FDU-2110型冷冻干燥机(上海爱朗仪器有限公司)，DFZ-60508型真空干燥箱(上海一恒科学仪器有限公司)，AB204-N万分之一精密分析天平(METTLER TOLEDO)，iMARK型酶标仪(美国BIO-RAD)，二氧化碳培养箱(上海STIK)，超净工作台(苏净集团)。
大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞PC-12，购于中国科学院上海细胞库；皮质酮(中国上海阿拉丁生化B2302817)；氟西汀(美国Med Chem Express公司251273)；CCK8(美国GLPBIO公司43)；5-HT7抗体(中国武汉三鹰生物科技有限公司00058665)；Tubulin抗体(GR3398636-5)；DAPI染色剂(美国ABCAM公司GR3445296-5)；柱层析填料Diaion HP-20、MCIGel CHP-20P(日本三菱化学公司)，柱层析所用硅胶H(100-200目)为青岛海洋化工厂生产，所用色谱纯试剂位天津四友精细化学品有限公司生产，所用分析纯试剂为北京化工厂和天津第三化学试剂厂生产。
山羊抗兔IgG H&L(Alexa488)预吸附二抗(GR3449096-1)；山羊抗小鼠IgGH&L(Alexa594)预吸附二抗(美国ABCAM公司GR3413419-1)；RPMI1640培养基(美国Invitrogen公司2315381)；胎牛血清(南美ExCell Bio公司12A218)；
本课题所选的草麻黄根于2021年5月购自亳州药材市场，经过药学院董诚明教授鉴定为麻黄科植物草麻黄(Ephedra sinica Stapf.)干燥的根与根茎，植物标本(NO.20210517)保存于河南中医药大学中药化学提取分离实验室。
二、结构鉴定。
麻黄根酚I黄色油状(DMSO)，HR-ESI-MS给出准分子离子峰m/z:427.0992[M+Na]+(Calcd.For427.0999)，确定分子式为C20H20O9；UV(MeOH)λmax(logε):208(2.74)，249(2.65)，311(2.06)nm；IRνmax:3410，1632，1507，1109，1023cm-1；1H NMR(DMSO-d6,500MHz)和13C NMR(DMSO-d6,125MHz)数据见表1。
麻黄根酚J红色无定形粉末(DMSO)，HR-ESI-MS准分子离子峰m/z:427.1006[M+Na]+(Calcd.For427.0999)，确定分子式为C20H20O9；UV(MeOH)λmax(logε):204(2.98)，314(3.20)nm；IRνmax:3302，1615，1506，1264，1079cm-1；1H NMR(DMSO-d6,500MHz)和13C NMR(DMSO-d6,125MHz)数据见表1。
麻黄根酚K黄色无定形粉末(MeOH)，HR-ESI-MS准分子离子峰m/z:417.0959[M+H]+(Calcd.For417.0944)，分子式为C22H18O7；UV(MeOH)λmax(logε):204(4.58)、262(4.12)nm；IRνmax:3389，2923，1705cm-1；1H NMR(CD3OD,500MHz)和13C NMR(CD3OD,125MHz)数据见表2。
麻黄根酚M黄色无定形粉末(MeOH)，HR-ESI-MS准分子离子峰m/z:441.0958[M+Na]+(calcd for C24H18O7Na,441.0944)，提示化合物的分子式为C24H18O7；UV(MeOH)λmax(logε):202(4.45)，359(4.08)nm；IRνmax:3242，2922，1697cm-1；1H NMR(CD3OD,500MHz)和13C NMR(CD3OD,125MHz)数据见表2。
麻黄根酚I、麻黄根酚J、麻黄根酚K、麻黄根酚M的分子结构式如下：
表1麻黄根酚I-J的NMR波谱数据
表2麻黄根酚K和M的NMR波谱数据
a Recorded in DMSO-d6,b Recorded in CD3OD
三、活性检测。
PC-12细胞置于5％CO2，37℃恒温培养箱中，同时使用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液进行培养，从中选取最佳生长期的细胞，用0.25％的胰蛋白酶消化，终止消化后，用含10％的胎牛血清的RPMI1640配置成细胞浓度1×104，接种于96孔板上，每孔100μL细胞悬液，放入培养箱中，待细胞贴壁后，将培养基换为不含血清的培养基。饥饿24h后，PC-12细胞分为4组：正常组NC(control，RPMI1640培养基中培养)、模型组CORT(model，皮质酮)、阳性对照组FXT(氟西汀，0.4μmol·L-1)、给药组(麻黄根酚I、麻黄根酚J、麻黄根酚K、麻黄根酚M，2μmol·L-1)实验组。每组6个复孔，各组均培养24h后，更换新的培养基后，每孔加入10μL的CCK8溶液，37℃孵育1.5小时后，酶标仪450nm下检测吸光度OD值。
细胞存活率＝(给药组OD值-空白组OD值)/(正常对照组OD值-空白组OD值)×100％4.活性结果
通过使用CCK8法检测麻黄根酚I、麻黄根酚J、麻黄根酚K、麻黄根酚M对皮质酮诱导的PC-12细胞损伤模型中细胞存活率，结果如表3、4所示。模型组与正常对照组相比，细胞活力明显下降(P<0.05)；与模型组相比，麻黄根酚I、麻黄根酚J、麻黄根酚K、麻黄根酚M可以明显的提高细胞活力(P<0.01)，改善皮质酮对PC-12细胞的损伤。
表3麻黄根酚I、麻黄根酚J对皮质酮诱导的PC-12细胞损伤模型中细胞存活率的影响.n＝4。
| 组别 | 剂量(μmol·L-1) | 细胞存活率(％) |
| 正常组 | 0 | 124.25±21.02 |
| 模型组 | 800 | 60.39±7.73 |
| 阳性对照组 | 0.4 | 82.92±6.81 |
| 麻黄根酚I | 2 | 92.81±4.46 |
| 麻黄根酚J | 2 | 87.69±7.53 |
表4麻黄根酚K、麻黄根酚M对皮质酮诱导的PC-12细胞损伤模型中细胞存活率的影响.n＝4。
| 组别 | 剂量(μmol·L-1) | 细胞存活率(％) |
| 正常组 | 0 | 100±4.66 |
| 模型组 | 800 | 59.83±4.75 |
| 阳性对照组 | 0.4 | 74.99±16.48 |
| 麻黄根酚K | 2 | 115.14±8.37 |
| 麻黄根酚M | 2 | 111.84±3.28 |
由以上可以清楚看出，本发明原料丰富，制备方法易操作，产品质量好，提取效果好，得率高，纯度高达98.5％，所得化合物具有抗抑郁活性，实现在制备治疗抑郁症药物中的应用，是治疗药物上的创新，有实际的临床应用价值，开拓了麻黄根的新用途，有巨大的经济和社会效益。
Claims (4)
1.一种从麻黄根中制备的麻黄根酚类化合物，该酚类化合物为糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J，黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M，其分子结构式分别为：
，
其中，麻黄根酚I和麻黄根酚J为分子式相同的一对。
2.权利要求1所述的从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物的方法，其特征在于，取清除杂质的草麻黄干燥根及根茎，作为原料，加入原料重量体积15倍量的水，重量体积是指固体以kg计，液体以L计，采用煎煮法提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩至原料重量体积的0.100-0.102倍，得第一浸膏，第一浸膏用水分散，经Diaion HP-20大孔吸附树脂柱，依次用水和乙醇进行梯度洗脱，得到水部位、体积浓度10%乙醇部位、体积浓度20%乙醇部位、体积浓度30%乙醇部位、体积浓度40%乙醇部位、体积浓度50%乙醇部位、体积浓度70%乙醇部位、体积浓度95%乙醇部位；
将50%乙醇部位用甲醇溶解后，采用硅胶柱层析法以体积比的样品：硅胶为1:1.2拌样，然后用体积比的二氯甲烷-甲醇系统：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，2-3天/每梯度，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每50 ml检识一次，合并相同流份，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6，将组分Fr.3经100~200目的硅胶柱色谱分离，以体积比的石油醚-乙酸乙酯：10:1、5:1、3:1梯度洗脱，TLC检识，合并相同流分得组份Fr.3.1、Fr.3.2、Fr.3.3、Fr.3.4、Fr.3.5、Fr.3.6，将组分Fr.3.4用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm, 孔径12 nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=54:46，流速3ml/min，收集保留时间tR=16-18 min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚K；收集保留时间tR=20-22 min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-2；收集保留时间tR=35-37 min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-3；化合物MHG-50-5-3-4-2用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm,粒径5μm, 孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水=27:73，流速3ml/min，收集保留时间tR=40-42 min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚M；
经水煎煮提取后的草麻黄根再用体积浓度95%乙醇用加热回流装置提取2次，每次1kg麻黄根加4L乙醇，加热回流2h，合并提取液，减压浓缩得原料重量体积1/4的第二浸膏，用水分散溶解，再依次用石油醚萃取5次，每次用量为浸膏重量体积的0.7倍，用二氯甲烷萃取10次，每次用量为浸膏重量体积的1倍，用乙酸乙酯萃取12次，每次用量为浸膏重量体积的1倍，用正丁醇萃取6次，每次用量为浸膏重量体积的0.6倍，回收溶剂，得石油醚部位、二氯甲烷部位、乙酸乙酯部位、正丁醇部位；
将乙酸乙酯部位进行硅胶柱色谱分离，采用体积比的二氯甲烷-甲醇：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行梯度洗脱，3-4天/每梯度，TLC检识并合并相同流分得到组分E1、E2～E9，将组分E9减压浓缩，使用Toyopearl HW-40C凝胶柱色谱，依次用体积浓度70%、80%、85%甲醇梯度洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每10 ml检识一次，合并相同流份，得到组份E9-1、E9-2、E9-3、E9-4～E9-8；组分E9-4减压浓缩，使用Toyopearl HW-40C 凝胶柱色谱，用体积浓度70%甲醇洗脱，用量为柱体积的7倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每5ml检识一次，合并相同流份，得到组份Er；组份Er用半制备HPLC粗分离，上规格型号为：250×10mm，粒径5μm，孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=42:58，流速3ml/min，收集保留时间tR=8-10 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-1，收集保留时间tR=13-16 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2，收集保留时间tR=18-21min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-3，收集保留时间tR=24-26 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-4；Er-3用半制备HPLC进一步分离纯化，上规格型号为：250×10mm， 粒径5μm，孔径12nm的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=40:60，流速3ml/min，收集保留时间tR=17-19 min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚I；组分Er-2用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm, 孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=35:65，流速3ml/min，收集保留时间tR=28-30 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2-3；组分Er-2-3用制备薄层色谱分离，展开剂为体积比的二氯甲烷：甲醇=5:1，收集Rf最小的暗斑色带，使用体积比为二氯甲烷：甲醇=1:1的混合液6ml洗脱，洗脱液浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚J。
3. 权利要求2所述的从麻黄根中制备麻黄根酚类化合物的方法，其特征在于，取清除杂质的草麻黄干燥根及根茎40 kg，作为原料，每次加入600L水煎煮提取2次，每次2小时，合并两次提取液，减压浓缩后得第一浸膏4.07 kg，第一浸膏用水分散，经Diaion HP-20大孔吸附树脂柱，依次用水和不同体积浓度的乙醇进行梯度洗脱，得到水部位3.06 kg、体积浓度10%乙醇部位191.82 g、体积浓度20%乙醇部位180.05 g、体积浓度30%乙醇部位120.12g、体积浓度40%乙醇部位147.45 g、体积浓度50%乙醇部位97.80 g、体积浓度70%乙醇部位53.40 g、体积浓度95%乙醇部位8.73 g；
50%乙醇部位97.80 g用甲醇溶解，采用硅胶柱层析法以体积比的样品：硅胶=1:1.2拌样，然后用体积比的二氯甲烷-甲醇系统：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、1:1进行梯度洗脱，每个洗脱部位用量为3.5L，2-3天/每梯度，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每50 ml检识一次，合并相同流份，得到组份Fr.1、Fr.2、Fr.3、Fr.4、Fr.5、Fr.6，将组分Fr.3 0.10g经硅胶柱色谱分离，以体积比的石油醚-乙酸乙酯：10:1、5:1、3:1梯度洗脱，每个梯度0.5L，3-4h/每梯度，TLC检识，合并相同流分得到组份Fr.3.1、Fr.3.2、Fr.3.3、Fr.3.4、Fr.3.5、Fr.3.6，；将组分Fr.3.4 62.03mg用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm,孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=54:46，流速3ml/min，收集保留时间tR=16-18 min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚K 3.06mg；收集保留时间tR=20-22 min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-2；收集保留时间tR=35-37 min的流份，浓缩干燥，得到化合物MHG-50-5-3-4-3；化合物MHG-50-5-3-4-3（62.03mg）用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm, 孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的乙腈：水=27:73，流速3ml/min，收集保留时间tR=40-42 min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚M 1.61mg；
经水煎煮提取后的草麻黄根再用95%乙醇使用10L的加热回流装置提取2次，每次1kg麻黄根加4L乙醇，加热回流2h，提取液减压浓缩得总浸膏10.0 kg，用水分散溶解，依次用石油醚萃取5次，每次7L、二氯甲烷萃取10次，每次10L、乙酸乙酯萃取12次，每次10L，正丁醇萃取6次，每次6L，回收溶剂后得到石油醚部位211.6g、二氯甲烷部位245.1g、乙酸乙酯部位335.5g、正丁醇部位62.5g；
将乙酸乙酯部位335.5 g进行硅胶柱色谱分离，采用体积比的二氯甲烷-甲醇体系：50:1、30:1、20:1、10:1、5:1、3:1进行梯度洗脱，每个梯度6.3L，3-4天/每梯度，TLC检识并合并相同流分得到组分E1、E2～E9，E9 50.0g减压浓缩至20ml，使用Toyopearl HW-40C凝胶柱色谱，依次用体积浓度70%、80%、85%甲醇依次洗脱，每个洗脱部位用量为柱体积的10倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每10 ml检识一次，合并相同流份，得到组份E9-1、E9-2、E9-3、E9-4～E9-8，将组分E9-4 1.25g减压浓缩至20ml，使用Toyopearl HW-40C 凝胶柱色谱，用70%甲醇洗脱，用量为柱体积的7倍，采用茴香醛-浓硫酸喷雾检识，每5ml检识一次，合并相同流份，得到组份Er；组份Er 223.08 mg用半制备HPLC粗分离，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm, 孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=42:58，流速3ml/min收集保留时间tR=8-10 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-1，收集保留时间tR=13-16 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2，收集保留时间tR=18-21 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-3，收集保留时间tR=24-26 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-4；Er-3 10.59 mg用半制备HPLC进一步分离纯化，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm, 孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=40:60，流速3ml/min，收集保留时间tR=17-19 min的流份，浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚I 5.58mg；组分Er-2 28.47 mg用半制备HPLC进一步分离分离，上规格型号为：250×10mm, 粒径5μm, 孔径12 nm 的5C18-MS-Ⅱ 色谱柱，流动相为体积比的甲醇：水=35:65，流速3ml/min，收集保留时间tR=28-30 min的流份，浓缩干燥，得到组分Er-2-3，Er-2-3 10.01 mg用制备薄层色谱分离，展开剂为体积比的二氯甲烷：甲醇=5:1，收集Rf最小的暗斑色带，使用体积比为二氯甲烷：甲醇=1:1的混合液6ml洗脱1h，洗脱液浓缩干燥，得到化合物麻黄根酚J 3.52mg。
4.权利要求2或3所述方法制备的糖苷类化合物麻黄根酚I和麻黄根酚J、黄烷醇类化合物麻黄根酚K和麻黄根酚M在制备抗抑郁药物中的应用。
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