CN116570653A - 一种降脂中药组合物的醇提发酵工艺及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种降脂中药组合物的醇提发酵工艺及其应用，通过先醇提后发酵的提取工艺，该中药组合物中总黄酮提取率较高，且由该工艺制成的颗粒剂经大鼠灌胃，结果大鼠血液中槲皮素浓度达峰时间比原剂型降脂胶囊提前了30分钟，且达峰浓度高于胶囊剂。有效证明了降脂方经醇提发酵制成速效制剂后，起效更快，疗效更好。
Description
技术领域
本发明涉及医药领域，具体涉及一种降脂中药组合物的醇提发酵工艺及其应用。
背景技术
降脂方是贵州省遵义市中医院临床经验方，处方由银杏叶、海藻、山楂、水蛭、葛根和何首乌等药味组成，具有消食除痰，活血化瘀的功效，用于脾运失常所致的头晕、头痛、胸闷、四肢沉重及高血脂见上述证候者。2003年，遵义市中医院将该方研制成医疗机构制剂降脂胶囊，并获得制剂批文(批文号：黔药制Z20030209)。
降脂胶囊用于临床已20余年，治疗患者3000余例，效果显著，得到临床医生和患者肯定。但在其使用过程中，据临床医生和患者普遍反应，降脂胶囊起效较慢。究其原因，主要是降脂胶囊剂型和制备工艺致使药物有效成分溶出较慢，需要经过较长时间才能达到有效血药浓度，发挥治疗效果。
(1)胶囊剂采用明胶空心胶囊填充药物，明胶空心胶囊进入胃后，需要15分钟左右才能崩解，释放药物。
(2)降脂胶囊制备工艺为将处方中六味药材粉碎成细粉，过筛，混匀，装入胶囊即得。由于生药粉没有经过有效成分提取，生药粉进入胃后，需要经过胃蠕动，在胃液中缓慢释放有效成分，再经过胃黏膜吸收后才能进入血液发挥疗效。
因此，在胶囊壳需要崩解才能释放药物，而药物还需要消化吸收才能进入血液双重过程的影响下，降脂胶囊起效慢就成了必然。
降脂胶囊治疗的症状是脾运失常所致的头晕、头痛、胸闷，由于上述症状往往发病较急，临床上宜采用速效制剂。因此，鉴于降脂胶囊临床疗效的显著性和安全性，有必要对降脂胶囊的剂型和制备工艺进行改进和提高，达到提质增效的目的。
为了解决以上降脂胶囊疗效发挥慢的技术问题，发明团队通过了系列的研究，将降脂方处方中药材采用了醇提和发酵提取结合的提取工艺，使黄酮类有效成分提取效率达到了71.26％，且处方中药材经醇提发酵工艺制成口服制剂后，经大鼠灌胃，结果大鼠血液中槲皮素浓度达峰时间比降脂胶囊提前了30分钟，且达峰浓度高于胶囊剂。说明降脂方经醇提发酵制成速效制剂后，起效更快，疗效更好。解决了原有降脂胶囊制备工艺直接将处方中六味药材粉碎成细粉，造成发挥疗效慢的技术问题。
发明内容
本发明的目的是为了一种降脂中药组合物的醇提发酵工艺及其应用。
本发明所述中药组合物的组方由银杏叶16份、海藻8份、山楂8份、水蛭2份、葛根2份、何首乌4份组成。
本发明所述组合物的醇提发酵工艺为：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量6-12倍浓度为40％-90％的乙醇，加热提取1-3次，每次提取0.5-2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10-20％的葡萄糖，接种双歧杆菌发酵4-6天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏，再加入药学上可以接受的辅料，制成药学上可接受的制剂。
优选的，
本发明所述组合物的醇提发酵工艺为：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8-10倍浓度为50％-80％的乙醇，加热提取1-2次，每次提取1-2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10-15％的葡萄糖，接种双歧杆菌发酵4-5天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏，再加入药学上可以接受的辅料，制成药学上可接受的制剂。
进一步优选的，
本发明所述组合物的醇提发酵工艺为：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8倍浓度为60％的乙醇，加热提取1次，每次提取1小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏，再加入药学上可以接受的辅料，制成药学上可接受的制剂。
本发明所述接种双歧杆菌，接菌量为6.5×106CFU/mL以上。
本发明所述的发酵，温度为30-40℃。
优选的，
本发明所发酵,温度为35-40℃。
本发明所发酵,温度为40℃。
本发明所述制剂可以为固体制剂和液体制剂。
本发明所述固体制剂为颗粒剂、滴丸。
本发明所述液体制剂为口服液。
本发明所述醇提发酵工艺制备的降脂中药组合物在头晕、头痛、胸闷、四肢沉重及高血脂方面的应用。
本发明所述的份是本领域的常规单位，可以是g、kg等。
有益效果：
1、本申请工艺通过了水和醇提取前和提取后总黄酮提取率考察，结果显示水提取总黄酮提取率为19.61％，醇提取总黄酮提取率为41.11％，故醇提取优于水提取。
2、本申请通过了发酵提取菌株双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母和红曲霉的考察，结果显示双歧杆菌发酵提取总黄酮提取率最高，明显优于其它3种菌株，因此选择双歧杆菌为发酵菌株。
3、本申请通过了发酵工艺最佳参数考察，结果显示加入药材量总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌后，在40℃下发酵4天，总黄酮提取率为49.83％。
4、本申请通过了复合提取工艺考察，结果显示：先醇提后发酵，总黄酮平均提取率为71.26％；先发酵后醇提，总黄酮平均提取率为56.63％；故先醇提后发酵工艺总黄酮提取率明显高于先发酵后醇提，通过复合提取，处方中总黄酮提取率大幅上升，其中先醇提后发酵工艺总黄酮提取率达到71.26％，提取效果理想，可以作为降脂方的提取工艺。
5、本发明工艺制备的降脂颗粒通过了药效学评价研究，不同制剂灌胃后槲皮素在大鼠血浆中的浓度变化结果表明，降脂方经醇提发酵工艺处理制成的颗粒剂，大鼠灌胃后槲皮素的血药浓度30min即达峰值，而降脂胶囊槲皮素的血药浓度峰值为1小时，且峰值血药浓度颗粒剂明显大于胶囊剂，说明降脂方经醇提发酵工艺制成口服制剂后，和原处方药材粉碎制成胶囊剂相比，起效更快，且疗效好。
说明书附图
图1芦丁光谱扫描图；
图2大鼠血浆中槲皮素RP-HPLC色谱图(A:空白血浆B:含标准品血浆C:含药血浆)；
图3大鼠血浆中槲皮素的血药浓度-时间曲线。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8倍浓度为60％的乙醇，加热提取1次，每次提取1小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为40℃下发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏用水稀释，加入苯甲酸钠2g，充分搅拌混合均匀后定容至1000mL，得口服液。
实施例2
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量6倍浓度为40％的乙醇，加热提取次，每次提取0.5小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为30℃下发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏用水稀释，加入苯甲酸钠2g，充分搅拌混合均匀后定容至1000mL，得口服液。
实施例3
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量12倍浓度为90％的乙醇，加热提取3次，每次提取2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量20％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为40℃下发酵6天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏用水稀释，加入苯甲酸钠2g，充分搅拌混合均匀后定容至1000mL，得口服液。
实施例4
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量10倍浓度为50％的乙醇，加热提取2次，每次提取1.5小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量15％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为35℃下发酵5天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏用水稀释，加入苯甲酸钠2g，充分搅拌混合均匀后定容至1000mL，得口服液。
实施例5
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8倍浓度为60％的乙醇，加热提取1次，每次提取1小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为40℃下发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量淀粉，制粒，干燥，整粒，制成1000g颗粒，得颗粒剂。
实施例6
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量6倍浓度为40％的乙醇，加热提取次，每次提取0.5小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为30℃下发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量淀粉，制粒，干燥，整粒，制成1000g颗粒，得颗粒剂。
实施例7
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量12倍浓度为90％的乙醇，加热提取3次，每次提取2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量20％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为40℃下发酵6天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量淀粉，制粒，干燥，整粒，制成1000g颗粒，得颗粒剂。
实施例8
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量10倍浓度为50％的乙醇，加热提取2次，每次提取1.5小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量15％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为35℃下发酵5天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量淀粉，制粒，干燥，整粒，制成1000g颗粒，得颗粒剂。
实施例9
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8倍浓度为60％的乙醇，加热提取1次，每次提取1小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为40℃下发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量聚乙二醇4000，滴制成1000g，得滴丸剂。
实施例10
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量6倍浓度为40％的乙醇，加热提取次，每次提取0.5小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为30℃下发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量聚乙二醇4000，滴制成1000g，得滴丸剂。
实施例11
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量12倍浓度为90％的乙醇，加热提取3次，每次提取2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量20％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为40℃下发酵6天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量聚乙二醇4000，滴制成1000g，得滴丸剂。
实施例12
组方：银杏叶160g、海藻80g、山楂80g、水蛭20g、葛根20g、何首乌40g。
醇提发酵工艺：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量10倍浓度为50％的乙醇，加热提取2次，每次提取1.5小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量15％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量6.5×106CFU/mL以上，温度为35℃下发酵5天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏。
(5)制剂：将稠膏加入适量聚乙二醇4000，滴制成1000g，得滴丸剂。
实验例：为了进一步验证本发明的可行性，发明人进行了一系列的实验，具体如下：
1提取工艺研究
降脂方处方由银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g组成，经查阅相关资料表明，该处方发挥治疗高血脂作用的物质基础主要为黄酮类成分。为了优选降脂方最佳提取方法及其工艺参数，本发明团队以处方中黄酮类有效成分提取率为考察指标，通过试验比较水提工艺、醇提工艺、醇提发酵工艺和复合提取工艺等4种不同提取工艺，最终优选出最佳提取工艺。
1.1黄酮类有效成分提取率测定方法
采用紫外分光光度法测定
1.1.1检测波长的确定
精密量取芦丁对照品2ml，置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，于400-800nm波长下进行光谱扫描。结果对照品溶液在500nm处具有较大吸收(见图1)，故确定检测波长为500nm。
1.1.2对照品溶液的制备
取芦丁对照品50mg，精密称定，置25ml量瓶中，加甲醇适量，置水浴上微热使溶解，放冷，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀，即得(每1ml中含芦丁0.2mg)。
1.1.3标准曲线的制备
精密量取对照品溶液1ml、2ml、3ml、4ml、5ml与6ml，分别置25ml量瓶中，各加水至6.0ml，加5％亚硝酸钠溶液1ml，混匀，放置6分钟，加10％硝酸铝溶液1ml，摇匀，放置6分钟，加氢氧化钠试液10ml，再加水至刻度，摇匀，放置15分钟，以相应的试剂为空白，照紫外-可见分光光度法，在500nm波长处测定吸光度，以吸光度为纵坐标，浓度为横坐标，绘制标准曲线。
1.1.4测定法
1.1.4.1提取前总黄酮含量
取降脂方粗粉约2g，精密称定，置索氏提取器中，加乙醚适量，加热回流至提取液无色，放冷，弃去乙醚液。再加甲醇90ml，加热回流至提取液无色，转移至100ml量瓶中，用甲醇少量洗涤容器，洗液并入同一量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀。精密量取10ml，置100ml量瓶中，加水至刻度，摇匀。精密量取3ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加水至6.0ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的重量(μg)，计算，即得降脂方提取前总黄酮含量。
1.1.4.2提取后总黄酮含量
精密量取提取液5ml，置25ml量瓶中，照标准曲线制备项下的方法，自“加5％亚硝酸钠溶液1ml”起，依法测定吸光度，从标准曲线上读出供试品溶液中含芦丁的重量(μg)，计算，即得降脂方提取后总黄酮含量。
1.1.4.3总黄酮提取率
总黄酮提取率＝提取后总黄酮含量÷提取前总黄酮含量×100％
2 水提工艺研究
2.1 正交试验优选
选取加水量(因素A)、提取时间(因素B)、提取次数(因素C)为考察因素，采用正交试验筛选最佳水提工艺参数，因素与水平见表1，正交设计及试验结果见表2，方差分析结果见表3。
表1水提工艺正交试验因素与水平表
| 水平 | 因素A(倍) | 因素B(小时) | 因素C(次) |
| 1 | 6 | 0.5 | 1 |
| 2 | 8 | 1 | 2 |
| 3 | 10 | 2 | 3 |
表2水提工艺正交试验设计及结果表
表3水提工艺方差分析结果
| 方差来源 | 离差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
| A | 44.39 | 2 | 22.19 | 56.46 | 显著 |
| B | 22.98 | 2 | 11.49 | 29.22 | 显著 |
| C | 11.84 | 2 | 5.92 | 15.07 | 不显著 |
| D(误差) | 0.79 | 2 | 0.39 |
注:F0.05(2，2)＝19
从表2正交试验结果可知，各因素对水提取效果的影响大小为A＞B＞C，且A3＞A2＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，最佳水提工艺参数为A3B3C3，结合方差分析表3中可以看出，3个因素中A、B有显著性差异，C因素无显著性影响，由于A因素中A3和A2接近，从节约成本的角度考虑，水提工艺最佳参数可调整为A2B3C1，即加8倍水煎煮1次，煎煮时间为2小时。
2.2水提工艺最佳参数验证
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共3份，分别按前述优选出的最佳水提工艺参数进行水煎煮提取后，提取液用水稀释并定容至1000ml。测定总黄酮提取率，结果见表4。
表4最佳水提工艺参数验证结果
验证结果表明，经正交试验优选得的最佳水提工艺参数提取降脂方，总黄酮提取率为19.61％。
3醇提工艺研究
3.1乙醇浓度考察
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共4份，分别用8倍量40％、60％、80％和90％的乙醇加热提取1小时，提取液过滤后用相应浓度的乙醇稀释并定容至1000ml。测定总黄酮提取率，结果见表5。
表5乙醇浓度考察结果
| 试验号 | 乙醇浓度(％) | 加醇量(倍) | 提取时间(小时) | 总黄酮提取率(％) |
| 1 | 40 | 8 | 1 | 30.22 |
| 2 | 60 | 8 | 1 | 41.23 |
| 3 | 80 | 8 | 1 | 43.47 |
| 4 | 90 | 8 | 1 | 43.86 |
试验结果表明，当乙醇浓度大于60％后，处方中黄酮的提取率增加不多，为了节约生产成本，降低乙醇使用量，选择60％乙醇作为提取溶剂。
3.2正交试验优选
选取加醇量(因素A)、提取时间(因素B)、提取次数(因素C)为考察因素，采用正交试验筛选最佳醇提工艺参数，因素与水平见表6，正交设计及试验结果见表7，方差分析结果见表8。
表6醇提工艺正交试验因素与水平表
| 水平 | 因素A(倍) | 因素B(小时) | 因素C(次) |
| 1 | 6 | 0.5 | 1 |
| 2 | 8 | 1 | 2 |
| 3 | 10 | 2 | 3 |
表7醇提工艺正交试验设计及结果表
表8醇提工艺方差分析结果
注:F0.05(2，2)＝19
从表7正交试验结果可知，各因素对醇提取效果的影响大小为A＞B＞C，且A2＞A3＞A1，B3＞B2＞B1，C3＞C2＞C1，最佳醇提工艺参数为A2B3C3，结合方差分析表8中可以看出，3个因素中A、B有显著性差异，C因素无显著性影响，由于B因素中B3和B2接近，从节约成本的角度考虑，醇提工艺最佳参数可调整为A2B2C1，即加8倍60％乙醇提取1次，提取时间为1小时。
3.3醇提工艺最佳参数验证
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共3份，分别按前述优选出的最佳醇提工艺参数进行提取后，提取液用60％乙醇稀释并定容至1000ml。测定总黄酮提取率，结果见表9。
表9最佳醇提工艺参数验证结果
验证结果表明，经正交试验优选得的最佳醇提工艺参数提取降脂方，总黄酮提取率为41.11％。
4醇提发酵工艺研究
4.1发酵菌株优选
中药发酵菌株主要有细菌和真菌两大类。
细菌发酵方式多样，代谢产物丰富，且特殊代谢途径普遍，同时具有结构简单、对环境敏感、易于改良等特点。常用的菌种主要有双歧杆菌、青春双歧杆菌、嗜热链球菌、保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌等。
真菌具有物种种类齐全、培养条件简单、生长环境要求低、次生代谢产物丰富等诸多优点。同时，真菌还可在其生长过程中产生某些具有较强分解作用的特殊酶系，能有效分解脂类、蛋白质、淀粉及纤维素等营养物质，常被当做中药发酵的主要功能菌种，主要有酿酒酵母、卡式酵母、蝙蝠蛾拟青霉和红曲霉等。
根据细菌和真菌的发酵特点，结合文献检索资料，本试验选择双歧杆菌、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母和红曲霉作为重点筛选菌株开展如下试验：
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共取4份，分别混匀后粉碎成粗粉，分别加入药材总量8倍的水，煮沸后冷却，再分别加入药材量总量10％的葡萄糖，第一份接种双歧杆菌、第二份保加利亚乳杆菌，第三份接种酿酒酵母，第四份接种红曲霉，接菌量均为6.5×106CFU/mL，在40℃下发酵4天，离心过滤，滤液稀释并定容至1000mL。按前述方法测定有效成分提取率，结果见表10。
表10不同菌株发酵提取法总黄酮提取率
| 试验号 | 菌株 | 发酵温度(℃) | 发酵时间(天) | 总黄酮提取率(％) |
| 1 | 双歧杆菌 | 40 | 4 | 48.43 |
| 2 | 保加利亚乳杆菌 | 40 | 4 | 40.16 |
| 3 | 酿酒酵母 | 40 | 4 | 35.57 |
| 4 | 红曲霉 | 40 | 4 | 42.33 |
试验结果表明，在选择的4种菌株中，双歧杆菌发酵提取总黄酮提取率最高，明显优于其它3种菌株，因此选择双歧杆菌为发酵菌株。
4.2正交试验优选
选取葡萄糖用量(因素A)、发酵温度(因素B)、发酵时间(因素C)为考察因素，采用正交试验筛选最佳醇提发酵工艺条件。因素与水平见表11，正交设计及试验结果见表12，方差分析结果见表13。
表11发酵工艺正交试验因素与水平表
表12发酵工艺正交试验设计及结果表
| 编号 | 因素A | 因素B | 因素C | 误差D | 总黄酮提取率(％) |
| 1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 20.25 |
| 2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 34.67 |
| 3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 38.84 |
| 4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 45.21 |
| 5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 48.20 |
| 6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 42.35 |
| 7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 48.32 |
| 8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 38.26 |
| 9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 50.29 |
| K1 | 93.76 | 113.78 | 100.86 | 118.74 | |
| K2 | 138.87 | 121.13 | 133.28 | 122.23 | |
| K3 | 133.76 | 131.48 | 132.25 | 125.42 | |
| R | 45.11 | 17.70 | 32.42 | 6.68 |
表13发酵工艺方差分析结果
| 方差来源 | 离差平方和 | 自由度 | 均方 | F值 | 显著性 |
| A | 406.78 | 2 | 203.39 | 54.66 | |
| B | 52.71 | 2 | 26.36 | 7.08 | * |
| C | 226.38 | 2 | 113.19 | 30.42 | * |
| D(误差) | 7.44 | 2 | 3.72 |
注:F0.05(2，2)＝19
从表12正交试验结果可知，醇提发酵工艺中各因素对提取效果的影响大小为A＞C＞B，且A2＞A3＞A1，C2＞C3＞C1，B3＞B2＞B1，从方差分析表13中可以看出，A、C因素对醇提发酵工艺有显著影响，B因素无显著性影响，结合生产周期和生产成本考虑，可选择工艺最佳参数为A2B3C2，即加入药材量总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌后，在40℃下发酵4天。
4.3发酵工艺最佳参数验证
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共3份，分别按前述优选出的最佳发酵工艺参数进行提取后，提取液用水稀释并定容至1000ml。测定总黄酮提取率，结果见表14。
表14最佳发酵工艺参数验证结果
验证结果表明，经正交试验优选得的最佳发酵工艺参数提取降脂方，总黄酮提取率为49.83％。
5复合提取工艺研究
在前述3种提取工艺中，总黄酮提取率从大到小依次为发酵提取、乙醇提取和水提取，单一的提取方式处方中总黄酮提取率均未超过50％，为了增加总黄酮提取率，可考虑采用复合提取的方式，即选用前述提取效率较高的两种提取方法发酵提取和乙醇提取结合。
本发明团队按前述优选出的最佳乙醇提取和最佳醇提发酵工艺参数进行复合提取试验，比较了先醇提后发酵和先发酵后醇提两种复合提取方法。具体操作如下：
5.1先醇提后发酵
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共3份，分别加8倍量60％乙醇提取1小时，过滤，滤液回收乙醇，得醇提液；药渣加入药材总量8倍的水，再分别加入药材量总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量均为6.5×106CFU/mL，在40℃下发酵4天，离心过滤，滤液和醇提液合并，稀释并定容至1000mL。测定总黄酮提取率，结果见表15。
5.2先发酵后醇提
按处方比例取银杏叶16g、海藻8g、山楂8g、水蛭2g、葛根2g、何首乌4g，共3份，加入药材总量8倍的水，煮沸后冷却至常温，再分别加入药材量总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌，接菌量均为6.5×106CFU/mL，在40℃下发酵4天，离心过滤，得发酵滤液；药渣分别加8倍量60％乙醇提取1小时，过滤，滤液回收乙醇，得醇提液；将发酵滤液和醇提液合并，稀释并定容至1000mL。测定总黄酮提取率，结果见表15。
表15复合提取法总黄酮提取率
试验结果表明，两种复合提取工艺相比，先醇提后发酵工艺总黄酮提取率明显高于先发酵后醇提，通过复合提取，处方中总黄酮提取率大幅上升，其中先醇提后发酵工艺总黄酮提取率达到71.26％，提取效果理想，可以作为降脂方的提取工艺。
6药效评价
银杏叶是降脂方中君药，黄酮类成分是其主要有效成分，槲皮素是银杏叶黄酮类成分中的一种。为了验证经醇提发酵工艺优越性，本研究团队参照潘瑜等发表于浙江医学2016年第38卷第19期《RP-HPLC法测定大鼠血浆中槲皮素含量》方法，将降脂胶囊原生药粉和经醇提发酵工艺制成的降脂颗粒分别对大鼠灌胃，以大鼠灌胃后血液中槲皮素的浓度变化值为指标来评判两种工艺的优劣。
6.1实验方法
6.1.1色谱条件
色谱柱：Hypersil ODS C18(250mm×4.6mm，5μm)；流动相：甲醇-0.5％磷酸水(60∶40)；流速：1.0ml/min；柱温：25℃；检测波长：360nm；进样量：20μl。
6.1.2给药及采血
10只SD大鼠，随机分成2组，禁食不禁水12h，一组灌胃给予降脂颗粒，另一组按照同等生药剂量灌胃给予降脂胶囊。于灌胃后0、10min、20min、30min、45min、1h、1.5h、2h、4h、8h和12h尾静脉取血，每次约0.5ml，置于肝素化离心管中，13000r/min离心10min，分离血浆，-20℃保存待测。
6.1.3血浆样品处理
取血浆室温下冻融，准确吸取甲醇1ml于10ml具塞试管中，加入10mol/L的盐酸0.4ml，混匀后精密吸取待测大鼠血浆样品200μl加入其中，密闭涡旋之后于90℃水浴5h，冷却后精密加入2ml乙酸乙酯，涡旋(5000r/min)10min，转移上清液于另一刻度离心管中，氮气吹扫仪中吹干。用200μl甲醇复溶，过滤，进样20μl进行RP-HPLC分析。
6.1.4结果
6.1.4.1色谱行为
空白血浆、含药血浆和含标准品血浆的色谱如图2所示，组分色谱峰充分分离，不受内源性杂质峰干扰。
6.1.4.2槲皮素在大鼠体内的血药浓度测定
大鼠灌胃降脂胶囊和降脂颗粒后，于不同时间点采集的血样，检测槲皮素血药浓度，结果见表16，槲皮素在大鼠血浆中的血药浓度-时间曲线见图3。
表16不同制剂灌胃后槲皮素在大鼠血浆中的浓度变化表
| 组别 | 0min | 10min | 20min | 30min | 45min | 1h | 1.5h | 2h | 4h | 8h | 12h |
| 颗粒剂 | 0 | 0.33 | 3.26 | 9.48 | 8.14 | 6.22 | 5.36 | 3.18 | 2.29 | 1.47 | 0.23 |
| 胶囊剂 | 0 | 0.01 | 1.35 | 3.58 | 5.67 | 7.21 | 5.79 | 4.33 | 1.87 | 1.14 | 0.12 |
不同制剂灌胃后槲皮素在大鼠血浆中的浓度变化结果表明，降脂方经醇提发酵工艺处理制成的颗粒剂，大鼠灌胃后槲皮素的血药浓度30min即达峰值，而降脂胶囊槲皮素的血药浓度峰值为1小时，且峰值血药浓度颗粒剂明显大于胶囊剂，说明降脂方经醇提发酵工艺制成口服制剂后，和原处方药材粉碎制成胶囊剂相比，起效更快，且疗效好。
虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的，因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
Claims (10)
1.一种降脂中药组合物的醇提发酵工艺，所述中药组合物的组方由银杏叶16份、海藻8份、山楂8份、水蛭2份、葛根2份、何首乌4份组成，其特征在于，所述组合物的醇提发酵工艺为：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量6-12倍浓度为40％-90％的乙醇，加热提取1-3次，每次提取0.5-2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10-20％的葡萄糖，接种双歧杆菌发酵4-6天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏，再加入药学上可以接受的辅料，制成药学上可接受的制剂。
2.根据权利要求1所述的醇提发酵工艺，其特征在于，所述组合物的醇提发酵工艺为：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8-10倍浓度为50％-80％的乙醇，加热提取1-2次，每次提取1-2小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10-15％的葡萄糖，接种双歧杆菌发酵4-5天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏，再加入药学上可以接受的辅料，制成药学上可接受的制剂。
3.根据权利要求2所述的醇提发酵工艺，其特征在于，所述组合物的醇提发酵工艺为：
(1)称取药材：按组方比例称取各药材，混匀；
(2)醇提：加入药材总量8倍浓度为60％的乙醇，加热提取1次，每次提取1小时，过滤，滤液浓缩并回收乙醇，得醇提浓缩液；
(3)发酵：将醇提后的药渣加入药材总量8倍的水，再加入药材总量10％的葡萄糖，接种双歧杆菌发酵4天，离心过滤，得发酵提取液；
(4)浓缩：将醇提浓缩液和发酵提取液合并后浓缩至稠膏，再加入药学上可以接受的辅料，制成药学上可接受的制剂。
4.根据权利要求1-3任一项所述的醇提发酵工艺，其特征在于，步骤(3)所述的接种双歧杆菌，接菌量为6.5×106CFU/mL以上。
5.根据权利要求1-3任一项所述的醇提发酵工艺，其特征在于，步骤(3)所述的发酵，温度为30-40℃。
6.根据权利要求5所述的醇提发酵工艺，其特征在于，步骤(3)所发酵,温度为35-40℃。
7.根据权利要求6所述的醇提发酵工艺，其特征在于，步骤(3)所发酵,温度为40℃。
8.根据权利要求1-3任一项所述的醇提发酵工艺，其特征在于，步骤(4)所述制剂可以为固体制剂和液体制剂。
9.根据权利要求8所述的醇提发酵工艺，其特征在于，所述固体制剂为颗粒剂、滴丸；所述液体制剂为口服液。
10.根据权利要求1-3任一项所述的醇提发酵工艺，其特征在于，所述醇提发酵工艺制备的降脂中药组合物在头晕、头痛、胸闷、四肢沉重及高血脂方面的应用。
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