CN116568812A - 用于t细胞工程化的组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

本公开涉及工程化免疫细胞及其用途。本公开提供了包含CAR或工程化TCR的工程化免疫细胞。当将本公开的工程化免疫细胞施用于受试者时，其可以抑制宿主免疫细胞例如T细胞和/或NK细胞，并增强工程化免疫细胞在体内的存活和持久性，从而表现出更有效的肿瘤杀伤活性。

Description

用于T细胞工程化的组合物和方法
背景技术
嵌合抗原受体T细胞(也称为CAR T细胞)是经过基因工程化以产生人工受体的T细胞，用于免疫疗法。第一种CAR T细胞在1987年由Yoshikazu Kuwana开发，随后在1989年由Gideon Gross和Zelig Eshhar在以色列的Weizmann Institute开发。
嵌合抗原受体(CAR，也称为嵌合免疫受体)是如下受体蛋白：其经过工程化以赋予T细胞靶向特定蛋白质的新能力。这些受体是嵌合的，因为它们将抗原结合和T细胞激活功能结合到单个受体中。CAR由四个基本区域组成：抗原识别结构域、细胞外铰链区、跨膜结构域和细胞内T细胞信号传导结构域。随着时间的推移，工程化CAR的复杂度不断提高，根据其组成被称为第一代、第二代、第三代和第四代CAR。
由于有强大的抗肿瘤作用，肿瘤特异性CAR T细胞的产生越来越受到关注。然而，临床研究表明，它们同时可能引起严重的副作用，如细胞因子释放综合征(CRS)。
发明内容
本文认识到需要用于基因修饰免疫细胞进行细胞疗法的改进的组合物和方法。本文还认识到需要具有改进功能的修饰的CAR。本公开解决了这些需求并且还提供了额外优势。
在一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域结合CD7。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述CAR进一步包含第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，所述第二铰链结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。在一些实施方案中，所述第二铰链结构域源自于CD8。在一些实施方案中，所述第二铰链结构域包含SEQ ID NO.17或SEQ ID NO.18的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域源自于CD8。在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域包含SEQ ID NO.19的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述第二共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，所述第二CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。在一些实施方案中，所述接头是可切割接头。在一些实施方案中，所述接头是自切割肽。在一些实施方案中，所述可切割接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步包含增强子部分，所述增强子部分能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
在一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于4-1BB。在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。在一些实施方案中，所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。在一些实施方案中，所述CAR进一步包含第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于4-1BB。
在一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
在一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含：(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
在一些实施方案中，所述铰链结构域源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，所述ITAM3包含YXXL/I-X7-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQID NO.2的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.3的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.4的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含至少ITAM1和ITAM2。在一些实施方案中，所述ITAM1包含YXXL/I-X7-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。在一些实施方案中，所述ITAM2包含YXXL/I-X8-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.9的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.10的氨基酸序列。在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。在一些实施方案中，所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。在一些实施方案中，所述增强子部分通过自寡聚化自激活。在一些实施方案中，所述增强子部分通过自二聚化自激活。在一些实施方案中，所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。在一些实施方案中，所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19、TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。在一些实施方案中，所述增强子部分用作反式激活因子或顺式激活因子。
在一些实施方案中，所述增强子经由接头连接至所述CAR。在一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头是自切割肽。在一些实施方案中，所述可切割的接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。在一些实施方案中，所述增强子部分连接至所述诱导型细胞死亡部分。在一些实施方案中，所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。在一些实施方案中，所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些实施方案中，所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。在一些实施方案中，所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。在一些实施方案中，所述细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些实施方案中，所述T细胞是αβT细胞或γδT细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞源自于干细胞。在一些实施方案中，所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞获自患有病况的受试者。在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞获自健康供体。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含：(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
在一些实施方案中，所述铰链结构域源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，所述跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。在一些实施方案中，所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含：(i)功能灭活的T细胞受体(TCR)，和(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含：(i)功能灭活的T细胞受体(TCR)，和(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含：(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；(ii)包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含：(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；(ii)包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列，并且所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列，并且所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。在一些实施方案中，所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ IDNo.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。
在另一方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，其包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ IDNo.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。在一些实施方案中，所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。在一些实施方案中，所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域结合CD7。
在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述CAR进一步包括第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，所述第二铰链结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。在一些实施方案中，所述第二铰链结构域源自于CD8。在一些实施方案中，所述第二铰链结构域包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域源自于CD8。在一些实施方案中，所述第二跨膜结构域包含SEQ ID NO.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述第二共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，所述第二CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。在一些实施方案中，所述接头是可切割的接头。在一些实施方案中，所述接头是自切割肽。在一些实施方案中，所述可切割的接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步包含增强子部分，所述增强子部分能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性。
在一些实施方案中，所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于4-1BB。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在一些实施方案中，所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
在一些实施方案中，所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。
在一些实施方案中，所述CAR进一步包括第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ胞内信号传导结构域。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。
在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。在一些实施方案中，所述共刺激结构域源自于4-1BB。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
在一些实施方案中，所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。在一些实施方案中，所述抗原结合结构域结合CD7。
在另一方面，提供了一种工程化免疫细胞，其包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
通过下面的详细描述，本公开的其他方面和优点对于本领域技术人员将变得显而易见，其中，仅示出和描述了本公开的说明性实施方案。如将会认识到的，本公开能够具有其他和不同的实施方案，并且其若干细节能够在各种明显的方面进行修改，所有这些都不脱离本公开。因此，附图和描述本质上应被认为是说明性的，而不是限制性的。
援引并入
本说明书中提到的所有出版物、专利和专利申请都通过引用并入本文，其程度如同每个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用并入本文。在通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相抵触的程度而言，本说明书旨在取代和/或优先于任何此类相抵触的材料。
附图说明
本发明的新颖特征在所附权利要求书中具体地阐述。通过参考以下对其中利用本发明的原理的说明性实施方案加以阐述的详细描述和附图(在本文也称为“图(Figure)”和“图(FIG.)”)将获得对本发明的特征和优点的更好理解，在附图中：
图1A、图1B、图1C和图1D示出了具有本申请的修饰结构的CAR的示例性设计。
图2示出了具有本申请的修饰结构的CAR T细胞的体外杀伤活性。
图3示出了具有本申请的修饰结构的CAR T细胞的细胞因子释放。
图4示出了小鼠中的CAR T细胞的体内抗肿瘤活性。
图5示出了具有本申请的修饰结构的双重CAR在T细胞中的表达。
图6示出了具有本申请的修饰结构的双重CAR T细胞针对表达CD7或CD19的Hela细胞的杀伤效力。
图7示出了具有本申请的修饰结构的双重CAR T细胞针对CCRF和Nalm6细胞的杀伤效力。
图8示出了具有本申请的修饰结构的双重CAR T细胞的细胞因子释放。
图9示出了流式细胞术图，显示了具有修饰结构18-21的CAR T细胞中的CAR表达。在转导后8天，全部CAR T细胞都展示了通过CD19或CD7抗原测量的良好的CD19 CAR和CD7CAR表达。
图10示出了具有修饰结构18-21的双重CAR T的细胞杀伤效力，如从萤光素酶测定所测量的。将CCRF-CEM细胞(急性淋巴母细胞性白血病细胞系)、Nalm6细胞(B细胞前体白血病细胞系)或初代T细胞与包含修饰结构18-21的双重CAR T细胞以5:1、1:1或1:5的比例混合。在多个时间点测量细胞杀伤效力。
图11a和图11b示出了具有修饰结构18-21的双重CAR T细胞在杀伤癌细胞时的细胞因子释放(图11a，CCRF细胞；和图11b，Nalm6细胞)。用与双重CAR T细胞以1:1比例混合的CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞在24小时后进行细胞因子测量。用流式微珠阵列(CBA)测量细胞因子。
图12示出了具有修饰结构18-21的双重CAR T细胞的增殖，该增殖是通过将双重CAR T细胞与CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞以1:3比例混合而刺激的。在CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞的每轮杀伤后测量双重CAR T细胞的增殖。
具体实施方式
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的各个实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为示例提供。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员可以想到许多变化、改变和替换。应当理解，可以采用本文所述的本发明的实施方案的各种替代方案。
定义
如本文所用，术语“约”是指对于所确定的特定值或组成在可接受的公差范围内的值或组成，这将部分取决于如何测量或测量该值或组成，即，测量系统的局限性。例如，按照本领域的实践，“约”可以表示在1或大于1的标准偏差之内。或者，“约”可以表示给定值的至多20％、至多10％、至多5％或至多1％的范围。或者，特别是关于生物系统或过程，该术语可表示在一个数量级内，优选地在值的5倍之内，更优选地在值的2倍之内。在本申请和权利要求书中描述了特定值的情况下，除非另有说明，否则应假设术语“约”表示在特定值的可接受的误差范围内。
如本文所用，术语“施用”是指使用多种方法和递送系统中的任何一种将本公开的产品物理地引入受试者中，包括静脉内、肌内、皮下、腹膜内、脊髓或其他肠胃外施用途径，例如通过注射或输注。
如本文所用，术语“抗原”是指能够被选择性结合剂结合的分子或其片段。例如，抗原可以是可被选择性结合剂例如受体结合的配体。作为另一个实例，抗原可以是可被选择性结合剂例如免疫蛋白(例如抗体)结合的抗原分子。抗原也可以指能够在动物中使用以产生能够与该抗原结合的抗体的分子或其片段。在一些情况下，抗原可以结合至底物(例如细胞膜)。或者，抗原可以不与底物结合(例如，分泌的分子，例如分泌的多肽)。
如本文所用，术语“抗体(Ab)”包括但不限于特异性结合抗原并包含通过二硫键互连的至少两条重(H)链和两条轻(L)链的免疫球蛋白、或其片段。每条H链包含重链可变区(本文缩写为VH)和重链恒定区。重链恒定区包含三个恒定结构域CH1、CH2和CH3。每条轻链包含轻链可变区(在本文中缩写为VL)和轻链恒定区。轻链恒定区包括恒定结构域CL。VH和VL区可以进一步细分为称为互补决定区(CDR)的高变区，其间散布有称为构架区(FR)的更保守区。每个VH和VL包含三个CDR和四个FR，从氨基末端到羧基末端按以下顺序排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。重链和轻链的可变区包含与抗原相互作用的结合结构域。
如本文所用，术语“核苷酸”通常是指碱基-糖-磷酸的组合。核苷酸可以包含合成核苷酸。核苷酸可包含合成核苷酸类似物。核苷酸可以是核酸序列的单体单元(例如，脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA))。术语核苷酸可以包括核糖核苷三磷酸腺苷三磷酸(ATP)、尿苷三磷酸(UTP)、胞嘧啶三磷酸(CTP)、鸟苷三磷酸(GTP)和脱氧核苷三磷酸，例如dATP、dCTP、dITP、dUTP、dGTP、dTTP或其衍生物。此类衍生物可以包括例如[αS]dATP、7-脱氮-dGTP和7-脱氮-dATP，以及赋予包含它们的核酸分子核酸酶抗性的核苷酸衍生物。如本文所用，术语核苷酸可以指双脱氧核苷三磷酸(ddNTP)及其衍生物。双脱氧核苷三磷酸的说明性实例可包括但不限于ddATP、ddCTP、ddGTP、ddITP和ddTTP。核苷酸可以是未标记的，或者通过众所周知的技术可检测地标记的。标记也可以用量子点进行。可检测的标记可以包括例如，放射性同位素、荧光标记、化学发光标记、生物发光标记和酶标记。核苷酸的荧光标记可包括但不限于荧光素、5-羧基荧光素(FAM)、2′7′-二甲氧基-4′5-二氯-6-羧基荧光素(JOE)、罗丹明、6-羧基罗丹明(R6G)、N,N,N′,N′-四甲基-6-羧基罗丹明(TAMRA)、6-羧基-X-罗丹明(ROX)、4-(4′二甲基氨基苯基偶氮)苯甲酸(DABCYL)、级联蓝(Cascade Blue)、俄勒冈州绿(Oregon Green)、德克萨斯红(Texas Red)、花菁和5-(2'-氨基乙基)氨基萘-1-磺酸(EDANS)。荧光标记的核苷酸的具体实例可包括可购自加利福尼亚州福斯特市珀金埃尔默公司(Perkin Elmer,Foster City,Calif.)的[R6G]dUTP、[TAMRA]dUTP、[R110]dCTP、[R6G]dCTP、[TAMRA]dCTP、[JOE]ddATP、[R6G]ddATP、[FAM]ddCTP、[R110]ddCTP、[TAMRA]ddGTP、[ROX]ddTTP、[dR6G]ddATP、[dR110]ddCTP、[dTAMRA]ddGTP和[dROX]ddTTP，可购自伊利诺伊州阿灵顿高地安玛西亚(Amersham,Arlington Heights,Ill.)的FluoroLink脱氧核苷酸、FluoroLink Cy3-dCTP、FluoroLink Cy5-dCTP、FluoroLink Fluor X-dCTP、FluoroLinkCy3-dUTP和FluoroLink Cy5-dUTP；可购自印第安纳州印第安纳波利斯宝灵曼(BoehringerMannheim,Indianapolis,Ind.)的荧光素-15-dATP、荧光素-12-dUTP、四甲基-罗丹明-6-dUTP、IR770-9-dATP、荧光素-12-ddUTP、荧光素-12-UTP和荧光素-15-2′-dATP；和可购自俄勒冈州尤金分子探针(Molecular Probes,Eugene,Oreg.)的染色体标记的核苷酸、BODIPY-FL-14-UTP、BODIPY-FL-4-UTP、BODIPY-TMR-14-UTP、BODIPY-TMR-14-dUTP、BODIPY-TR-14-UTP、BODIPY-TR-14-dUTP、级联蓝-7-UTP、级联蓝-7-dUTP、荧光素-12-UTP、荧光素-12-dUTP、俄勒冈州绿488-5-dUTP、罗丹明绿-5-UTP、罗丹明绿-5-dUTP、四甲基罗丹明-6-UTP、四甲基罗丹明-6-dUTP、德克萨斯红-5-UTP、德克萨斯红-5-dUTP和德克萨斯红-12-dUTP。核苷酸也可以通过化学修饰来标记或标示。化学修饰的单核苷酸可以是生物素-dNTP。生物素化的dNTP的一些非限制性实例可以包括生物素-dATP(例如，生物-N6-ddATP、生物素-14-dATP)、生物素-dCTP(例如，生物素-11-dCTP、生物素-14-dCTP)和生物素-dUTP(例如，生物素-11-dUTP、生物素-16-dUTP、生物素-20-dUTP)。
术语“多核苷酸”、“寡核苷酸”和“核酸”可互换使用，是指任意长度的核苷酸的聚合形式，无论是单链、双链或多链形式的脱氧核苷酸或核糖核苷酸或其类似物。多核苷酸可以是细胞外源的或内源的。多核苷酸可以存在于无细胞的环境中。多核苷酸可以是基因或其片段。多核苷酸可以是DNA。多核苷酸可以是RNA。多核苷酸可以具有任何三维结构，并且可以执行任何已知或未知的功能。多核苷酸可包含一种或多种类似物(例如，改变的主链、糖或核碱基)。如果存在的话，可以在聚合物组装之前或之后对核苷酸结构进行修饰。类似物的一些非限制性实例包括：5-溴尿嘧啶、肽核酸、异种核酸、吗啉代(morpholino)、锁核酸、乙二醇核酸、苏糖核酸、双脱氧核苷酸、虫草素、7-脱氮-GTP、荧光团(例如，与糖连接的若丹明或荧光素)、含硫醇的核苷酸、生物素连接的核苷酸、荧光碱基类似物、CpG岛、甲基-7-鸟苷、甲基化的核苷酸、肌苷、硫代尿苷、假尿苷、二氢尿苷、queussine和怀俄苷(wyosine)。多核苷酸的非限制性实例包括基因或基因片段的编码或非编码区、由连锁分析定义的基因座(基因座)、外显子、内含子、信使RNA(mRNA)、转移RNA(tRNA)、核糖体RNA(rRNA)、短干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、cDNA、重组多核苷酸、分支多核苷酸、质粒、载体、任何序列的分离DNA、任何序列的分离RNA、包括无细胞DNA(cfDNA)和无细胞RNA(cfRNA)的无细胞的多核苷酸、核酸探针和引物。核苷酸的序列可以被非核苷酸组分中断。
如本文所用，术语“基因”是指参与编码RNA转录物的核酸(例如，诸如基因组DNA的DNA和cDNA)及其相应的核苷酸序列。如本文所用的涉及基因组DNA的术语包括中间的非编码区以及调节区，并且可以包括5'和3'末端。在某些用途中，该术语涵盖转录的序列，包括5'和3'非翻译区(5'-UTR和3'-UTR)、外显子和内含子。在某些基因中，转录区将包含编码多肽的“开放阅读框”。在该术语的一些用途中，“基因”仅包含编码多肽所需的编码序列(例如，“开放阅读框”或“编码区”)。在一些情况下，基因不编码多肽，例如核糖体RNA基因(rRNA)和转移RNA(tRNA)基因。在一些情况下，术语“基因”不仅包括转录的序列，而且另外还包括非转录区，包括上游和下游调节区、增强子和启动子。基因可以指“内源基因”或在生物体基因组中位于其天然位置的天然基因。基因可以是指“外源基因”或非天然基因。非天然基因可以是指通常在宿主生物体中没有发现但通过基因转移引入宿主生物体中的基因。非天然基因也可以是指生物体基因组中不在其天然位置的基因。非天然基因还可以是指包含突变、插入和/或缺失的天然存在的核酸或多肽序列(例如，非天然序列)。
如本文所用，术语“内源的”是指通常在细胞或组织中正常表达的核酸分子或多肽。
如本文所用，术语“外源的”是指核酸分子或多肽不是内源性存在于细胞中或以足以实现在过表达时获得的功能作用的水平存在。因此，术语“外源的”包括在细胞中表达的任何重组核酸分子或多肽，例如外源、异源和过表达的核酸分子和多肽。
如本文所用，术语“自体的”是指源自同一生物。例如，自体样品(例如，细胞)可以指被取出、处理，然后在稍后时间返回给同一受试者(例如，患者)的样品。就过程而言，自体可与同种异体过程有所区别，在同种异体过程中样品(例如，细胞)的供体和样品的接受者不是同一受试者。
如本文所用，术语“同种异体的”是指源自与被引入材料的个体相同物种的不同动物的任何材料。当一个或多个基因座处的基因不相同时，两个或更多个个体被称为彼此同种异体。在一些实施方案中，来自相同物种个体的同种异体材料在遗传上可能足够不同以在抗原性上相互作用。
如本文所用，术语“异种的”是指源自不同物种的动物的移植物。
如本文所用，术语“T细胞和NK细胞共有区标志物”是指在T细胞和NK细胞上共存的标志物，包括但不限于：CD2、CD7、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD69、CD100、CD122、CD132、CD161、CD159a、CD159c、CD314。
如本文所用，术语“T细胞和/或NK细胞的标志物”是指分别存在于T细胞或NK细胞，或存在于T细胞和NK细胞两者中的标志物，包括但不限于：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD160、CD161 CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、SLAMF7。
如本文所用，蛋白质或多肽上下文中的术语“天然”是指自然存在的氨基酸序列，包括蛋白质或多肽的未成熟形式或前体形式和成熟形式。
如本文所用，蛋白质或多肽的上下文中的术语“修饰的”或“修饰”是指相比于天然多肽的序列具有一个或多个氨基酸的添加、缺失、置换(或突变)的蛋白质或多肽。
在一些实施方案中，修饰的多肽包括相比于天然多肽的序列具有一个或多个氨基酸的添加的多肽。除非另有说明，否则修饰的多肽可以包括相比于天然多肽的序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个氨基酸的添加的多肽。除非另有说明，否则修饰的多肽可以包括相比于天然多肽的序列具有从N末端或C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个连续氨基酸的添加的多肽，并且在这种情况下，修饰的多肽还可以指本文中的延伸的多肽(或“具有延伸”)。
在一些实施方案中，修饰的多肽包括相比于天然多肽的序列具有一个或多个氨基酸的缺失的多肽。除非另有说明，否则修饰的多肽可以包括相比于天然多肽的序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个氨基酸的缺失的多肽。除非另有说明，否则修饰的多肽可以包括相比于天然多肽的序列具有从N末端或C末端的至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个连续氨基酸的缺失的多肽，并且在这种情况下，修饰的多肽还可以指本文中的截短的多肽(或“具有截短”)。
在一些实施方案中，修饰的多肽包括相比于天然多肽的序列具有一个或多个氨基酸的置换(或突变)的多肽。具有一个或多个氨基酸的置换(或突变)的多肽还可以指本文中的“多肽变体”。除非另有说明，否则修饰的多肽可以包括相比于天然多肽的序列具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14 15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100个氨基酸的置换(或突变)的多肽。在一些实施方案中，置换(或突变)可以导致多肽的功能灭活或失功能。
如本文所用，术语“功能上灭活的”、“功能性灭活”或“失功能”是指阻止或抑制功能性基因或该基因的产物，例如mRNA或蛋白质。可以通过基因或其启动子的缺失、添加或替换，从而不发生表达，或者基因的编码序列的突变，使得诸如mRNA或蛋白质的基因产物灭活来实现灭活。功能灭活可以是完全的或部分的。基因的灭活可以涵盖所有程度的灭活，包括基因沉默化、敲除、抑制和破坏。在一些实施方案中，通过CRISPR-Cas9系统引入功能灭活。
如本文可互换使用的，术语“受试者”、“个体”、“患者”是指脊椎动物，优选为哺乳动物，例如人。哺乳动物包括但不限于鼠类、猿猴、人类、农场动物、运动动物和宠物。还包括体内获得或体外培养的生物实体的组织、细胞及其后代。
如本文所用，术语“治疗(treatment)”、“治疗(treating)”是指用于获得有益或期望结果的方法，包括但不限于治疗益处和/或预防益处。例如，治疗可以包括施用本文公开的系统或细胞群体。治疗益处是指对一种或多种治疗中的病况(例如，疾病或症状)的任何治疗上相关的改善或作用。为了预防益处，可以将组合物施用于有发生特定病况风险的受试者，或施用于报告疾病的一种或更多种生理症状的受试者，即使该病况可能尚未显现。
概述
CAR可以包含细胞外抗原识别区域，例如，scFv(单链可变片段)或单结构域抗体(sdAb，如VHH抗体)、铰链区(如CD8铰链区)、跨膜结构域(如CD8或CD28跨膜结构域)、共刺激结构域(如4-1BB或CD28共刺激结构域)和细胞内信号传导区(如CD3ζ)。CAR的细胞外结构域可以识别特定抗原，然后通过细胞内结构域转导信号，从而引起T细胞激活和增殖、细胞溶解毒性和细胞因子的分泌，从而消除靶细胞。首先可以分离、激活和基因工程化患者的自体T细胞(或异源供体)以产生CAR T细胞，然后将其注射到同一患者中。以这种方式，可以降低移植物抗宿主病的可能性，并且抗原可以非MHC限制的方式被T细胞识别。
本公开提供了工程化细胞(如免疫细胞)的组合物和方法，使得其可以包含修饰的CAR结构，该结构具有期望的活性以及通过单个双特异性或多价CAR靶向疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原或肿瘤细胞标志物如BCMA、CD19)和任选的免疫细胞抗原(例如，CD7、CD137)的能力。
例如，本公开提供了工程化免疫细胞，其包含具有修饰的CD3ζ且能够靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原如CD7的CAR。本公开还提供了工程化免疫细胞，其包含具有修饰的铰链区和/或修饰的跨膜结构域且能够靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原如CD7的CAR。本公开还提供了工程化免疫细胞，其包含具有规则的铰链区和/或修饰的跨膜结构域且能够靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原如CD7的CAR。还提供了工程化免疫细胞，其包含具有修饰的铰链区和/或修饰的跨膜结构域、修饰的CD3ζ且能够靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原如CD7的CAR。
本公开提供了工程化免疫细胞，其包含具有修饰的CD3ζ的双特异性CAR。本公开还提供了工程化免疫细胞，其包含具有修饰的铰链区和/或修饰的跨膜结构域的双特异性CAR。本公开还提供了工程化免疫细胞，其包含具有规则的铰链区和/或修饰的跨膜结构域的双特异性CAR。还提供了工程化免疫细胞，其包含具有修饰的铰链区和/或修饰的跨膜结构域、修饰的CD3ζ的双特异性CAR。
免疫细胞的内源性TCR可以被灭活(例如，被破坏、抑制、敲除或沉默化)。本公开的靶向肿瘤细胞标志物和免疫细胞抗原的CAR T可以消除阳性肿瘤细胞并清除宿主免疫细胞抗原阳性T细胞和NK细胞，从而避免宿主排斥(HVG)。
在本公开中，任选地，可以将内源性MHC分子灭活(例如，破坏、抑制、敲除或沉默化)以避免宿主排斥。可以将工程化免疫细胞中免疫细胞抗原的内源性表达灭活(例如，破坏、抑制、敲除或沉默化)以避免自相残杀。可以敲除工程化免疫细胞的内源性TCR，并且可以预防移植物抗宿主病(GVHD)，从而制备多用途或通用CAR T(UCAR-T)细胞。工程化免疫细胞可以源自于自体T细胞或同种异体T细胞。
在一些情况下，工程化免疫细胞可以进一步包含增强子部分。当将工程化免疫细胞施用于受试者时，增强子部分可以调节工程化免疫细胞的一种或多种活性。例如，增强子部分可以是细胞因子(例如，IL-5或IL-7)或细胞因子受体(例如，IL-5R或IL-7R)。增强子部分可以增强工程化免疫细胞内的信号传导通路，例如STAT5信号传导通路。
工程化免疫细胞可进一步包含诱导型细胞死亡部分，例如截短的表皮生长因子受体(EGFRt或tEGFR，其可在本文中可互换使用；参见美国专利号9447194B2和PCT公开号WO2018038945)。
诱导型细胞死亡部分或增强子部分可通过单独的表达载体引入到免疫细胞中。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分和增强子部分可通过包含编码两个部分的序列的表达载体被引入免疫细胞中。在一些情况下，将诱导型细胞死亡部分和增强子部分连接并且表达为嵌合多肽。
本文提供的工程化免疫细胞在细胞治疗中的应用可以以改善的功能治疗患者的疾病(例如，癌症)，被预先大规模制备以避免GVHD和HvG，降低治疗成本，如果必要时随时使CAR T灭活，减少免疫疗法的副作用如细胞因子释放综合征，和确保产品安全。本文提供的工程化细胞可以称为通用CAR T细胞(UCAR T细胞)。
嵌合抗原受体(CAR)
本文提供的细胞(例如，免疫细胞或工程化免疫细胞)可包含一种或多种CAR。CAR可以包括抗原结合结构域、铰链区、跨膜结构域、共刺激结构域和细胞内信号传导区。CAR的细胞外结构域可包括抗原结合结构域和铰链区。细胞内结构域可包括共刺激结构域和信号传导区。
铰链区
铰链区，也称为间隔区，是CAR的细胞外区的一部分，其将细胞外抗原结合结构域连接至跨膜结构域。铰链可以影响CAR T细胞的总体性能。铰链区可以为有效CAR表达和活性提供稳定性并且提供访问靶向抗原的灵活性。间隔区的长度对于提供足够的细胞间距离以供免疫突触形成是至关重要的，从而突显了相应优化铰链的需要。
本领域已知的任何合适的铰链区均可用于本申请的CAR。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以是选自下组的多肽的天然铰链区：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，本申请的铰链结构域可以是选自下组的多肽的修饰铰链区：CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以源自于CD8。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以是天然CD8的铰链区。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以是CD8的修饰铰链区。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以包含与CD8的天然铰链区相比的延伸区。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区可以包含与CD8的天然铰链区相比的截短铰链区。
在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.17具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含SEQ ID No.17的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.17相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.17相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.17相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.17相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.18具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含SEQ ID No.18的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.18相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.18相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.18相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的铰链区包含与SEQ ID No.18相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
跨膜结构域
跨膜结构域由疏水性α螺旋组成，该疏水性α螺旋跨越细胞膜以将CAR锚定在T细胞表面。一些证据表明，跨膜结构域可以影响CAR T细胞功能。
本领域已知的任何合适的跨膜结构域均可用于本申请的CAR。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以是选自下组的多肽的天然跨膜结构域：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。在一些实施方案中，本申请的跨膜结构域可以是选自下组的多肽的修饰跨膜结构域：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
在一些实施方案中，跨膜结构域可以与铰链区源自于相同多肽。在一些实施方案中，跨膜结构域可以与铰链区源自于不同多肽。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以源自于CD8。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以是天然CD8的跨膜结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以是CD8的修饰跨膜结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以包含与CD8的天然跨膜结构域相比的延伸区。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以包含与CD8的天然跨膜结构域相比的截短跨膜结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以源自于CD28。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以是天然CD28的跨膜结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以是CD28的修饰跨膜结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以包含与CD28的天然跨膜结构域相比的延伸区。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域可以包含与CD28的天然跨膜结构域相比的截短跨膜结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.19具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.19相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.19相比具有1、2或3个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.19相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.19相比具有1、2或3个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.20具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含SEQ ID No.20的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.20相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.20相比具有1、2或3个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.20相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.20相比具有1、2或3个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.21具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含SEQ ID No.21的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.21相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.21相比具有1、2或3个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.21相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.21相比具有1、2或3个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.22具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含SEQ ID No.22的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ IDNo.22相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.22相比具有1、2或3个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.22相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的跨膜结构域包含与SEQ ID No.22相比具有1、2或3个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
共刺激结构域
共刺激结构域是CAR的内域或细胞内结构域的一部分。其可以源自于增强细胞因子产生的共刺激蛋白的细胞内信号传导区。需要共刺激结构域来实现稳健的CAR T细胞扩增、功能、持久性和抗肿瘤活性。
在一些实施方案中，本申请的CAR可以包含一个或多个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至少一个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至少两个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至少三个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至少四个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至少五个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至多一个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至多两个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至多三个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至多四个共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR包含至多五个共刺激结构域。
本领域已知的任何合适的共刺激结构域均可用于本申请的CAR。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
在一些实施方案中，共刺激结构域可以与跨膜结构域源自于相同多肽。在一些实施方案中，共刺激结构域可以与跨膜结构域源自于不同多肽。
在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以源自于4-1BB。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以是天然4-1BB的共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以是4-1BB的天然共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以是4-1BB的修饰共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以包含与4-1BB的天然共刺激结构域相比的延伸区。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以包含与4-1BB的天然共刺激结构域相比的截短共刺激结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以源自于CD28。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以是天然CD28的共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以是CD28的天然共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以是CD28的修饰共刺激结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以包含与CD28的天然共刺激结构域相比的延伸区。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域可以包含与CD28的天然共刺激结构域相比的截短共刺激结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.23具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含SEQ ID No.23的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.23相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.23相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.23相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ IDNo.23相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.24具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含SEQ ID No.24的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.24相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.24相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ ID No.24相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的共刺激结构域包含与SEQ IDNo.24相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
细胞外信号传导区
本申请的CAR的细胞内信号传导区可以包含涉及免疫细胞信号传导的信号传导结构域或其任何衍生物、变体或片段。CAR的细胞内信号传导区可以诱导包含CAR的免疫细胞的活性。
在一些情况下，细胞内信号传导区可负责激活其中已经放置了CAR的免疫细胞的至少一种正常效应子功能。术语“效应子功能”是指细胞的特定功能。T细胞的效应子功能例如可以是细胞溶解活性或辅助活性，包括细胞因子的分泌。因此，术语“细胞内信号传导区”是指转导效应子功能信号并指导细胞执行特定功能的多肽。
本领域已知的任何合适的细胞内信号传导区均可用于本公开的CAR，包括在抗原受体接合后协同作用以启动信号转导的TCR和共受体的胞质序列，以及这些序列的任何衍生物或变体以及具有相同功能能力的任何合成序列。
在一些实施方案中，细胞内信号传导区包含涉及免疫细胞信号传导的一个或多个信号传导结构域，或其衍生物、变体或片段。免疫细胞信号传导结构域可以涉及以刺激方式或抑制方式调节TCR复合体的初级激活。细胞内信号传导区可以是T细胞受体(TCR)复合体的细胞内信号传导区。本申请的CAR的细胞内信号传导区可以包含Fcγ受体(FcγR)、Fcε受体(FcεR)、Fcα受体(FcαR)、新生儿Fc受体(FcRn)、CD3、CD3ζ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CD4、CD5、CD8、CD21、CD22、CD28、CD32、CD40L(CD154)、CD45、CD66d、CD79a、CD79b、CD80、CD86、CD278(也称ICOS)、CD247ζ、CD247η、DAP10、DAP12、FYN、LAT、Lck、MAPK、MHC复合体、NFAT、NF-κB、PLC-γ、iC3b、C3dg、C3d和Zap70的信号传导结构域。
在一些实施方案中，信号传导结构域包含一个或多个基于免疫受体酪氨酸的激活基序或ITAM。包含ITAM的信号传导结构域可以包含由6-8个氨基酸隔开的两个氨基酸序列YXXL/I重复序列，其中每个x独立地为任何氨基酸，从而产生保守基序YXXL/I-X6-8-YXXL/I。当抗原结合结构域结合至表位时，包含ITAM的信号传导结构域可以例如通过磷酸化激活。磷酸化的ITAM可以用作其他蛋白质，例如，涉及各种信号传导通路的蛋白质的停靠位点。
在一些实施方案中，CAR的细胞内信号传导结构域包含修饰ITAM结构域，例如，突变、截短和/或优化的ITAM结构域，其活性相比于天然ITAM结构域发生了改变(例如，增加或降低)。天然CD3ζ细胞内信号传导结构域或其同种型包含来自三个跨膜方向的三个ITAM，分别称为ITAM1、ITAM2和ITAM3。
如本文所用，“CD3ζ细胞内信号传导结构域”包含天然CD3ζ细胞内信号传导结构域或其同种型。例如，本文所述的CD3ζ细胞内信号传导结构域可以包含如SEQ ID No.15所示的天然CD3ζ细胞内信号传导结构域和如SEQ ID No.45所示的其同种型。本文所述的修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含相比于天然CD3ζ细胞内信号传导结构域(例如，如SEQ IDNo.15所示)的修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域和相比于其同种型(例如，如SEQ IDNo.45所示)的修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含天然CD3ζ细胞内信号传导结构域(例如，如SEQ ID No.15所示)或其同种型(例如，如SEQ ID No.45所示)。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含修饰的CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含延伸的CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。所述失功能突变可以是本领域已知的任何合适的突变，其导致CAR的CD3ζ细胞内信号传导结构域具有降低的功能或无功能(部分或全部灭活)。在一些实施方案中，失功能突变包含置换、插入、缺失或其任何组合。
在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含一个或多个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少一个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少两个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少三个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少四个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少五个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多一个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多两个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多三个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多四个失功能突变。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多五个失功能突变。
失功能突变可以出现在CAR的CD3ζ细胞内信号传导结构域的任何位置。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的一个或多个ITAM中。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的一个或多个ITAM中。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的任一个ITAM中。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1中。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM2中。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM3中。在一些实施方案中，失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
在一些实施方案中，失功能突变存在于YXXL/I-X6-8-YXXL/I的任何位置处。在一些实施方案中，失功能突变存在于ITAM结构域(YXXL/I-X6-8-YXXL/I)的任何酪氨酸残基(Y)处。在一些实施方案中，失功能突变存在于ITAM的两个酪氨酸残基(Y)处。在一些实施方案中，酪氨酸残基(Y)被选自下组的任何残基置换：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。在一些实施方案中，ITAM1的酪氨酸残基(Y)被选自下组的任何残基置换：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、亮氨酸(L)、赖氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，ITAM1的任何酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。在一些实施方案中，ITAM1的两个酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。在一些实施方案中，ITAM2的任何酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。在一些实施方案中，ITAM2的两个酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。在一些实施方案中，ITAM3的任何酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。在一些实施方案中，ITAM3的两个酪氨酸残基(Y)被苯丙氨酸(F)置换。
在一些实施方案中，失功能突变存在于ITAM结构域的亮氨酸残基(L)处。在一些实施方案中，失功能突变存在于ITAM的两个亮氨酸残基(L)处。在一些实施方案中，亮氨酸残基(L)被选自下组的任何残基置换：丙氨酸(A)、精氨酸(R)、天冬酰胺(N)、天冬氨酸(D)、半胱氨酸(C)、谷氨酰胺(Q)、谷氨酸(E)、甘氨酸(G)、组氨酸(H)、异亮氨酸(I)、赖氨酸(K)、蛋氨酸(M)、苯丙氨酸(F)、脯氨酸(P)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)、色氨酸(W)、酪氨酸(Y)和缬氨酸(V)。在一些实施方案中，失功能突变存在于ITAM的两个亮氨酸残基(L)处。
在一些实施方案中，CAR包含CD3ζ细胞内信号传导结构域变体并且该变体包含失功能插入。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少一个失功能插入。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少两个失功能插入。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至少三个失功能插入。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多一个失功能插入。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多两个失功能插入。在一些实施方案中，CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含至多三个失功能插入。
在一些实施方案中，失功能插入不存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM中。在一些实施方案中，失功能插入存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM之间。在一些实施方案中，失功能插入存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1与ITAM2之间。在一些实施方案中，失功能插入存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM2与ITAM3之间。
失功能插入可以是能够减少或消除CD3ζ细胞内信号传导结构域的功能的任何合适的序列。在一些实施方案中，失功能插入包含SEQ ID No.43的序列(本文中也称为M1)或其片段。在一些实施方案中，失功能插入包含SEQ ID No.44的序列(本文中也称为M2)或其片段。
在一些实施方案中，CAR包含截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，并且截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少一个或多个ITAM或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少CD3ζ细胞内信号传导结构域的至少一个ITAM或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少CD3ζ细胞内信号传导结构域的至少两个ITAM或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少CD3ζ细胞内信号传导结构域的至多一个ITAM或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少CD3ζ细胞内信号传导结构域的至多两个ITAM或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM1或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM2或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM1和ITAM2或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM1和ITAM3或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM2和ITAM3或其片段。
在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQID NO.3的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.4的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.5的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.6的氨基酸序列或其片段。在一些实施方案中，截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.7的氨基酸序列或其片段。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含三个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含两个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含ITAM2和ITAM3或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含一个ITAM或其片段。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含三个ITAM1、ITAM2和ITAM3或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含ITAM1和ITAM2或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含ITAM1和ITAM3或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含ITAM1或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含ITAM2或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含ITAM3或其片段。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含至多三个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含至多两个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含至多一个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含至少三个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含至少两个ITAM或其片段。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含至少一个ITAM或其片段。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.8的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.8具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ IDNo.8相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.8相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.8相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.8相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.9的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.9具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ IDNo.9相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.9相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.9相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.9相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.10的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.10具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.10相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.10相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.10相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.10相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.11的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.11具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.11相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.11相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.11相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.11相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.12的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.12具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.12相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.12相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.12相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.12相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.13的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.13具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.13相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.13相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.13相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.13相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.14的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.14具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.14相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.14相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.14相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.15的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.15具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.15相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.15相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.15相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.15相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含SEQ ID No.45的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.45具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％或至少99％同一性的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.45相比具有一个或多个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.45相比具有1、2、3、4或5个氨基酸修饰的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.45相比具有一个或多个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。在一些实施方案中，本申请的CAR的细胞内信号传导区包含与SEQ ID No.45相比具有1、2、3、4或5个氨基酸添加、缺失、突变的氨基酸序列。
抗原结合结构域
本文提供的CAR可包含一个或多个抗原结合结构域。在一些情况下，本文提供的CAR包含可以靶向免疫细胞抗原(例如，以抑制T细胞或NK细胞的杀伤活性)和疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原)两者的抗原结合结构域。例如，靶向免疫细胞抗原和癌症抗原两者的抗原结合结构域包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD69、CD100、CD122、CD132、CD137、CD161、CD159a、CD159c、CD279、CD314、CD319(CS1)和TCR。
在一些情况下，本文提供的CAR包含单个抗原结合结构域。在一些实施方案中，单个抗原结合结构域是scFv或sdAb。在一些情况下，抗原可以是选自下组的任一个：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2。在一些实施方案中，抗原是CD7。
在一些情况下，本文提供的CAR包含两个抗原结合结构域使得一个单个CAR是靶向两个不同抗原的双特异性CAR。在一些情况下，抗原结合结构域可以选自本文公开的任何抗原结合结构域。在一些情况下，一个抗原结合结构域可以是scFv，并且其他抗原结合结构域可以是单结构域抗体(sdAb)。在一些情况下，两个抗原结合结构域都是scFv。在一些情况下，两个抗原结合结构域都是sdAb。
在一些情况下，双特异性CAR的第一抗原结合结构域靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2。
在一些情况下，双特异性CAR的第二抗原结合结构域靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2。
双特异性CAR的两个抗原结合结构域可以具有串联结构、平行结构或环结构。
在一些情况下，CAR包含两个以串联形式排列的抗原结合结构域。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域是scFv。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按任意以下模式排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
在一些情况下，CAR包含两个以环形式排列的抗原结合结构域。在一些情况下，第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按任意以下模式排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；和(viii)VH1-VH2-VL2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
在一些情况下，包含两个抗原结合结构域的CAR以平行形式排列。平行形式可以包含具有第一抗原结合结构域的第一CAR的完整构建体，该第一CAR的完整构建体与具有第二抗原结合结构域的第二CAR的完整构建体连接。
在一些情况下，本文提供的CAR是多价CAR，如包含三个抗原结合结构域的三特异性CAR(tri-CAR)。在一些情况下，三特异性CAR的第一抗原结合结构域靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。在一些实施方案中，第一抗原结合结构域靶向CS1、CD7、CD137、BCMA或CD19。
在一些情况下，三特异性CAR的第二抗原结合结构域靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。在一些实施方案中，第二抗原结合结构域靶向CS1、CD7、CD137、BCMA或CD19。
在一些情况下，三特异性CAR的第三抗原结合结构域靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。在一些实施方案中，第三抗原结合结构域靶向CS1、CD7、CD137、BCMA或CD19。
在一些实施方案中，提供了核酸，其包含编码上述的一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第一序列，其中CAR可以包含单价或多价(如二价)抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR中的每种CAR可以进一步包含上述的跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
抗原结合结构域可以靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。
在一些实施方案中，核酸可以包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第一序列，其中CAR可以包含(i)第一抗原结合结构域，其连接至(ii)第二抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR中的每种CAR可以进一步包含上述的跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
第一抗原结合结构域可以靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。
在一些情况下，第二抗原结合结构域可以靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。
在一些实施方案中，核酸可以包含编码一种或多种嵌合抗原受体(CAR)的第一序列，其中CAR可以包含(i)第一抗原结合结构域，其连接至(ii)第二抗原结合结构域，(iii)第三抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR中的每种CAR可以进一步包含上述的跨膜结构域和细胞内信号传导结构域。
第一抗原结合结构域可以靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。
在一些情况下，第二抗原结合结构域可以靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。
在一些情况下，第三抗原结合结构域可以靶向选自下组中任一个的抗原：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD137、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R和TROP-2。
核酸分子还可包含编码增强子部分的第二序列，当在细胞中表达时，该增强子部分可增强CAR的一种或多种活性。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19、TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。核酸分子还包含编码诱导型细胞死亡部分的第二序列，当在细胞中表达时，该诱导型细胞死亡部分可在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时实现细胞的死亡。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8和EGFRt。
核酸分子还可包含侧接于第一序列和第二序列的第三序列，其中第三序列可以编码可切割的接头。可切割的接头可以是自切割肽。在一些实施方案中，可切割的接头是P2A接头。
核酸分子还可包含调节第一序列和/或第二序列的表达的调节序列。
在本公开中还考虑了包含本文所述核酸分子的试剂盒。
在一些情况下，可以将编码本文所述的CAR的核酸递送至免疫细胞中以表达CAR，产生工程化细胞。
源细胞
本公开提供了工程化细胞，例如工程化免疫细胞。工程化免疫细胞可以从分离自获自受试者的样品中的细胞(例如，免疫细胞)制备。工程化免疫细胞可以从细胞系细胞制备。用于制备工程化免疫细胞的免疫细胞可以是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞或巨噬细胞。用于制备工程化免疫细胞的免疫细胞可以是先天淋巴细胞(ILC)。
用于制备工程化免疫细胞的免疫细胞可以是干细胞。干细胞可以是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
免疫细胞可以包含T细胞受体(TCR)。TCR可以是免疫细胞的内源性TCR。在一些情况下，内源性TCR可以被灭活。例如，编码TCR亚基的基因可以被灭活。例如，免疫细胞可以是具有受损的TCR的αβT细胞，使得免疫细胞可以避免GVHD。又例如，内源性TCR的功能可以被抑制剂抑制，例如TCR衍生的肽，源自于融合的氨基酸序列的肽和各种病毒的其他蛋白质区域、抗体和小分子抑制剂。可以衍生TCR抑制肽的病毒包括但不限于：严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)、松鼠猴疱疹病毒(HVS)、人疱疹病毒6(HHV-6)、拉沙病毒(LASV)、淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒(LCMV)、莫佩亚病毒(MOPV)、塔卡里伯病毒(TACV)、弗云德鼠白血病病毒(MLV)、1型人类T淋巴细胞病毒(HTLV-1)、蜘蛛猴疱疹病毒(HVA)、马尔堡病毒(MARV)、苏丹埃博拉病毒(SEBOV)和扎伊尔埃博拉病毒(ZEBOV)。
在一些情况下，免疫细胞可以是包含可能不引起GVHD应答的TCR的T细胞。例如，免疫细胞可以是具有TCR的αβT细胞，该αβT细胞可以识别特异性抗原，例如病毒特异性抗原、肿瘤相关抗原(TAA)或肿瘤特异性抗原(TSA)。又例如，免疫细胞可以是γδT细胞或自然杀伤T(NKT)细胞。又例如，免疫细胞可以是由抗原特异性T细胞(例如，抗原特异性细胞毒性T细胞)产生的诱导型多能干细胞。免疫细胞可以是脐带血T细胞。
免疫细胞可以包含细胞表面标志物。细胞表面标志物可以是免疫细胞抗原。用于制备工程化免疫细胞的编码免疫细胞的免疫细胞抗原的基因可以被灭活。免疫细胞抗原的实例包括但不限于CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。例如，在一些情况下，编码免疫细胞的CD7的基因被灭活。
可以从受试者的样品中分离免疫细胞。受试者可以是健康供体。受试者可以患有病况(例如，诸如癌症的疾病)。样品可以是体液或组织，包括但不限于外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织和肿瘤。在一些情况下，样品包含NK细胞、NKT细胞、T细胞或T细胞祖细胞。例如，在一些情况下，样品是脐带血样品、外周血样品(例如单核细胞部分)或来自受试者的包含多能细胞的样品。在一些实施方案中，可以培养来自受试者的样品以产生诱导型多能干(iPS)细胞，并且这些细胞用于产生NK细胞、NKT细胞或T细胞。细胞样品可以直接从受试者培养，或者可以在使用前冷冻保存。在一些实施方案中，获得细胞样品包括收集细胞样品。在其他方面，样品是通过第三方获得的。在另外的方面，可以对来自受试者的样品进行处理以纯化或富集样品中的T细胞或T细胞祖细胞。例如，可以对样品进行梯度纯化、细胞培养物选择和/或细胞分选(例如，通过荧光激活的细胞分选(FACS))。
免疫细胞可以是NK细胞。NK细胞可以获自外周血、脐带血或本文所述的其他来源。NK细胞可以源自于诱导型多能干细胞。
在一些实施方案中，对于给定因子，可以在本文提供的方法中使用的细胞可以是阳性的或阴性的。在一些实施方案中，本文提供的方法中利用的细胞可以是CD3+细胞、CD3-细胞、CD5+细胞、CD5-细胞、CD7+细胞、CD7-细胞、CD14+细胞、CD14-细胞、CD8+细胞、CD8-细胞、CD103+细胞、CD103-细胞、CD11b+细胞、CD11b-细胞、BDCA1+细胞、BDCA1-细胞、L-选择素(selectin)+细胞、L-选择素-细胞、CD25+、CD25-细胞、CD27+、CD27-细胞、CD28+细胞、CD28-细胞、CD44+细胞、CD44-细胞、CD56+细胞、CD56-细胞、CD57+细胞、CD57-细胞、CD62L+细胞、CD62L-细胞、CD69+细胞、CD69-细胞、CD45RO+细胞、CD45RO-细胞、CD127+细胞、CD127-细胞、CD132+细胞、CD132-细胞、IL-7+细胞、IL-7-细胞、IL-15+细胞、IL-15-细胞、凝集素样受体G1阳性细胞、凝集素样受体G1阴性细胞或其分化的或去分化的细胞。细胞表达的因子的实例不旨在是限制性的，并且本领域技术人员将理解，对于本领域已知的任何因子，细胞可以是阳性或阴性的。在一些实施方案中，细胞对于两种或更多种因子可以是阳性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8+。在一些实施方案中，细胞对于两种或更多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD25-、CD44-和CD69-。在一些实施方案中，细胞对于一种或多种因子可以是阳性的，而对于一种或多种因子可以是阴性的。例如，细胞可以是CD4+和CD8-。在一些实施方案中，本文提供的细胞标志物可用于选择、富集或消减细胞群。在一些实施方案中，富集包括选择单核细胞部分。在一些实施方案中，富集包括从单核细胞部分分选免疫细胞群。在一些实施方案中，可以针对具有或不具有一种或多种给定因子来选择细胞(例如，可以基于一种或多种因子的存在或不存在来分离细胞)。在一些实施方案中，所选择的细胞也可以在体外转导和/或扩增。所选择的细胞可以在输注之前在体外扩增。在一些实施方案中，可以用本文提供的载体转导选择的细胞。应当理解，本文公开的任何方法中使用的细胞可以是本文公开的任何细胞的混合物(例如，两种或更多种不同的细胞)。例如，本公开的方法可以包括细胞，并且细胞是CD4+细胞和CD8+细胞的混合物。在另一个实例中，本公开的方法可以包括细胞，并且细胞是CD4+细胞和幼稚细胞(cell)的混合物。在一些情况下，细胞可以是由CD45RO(-)、CCR7(+)、CD45RA(+)、CD62L+(L-选择素)、CD27+、CD28+和IL-7Rα+组成的干记忆TSCM细胞，干记忆细胞可以还表达CD95、IL-2Rβ、CXCR3和LFA-1，并显示出许多干记忆细胞特有的功能属性。本文提供的细胞也可以是包含L-选择素和CCR7的中枢记忆TCM细胞，其中中枢记忆细胞可以分泌例如IL-2，但不分泌IFNγ或IL-4。细胞也可以是包含L-选择素或CCR7的效应记忆TEM细胞，并产生例如效应细胞因子，例如IFNγ和IL-4。在一些情况下，可以将细胞群引入受试者中。例如，细胞群可以是T细胞和NK细胞的组合。在其他情况下，群可以是幼稚细胞和效应细胞的组合。细胞群可以是TIL。
源免疫细胞可以是T细胞。T细胞可以是αβT细胞或γδT细胞。T细胞可从多种来源获得，包括外周血单核细胞、骨髓、淋巴结组织、脐带血、胸腺组织、来自感染部位的组织、腹水、胸腔积液、脾脏组织、和肿瘤。在本公开的某些实施方案中，可以使用各种T细胞系。在本公开的某些实施方案中，T细胞可以使用本领域技术人员已知的许多技术(例如FicollTM分离)从采集自受试者的血液单位中获得。在一些实施方案中，来自个体循环血液的细胞是通过单采血液成分法(apheresis)获得的。单采血液成分法产品通常包含淋巴细胞，包括T细胞、单核细胞、粒细胞、B细胞、其他有核白细胞、红细胞和血小板。在一些实施方案中，可以洗涤通过单采血液成分法收集的细胞以除去血浆部分并将细胞置于适当的缓冲液或介质中以用于随后的处理步骤。在本公开的一些实施方案中，用磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗涤细胞。在替代实施方案中，洗涤溶液缺少钙，且可能缺少镁，或者可能缺少许多(如果不是全部的话)二价阳离子。在不存在钙的情况下的初始激活步骤可能导致放大的激活。洗涤步骤可以通过诸如使用半自动“流通”离心机(例如，Cobe 2991细胞处理器、Baxter CytoMate或Haemonetics细胞回收器5)的方法、根据制造商的说明书来完成。在洗涤后，可以将细胞重悬于多种生物相容性缓冲液中，诸如例如无Ca2+，无Mg2+的PBS、勃脉力(PlasmaLyte)A或具有或不具有缓冲液的其他盐溶液。或者，可以除去单采血液成分法样品的不期望的组分，并将细胞直接重悬浮在培养基中。
在另一个实施方案中，例如通过裂解红细胞和消耗单核细胞(例如通过PERCOLLTM梯度离心或通过逆流离心淘析)，从外周血淋巴细胞中分离T细胞。T细胞的特定亚群可以通过阳性或阴性选择技术进一步分离，例如CD3+、CD28+、CD4+、CD8+、CD45RA+和CD45RO+ T细胞。例如，在一个实施方案中，通过与抗CD3/抗CD28(即，3×28)-缀合的珠，例如M-450CD3/CD28 T孵育足以阳性选择所需T细胞的时间段来分离T细胞。在一个实施方案中，该时间段为约30分钟。在另外的实施方案中，该时间段的范围为30分钟至36小时或更长时间，以及其间的所有整数值。在另一个实施方案中，该时间段是至少1、2、3、4、5或6小时。在另一个优选的实施方案中，该时间段是10至24小时。在一些实施方案中，孵育时间段是24小时。为了从白血病患者中分离出T细胞，使用更长的孵育时间(例如24小时)可以提高细胞产率。与其他细胞类型相比，在T细胞较少的任何情况下，可以使用更长的孵育时间来分离T细胞。此外，使用更长的孵育时间可以提高捕获CD8+ T细胞的效率。因此，通过简单地缩短或延长T细胞与CD3/CD28珠结合的时间和/或通过增加或降低珠与T细胞的比率(如本文进一步所述)，可以在培养开始时或该过程期间的其他时间点优先选择支持或反对的T细胞的亚群。另外，通过增加或减少珠或其他表面上抗CD3和/或抗CD28抗体的比例，可以在培养开始时或其他期望的时间点优先选择支持或反对的T细胞的亚群。在一些情况下，也可以使用多轮选择。在一些实施方案中，执行选择程序并在激活和扩增过程中使用“未选择的”细胞可以是有用的。“未选择的”细胞也可以进行更多各轮的选择。
通过阴性选择富集T细胞群体可以通过针对阴性选择细胞特有的表面标志物的抗体的组合来完成。示例性方法可以是通过阴性磁性免疫粘附或流式细胞术进行的细胞分选和/或选择，其使用针对存在于阴性选择细胞上的细胞表面标志物的单克隆抗体的混合物。例如，为了通过阴性选择富集CD4+细胞，单克隆抗体混合物通常包括针对CD14、CD20、CD11b、CD16、HLA-DR和CD8的抗体。在某些实施方案中，可能需要富集或阳性选择通常表达CD4+、CD25+、CD62Lhi、GITR+和FoxP3+的调节性T细胞。或者，在某些实施方案中，通过抗C25缀合珠或其他类似的选择方法来耗尽T调节细胞。
为了通过阳性或阴性选择分离期望的细胞群，可以改变细胞和表面(例如颗粒，例如珠)的浓度。在某些实施方案中，可能期望显著减小珠和细胞混合在一起的体积(即，增加细胞的浓度)，以确保细胞和珠的最大接触。例如，在一个实施方案中，使用了20亿个细胞/ml的浓度。在一个实施方案中，使用10亿个细胞/ml的浓度。在另外的实施方案中，使用大于1亿个细胞/ml。在另外的实施方案中，使用10、15、20、25、30、35、40、45或50百万个细胞/ml的细胞浓度。在另一个实施方案中，使用75、80、85、90、95或100百万个细胞/ml的细胞浓度。在另外的实施方案中，可以使用125或150百万个细胞/ml的浓度。使用高浓度可导致增加的细胞产率、细胞激活和细胞扩增。此外，使用高细胞浓度可允许更有效地捕获可能弱表达目标靶抗原的细胞(例如CD28-阴性T细胞)，或者来自存在许多肿瘤细胞的样品(例如，白血病血液、肿瘤组织等)的细胞。此类细胞群可能具有治疗价值，并且将是期望获得的。例如，使用高浓度的细胞可允许更有效地选择通常具有较弱CD28表达的CD8+ T细胞。
在相关的实施方案中，可以使用较低浓度的细胞。通过显著稀释T细胞和表面(例如颗粒，例如珠)的混合物，使颗粒和细胞之间的相互作用最小化。该方法可以选择表达大量待与颗粒结合的期望抗原的细胞。例如，稀释浓度的CD4+ T细胞表达更高水平的CD28，并且比CD8+ T细胞更有效地被捕获。在一些实施方案中，使用的细胞的浓度为5×106/ml。在其他实施方案中，使用的浓度可为约1×105/ml至1×106/ml，以及介于两者之间的任何整数值。在其他实施方案中，可以在旋转器上在2-10℃或在室温下以不同的速度将细胞孵育不同的时间长度。
用于刺激的T细胞也可以在洗涤步骤后冷冻。不希望受理论的束缚，冷冻和随后的解冻步骤通过去除细胞群中的粒细胞和某种程度上去除单核细胞提供了更均匀的产物。在去除血浆和血小板的洗涤步骤之后，可以将细胞悬浮在冷冻溶液中。尽管许多冷冻溶液和参数是本领域已知的，并且在该上下文中将是有用的，但一种方法涉及使用包含20％DMSO和8％人血清白蛋白的PBS，或包含10％葡聚糖40和5％葡萄糖，20％人血清白蛋白和7.5％DMSO的培养基，或31.25％勃脉力-A、31.25％葡萄糖5％、0.45％NaCl、10％葡聚糖40和5％葡萄糖、20％人血清白蛋白和7.5％DMSO或包含例如羟乙基淀粉(Hespan)和勃脉力A的其他合适的细胞冷冻培养基，然后将细胞以每分钟1°的速率冷冻至-80℃，并储存在液氮储存罐的气相中。可以使用其他受控冷冻的方法以及在-20℃或在液氮中立即进行非受控冷冻。
在一些实施方案中，如本文所述将冷冻保存的细胞解冻并洗涤，并在使用本公开的方法激活之前使其在室温下静置一小时。
在一些实施方案中，在任何数量的相关治疗方式之前，从受试者的血液样品或单采血液成分中分离细胞，相关治疗方式包括但不限于用试剂诸如那他珠单抗、依法珠单抗、抗病毒剂的试剂、化学疗法、放射、免疫抑制剂如环孢菌素、硫唑嘌呤、甲氨蝶呤、麦考酚酯和FK506、抗体，或其他免疫消融剂(immunoablative agent)如CAMPATH、抗CD3抗体、环磷酰胺、氟达拉滨、环孢菌素、FK506、雷帕霉素、麦考酚酸、类固醇、FR901228和放射物的治疗。这些药物抑制钙依赖性磷酸酶钙调磷酸酶(环孢素和FK506)或抑制对生长因子诱导的信号传导重要的p70S6激酶(雷帕霉素)(Liu等人,Cell 66:807-815,1991；Henderson等人,Immun.73:316-321,1991；Bierer等人,Curr.Opin.Immun.5:763-773,1993)。在另外的实施方案中，分离出患者的细胞并冷冻，以随后与骨髓或干细胞移植，使用化学治疗剂(例如氟达拉滨)的T细胞消融疗法、外束放射治疗(XRT)、环磷酰胺或抗体(诸如OKT3或CAMPATH)联合使用(例如，在其之前、同时或之后)。在另一个实施方案中，细胞在B细胞消融疗法之前被分离并且可以被冷冻以随后用于以后的治疗，例如与CD20反应的试剂例如利妥昔单抗。
工程化免疫细胞
本文提供的工程化免疫细胞可以表现出对肿瘤细胞的增强活性，但是具有降低的副作用，例如细胞因子释放综合征(CRS)、GVHD和/或移植物宿主排斥反应(HVG)。工程化免疫细胞可以靶向疾病相关抗原(例如，肿瘤相关抗原或肿瘤细胞标志物)，同时抑制宿主免疫细胞。可以使工程化免疫细胞的一种或多种内源基因(例如，编码TCR的亚基的基因、编码MHC分子的亚基的基因或编码细胞表面标志物的基因)灭活。
在一些情况下，工程化免疫细胞包含单个CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞包含第一CAR和第二CAR，各自靶向不同抗原。在一些情况下，工程化免疫细胞包含具有第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域的CAR。在一些情况下，工程化免疫细胞包含第一CAR、第二CAR和第三CAR，各自靶向不同抗原。在一些情况下，工程化免疫细胞包含具有第一抗原结合结构域、第二抗原结合结构域和第三抗原结合结构域的CAR。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性抗原可以在工程化免疫细胞中被灭活。在一些情况下，编码内源性抗原的基因可以在工程化免疫细胞中被灭活(例如，沉默化或敲除)。在一些情况下，编码内源性CD7的基因可以在工程化免疫细胞中被灭活(例如，沉默化或敲除)。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可以被灭活。在一些情况下，编码工程化免疫细胞的内源性TCR的亚基的基因可以被灭活，使得内源性TCR可以被灭活。编码该亚基的基因可以是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性MHC分子可以被灭活。在一些情况下，内源性MHC分子包含MHC I类分子和MHC II类分子。在一些情况下，编码MHC I分子的基因可以被灭活。编码MHC I分子的基因包括但不限于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的一个或多个内源性HLA基因的表达可以被敲除或部分敲除。例如，工程化免疫细胞的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中的任一个或多个可以被敲除或部分敲除。在一些情况下，内源性HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G可以被敲除或部分敲除以降低T细胞杀伤活性。在一些情况下，工程化免疫细胞的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中的任一个或多个可以保持完整。在一些情况下，所述工程化免疫细胞中的内源性MHC分子的亚基可以被灭活，使得内源性MHC分子灭活。在一些情况下，所述工程化免疫细胞中的内源性MHC分子的B2M亚基被灭活。在一些情况下，所述工程化免疫细胞中的内源性MHC分子的B2M亚基被敲除或部分敲除。
在一些情况下，工程化免疫细胞的杀伤/吞噬细胞抑制剂可以过表达。在一些其他情况下，内源性HLA可以通过杀伤/吞噬细胞抑制剂的共表达而被敲除。例如，B2M可以通过杀伤/吞噬细胞抑制剂的共表达被敲除。杀伤/吞噬细胞抑制剂可以抑制对工程化免疫细胞的免疫应答。杀伤/吞噬细胞抑制剂包括但不限于HLA-E单链三聚体、HLA-G、CD47、CD24、FASL、PDL1或其功能结构域。
在一些情况下，相比于没有灭活TCR、MHC分子和/或免疫细胞抗原的包含一个或多个CAR的其他工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞可以表现出(i)在存在相对于工程化免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源性T细胞、异源性NK细胞和异源性T细胞与异源性NK细胞的混合物)时通过在体外保持活力而持久性程度增强，(ii)扩增程度增强，或(iii)针对包含抗原的靶细胞的细胞毒性增强。在一些情况下，工程化免疫细胞的特征可以在于表现出以下中的两项或更多项：(i)在存在相对于工程化免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源性T细胞、异源性NK细胞和异源性T细胞与异源性NK细胞的混合物)时通过在体外保持活力而持久性程度增强，(ii)扩增程度增强，和(iii)细胞毒性增强。
结合部分可以包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每种CAR可以进一步包含上述的铰链、跨膜结构域、共刺激区和细胞内信号传导区。
工程化免疫细胞还可以包含增强子部分，该增强子部分能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原可以被灭活。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可以被灭活。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性MHC分子可以被灭活。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性TCR和内源性MHC分子中的任意两种或更多种可以被灭活。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性TCR和内源性MHC分子可以全部被灭活。
在一些情况下，相比于没有灭活TCR、MHC分子和/或免疫细胞抗原的包含一个或多个CAR的其他工程化免疫细胞，所述工程化免疫细胞可以表现出(i)在存在相对于工程化免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源性T细胞、异源性NK细胞和异源性T细胞与异源性NK细胞的混合物)时通过在体外保持活力而持久性程度增强，(ii)扩增程度增强，或(iii)针对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞的细胞毒性增强。在一些情况下，所述工程化免疫细胞的特征可以在于表现出以下中的两项或更多项：(i)在存在相对于工程化免疫细胞异源的细胞(包括但不限于异源性T细胞、异源性NK细胞和异源性T细胞与异源性NK细胞的混合物)时通过在体外保持活力而持久性程度增强，(ii)扩增程度增强，和(iii)细胞毒性增强。
增强子部分可以被配置为组成型地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。增强子部分可以被配置为组成型地上调工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。一个或多个细胞内信号传导通路可以是一个或多个细胞因子信号传导通路。增强子部分可以通过自寡聚化自激活。增强子部分可以通过自二聚化自激活。
增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19、TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
工程化免疫细胞可以进一步包含诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分可以在与细胞死亡激活剂接触时实现工程化免疫细胞的自杀。诱导型细胞死亡部分可以选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8和EGFRt。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。细胞死亡激活剂可以包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
本文提供的工程化免疫细胞可以包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞死亡的诱导型细胞死亡部分，其中增强子部分与诱导型细胞死亡部分连接。在一些情况下，增强子部分和诱导型部分可以通过接头连接。接头可以是可切割接头，例如自切割肽。
工程化免疫细胞还可包含一种或多种嵌合多肽受体(CPR)，该一种或多种CPR包含结合部分，其中结合部分包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答和(ii)能够与疾病相关抗原结合的第二抗原结合结构域。一种或多种CPR中的单个CPR可包含(i)第一抗原结合结构域，(ii)第二抗原结合结构域，或(iii)第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。一种或多种CPR的CPR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。在一些情况下，工程化免疫细胞中的一种或多种CPR是一种或多种嵌合抗原受体(CAR)或工程化T细胞受体(TCR)。在一些情况下，工程化免疫细胞包含CAR和工程化TCR两者。
工程化TCR可以是TCR融合蛋白。例如，TCR融合蛋白可包含与TCR复合物的一个或多个亚基融合的异源抗原结合结构域。在一些情况下，TCR融合蛋白可以包含TCR亚基，该TCR亚基包含TCR胞外结构域和TCR胞内结构域的至少一部分；和包含抗原结合结构域的抗体结构域，其中TCR亚基和抗体结构域连接。当在T细胞中表达时，TCR融合蛋白可以并入TCR复合物中。在一些情况下，TCR融合蛋白还可包含TCR跨膜结构域。TCR胞外结构域、TCR胞内结构域或TCR跨膜结构域可源自于TCRα链、TCRβ链、TCRγ链、TCRδ链、CD3ε、CD3γ、CD3δ或CD3ζ。在一些情况下，包含工程化TCR的工程化免疫细胞的内源性TCR被灭活。在一些情况下，包含灭活的内源性TCR的工程化免疫细胞可以不引起GVHD。例如，可以使编码内源性TCR亚基的基因灭活。对于另一个实例，可以使编码内源性TCR亚基的基因突变，使得可以不形成内源性TCR。
本文提供的工程化免疫细胞可以包含嵌合多肽，该嵌合多肽包含(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞死亡的诱导型细胞死亡部分。在一些情况下，增强子部分与诱导型细胞死亡部分连接。一种或多种嵌合抗原受体(CAR)可包含结合部分。结合部分可包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)能够与疾病相关抗原结合的第二抗原结合结构域。
在一些情况下，一种或多种CAR中的单个CAR包含(i)第一抗原结合结构域或(ii)第二抗原结合结构域。在一些情况下，一种或多种CAR中的单个CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域二者。在一些情况下，一种或多种CAR中的每种CAR进一步包含上述的铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可以被灭活。在一些情况下，编码工程化免疫细胞的内源性TCR的亚基的基因可以被灭活，使得内源性TCR被灭活。编码该亚基的基因可以是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性MHC分子可以被灭活。在一些情况下，内源性MHC分子包含MHC I类分子和MHC II类分子。在一些情况下，编码MHC I分子的基因被灭活。编码MHC I分子的基因包括但不限于HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G。在一些实施方案中，工程化免疫细胞的一个或多个内源性HLA基因的表达可以被敲除或部分敲除。例如，工程化免疫细胞的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中的任一个或多个可以被敲除或部分敲除。在一些情况下，内源性HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F或HLA-G可以被敲除或部分敲除以降低T细胞杀伤活性。在一些情况下，工程化免疫细胞的HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G中的任一个或多个可以保持完整。
在一些情况下，所述工程化免疫细胞中的内源性MHC分子的亚基可以被灭活，使得内源性MHC分子灭活。在一些情况下，所述工程化免疫细胞中的内源性MHC分子的B2M亚基被灭活。在一些情况下，所述工程化免疫细胞中的内源性MHC分子的B2M亚基被敲除或部分敲除。在一些情况下，工程化免疫细胞的杀伤/吞噬细胞抑制剂可以过表达。
在一些其他情况下，内源性HLA可以通过杀伤/吞噬细胞抑制剂的共表达而被敲除。例如，B2M可以通过杀伤/吞噬细胞抑制剂的共表达被敲除。杀伤/吞噬细胞抑制剂可以抑制对工程化免疫细胞的免疫应答。杀伤/吞噬细胞抑制剂包括但不限于HLA-E单链三聚体、HLA-G、CD47、CD24、FASL、PDL1或其功能结构域。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性TCR和内源性MHC分子中的任意两种或更多种可以被灭活。在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原和内源性TCR可以被灭活，工程化免疫细胞的内源性TCR和内源性MHC分子可以被灭活，或者工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原和内源性MHC分子可以被灭活。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性免疫细胞抗原、内源性TCR和内源性MHC分子可以全部被灭活。
在一些情况下，工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)被灭活。可以使用各种方法来灭活内源性TCR。例如，可将编码内源性TCR的亚基的基因灭活，使得内源性TCR灭活。编码亚基的基因可以是TCRα、TCRβ、CD3ε、CD3δ、CD3γ或CD3ζ。
嵌合多肽可以包含或不包含侧接增强子部分和诱导型细胞死亡部分的任何自切割肽。增强子部分可以被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。增强子部分可以被配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以通过自寡聚而自激活。增强子部分可以通过自二聚化而自激活。
本文所述的嵌合多肽可以是分泌型蛋白质。嵌合多肽可以是细胞内蛋白。嵌合多肽可以是跨膜蛋白。增强子部分或诱导型细胞死亡部分可包含在跨膜蛋白的胞外结构域中。增强子部分或诱导型细胞死亡部分包含在跨膜蛋白的胞内结构域中。增强子部分可以包含在跨膜蛋白的胞内结构域中，且诱导型细胞死亡部分可以包含在跨膜蛋白的胞外结构域中。增强子部分可以包含在跨膜蛋白的胞外结构域中，且诱导型细胞死亡部分可以包含在跨膜蛋白的胞内结构域中。
增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。例如，增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8和EGFRt。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂是GCV。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且细胞死亡激活剂是AP1903。细胞死亡激活剂可包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
本文提供的CAR T细胞可以是通用CAR T细胞。CAR T细胞可以表达靶向肿瘤细胞标志物的嵌合抗原受体CAR，并且T细胞受体与PD-1的结合受到抑制。CAR T细胞可以靶向CD7。本文提供的CAR T细胞中的内源性TCR表达可以通过基因编辑技术敲除。在敲除CAR T细胞的内源性TCR后，正常细胞在同种异体输注过程中可能不会被CAR T细胞识别并杀伤。GVHD反应可以受到抑制。此外，通过CD7靶向肿瘤细胞，同时通过CD7消除宿主T细胞和/或NK细胞可以避免宿主排斥移植物(HVG)和/或NK杀伤，并提高同种异体CAR T细胞在受体中的存活率和抗肿瘤作用。CAR T还可包含自杀基因开关(例如，诱导型细胞死亡部分)。可以通过打开自杀基因开关(例如，使激活剂与诱导型细胞死亡部分结合)来灭活或去除CAR T细胞，以减少CAR T细胞疗法的副作用。
工程化免疫细胞可以包含两种不同的CAR，其各自具有靶向不同抗原的不同抗原结合结构域。工程化免疫细胞可以包含单个CAR，其还包含靶向两种不同抗原的两种抗原结合结构。在一些情况下，第一CAR和/或第二CAR通过自切割元件与诱导型细胞死亡部分和/或增强子部分连接。在一些情况下，增强子部分是细胞因子或细胞因子复合物。细胞因子或细胞因子复合物的实例包括IL2、IL7、IL15、膜结合的IL15(mbIL15或mb15)和组成型激活细胞因子受体，例如IL7受体(C7R)。如本文所用，“mbIL”和“mb”可互换使用，指膜结合的白介素因子，例如，mbIL7或mb7，以及mbIL17或mb17。
本文所述的工程化免疫细胞可能具有以下特征：(a)工程化免疫细胞表达CAR和/或外源性TCR，并且CAR和/或外源性TCR靶向肿瘤细胞标志物；和(b)细胞因子相关信号传导通路被增强。工程化免疫细胞可以是(i)嵌合抗原受体T细胞(CAR T细胞)；(ii)嵌合抗原受体NK细胞(CAR-NK细胞)；或(iii)外源性T细胞受体(TCR)T细胞(TCR-T细胞)。工程化免疫细胞可以是CAR T细胞，优选通用CAR T细胞(UCAR T细胞)。如本文所用，“细胞因子相关信号传导通路”是指由细胞因子与相应受体结合，将细胞外信号转化为细胞内信号，然后细胞内信号被信号级联放大、分散和调节所引发的信号传导通路。可以产生一系列细胞应答。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路包括选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、25或其组合的细胞因子的相关信号传导通路。
工程化免疫细胞可以包含双特异性CAR(或双重CAR)。例如，双特异性CAR可包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可通过接头连接。接头可以不包含自切割肽。第一抗原结合结构域或第二抗原结合结构域可以是scFv。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可从氨基末端到羧基末端按任意以下模式排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；和(iv)VH1-VL2-VH2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可从氨基末端到羧基末端按任意以下模式排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；和(iv)VL1-VH1-VH2-VL1，其中VH1是第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是第二抗原结合结构域的重链可变结构域，且VL2是第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域可与免疫细胞抗原和疾病相关抗原结合。
在一些情况下，工程化免疫细胞可以不包含双特异性CAR。例如，工程化免疫细胞的单个CAR可以仅包含第一抗原结合结构域，且工程化免疫细胞的另外的单个CAR可以仅包含第二抗原结合结构域。
免疫细胞抗原可以是免疫细胞的表面蛋白或分泌型蛋白。免疫细胞可以是NK细胞、T细胞、单核细胞、巨噬细胞或粒细胞。免疫细胞抗原可选自：CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。
疾病相关抗原可以是肿瘤相关抗原。肿瘤相关抗原可以是CS1或本文所述的其他抗原。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与选自CD2、CD3、CD5、CS1、CD7和CD137的免疫细胞抗原结合，并且第二抗原结合结构域可与CS1结合。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与CD7结合，并且第二抗原结合结构域可与CS1结合。在一些情况下，第一抗原结合结构域可与CD137结合，并且第二抗原结合结构域可与CS1结合。工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达可保持完整。工程化免疫细胞的内源性HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G基因中的一种或多种的表达可保持完整。工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达可被灭活。工程化免疫细胞的内源性HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G基因中的一种或多种的表达可被灭活。工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达可被下调。工程化免疫细胞的内源性HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E、HLA-F和HLA-G基因中的一种或多种的表达可被下调。工程化免疫细胞的一种或多种内源性人白细胞抗原(HLA)基因的表达可被敲除或部分敲除。
在各种实施方案中，工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。在一些情况下，工程化免疫细胞源自干细胞。干细胞可以是造血干细胞(HSC)或诱导型多能干细胞(iPSC)。
本文提供的细胞(例如，工程化免疫细胞)可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中所述结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。细胞还可包含能够增强细胞的一种或多种活性的增强子部分，其中细胞的内源性T细胞受体(TCR)可被灭活。
增强子部分可以增强细胞的一种或多种活性。增强子部分可以被配置为组成性地增强细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成性地上调细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。例如，一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
细胞还可包含在诱导型细胞死亡部分，该诱导型细胞死亡部分在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞死亡。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。例如，诱导型细胞死亡部分可以是EGFRt，并且细胞死亡激活剂可以是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂可以是GCV。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是iCasp9，并且细胞死亡激活剂可以是AP1903。
可将编码细胞的内源性表面标志物的基因灭活，其中所述内源性表面标志物在表达时可以能够与第一抗原结合结构域结合。内源性表面标志物可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
增强子部分
本文提供的工程化免疫细胞可包含增强子部分。增强子部分可以调节工程化免疫细胞的一种或多种活性，例如，增强或上调一种或多种信号传导通路以增强或上调工程化免疫细胞的效应子功能。信号传导通路可以是细胞因子相关信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子。增强子部分可以是细胞因子受体。
细胞因子相关信号传导通路可包括细胞因子的相关信号传导通路。细胞因子的实例包括但不限于IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21和IL25。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路包括两种或多种细胞因子的相关信号传导通路，其中细胞因子包括：IL-2和IL-7、IL-2和IL-15。IL-7和IL-15、IL15和IL21。细胞应答可包括调节下游基因表达、改变细胞内酶活性、改变细胞骨骼结构、改变DNA合成、促进基因转录、调节免疫细胞分化、增殖和对细胞死亡的抗性。在一些情况下，细胞因子相关信号传导通路被增强，包括：引入或上调编码细胞因子和/或其受体的基因、外源添加细胞因子、引入细胞因子受体中、或其组合。在一些情况下，上调编码细胞因子和/或其受体的基因包括上调编码基因的转录和/或翻译水平。在一些情况下，可以通过以下方法中的一种或多种实现增强的细胞因子相关信号转导通路：在免疫细胞中表达编码细胞因子和/或其受体的基因、增加免疫细胞中编码细胞因子和/或其受体的基因的拷贝数、工程化编码基因的调节序列(例如启动子)以提高转录速度(例如转录起始速率)、修饰携带编码基因的信使RNA的翻译调节区以增强翻译强度、修饰编码基因本身以增强mRNA稳定性、蛋白质稳定性并释放蛋白质反馈抑制。
细胞因子相关的信号传导通路可通过细胞因子及其受体的膜表达、细胞因子的分泌、细胞因子和/或其受体的转录调节的增强或其组合来增强。膜表达的细胞因子及其受体可包括：IL-15及其受体(例如，mbIL15融合蛋白)、IL-7及其受体(例如，mbIL7融合蛋白)、IL-17及其受体(例如，mbIL17融合蛋白)、IL-2及其受体(例如，mbIL2融合蛋白)、IL-21及其受体(例如，mbIL21融合蛋白)、构建激活的IL-7受体(C7R)或其组合。在一些情况下，工程化免疫细胞中包含的增强子部分是分泌型细胞因子。分泌型细胞因子可以以各种机制起作用，例如，分泌型细胞因子可以是反式激活因子或顺式激活因子。分泌型细胞因子可包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21或其组合。在一些情况下，增强子是膜结合蛋白，例如mbIL15、mbIL7、mbIL21和mbIL2。在一些情况下，增强子部分是组成型活性细胞因子受体下游信号传导蛋白，例如STAT5和STAT3。在一些情况下，增强子部分是组成型活性细胞因子受体，例如组成型活性IL-7受体(C7R)或其衍生物。例如，组成型活性细胞因子受体可以是工程化蛋白(例如，在本公开中称为“E3”)，其中C7R的胞外结构域被安全开关(例如，EGFRt或人表皮生长因子受体2的截短形式)替代(Her2t；参见美国专利申请公开号20170267742A1)或本公开中描述的其他肽。又例如，组成型活性细胞因子受体可以是工程化蛋白(例如，在本公开中称为“E4”)，其中C7R的胞外结构域被免疫细胞抑制剂(例如CD47、CD24)或其他肽替代，其抑制杀伤或吞噬性免疫细胞功能并保护治疗性细胞(例如，本文所述的工程化免疫细胞)。在一些情况下，细胞因子可以是趋化因子，例如CCL21和CCL19。可以使用的趋化因子的其他非限制性实例包括CCL27、CCL28、CCL20、CXCL9、CXCLIO、CXCLl l、CXCL16、CXCL13、CXCL5、CXCL6、CXCL8、CXCL12、CCL2、CCL8、CCL13、CCL25、CCL3、CCL4、CCL5、CCL7、CCL14、CCL15、CCL16、CCL23、CX3CL1、XCL1、XCL2、CCL1、CCL17、CCL22、CCL11、CCL24、CCL26、CXCLl、CXCL2、CXCL3和CXCL7。在一些情况下，增强子部分是CCR7的配体，其可以起到增强T细胞、NK细胞或树突细胞的浸润的作用。CCR7配体包括但不限于CCL21和CCL19。在一些情况下，增强子部分包含趋化因子CCL21和CCL19的共表达，用于治疗性用途以治疗淋巴瘤或其他实体瘤。
在一些情况下，工程化免疫细胞用作治疗液体肿瘤的治疗剂，并且在这种情况下，增强子部分可以包含本文所述的任何形式的任何细胞因子。在一些情况下，工程化免疫细胞用作治疗实体瘤的治疗剂，并且在这种情况下，增强子部分可以包含任何形式的任何细胞因子，并且还包含一种或多种趋化因子。
在一些情况下，可以使用两种细胞因子来增强工程化免疫细胞中细胞因子相关信号传导通路，包括IL-2和IL-7、IL-2和IL-15、IL-7和IL-15以及IL15和IL21。细胞因子相关信号传导通路的增强可包括选自mbIL融合蛋白、组成型活性IL-7受体(C7R)、白介素或其组合组成的组的多肽的表达。
本文所述的增强子部分可以是白介素15(IL-15)或IL-15受体。IL-15是由114个氨基酸组成的14-15kD糖蛋白，属于四个螺旋束细胞因子家族。IL-15在结构上与白介素2(IL-2)同源。IL-15受体包含高亲和力的IL-15受体α链、IL2/15受体β链和共同的γ链。因此，IL-15可能具有一些与IL-2相似的功能，例如刺激T细胞的激活和增殖、增强NK细胞杀伤活性和促进免疫球蛋白的B细胞产生。最近研究发现，IL-15可在NK细胞、NKT细胞和肠上皮细胞的分化、增殖和激活中起作用。IL-15和IL-17可在CD8+记忆T细胞的调节中起作用。研究还表明，IL-15可以通过一种机制来调节CD8+记忆T细胞的增殖和NK细胞的生存周期，其中表达IL-15α链受体的细胞可以向表达15β链和公共的γ链的细胞呈递IL-15。IL-15也可以在非免疫系统中起作用，例如调节骨骼肌合成代谢。本文所述的增强子部分可以是白介素7(IL-7)。IL-7可以促进前-B细胞、祖-B细胞(pro-B cell)、B细胞和T细胞的生长。它还可以促进B细胞和T细胞的生长和抗细胞凋亡。IL-7可以在胸腺的早期分化和增殖以及树突细胞的发育和分化中起作用。然而，IL-7可能对抗原特异性细胞毒性T淋巴细胞的杀伤活性没有增强的作用。它可以首先从胸腺转移到外周血，然后诱导胸腺细胞或外周血淋巴细胞产生淋巴因子，激活并增强LAK细胞的淋巴因子激活的杀伤细胞活性。CD8+亚群可以是IL-7的主要效应细胞，且IL-7也可以支持记忆CD8+ T细胞扩增和存活。IL-7可以促进骨髓组织产生。IL-7不仅可以刺激髓样前体细胞和巨核细胞产生集落形成单位和血小板，还可以使身体从环磷酰胺的免疫抑制中恢复。在较高浓度下，它还可以诱导增强巨噬细胞的细胞毒性，作为用于产生CTL细胞、NK细胞和激活的单核细胞的协同因子，诱导单核细胞-巨噬细胞以分泌各种细胞因子并促进炎性因子(例如巨噬细胞炎性蛋白α(MIP-α)、MIP-β、IL-8和单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)等)的表达。通过激活炎症细胞所产生的大量炎性因子，IL-7不仅可以调节炎性过程的各组分之间的相互作用，而且还可以增强炎性细胞因子受体(CCR)，例如CCR1、CCR2和CCR5。另外，IL-7可以在诱导免疫应答中起作用。IL-7可以诱导I型免疫应答并增加IFN-γ和IL2的产生。IL-7可以与IL12协同作用以诱导IFN-γ和T细胞增殖。IL-7和转化生长因子β(TGFβ)可以发挥调节作用，并且可以是免疫调节机制的一部分。IL-7不仅可以促进T细胞的免疫重建，而且还可以诱导T细胞周期的上调和BCL-2表达，这扩大了循环T细胞受体池(pool)的多样性和持久性，并增加了CD4+和CD8+T细胞的数量。此外，对于HIV抗原，扩增的T细胞还可以分泌IL2和IFN-γ，并具有良好的抗病毒功能。因此，IL-7可以逆转HIV特异性T淋巴细胞在增殖、细胞因子分泌和细胞功能方面的缺陷。
增强部分可以调节(例如，激活)转录5(STAT5)介导的信号传导通路的信号转导物和激活物。STAT5可广泛存在于细胞质中。当细胞因子(例如IL2、IL7、IL15和IL21)与细胞因子受体结合时，偶联受体的JAK被激活，从而使STAT5蛋白C端的Tyr残基磷酸化。磷酸化的STAT5可以通过其SH2区域形成同源或异源二聚体。同源或异二聚体可以转移至细胞核并与靶基因结合，从而调节靶基因的表达，靶基因包括细胞调节因子和抗细胞凋亡基因。STAT5的激活可以在维持正常细胞功能以及调节细胞增殖和分化中起作用。因此，调节STAT5信号传导通路的活性可以调节本文所述的CAR T细胞的存活和持久性。
通过将编码增强子部分的核酸分子递送到细胞中，可以将增强子部分引入细胞(例如，免疫细胞或工程化免疫细胞)。核酸分子可以是载体。增强子部分可以是融合构建体的一部分。融合蛋白或相应的核酸构建体可具有由选自以下的式表示的结构：S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-IL15-IL15Ra(A)；S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-IL15-IL15Ra-2A-L3-IL7(B)；S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-C7R(C)；S-2A-L1-scFv-H-TM-C-CD3ζ-2A-L2-IL7-IL7Ra(D)；其中：每个“-”独立地是接头肽或肽键；S是安全开关；2A是任选的自切割肽；L1、L2和L3各自独立地为空或信号肽序列；C7R如上所述；scFv是抗原结合结构域；H为空或铰链区；TM是跨膜结构域；C是共刺激信号传导分子；CD3ζ是上述的细胞内信号传导区；IL15是白介素15，IL15Ra是IL-15受体α；IL7是白介素7，IL7Ra是IL-7受体α；C7R是组成性地激活的IL-7受体。
增强子部分可以是嵌合多肽的一部分。例如，增强子部分可以与诱导型细胞死亡部分连接。增强子部分可以通过接头与诱导型细胞死亡部分连接。接头可以不被切割。接头可以不包含自切割肽。在一些其他情况下，增强子部分和诱导型细胞死亡部分可以在细胞中由相同核酸分子表达，并且可以被切割以形成两个多肽。
诱导型细胞死亡部分
本文所述的工程化免疫细胞可包含诱导型细胞死亡部分，也称为“自杀基因开关”、“自杀开关”、“安全开关”或“细胞自杀元件”。诱导型细胞死亡部分可用于在外源因子(例如，药物)的作用下体内有效地去除工程化免疫细胞(例如，CAR T细胞)。本文所述的诱导型细胞死亡部分可以是rapaCasp9、iCasp9、CD20(及其模拟表位)、RQR8、Her2t、CD30、BCMA、EGFRt、HSV-TK、mTMPK等。iCasp9、CD20(及其模拟表位)、RQR8和HSV-TK可具有相同的清除T细胞的能力，但rapaCasp9、iCasp9、RQR8和CD20(及其模拟表位)可以比HSV-TK更快。
在一些情况下，诱导型细胞死亡部分在使所述诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现所述细胞的死亡。诱导型细胞死亡部分可以是例如，rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8或EGFRt。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。在一些情况下，诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
诱导型细胞死亡部分可以与增强子部分连接，并且可以如上所述作为嵌合多肽在细胞中共表达。
移植物抗宿主病(GVHD)
为了制备用于治疗恶性和传染性疾病的“现成(off the shelf)”同种异体T细胞，通过输注T细胞的细胞疗法可以设计为重建针对病原体和恶性肿瘤的免疫力。在体外用足够数量的T细胞生产具有肿瘤靶向特性的T细胞所需的时间量通常可能与患者的治疗窗不相容。此外，来自患有晚期疾病的患者的自体T细胞可能具有受损功能并且对期望抗原具有耐受性。
为了解决这些问题，可以向患者施用同种异体T细胞，但需要通过识别输注细胞上不同的主要或次要组织相容性抗原来阻止通过宿主NK细胞和T细胞的免疫介导的排斥反应。输注不表达TCRα和β链以及/或者MHC分子的T细胞可能不会引起GVHD和HVG。因此，用CRISPR/CAS9编辑以删除TCRα链和/或MHC分子的T细胞可作为通用效应子供体细胞的来源。
移植物排斥
敲低β-2-微球蛋白(B2M)可防止供体CAR T细胞受到宿主T细胞的攻击。供体CAR T细胞可被宿主NK细胞攻击并影响CAR T细胞的存活。因此，本公开提供了靶向肿瘤细胞和宿主T细胞和/或NK细胞的工程化免疫细胞。本文所述的工程化免疫细胞可以清除宿主T细胞和/或NK细胞，并增强CAR T细胞的存活、持久性和扩增能力，从而更有效地对抗肿瘤细胞。或者通过表达一种或多种NK细胞抑制剂包括但不限于HLA-E单链三聚体、HLA-G、PD-L1、FASL、PDL1或其功能结构域。
基因编辑
在本公开中可以使用各种基因编辑方法来制造工程化免疫细胞，包括CRISPR、RNA干扰技术、TALEN(转录激活物样(TAL)效应子核酸酶)和锌指核酸酶(ZFN)。
在一些情况下，CRISPR/Cas9系统用于编辑免疫细胞的基因。例如，CRISPR/Cas9系统可用于敲除免疫细胞的内源性TCR或细胞表面标志物(例如CS1、CD7、CS137)，以产生用于T细胞疗法的工程化免疫细胞。CRISPR/Cas9(聚簇规律间隔的短回文重复序列)/Cas(CRISPR相关)系统是对病毒或外源质粒具有抗性的原核生物特有的天然免疫系统。II型CRISPR/Cas系统已作为直接基因组导向的基因组编辑工具应用于许多真核生物和原核生物体中。CRISPR/Cas9系统的发展彻底改变了人们编辑DNA序列和调节靶基因表达水平的能力，为生物体的精确基因组编辑提供了强大的工具。简化的CRISPR/Cas9系统可包含Cas9蛋白和gRNA。作用原理是gRNA通过其自身的Cas9手柄(handle)与Cas9蛋白形成Cas9-gRNA复合物，并且通过碱基互补配对原理，Cas9-gRNA复合物中的gRNA的碱基互补配对序列与靶基因的靶序列配对。Cas9使用其自身的核酸内切酶活性来切割靶DNA序列。与传统的基因组编辑技术相比，CRISPR/Cas9系统具有几个明显的优势：易用、简单、低成本、可编程性以及同时编辑多个基因的能力。
药物组合物
本公开还提供了一种药物组合物，该药物组合物包含本文所述的工程化免疫细胞和药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。在一些实施方案中，药物组合物是液体组合物。药物组合物可以例如通过注射施用给受试者。制剂中工程化免疫细胞的浓度可为至少约102、103、104、105、106、107、108、109或更多个细胞/ml。在一些情况下，制剂中工程化免疫细胞的浓度可为1x103-1x108个细胞/ml，或1x104-1x107个细胞/ml。
本公开的药物组合物可以包含本文所述的工程化免疫细胞，结合一种或多种药学或生理学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂。此类组合物可以包含缓冲剂，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如，氢氧化铝)和防腐剂。本公开的组合物可以被配制用于静脉内施用。
本公开的药物组合物可以适合于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。尽管可以通过临床试验确定适当的剂量，但是施用的量和频率将由诸如患者的病况以及患者的疾病的类型和严重性等因素来确定。
当指示“免疫有效量”、“抗肿瘤有效量”、“肿瘤抑制有效量”或“治疗量”时，可以由医生考虑到患者(受试者)的年龄、体重、肿瘤大小、感染或转移的程度以及病况的个体差异确定要待施用的本公开组合物的精确量。通常可以指出，包含本文所述的工程化免疫细胞(例如，CAR T细胞)的药物组合物可以以104至109个细胞/kg体重，或在一些情况下以105至106个细胞/kg体重、包括这些范围内的所有整数值的剂量施用。T细胞组合物也可以这些剂量多次施用。可以通过使用输注技术来施用细胞。通过监视患者的疾病征兆并相应地调整治疗，可以容易地确定特定患者的最佳剂量和治疗方案。
可以任何方便的方式进行主题组合物的施用，包括通过气溶胶吸入、注射、摄入、输血、植入或移植。本文所述的组合物可以经皮下、皮内、肿瘤内、结节内、髓内、肌内、通过静脉内(i.v.)注射或腹膜内施用给患者。在一些实施方案中，本公开的T细胞组合物通过皮内或皮下注射施用于患者。在一些其他实施方案中，本公开的T细胞组合物优选通过静脉内注射施用。T细胞的组合物可以直接注射到肿瘤、淋巴结或感染部位。
治疗学
本公开提供了用编码本文所述的表达盒的慢病毒载体(LV)转导的工程化免疫细胞(例如，T细胞或NK细胞)的治疗应用。转导的T细胞或NK细胞可以靶向肿瘤细胞标志物(例如CD7、CD19、BCMA)和激活的T细胞和/或NK细胞共有标志物(例如，CD7、CD137等)。工程化免疫细胞可用于同种异体肿瘤治疗，并可大规模制备。
因此，本公开还提供了一种刺激T细胞介导的对受试者(例如，哺乳动物)的靶细胞群体或组织的免疫应答的方法，该方法包括向受试者施用公开的工程化免疫细胞(例如，CAR T细胞)的步骤。
在一些实施方案中，本公开提供了一种类型的细胞疗法，该细胞疗法包括将本公开的工程化的通用CAR T细胞直接施用给有需要的患者。本公开的CAR T细胞可通过基因编辑技术在细胞中敲除或沉默内源性TCR表达。内源性TCR和/或MHC(如B2M)的灭活可以防止TCR在同种异体输注期间杀伤正常细胞。可以预防GVHD反应。靶向肿瘤细胞标志物(例如CD7、CD19、BCMA)和激活的T细胞和/或NK细胞的标志物(例如CD7、CD137)的CAR T细胞可以在清除肿瘤细胞的同时去除激活的T细胞和/或NK细胞。另外，还可以预防宿主抗移植物应答(HVG)。本文提供的细胞疗法还可以改善受试者中同种异体CAR T细胞的存活和抗肿瘤作用。
在一些实施方案中，本文提供了一种治疗或诊断受试者中的疾病的方法，该方法包括向所述受试者施用本文所述的药物组合物。
所述药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于同种异体免疫细胞。源自所述同种异体免疫细胞的工程化免疫细胞可能不会在所述受试者中诱导移植物抗宿主病(GvHD)。所述药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于自体免疫细胞。
所述药物组合物中的所述工程化免疫细胞的内源性TCR和/或MHC(如B2M)可以是功能上灭活的。与具有功能上活性的TCR和/或MHC(如B2M)的另外的免疫细胞相比，工程化免疫细胞可以降低所述受试者中的GVHD。该疾病可以是癌症。癌症可以是例如，淋巴瘤或白血病。
本公开的CAR T细胞可以经历稳健的体内细胞扩增并且可以被扩展。CAR介导的免疫应答可以是过继性免疫疗法的步骤的一部分，其中CAR修饰的T细胞可以诱导对CAR中的抗原结合结构域具有特异性的免疫应答。例如，抗CD7 CAR T细胞引起针对表达CD7的细胞的特异性免疫应答。
本文提供的工程化免疫细胞可用于治疗癌症。可以治疗的癌症包括尚未血管化或尚未充分血管化的肿瘤，以及已血管化的肿瘤。癌症可以包括非实体瘤(例如，血液肿瘤，例如白血病和淋巴瘤)，或者可以包括实体瘤。用本公开的CAR治疗的癌症类型包括但不限于癌、胚细胞瘤和肉瘤，某些白血病或淋巴样恶性肿瘤、良性和恶性肿瘤以及恶性肿瘤，例如肉瘤、癌和黑素瘤。还包括成人肿瘤/癌症和儿科肿瘤/癌症。
血液癌症是血液或骨髓的癌症。血液学(或血源性)癌症的实例包括白血病，包括急性白血病(例如急性淋巴细胞白血病、急性髓细胞白血病、急性骨髓性白血病和成髓细胞、早幼粒细胞性、粒单核细胞、单核细胞和红白血病)、慢性白血病(例如，慢性髓细胞性(粒细胞性)白血病、慢性骨髓性白血病和慢性淋巴细胞性白血病)、真性红细胞增多症、淋巴瘤、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤(惰性和高级别形式)、多发性骨髓瘤、华氏巨球蛋白血症、重链疾病、骨髓增生异常综合征、毛细胞白血病和脊髓发育不良。
实体瘤是通常不包含囊肿或液体区域的异常组织肿块。实体瘤可以是良性或恶性的。不同类型的实体瘤因形成它们的细胞类型而命名(例如肉瘤、癌和淋巴瘤)。实体瘤如肉瘤和癌的实例包括纤维肉瘤、粘液肉瘤、脂肪肉瘤、软骨肉瘤、骨肉瘤和其他肉瘤、滑膜瘤、间皮瘤、尤因氏瘤、平滑肌肉瘤、横纹肌肉瘤、结肠癌、淋巴样恶性肿瘤、胰腺癌、乳腺癌、肺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝细胞癌、鳞状细胞上皮癌、基底细胞癌、腺癌、汗腺癌、甲状腺髓样癌、乳头状甲状腺癌、嗜铬细胞瘤、皮脂腺癌、乳头状癌、乳头状腺癌、髓样癌、支气管癌、肾细胞癌、肝癌、胆管癌、绒毛膜癌、维尔姆斯瘤、宫颈癌、睾丸瘤、精原细胞瘤、膀胱癌、黑素瘤和中枢神经系统肿瘤(例如，神经胶质瘤(例如，脑干胶质瘤和混合胶质瘤)、胶质母细胞瘤(也称为多形性胶质母细胞瘤)、星形细胞瘤、中枢神经系统淋巴瘤、生殖细胞瘤、成神经管细胞瘤、神经鞘瘤、颅咽管瘤、室管膜瘤、松果体瘤、血管母细胞瘤、听神经瘤、少突胶质细胞瘤、脑膜瘤、神经母细胞瘤、视网膜母细胞瘤和脑转移)。
本文公开的细胞疗法可以与一种或多种另外的治疗剂共同配制和/或共同施用，另外的治疗剂例如一种或多种抗癌剂、细胞毒性或细胞抑制剂、激素治疗、疫苗和/或其他免疫疗法。在一些实施方案中，将工程化免疫细胞与其他治疗性治疗形式组合施用，其他治疗性治疗形式包括手术、放射、冷冻手术和/或热疗。此类组合疗法可以有利地利用较低剂量的所施用的治疗剂，从而避免与各种单一疗法相关的可能的毒性或并发症。
在某些实施方案中，本文所述的方法和组合物与一种或多种抗体分子、化学疗法、其他抗癌疗法(例如，靶向抗癌疗法或溶瘤药物)、细胞毒素剂，基于免疫的疗法(例如，细胞因子)、手术和/或放射程序联合施用。可与之联合施用的示例性细胞毒素剂包括抗微管剂、拓扑异构酶抑制剂、抗代谢药、有丝分裂抑制剂、烷基化剂、蒽环类药物、长春花生物碱、嵌入剂、能够干扰信号转导通路的试剂、促进细胞凋亡的试剂、蛋白酶体抑制剂和放射(例如局部或全身放射)。
在某些实施方案中，联合疗法与标准的癌症护理化疗剂联合使用，该标准的癌症护理化疗剂包括但不限于阿那曲唑比卡鲁胺/>硫酸博莱霉素白消安/>白消安注射液/>卡培他滨N4-戊氧基羰基-5-脱氧-5-氟胞苷、卡铂/>卡莫司汀苯丁酸氮芥/>顺铂/>克拉屈滨/>环磷酰胺(/>或/>)、阿糖孢苷、阿糖胞苷/>阿糖孢苷脂质体注射液/>达卡巴嗪/>更生霉素(放线菌素D、Cosmegan)、盐酸柔红霉素/>枸橼酸柔红霉素脂质体注射液/>地塞米松、多西他赛/>盐酸阿霉素/>依托泊苷磷酸氟达拉滨/>5-氟尿嘧啶/> 氟他胺替扎西滨(tezacitibine)、吉西他滨(二氟脱氧胞苷)、羟基脲/>伊达比星/>异环磷酰胺/>伊立替康/>L-天冬酰胺酶亚叶酸钙、美法仑/>6-巯基嘌呤/>甲氨蝶呤/>米托蒽醌/>吉妥单抗、紫杉醇/>nab-紫杉醇phoenix(钇90/MX-DTPA)、喷司他丁、含卡莫司汀植入物的聚苯丙生20枸橼酸他莫昔芬/>替尼泊苷/>6-硫鸟嘌呤、噻替哌、替拉扎明/>注射用盐酸拓扑替康/>长春花碱/>长春新碱/>和长春瑞滨/>
烷基化剂的实例包括但不限于，氮芥、乙烯亚胺衍生物、烷基磺酸酯、亚硝基脲和三氮烯：尿嘧啶氮芥(Aminouracil Uracil nitrogen/> )、氮芥/>环磷酰胺(RevimmuneTM)、异环磷酰胺美法仑/>苯丁酸氮芥/>哌泊溴烷曲他胺/> 三亚乙基硫代磷酰胺、替莫唑胺/>噻替哌/>白消安/>卡莫司汀/>洛莫司汀/>链脲菌素/>和达卡巴嗪另外的示例性烷基化剂包括但不限于，奥沙利铂/>替莫唑胺(/>和/>)；更生霉素(也称为放线菌素-D、/>)；美法仑(也称为L-PAM、L-沙可来新和苯丙氨酸氮芥、/>)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、/>)；卡莫司汀/>苯达莫司汀/>白消安(/>和/>)；卡铂/>洛莫司汀(也称为CCNU、/>)；顺铂(也称为CDDP、/>和/>-AQ)；苯丁酸氮芥/>环磷酰胺(/>和)；达卡巴嗪(也称为DTIC、DIC和咪唑甲酰胺、DTIC-/>)；六甲蜜胺(也称为六甲基三聚氰胺(HMM)、/>)；异环磷酰胺/>异环磷酰胺普雷德氮芥(Prednumustine)；丙卡巴肼/>氮芥(也称为氮芥(nitrogen mustard、mustine)和盐酸氮芥(mechloroethamine hydrochloride)、/>)；链脲菌素噻替哌(也称为硫代磷酰胺、TESPA和TSPA、/>)；环磷酰胺 和盐酸苯达莫司汀
蒽环类药物的实例包括例如，阿霉素(和/>)；博来霉素柔红霉素(盐酸柔红霉素、道诺霉素和盐酸红比霉素、/>柔红霉素脂质体(枸橼酸柔红霉素脂质体、/>)；米托蒽醌(DHAD、/>)；表柔比星(EllenceTM)；去甲氧基柔红霉素(/>Idamycin/>)；丝裂霉素C格尔德霉素；除莠霉素；拉维霉素；和去乙酰基拉维霉素。
可以与本文所述的细胞疗法组合使用的长春花生物碱的实例包括但不限于，酒石酸长春瑞滨长春新碱/>和长春地辛/>长春碱(也称硫酸长春碱、长春花碱和VLB、Alkaban-/>和/>)；和长春瑞滨/>
可以与本文所述的细胞疗法联合使用的蛋白酶体抑制剂的实例包括但不限于硼替佐米卡非佐米(PX-171-007、(S)-4-甲基-N-((S)-1-((((S)-4-甲基-1-((R)-2-甲基环氧乙烷-2-基))-1-氧代戊烷-2-基)氨基)-1-氧代-3-苯基丙烷-2-基)-2-((S)-2-(2-吗啉代乙酰胺基)-4-苯基丁酰胺基)-戊酰胺)；马里佐米(marizomib)(NPI-0052)；枸橼酸艾沙佐米(MLN-9708)；德兰佐米(CEP-18770)；O-甲基-N-[((2-甲基-5-噻唑基)羰基]-L-丝氨酰基-O-甲基-N-[(1S)-2-[[(2R)-2-甲基-2-环氧乙烷基]-2-氧代-1-(苯甲基)乙基]-L-丝氨酰胺(ONX-0912)；达诺瑞韦(RG7227、CAS 850876-88-9)；伊沙佐米(MLN2238、CAS 1072833-77-2)；和(S)-N-[(苯基甲氧基)羰基]-L-亮氨酰-N-(1-甲酰基-3-甲基丁基)-L-亮氨酰胺(MG-132、CAS 133407-82-6)。
在一些实施方案中、细胞疗法可以与酪氨酸激酶抑制剂(例如，受体酪氨酸激酶(RTK)抑制剂)联合使用。示例性酪氨酸激酶抑制剂包括但不限于，表皮生长因子(EGF)通路抑制剂(例如，表皮生长因子受体(EGFR)抑制剂)、血管内皮生长因子(VEGF)通路抑制剂(例如，血管内皮生长因子受体(VEGFR)抑制剂(例如，VEGFR-1抑制剂、VEGFR-2抑制剂、VEGFR-3抑制剂)、血小板衍生生长因子(PDGF)通路抑制剂(例如，血小板衍生生长因子受体(PDGFR)抑制剂(例如，PDGFR-β抑制剂))、RAF-1抑制剂、KIT抑制剂和RET抑制剂。在一些实施方案中、与刺猬(hedgehog)抑制剂联合使用的抗癌剂选自：阿西替尼(AG013736)、博舒替尼(SKI-606)、西地尼布(RE-CENTIN、AZD2171)、达沙替尼BMS-354825)、厄洛替尼/>吉非替尼/>伊马替尼(/>CGP57148B、STI-571)、拉帕替尼/>来他替尼(CEP-701)、来那替尼(HKI-272)、尼洛替尼/>司马沙尼(塞玛替尼、SU5416)、舒尼替尼(/>SU11248)、妥拉尼布/>凡德他尼(/>ZD6474)、瓦他拉尼(PTK787、PTK/ZK)、曲妥珠单抗/>贝伐单抗/>利妥昔单抗西妥昔单抗/>帕尼单抗/>兰尼单抗尼洛替尼/>索拉非尼/>阿仑单抗吉妥珠单抗奥唑米星/>ENMD-2076、PCI-32765、AC220、多韦替尼乳酸盐(TKI258、CHIR-258)、BIBW 2992(TOVOKTM)、SGX523、PF-04217903、PF-02341066、PF-299804、BMS-777607、ABT-869、MP470、BIBF 1120/>AP24534、JNJ-26483327、MGCD265、DCC-2036、BMS-690154、CEP-11981、替沃扎尼(AV-951)、OSI-930、MM-121、XL-184、XL-647、XL228、AEE788、AG-490、AST-6、BMS-599626、CUDC-101、PD153035、培利替尼(EKB-569)、凡德他尼(zactima)、WZ3146、WZ4002、WZ8040、ABT-869(利尼伐尼)、AEE788、AP24534(帕纳替尼)、AV-951(替沃扎尼)、阿昔替尼、BAY 73-4506(瑞戈非尼)、丙氨酸布立尼布(BMS-582664)、布立尼布(BMS-540215)、西地尼布(AZD2171)、CHIR-258(多韦替尼)、CP 673451、CYC116、E7080、Ki8751、马赛替尼(AB1010)、MGCD-265、二磷酸莫替沙尼(AMG-706)、MP-470、OSI-930、盐酸帕唑帕尼、PD173074、甲苯磺酸索拉非尼(Bay43-9006)、SU 5402、TSU-68(SU6668)、瓦他拉尼、XL880(GSK1363089、EXEL-2880)。刺猬抑制剂的其他实例包括但不限于，维莫德吉(2-氯-N-[4-氯-3-(2-吡啶基)苯基]-4-(甲磺酰基)-苯甲酰胺、GDC-0449)；1-(4-氯-3-(三氟甲基)苯基)-3-((3-(4-氟苯基)-3,4-二氢-4-氧代-2-喹唑啉基)甲基)-脲(CAS 330796-24-2)；N-[(2S,3R,3′R,3aS,4′aR,6S,6′aR,6′bS,7aR,12′aS,12′bS)-2′,3′,3a,4,4′,4′a,5,5′,6,6′,6′a,6′b,7,7′,7a,8′,10′,12′,12′a,12′b-二十氢-3,6,11′,12′b-四甲基螺[呋喃[3,2-b]吡啶-2(3H),9′(1′H)-萘[2,1-a]薁]-3'-基]-甲磺酰胺(IPI926,CAS 1037210-93-7)；和4-氟-N-甲基-N-[1-[4-(1-甲基-1H-吡唑-5-基)-1-酞嗪基]-4-哌啶基]-2-(三氟甲基)-苯甲酰胺(LY2940680,CAS1258861-20-9)；和雷特格韦(Erismodegib)(LDE225)。选择的酪氨酸激酶抑制剂选自舒尼替尼、厄洛替尼、吉非替尼或盐酸索拉非尼厄洛替尼/>利尼伐尼(N-[4-(3-氨基-1H-吲唑-4-基)苯基]-N'-(2-氟-5-甲基苯基)脲，也称为ABT 869，可从Genentech获得)；苹果酸舒尼替尼/>博舒替尼(4-[((2,4-二氯-5-甲氧基苯基)氨基]-6-甲氧基-7-[3-(4-甲基哌嗪-1-基)丙氧基]喹啉-3-腈，也称为SKI-606，在美国专利号6,780,996中描述)；达沙替尼/>帕唑帕尼/>索拉非尼/>凡德他尼(ZD6474)；和伊马替尼或甲磺酸伊马替尼(/>和/>)。
在某些实施方案中，细胞疗法可以与血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂联合使用，所述血管内皮生长因子(VEGF)受体抑制剂包括但不限于贝伐单抗阿昔替尼/>丙氨酸布立尼布(BMS-582664、(S)—((R)-1-(4-(4-氟-2-甲基-1H-吲哚-5-基氧基)-5-甲基吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪-6-基氧基)丙-2-基)2-氨基丙酸酯)；索拉非尼/>帕唑帕尼/>苹果酸舒尼替尼/>西地尼布(AZD2171、CAS 288383-20-1)；尼达尼布(BIBF1120、CAS 928326-83-4)；Foretinib(GSK1363089)；替拉替尼(BAY57-9352、CAS 332012-40-5)；阿帕替尼(YN968D1、CAS811803-05-1)；伊马替尼/>帕纳替尼(AP24534、CAS 943319-70-8)；替沃扎尼(AV951、CAS 475108-18-0)；瑞戈非尼(BAY73-4506、CAS 755037-03-7)；瓦他拉尼二盐酸盐(PTK787、CAS 212141-51-0)；布立尼布(BMS-540215、CAS 649735-46-6)；凡德他尼(或AZD6474)；二磷酸莫替沙尼(AMG706、CAS 857876-30-3、N-(2,3-二氢-3,3-二甲基-1H-吲哚-6-基)2-[(4-吡啶基甲基)氨基]-3-吡啶甲酰胺，在PCT公开号WO 02/066470中描述)；多韦替尼二乳酸(TKI258、CAS 852433-84-2)；Linfanib(ABT869、CAS 796967-16-3)；卡博替尼(XL184、CAS 849217-68-1)；来他替尼(CAS 111358-88-4)；N-[5-[[[5-(1,1-二甲基乙基)-2-噁唑基]甲基]硫代]-2-噻唑基]-4-哌啶甲酰胺(BMS38703、CAS 345627-80-7)；(3R,4R)-4-氨基-1((4-((3-甲氧基苯基)氨基)吡咯并[2,1-f][1,2,4]三嗪-5-基)甲基)哌啶-3-醇(BMS690514)；N-(3,4-二氯-2-氟苯基)-6-甲氧基-7-[[(3aα,5β,6aα)-八氢-2-甲基环戊[c]吡咯-5-基]甲氧基]-4-氨基喹唑啉(XL647、CAS 781613-23-8)；4-甲基-3-[[1-甲基-6-(3-吡啶基)-1H-吡唑并[3,4-d]嘧啶-4-基]氨基]-N-[3-(三氟甲基)苯基]-苯甲酰胺(BHG712、CAS 940310-85-0)；和阿柏西普/>
在一些实施方案中，本文描述的细胞疗法可以与PI3K抑制剂联合使用。PI3K抑制剂可以是PI3K的δ和γ亚型的抑制剂。PI3K抑制剂的实例包括但不限于，4-[2-(1H-吲唑-4-基)-6-[[4-(甲基磺酰基)哌嗪-1-基]甲基]噻吩并[3,2-d]嘧啶-4-基]吗啉；2-甲基-2-[4-[3-甲基-2-氧代-8-(喹啉-3-基)-2,3-二氢咪唑并[4,5-c]喹啉-1-基]苯基]丙腈；4-(三氟甲基)-5-(2,6-二吗啉代嘧啶-4-基)吡啶-2-胺；陶扎色替(VX680或MK-0457、CAS 639089-54-6)；(5Z)-5-[[4-(4-吡啶基)-6-喹啉基]亚甲基]-2,4-噻唑烷二酮(GSK1059615、CAS958852-01-2)；(1E,4S,4aR,5R,6aS,9aR)-5-(乙酰氧基)-1-[(二-2-丙烯基氨基)亚甲基]-4,4a,5,6,6a,8,9,9a-八氢-11-羟基-4-(甲氧基甲基)-4a,6a-二甲基-环戊[5,6]萘并[1,2-c]吡喃-2,7,10(1H)-三酮(PX866、CAS 502632-66-8)；8-苯基-2-(吗啉-4-基)-苯并二氢吡喃-4-酮(LY294002、CAS 154447-36-6)；2-氨基-8-乙基-4-甲基-6-(1H-吡唑-5-基)吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(SAR 245409或XL 765)；1,3-二氢-8-(6-甲氧基-3-吡啶基)-3-甲基-1-[4-(1-哌嗪基)-3-(三氟甲基)苯基]-2H-咪唑并[4,5-c]喹啉-2-酮、(2Z)-2-丁烯二酸酯(1:1)(BGT 226)；5-氟-3-苯基-2-[(1S)-1-(9H-嘌呤-6-基氨基)乙基]-4(3H)-喹唑啉酮(CAL101)；2-氨基-N-[3-[N-[3-[(2-氯-5-甲氧基苯基)氨基]喹喔啉-2-基]氨磺酰基]苯基]-2-甲基丙酰胺(SAR 245408或XL 147)；和(S)-吡咯烷-1,2-二羧酸2-酰胺1-({4-甲基-5-[2-(2,2,2-三氟-1,1-二甲基-乙基)-吡啶-4-基]-噻唑-2-基}-酰胺)(BYL719)。
在一些实施方案中、本文描述的细胞疗法可以与mTOR抑制剂联合使用，例如，一种或多种mTOR抑制剂选自雷帕霉素、替西罗莫司AZD8055、BEZ235、BGT226、XL765、PF-4691502、GDC0980、SF1126、OSI-027、GSK1059615、KU-0063794、WYE-354、Palomod529(P529)、PF-04691502或PKI-587、地磷莫司(正式称为deferolimus、(1R,2R,4S)-4-[(2R)-2[(1R,9S,12S,15R,16E,18R,19R,21R,23S,24E,26E,28Z,30S,32S,35R)-1,18-二羟基-19,30-二甲氧基-15,17,21,23、29,35-六甲基-2,3,10,14,20-五氧代-11,36-二氧杂-4-氮杂三环[30.3.1.04,9]三十六烷-16,24,26,28-四烯-12-基]丙基]-2-甲氧基环己基二甲基次膦酸酯，也称为AP23573和MK8669，并且在PCT公开号WO 03/064383中描述)；依维莫司(/>或RAD001)；雷帕霉素(AY22989、/>)；simapimod(CAS 164301-51-3)；emsirolimus、(5-{2,4-双[(3S)-3-甲基吗啉-4-基]吡啶并[2,3-d]嘧啶-7-基}-2-甲氧基苯基)甲醇(AZD8055)；2-氨基-8-[反式-4-(2-羟基乙氧基)环己基]-6-(6-甲氧基-3-吡啶基)-4-甲基-吡啶并[2,3-d]嘧啶-7(8H)-酮(PF04691502、CAS 1013101-36-4)；和N2-[1,4-二氧代-4-[[4-(4-氧代-8-苯基-4H-1-苯并吡喃-2-基)吗啉鎓-4-基)甲氧基]丁基]-L-精氨酰基甘氨酰基-L-α-天冬氨酰L-丝氨酸-，内盐(SF1126、CAS936487-67-1)、(1r,4r)-4-(4-氨基-5-(7-甲氧基-1H-吲哚-2-基)咪唑并[1,5-f][1,2,4]三嗪-7-基)环己烷甲酸(OSI-027)；和XL765中的一种或多种。
在一些实施方案中，细胞疗法可以与BRAF抑制剂例如GSK2118436、RG7204、PLX4032、GDC-0879、PLX4720和甲苯磺酸索拉非尼(Bay 43-9006)联合使用。在另外的实施方案中，BRAF抑制剂包括但不限于，瑞戈非尼(BARG73-4506、CAS 755037-03-7)；tuvizanib(AV951、CAS 475108-18-0)；维罗非尼(PLX-4032、CAS918504-65-1)；康奈非尼(还称为LGX818)；1-甲基-5-[[2-[5-(三氟甲基)-1H-咪唑-2-基]-4-吡啶基]氧基]-N-[4-(三氟甲基)苯基-1H-苯并咪唑-2-胺(RAF265、CAS 927880-90-8)；5-[1-(2-羟乙基)-3-(吡啶-4-基)-1H-吡唑-4-基]-2,3-二氢茚-1-酮肟(GDC-0879、CAS 905281-76-7)；5-[2-[4-[2-(二甲基氨基)乙氧基]苯基]-5-(4-吡啶基)-1H-咪唑-4-基]-2,3-二氢-1H-茚-1-酮肟(GSK2118436或SB590885)；(+/-)-甲基(5-(2-(5-氯-2-甲基苯基)-1-羟基-3-氧代-2,3-二氢-1H-异吲哚-1-基)-1H-苯并咪唑-2-基)氨基甲酸酯(还称为XL-281和BMS908662)和N-(3-(5-氯-1H-吡咯并[2,3-b]吡啶-3-羰基)-2,4-二氟苯基)丙烷-1-磺酰胺(还称为PLX4720)。
在一些实施方案中，本文描述的细胞疗法可以与MEK抑制剂联合使用。可以联合使用任何MEK抑制剂，包括但不限于，司美替尼(5-[(4-溴-2-氯苯基)氨基]-4-氟-N-(2-羟基乙氧基)-1-甲基-1H-苯并咪唑-6-甲酰胺、还称为AZD6244或ARRY 142886)；ARRY-142886曲美替尼二甲亚砜(GSK-1120212、CAS 1204531-25-80)；G02442104(还称为GSK1120212)、RDEA436；N-[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-6-甲氧基苯基]-1-[(2R)-2,3-二羟丙基]-环丙烷磺酰胺(还称为RDEA119或BAY869766)；RDEA119/BAY 869766、AS703026；G00039805(还称为AZD-6244或司美替尼)、BIX 02188；BIX 02189；2-[(2-氯-4-碘苯基)氨基]-N-(环丙基甲氧基)-3,4-二氟苯甲酰胺(还称为CI-1040或PD184352)；CI-1040(PD-184352)、N-[(2R)-2,3-二羟基丙氧基]-3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]-苯甲酰胺(还称为PD0325901)；PD03259012'-氨基-3'-甲氧基黄酮(还称为PD98059、可从BiaffinGmbH&Co.,KG,Germany获得)；PD98059、2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(还称为U0126)；U0126、XL-518(还称为GDC-0973、Cas No.1029872-29-4、可从ACC Corp.获得)；GDC-0973(甲酮、[3,4-二氟-2-[(2-氟-4-碘苯基)氨基]苯基][3-羟基-3-(25)-2-哌啶基-1-氮杂环丁烷基]-)、G-38963；和G02443714(还称为AS703206)、或其药学上可接受的盐或溶剂化物。MEK抑制剂的其他实例包括但不限于，benimetinib(6-(4-溴-2-氟苯基氨基)-7-氟-3-甲基-3H-苯并咪唑-5-羧酸(2-羟基乙氧基)-酰胺，还称为MEK162、CAS 1073666-70-2)；2,3-双[氨基[(2-氨基苯基)硫代]亚甲基]-丁二腈(还称为U0126，并在美国专利号2,779,780中描述)；(3S,4R,5Z,8S,9S,11E)-14-(乙氨基)-8,9,16-三羟基-3,4-二甲基-3,4,9,19-四氢-1H-2-苯并噁环十四烷-1,7(8H)-二酮](还称为E6201)；维罗非尼(PLX-4032、CAS 918504-65-1)；(R)-3-(2,3-二羟丙基)-6-氟-5-(2-氟-4-碘苯基氨基)-8-甲基吡啶并[2,3-d]嘧啶-4,7(3H、8H)-二酮(TAK-733、CAS 1035555-63-5)；pimasertib(AS-703026、CAS 1204531-26-9)；2-(2-氟-4-碘苯基氨基)-N-(2-羟基乙氧基)-1,5-二甲基-6-氧代-1,6-二氢吡啶-3-甲酰胺(AZD 8330)；和3,4-二氟-2-[((2-氟-4-碘苯基)氨基]-N-(2-羟基乙氧基)-5-[(3-氧代-[1,2]恶嗪烷-2-基)甲基]苯甲酰胺(CH 4987655或Ro 4987655)。
在一些实施方案中，本文所述的细胞疗法可以与JAK2抑制剂例如CEP-701、INCB18424、CP-690550(托法替尼)联合使用。实例JAK抑制剂包括但不限于，鲁索替尼(ruxolitinib)；托法替尼(CP690550)；阿昔替尼(AG013736、CAS 319460-85-0)；5-氯-N2-[(1S)-1-(5-氟-2-嘧啶基)乙基]-N4-(5-甲基-1H-吡唑-3-基)-12,4-嘧啶二胺(AZD1480、CAS935666-88-9)；(9E)-15-[2-(1-吡咯烷基)乙氧基]-7,12,26-三氧杂-19,21,24-三氮杂四环[18.3.1.12,5.114,18]-二十六碳-1(24),2,4,9,14,16,18(25),20,22-壬烯(SB-1578、CAS 937273-04-6)；莫洛替尼(CYT 387)；巴瑞替尼(INCB-028050或LY-3009104)；帕西替尼(SB1518)；(16E)-14-甲基-20-氧杂-5,7,14,27-四氮杂四环[19.3.1.12,6.18,12]二十七烷-1(25),2,4,6(27),8,10,12(26),16,21,23-癸烯(SB 1317)；甘多替尼(LY2784544)；和N,N-ci环丙基-4-[(1,5-二甲基-1H-吡唑-3-基)氨基]-6-乙基-1,6-二氢-1-甲基咪唑[4,5-d]吡咯并[2,3-b]吡啶-7-羧酰胺(BMS 911543)。
在一些实施方案中，本文公开的组合疗法包括紫杉醇或紫杉醇药剂，例如，蛋白质结合的紫杉醇(例如，/>)。示例性紫杉醇药剂包括但不限于，纳米颗粒白蛋白结合的紫杉醇(ABRAX-ANE、由Abraxis Bioscience销售)、二十二碳六烯酸结合的紫杉醇(DHA-紫杉醇、Taxoprexin、由Protarga销售)、聚谷氨酸结合的紫杉醇(PG-紫杉醇、聚谷氨酸紫杉醇、CT-2103、XYOTAX、由Cell Therapeutic销售)、肿瘤激活的前药(TAP)、ANG105(与紫杉醇的三个分子结合的血管抑肽-2、由Im-munoGen销售)、紫杉醇-EC-1(与erbB2识别肽EC-1结合的紫杉醇；参见Li等人，Biopolymers(2007)87:225-230)和葡萄糖缀合的紫杉醇(例如，琥珀酸2'-紫杉醇甲基2-吡喃葡萄糖酯)。
方法
本公开提供了用于产生工程化细胞的方法。在一些实施方案中，该方法可以包括(a)将表达嵌合多肽的核酸分子递送到细胞中；和(b)在细胞中表达核酸分子，从而产生工程化细胞。嵌合多肽可以是如本文所述的嵌合抗原受体。
本公开还提供了用于施用如本文所述的工程化细胞的方法。工程化细胞可以是工程化免疫细胞。工程化免疫细胞可以是T细胞。工程化免疫细胞可以源自于自体T细胞。工程化免疫细胞可以源自于同种异体T细胞。
在一些实施方案中，本文提供了用于施用包含嵌合多肽的工程化免疫细胞的方法，该嵌合多肽包括(i)能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分，和(ii)当嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时能够实现工程化免疫细胞死亡的诱导型细胞死亡部分。增强子部分可以与诱导型细胞死亡部分连接。工程化免疫细胞还可包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含结合部分。结合部分可包含第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答。结合部分还可包含能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的单个CAR可包含(i)第一抗原结合结构域，(ii)第二抗原结合结构域，或(iii)第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域两者。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。
在一些实施方案中，本文提供了施用工程化免疫细胞的方法，该工程化免疫细胞包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该CAR包含结合部分。结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域和能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。在一些情况下，可将工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)灭活。与包含一种或多种CAR但没有增强子部分的其他工程化免疫细胞相比，工程化免疫细胞可(i)在存在与工程化免疫细胞异源的细胞(例如，癌细胞、免疫细胞或两者)的情况下通过在体外保持存活至少约5、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、150、200、250、300、350、400、450、500或更多天而表现出增强的持久性程度，(ii)在15天内表现出至少约2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、15倍、20倍、25倍、30倍、35倍、40倍、45倍、50倍、55倍、60倍、65倍、70倍、75倍、80倍、85倍、90倍、95倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、200倍、250倍、300倍或更多倍的增强的扩增程度，或(iii)对包含免疫细胞抗原或疾病相关抗原的靶细胞表现出增强的细胞毒性。在一些情况下，工程化免疫细胞可在30天内表现出至少约50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍、110倍、120倍、130倍、140倍、150倍、160倍、170倍、180倍、190倍、200倍、210倍、220倍、230倍、240倍、250倍、260倍、270倍、280倍、290倍、300倍、350倍、400倍、450倍、500倍或更多倍的增强的扩增程度。在一些情况下，工程化免疫细胞可在60天内表现出至少约100倍、200倍、300倍、400倍、500倍、600倍、700倍、800倍、900倍、1,000倍、2,000倍、3,000倍、4,000倍、5,000倍、6,000倍、7,000倍、8,000倍、9,000倍、10,000倍、20,000倍、30,000倍、40,000倍、50,000倍、60,000倍、70,000倍、80,000倍、90,000倍、100,000倍、200,000倍、300,000倍、400,000倍、500,000倍、600,000倍、700,000倍、800,000倍、900,000倍、1,000,000倍或更多倍的增强的扩增程度。可以在刺激存在下，例如通过癌抗原或癌细胞的刺激，测量存活力或扩增。可以在多轮或重复刺激的存在下测量存活力或扩增。
在一些实施方案中，本文提供了施用包含功能上灭活的T细胞受体(TCR)的细胞(例如，工程化免疫细胞)的方法。该细胞还可包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)。一种或多种CAR中的每个单个CAR可包含结合部分。结合部分可包含(i)第一抗原结合结构域，当施用于受试者时该第一抗原结合结构域抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答，和(ii)与疾病相关抗原结合的第二抗原结合结构域。一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。
在一些实施方案中，本文提供了施用工程化免疫细胞的方法，所述工程化免疫细胞包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化细胞还可包含嵌合抗原受体(CAR)，该嵌合抗原受体(CAR)包含特异性结合CD7的抗原结合结构域。CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。工程化免疫细胞中的内源性CD7可以被灭活。在一些实施方案中，工程化细胞可以包含CAR，所述CAR包含特异性结合免疫细胞抗原的抗原结合结构域。免疫细胞抗原可以是本文所述的任何免疫细胞抗原，例如CD2、CD3、CD4、CD5、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ和SLAMF7。抗原结合结构域结合的工程化细胞的内源性免疫细胞抗原可以在工程化细胞中被灭活。
在一些实施方案中，本文提供了施用包含单一嵌合抗原受体(CAR)的工程化免疫细胞的方法，并且单个CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。CAR还可包含上述的铰链结构域、跨膜结构域和细胞内信号传导区。
本公开还提供了治疗或诊断受试者中的疾病的方法。在一些情况下，该方法包括将包含工程化免疫细胞的药物组合物施用给受试者。药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于同种异体免疫细胞。源自同种异体免疫细胞的工程化免疫细胞可能不会在受试者中诱导移植物抗宿主病(GVHD)。药物组合物中的工程化免疫细胞可以源自于自体免疫细胞。在一些情况下，药物组合物中的工程化免疫细胞的内源性TCR是功能上灭活的。与具有功能活性的TCR的免疫细胞相比，工程化免疫细胞可以降低受试者中的GVHD。在一些情况下，药物组合物中工程化免疫细胞的内源性MHC分子(如B2M)是功能灭活的。相比于具有功能活性MHC分子(如B2M)的免疫细胞，该工程化免疫细胞可以减少受试者的GVHD。该疾病可以是癌症。例如，癌症可以是淋巴瘤或白血病。
本公开还提供了递送同种异体细胞疗法的方法，包括向有需要的受试者施用工程化免疫细胞群体。群体中的单个工程化免疫细胞可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分。结合部分可包含能够结合免疫细胞抗原的第一抗原结合结构域。结合部分还可包含能够结合疾病相关抗原的第二抗原结合结构域。当施用于受试者时，第一抗原结合结构域可以抑制或降低受试者对工程化免疫细胞的免疫应答。工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可被灭活例如，可以使编码TCR的亚基的基因灭活。工程化免疫细胞的内源性MHC分子可被灭活。例如，编码MHC(如B2M)的亚基的基因可被灭活。本文所述的各种基因编辑方法可用于使T细胞的内源性TCR灭活。
在一些实施方案中，本文提供的方法可包括细胞群体的激活。在一些情况下，用于制备工程化免疫细胞的细胞可以在制备工程化免疫细胞之前被激活。在一些情况下，工程化免疫细胞可以被激活。如本文所用，激活可以指细胞从静止状态转变为活性状态的过程。该过程可包括对抗原的应答、迁移和/或表型或遗传改变为功能活性状态。在一些实施方案中，激活可以指T细胞激活的逐步过程。在一些情况下，T细胞可能需要一个或多个信号来被激活。例如，T细胞可能需要至少两个信号来被完全激活。第一信号可在TCR与抗原-MHC复合物接合后出现，且第二信号可通过共刺激分子的接合而出现。在体外，抗CD3抗体(或其功能变体)可以模拟第一信号，且抗CD28抗体(或其功能变体)可以模拟第二信号。
在一些实施方案中，本文提供的方法可包括细胞群体的激活。激活可以通过使细胞群体与表面接触来进行，该表面具有附着于其上的可以刺激CD3 TCR复合物相关信号的试剂和可以刺激细胞表面上的共刺激分子的配体。特别地，T细胞群体可以例如通过与抗CD3抗体或其抗原结合片段、或固定化在表面上的抗CD2抗体接触，或通过与有时与钙离子载体结合的蛋白激酶C激活剂(例如苔藓抑素)接触而被体外刺激。为了共刺激T细胞表面上的辅助分子，可以使用结合辅助分子的配体。例如，可以在可刺激T细胞增殖的条件下使细胞群体与抗CD3抗体和抗CD28抗体接触。在一些情况下，4-1BB可用于刺激细胞。例如，可用4-1BB和IL-21或另一种细胞因子刺激细胞。为了激活CD4 T细胞或CD8 T细胞，可以使用抗CD3抗体和抗CD28抗体。例如，提供信号的试剂可以在溶液中或与固相表面缀合。颗粒与细胞的比例可取决于相对于靶细胞的粒度。在另外的实施方案中，细胞(例如T细胞)可以与试剂包被的珠结合，其中珠和细胞可以随后被分离，并任选地培养。每个珠可以用抗CD3抗体或抗CD28抗体包被，或者在一些情况下用两者的组合包被。在替代实施方案中，在培养之前，不分离试剂包被的珠和细胞，而是一起培养。细胞表面蛋白可通过使顺磁珠(3x28个珠)接触T细胞而缀合，抗CD3抗体和抗CD28抗体可附着至顺磁珠。在一个实施方案中，将细胞和珠(例如，1:1的比例的M-450CD3/CD28 T顺磁珠)在缓冲液中组合，该缓冲液例如为磷酸盐缓冲盐水(PBS)(例如，没有诸如钙和镁的二价阳离子)。可以使用任何细胞浓度。可以将混合物培养约数小时(例如约3小时)至约14天，或两者之间的任何小时整数值。在另一个实施方案中，可以将混合物培养约21天或培养至多约21天。适用于T细胞培养的条件可包括适当的培养基(例如，最低必需培养基或RPMI培养基1640或X-vivo 5，(Lonza))，其可以包含增殖和存活力所需的因子，包括血清(例如，胎牛或人血清)、白介素2(IL-2)、胰岛素、IFN-g、IL-4、IL-7、GM-CSF、IL-10、IL-21、IL-15、TGFβ和TNFα或细胞生长的任何其他添加剂。用于细胞生长的其他添加剂包括但不限于，表面活性剂、人血浆蛋白粉和还原剂，例如N-乙酰基-半胱氨酸和2-巯基乙醇。培养基可以包括RPMI 1640、A1 M-V、DMEM、MEM、α-MEM、F-12、X-Vivo 1、and X-Vivo 20、优化剂(Optimizer)，具有添加的氨基酸、丙酮酸钠和维生素(无血清或补充有适当量的血清(或血浆)或确定的激素集，和/或足以使T细胞生长和扩增的量的细胞因子。抗生素(例如青霉素和链霉素)可以仅包括在实验培养物中，可能不包括在要输注至受试者体中的细胞培养物中。靶细胞可以维持在支持生长的必要条件下；例如，适当的温度(例如，37℃)和气氛(例如，空气加5％CO2)。在一些情况下，已经暴露于不同刺激时间的T细胞可以表现出不同的特性。在一些情况下，可以使用抗人CD3、CD28、CD2或其任何组合的可溶性单特异性四聚体抗体。在一些实施方案中，激活可以利用激活部分、共刺激剂及其任何组合。在一些实施方案中，激活部分结合：CD3/T细胞受体复合物和/或提供共刺激。在一些实施方案中，激活部分是抗CD3抗体和/或抗CD28抗体中的任何一种。在一些实施方案中，固相是珠、板和/或基质中的至少一种。在一些实施方案中，固相是珠。替代地或附加地，激活部分可以不与底物缀合，例如，激活部分可以在介质中自由漂浮。
在一些情况下，可以通过与组织或细胞共培养来激活或扩增细胞群体。细胞可以是抗原呈递细胞。人工抗原呈递细胞(aAPC)可以表达T细胞受体和共刺激分子的配体，并可以激活和扩增T细胞以转移，同时在一些情况下提高其效能和功能。可以对aAPC工程化以表达用于T细胞激活的任何基因。可以对aAPC工程化以表达用于T细胞扩增的任何基因。aAPC可以是珠、细胞、蛋白质、抗体、细胞因子或任何组合。aAPC可以向可以经历基因组移植的细胞群体递送信号。例如，aAPC可以递送信号1、信号2、信号3或任何组合。信号1可以是抗原识别信号。例如，信号1可以是TCR通过肽-MHC复合物的连接，或者是针对CD3的激动性抗体的结合，其可导致CD3信号转导复合物的激活。信号2可以是共刺激信号。例如，共刺激信号可以是分别与ICOS-L、CD70和4-1BBL结合的抗CD28、诱导型共刺激物(ICOS)、CD27和4-1BB(CD137)。信号3可以是细胞因子信号。细胞因子可以是任何细胞因子。细胞因子可以是IL-2、IL-7、IL-12、IL-15、IL-21或其任何组合。在一些情况下，人工抗原呈递细胞(aAPC)可用于激活和/或扩增细胞群体。在一些情况下，人工制品可能不会诱导同种异型特异性(allospecificity)。在一些情况下，aAPC可能不表达HLA。可以对aAPC进行基因修饰以稳定表达可用于激活和/或刺激的基因。在一些情况下，K562细胞可用于激活。K562细胞也可以用于扩增。K562细胞可以是人红白血病细胞系。可以将K562细胞工程化以表达目标基因。K562细胞可以不内源性表达HLA I类、II类或CD1d分子，但可表达ICAM-1(CD54)和LFA-3(CD58)。可以将K562工程化以向T细胞递送信号1。例如，可以将K562细胞工程化以表达HLAI类。在一些情况下，可以将K562细胞工程化以表达另外的分子，例如B7、CD80、CD83、CD86、CD32、CD64、4-1BBL、抗CD3、抗-CD3 mAb、抗CD28、抗CD28mAb、CD1d、抗CD2、膜结合的IL-15、膜结合的IL-17、膜结合的IL-21、膜结合的IL-2、截短的CD19或任何组合。在一些情况下，除了CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可以表达抗CD3 mAb的膜形式、克隆OKT3。在一些情况下，除了CD80和CD83之外，工程化K562细胞还可以表达抗CD3 mAb的膜形式、克隆OKT3、抗-CD28 mAb的膜形式。
aAPC可以是珠。球形聚苯乙烯珠可用抗CD3和抗CD28的抗体包被，并用于T细胞激活。珠可具有任何尺寸。在一些情况下，珠可以是3和6微米或可以是约3和6微米。珠的尺寸可以是4.5微米或可以是约4.5微米。可以任何细胞与珠的比例使用珠。例如，可以在每毫升一百万个细胞下使用三比一的珠与细胞比。aAPC也可以是刚性球形颗粒、聚苯乙烯乳胶微珠、磁性纳米粒或微粒、纳米尺寸的量子点、4，聚(乳酸-共-乙醇酸)(PLGA)微球、非球形颗粒、5，碳纳米管束、6，椭球PLGA微粒、7，纳米蠕虫(nanoworm)、含流体脂质双层的系统、8，支持2D的脂质双层(2D-SLB)、9，脂质体、10，RAFT体(RAFTsome)/微结构域脂质体、11，SLB颗粒或其任何组合。在一些情况下，aAPC可以扩增CD4 T细胞。例如，可以将aAPC工程化以模拟HLA II类限制性CD4 T细胞的抗原加工和递送通路。可以将K562工程化以表达HLA-D、DPα、DPβ链、Ii、DMα、DMβ、CD80、CD83或其任何组合。例如，可以用HLA限制肽对工程化K562细胞进行脉冲，以扩增HLA限制的抗原特异性CD4 T细胞。在一些情况下，可以将aAPC与外源引入的细胞因子结合使用，以进行T细胞激活、扩增或任何组合。将基因组移植的细胞施用到受试者中后，细胞也可以在体内扩增，例如在受试者的血液中。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括细胞群体的转导。在一些实施方案中，方法包括引入编码细胞受体(如嵌合抗原受体和/或T细胞受体)的多核苷酸。在一些情况下，可以进行细胞的转染。
在一些实施方案中，产生了包含编码细胞受体例如CAR和/或TCR的多核苷酸的病毒上清液。在一些实施方案中，病毒载体可以是逆转录病毒载体、慢病毒载体和/或腺相关病毒载体。包装细胞可用于形成能够感染宿主细胞的病毒颗粒。此类细胞可以包括293细胞(例如，用于包装腺病毒)和Psi2细胞或PA317细胞(例如，用于包装逆转录病毒)。病毒载体可以通过产生将核酸载体包装到病毒颗粒中的细胞系来产生。载体可以包含包装和随后整合到宿主所需的最小病毒序列。载体可包含被待表达的多核苷酸的表达盒替代的其他病毒序列。缺失的病毒功能可以通过包装细胞系反式提供。例如，AAV载体可以包含来自AAV基因组的ITR序列，该ITR序列是包装和整合到宿主基因组中所需要的。病毒DNA可以包装在细胞系中，该细胞系可以包含编码其他AAV基因(即rep和cap)的辅助质粒，而缺少ITR序列。该细胞系也可以用腺病毒作为辅助病毒而感染。辅助病毒可促进AAV载体的复制和辅助质粒中AAV基因的表达。腺病毒的污染可以通过例如腺病毒比AAV更敏感的热处理来减少。可以使用将核酸递送至细胞的另外方法，例如，如通过引用并入本文的US20030087817中所述。
在一些实施方案中，宿主细胞可以用本文所述的一种或多种载体瞬时或非瞬时转染。细胞可以如它在受试者中自然存在的那样被转染。细胞可以取自或源自于受试者并被转染。细胞可以源自于从受试者获得的细胞，例如细胞系。在一些实施方案中，用本文所述的一种或多种载体转染的细胞用于建立包含一个或多个载体衍生序列的新细胞系。用于真核宿主细胞的载体的非限制性实例包括但不限于：pBs、pQE-9(Qiagen)、噬菌体脚本(phagescript)、PsiX174、pBluescript SK、pBsKS、pNH8a、pNH16a、pNH18a、pNH46a(Stratagene)；pTrc99A、pKK223-3、pKK233-3、pDR54O、pRIT5(Pharmacia)。真核的：pWL-neo、pSv2cat、pOG44、pXT1、pSG(Stratagene)pSVK3、pBPv、pMSG、pSVL(Pharmiacia)。此外，可以使用任何其他质粒和载体，只要它们在选择的宿主中是可复制的和可存活的即可。可将任何载体和可商购的那些载体(及其变体或衍生物)工程化以包括用于该方法的一个或多个重组位点。此类载体可以从例如，向量实验有限公司(Vector Laboratories Inc.)、英杰公司(Invitrogen)、普洛麦格(Promega)、安诺伦(Novagen)、NEB、科莱诗(Clontech)、柏林格曼海姆(Boehringer Mannheim)、法玛西亚(Pharmacia)、依皮森特(EpiCenter)、奥利金科技有限公司(OriGenes Technologies Inc.)、斯特拉塔基因(Stratagene)、珀金埃尔默(PerkinElmer)、帕哈密跟(Pharmingen)和研究遗传公司(Research Genetics)获得。其他目标载体包括真核表达载体，例如pFastBac、pFastBacHT、pFastBacDUAL、pSFV和pTet-Splice(英杰公司)、pEUK-C1、pPUR、pMAM、pMAMneo、pBI101、pBI121、pDR2、pCMVEBNA和pYACneo(科莱诗)、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110和pKK232-8(法玛西亚有限公司)、p3'SS、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、and pOG44(斯特拉塔基因有限公司)和pYES2、pAC360、pBlueBa-cHis A、B和C、pVL1392、pBlueBac111、pCDM8、pcDNA1、pZeoSV、pcDNA3 pREP4、pCEP4和pEBVHis(英杰公司)及其变体或衍生物。其他载体包括pUC18、pUC19、pBlueScript、pSPORT、粘粒、噬菌粒、YAC(酵母人工染色体)、BAC(细菌人工染色体)、P1(大肠杆菌(Escherichia coli)噬菌体)、pQE70、pQE60、pQE9(quagan)、pBS载体、PhageScript载体、BlueScript载体、pNH8A、pNH16A、pNH18A、pNH46A(斯特拉塔基因)、pcDNA3(英杰公司)、pGEX、pTrsfus、pTrc99A、pET-5、pET-9、pKK223-3、pKK233-3、pDR540、pRIT5(法玛西亚)、pSPORT1、pSPORT2、pCMVSPORT2.0和pSYSPORT1(英杰公司)及其变体或衍生物。另外的目标载体还可包括来自英杰公司的pTrxFus、pThioHis、pLEX、pTrcHis、pTrcHis2、pRSET、pBlueBa-cHis2、pcDNA3.1/His、pcDNA3.1(-)/Myc-His、pSecTag、pEBVHis、pPIC9K、pPIC3.5K、pA081S、pPICZ、pPICZA、pPICZB、pPICZC、pGAPZA、pGAPZB、pGAPZC、pBlue-Bac4.5、pBlueBacHis2、pMelBac、pSinRep5、pSinHis、pIND、pIND(SP1)、pVgRXR、pcDNA2.1、pYES2、pZEr01.1、pZErO-2.1、pCR-Blunt、pSE280、pSE380、pSE420、pVL1392、pVL1393、pCDM8、pcDNA1.1、pcDNA1.1/Amp、pcDNA3.1、pcDNA3.1/Zeo、pSe、SV2、pRc/CMV2、pRc/RSV、pREP4、pREP7、pREP8、pREP9、pREP10、pCEP4、pEBVHis、pCR3.1、pCR2.1、pCR3.1-Uni和pCRBac；来自法玛西亚的X ExCell、X gt11、pTrc99A、pKK223-3、pGEX-1X T、pGEX-2T、pGEX-2TK、pGEX-4T-1、pGEX-4T-2、pGEX-4T-3、pGEX-3X、pGEX-5X-1、pGEX-5X-2、pGEX-5X-3、pEZZ18、pRIT2T、pMC1871、pSVK3、pSVL、pMSG、pCH110、pKK232-8、pSL1180、pNEO和pUC4K；来自安诺伦的pSCREEN-lb(+)、pT7Blue(R)、pT7Blue-2、pCITE-4-abc(+)、pOCUS-2、pTAg、pET-32L1C、pET-30LIC、pBAC-2cp LIC、pBACgus-2cp LIC、pT7Blue-2 LIC、pT7Blue-2、X SCREEN-1、XB1ueSTAR、pET-3abcd、pET-7abc、pET9abcd、pET11 abcd、pET12abc、pET-14b、pET-15b、pET-16b、pET-17b-pET-17xb、pET-19b、pET-20b(+)、pET-21abcd(+)、pET-22b(+)、pET-23abcd(+)、pET-24abcd(+)、pET-25b(+)、pET-26b(+)、pET-27b(+)、pET-28abc(+)、pET-29abc(+)、pET-30abc(+)、pET-31b(+)、pET-32abc(+)、pET-33b(+)、pBAC-1、pBACgus-1、pBAC4x-1、pBACgus4x-1、pBAC-3cp、pBACgus-2cp、pBACsurf-1、plg、Signal plg、pYX、Vecta-Neo、Selecta Vecta-Hyg和Selecta Vecta-Gpt；来自科莱诗的pLexA、pB42AD、pGBT9、pAS2-1、pGAD424、pACT2、pGAD GL、pGAD GH、pGAD10、pGilda、pEZM3、pEGFP、pEGFP-1、pEGFPN、pEGFP-C、pEBFP、pGFPuv、pGFP、p6xHis-GFP、pSEAP2-Basic、pSEAP2-对照、pSEAP2-启动子、pSEAP2-增强子、p I3gal-基础(Basic)、pl3gal-对照、p I3gal-启动子、p I3gal-增强子、pCMV、pTet-Off、pTet-On、pTK-Hyg、pRetro-Off、pRetro-On、pIRES1neo、pIRES1hyg、pLXSN、pLNCX、pLAPSN、pMAMneo、pMAMneo-CAT、pMAMneo-LUC、pPUR、pSV2neo、pYEX4T-1/2/3、pYEX-S1、pBacPAK-His、pBacPAK8/9、pAcUW31、BacPAK6、pTriplEx、2Xgt10、Xgt11、pWE15和XTriplEx；来自斯特拉塔基因的λZAP II、pBK-CMV、pBK-RSV、pBluescript II KS+/-、pBluescript II SK+/-、pAD-GAL4、pBD-GAL4 Cam、pSurfscript、λFIX Ii、λDASH、λEMBL3、λEMBL4、SuperCos、pCR-Scrigt Amp、pCR-Script Cam、pCR-Script Direct、pBS+/-、pBC KS+/-、pBC SK+/-、Phag-escript、pCAL-n-EK、pCAL-n、pCAL-c、pCAL-kc、pET-3abcd、pET-llabcd、pSPUTK、pESP-1、pCMVLacI、pOPRSVI/MCS、pOPI3 CAT、pXT1、pSG5、pPbac、pMbac、pMClneo、pMClneo Poly A、pOG44、p0G45、pFRTI3GAL、pNE0I3GAL、pRS403、pRS404、pRS405、pRS406、pRS413、pRS414、pRS415和pRS416、pPC86、pDBLeu、pDBTrp、pPC97、p2.5、pGAD1-3、pGAD10、pACt、pACT2、pGADGL、pGADGH、pAS2-1、pGAD424、pGBT8、pGBT9、pGAD-GAL4、pLexA、pBD-GAL4、pHISi、pHISi-1、placZi、pB42AD、pDG202、pJK202、pJG4-5、pNLexA、pYESTrp，及其变体或衍生物。在一些实施方案中，载体可以是微环载体。本文提供的载体可用于递送编码CAR和/或TCR的多肽。
转导和/或转染可以通过以下任何一种方法进行：非病毒转染、基因枪、化学转染、电穿孔、核转染、热休克转染、脂质转染、显微注射或病毒转染。在一些实施方案中，提供的方法包括病毒转导，并且病毒转导包括慢病毒。病毒颗粒可用于将包含编码细胞受体的多肽序列的病毒载体离体或体内递送到细胞中。在一些情况下，如本文公开的病毒载体可以pfu(噬菌斑形成单位)为单位被测量。在一些情况下，本公开的组合物和方法的重组病毒或病毒载体的pfu可为约108至约5×1010pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒为至少约1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010和5×1010pfu。在一些情况下，本公开的重组病毒为至多约1×108、2×108、3×108、4×108、5×108、6×108、7×108、8×108、9×108、1×109、2×109、3×109、4×109、5×109、6×109、7×109、8×109、9×109、1×1010、2×1010、3×1010、4×1010和5×1010pfu。在一些实施方案中，本公开的病毒载体可以作为载体基因组被测量。在一些情况下，本公开的重组病毒是1×1010至3×1012个载体基因组，或1×109至3×1013个载体基因组，或1×108至3×1014个载体基因组，或至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018个载体基因组，或者是1×108至3×1014个载体基因组，或者至多约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018个载体基因组。在一些情况下，本文提供的病毒载体可以使用感染复数(MOI)来测量。在一些情况下，MOI可以指载体或病毒基因组与核酸可以被递送到的细胞的比例或倍数。在一些情况下，MOI可为1×106。在一些情况下，MOI可为1×105至1×107。在一些情况下，MOI可为1×104至1×108。在一些情况下，本公开的重组病毒为至少约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018MOI。在一些情况下，本公开的重组病毒为1×108至3×1014MOI，或至多约1×101、1×102、1×103、1×104、1×105、1×106、1×107、1×108、1×109、1×1010、1×1011、1×1012、1×1013、1×1014、1×1015、1×1016、1×1017和1×1018MOI。在一些情况下，病毒载体以每个细胞约1×105、2×105、3×105、4×105、5×105、6×105、7×105、8×105、9×105、1×106、2×106、3×106 4×106、5×106、6×106、7×106、8×106、9×106、1×107、2×107、3×107，或至多约9×109个基因组拷贝/病毒颗粒的感染复数(MOI)被引入。
用本文所述的任何核酸递送平台的细胞的转染(例如转导)效率可以为或可为约20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、99.5％、99.9％或大于99.9％。在一些实施方案中，方法可以包括将感染剂添加到包含细胞群体的组合物中。感染剂可包含聚凝胺。在一些实施方案中，感染剂可以增强病毒感染的效率。感染剂可将病毒感染性提高约100至1,000倍。可以将聚凝胺以每毫升约5ug至10ug的浓度添加到组合物中。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以包括将细胞受体引入细胞的非病毒方法。非病毒方法可以包括但不限于：CRISPR相关蛋白(Cas蛋白，例如Cas9)、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活类效应因子核酸酶(TALEN)，Argonaute核酸酶和大范围核酸酶。核酸酶可以是天然存在的核酸酶、基因修饰的和/或重组的。也可以使用基于转座子的系统(例如PiggyBac，睡美人(Sleeping beauty))进行非病毒方法。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以利用PiggyBac系统将外源多肽引入细胞。PiggyBac系统包含两个组件，转座子和转座酶。PiggyBac转座酶促进转座子特异性整合到随机分散在基因组中的“TTAA”位点处。基因组中预期的“TTAA”的频率在DNA序列的每256个碱基对中约为1。与其他转座子不同，PB转座酶还能够以完全无缝的方式切除转座子，不留下序列或突变。此外，PiggyBac提供很大的载货容量(已证明超过200kb)，而没有已知的上限。PB性能水平可通过密码子优化策略、突变、缺失、添加、取代或其任何组合来提高。在一些情况下，PB可具有更大的携带容量(cargo)(大约9.1-14.3kb)，更高的转座活性，并且其无足迹的特性使其成为基因编辑工具具有吸引力。在一些实施方案中，PB可包括一些特征：高效转座；大的携带容量；长期稳定表达；转基因以单拷贝整合；通过非侵入性标记而不是诸如PCR的传统方法在体内追踪靶基因；易于确定整合位点及其组合。
在一些实施方案中，本文提供的方法可以利用睡美人(SB)系统将编码细胞受体的多肽引入细胞。SB通过体外进化从鲑鱼基因组中发现的古代Tc1/mariner转座子化石工程化。SB ITR(230bp)包含长度为32bp的不完全直接重复序列(DR)，其可以用作转座酶的识别信号。ITR中DR元素之间的结合亲和力和间隔参与转座活动。SB转座酶可以是39kDa蛋白质，具有DNA结合多肽、核定位信号(NLS)和催化结构域，特征是保守氨基酸基序(DDE)。诱变SB转座酶的一级氨基酸序列的各种筛选导致高活性转座酶形式(version)。在一些情况下，可以使用改性的SB。改性的SB可以在原始SB转座子的ITR内包含突变、缺失和添加。改性的SB可以包括：pT2、pT3、pT2B、pT4、SB100X及其组合。改性的SB的非限制性实例可选自：SB10、SB11(为SB10的3倍高)、SB12(为SB10的4倍高)、HSB1-HSB5(为SB10的多达10倍高)、HSB13-HSB17(HSB17为SB10的17倍高)、SB100X(为SB10的100倍高)、SB150X(为SB10的130倍高)及其任何组合。在一些情况下，SB100X与原始重建转座酶(SB10)相比具有100倍高活性。在一些实施方案中，SB转座切除在携带位点留下足迹(3bp)。整合存在于基因组的TA二核苷酸中，并导致由宿主修复机制产生的靶位点重复。在一些情况下，SB似乎拥有几乎无偏差的、接近随机的整合分布。转座子整合可以在野生型系统中被人工靶向(约10％)到预定的基因组基因座，然而在本文提供的嵌合系统中，SB转座子整合可以被定向到预定的基因座，效率超过10％。
在一些实施方案中，可以采用非病毒方法将外源多核酸引入细胞群体。在一些实施方案中，非病毒载体或核酸可以在不使用病毒的情况下被递送，并且可以根据核酸的量进行测量。通常，任何合适量的核酸可以用于本公开的组合物和方法。在一些情况下，核酸可以是至少约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。在一些情况下，核酸可至多为约1pg、10pg、100pg、1pg、10pg、100pg、200pg、300pg、400pg、500pg、600pg、700pg、800pg、900pg、1μg、10μg、100μg、200μg、300μg、400μg、500μg、600μg、700μg、800μg、900μg、1ng、10ng、100ng、200ng、300ng、400ng、500ng、600ng、700ng、800ng、900ng、1mg、10mg、100mg、200mg、300mg、400mg、500mg、600mg、700mg、800mg、900mg、1g、2g、3g、4g或5g。
在一些实施方案中，将CAR和/或TCR序列引入细胞的非病毒方法可包括电穿孔。电穿孔可以使用例如转染系统(赛默飞世尔科学(ThermoFisher Scientific))或核转染(/>Biosystems)进行。可以调节电穿孔参数以优化转染效率和/或细胞存活力。电穿孔设备可以具有多种电波形式的脉冲设置，例如指数衰减、时间常数和方波。每种细胞类型具有唯一的最佳场强(E)，这取决于所施加的脉冲参数(例如电压、电容和电阻)。施加最佳场强通过诱导跨膜电压引起电通透，这使核酸穿过细胞膜。在一些情况下，可以调节电穿孔脉冲电压、电穿孔脉冲宽度、脉冲数、细胞密度和尖端类型，以优化转染效率和/或细胞存活力。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲电压以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔电压可以小于约500伏。在一些情况下，电穿孔电压可为至少约500伏、至少约600伏、至少约700伏、至少约800伏、至少约900伏、至少约1000伏、至少约1100伏、至少约1200伏、至少约1300伏、至少约1400伏、至少约1500伏、至少约1600伏、至少约1700伏、至少约1800伏、至少约1900伏、至少约2000伏、至少约2100伏、至少约2200伏、至少约2300伏、至少约2400伏、至少约2500伏、至少约2600伏、至少约2700伏、至少约2800伏、至少约2900伏或至少约3000伏。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲电压可以是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，1900伏的电穿孔电压可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于Jurkat细胞或原代人细胞例如T细胞，约1350伏的电穿孔电压可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔电压的范围可以是最佳的。例如，对于人578T细胞，约1000伏至约1300伏的电穿孔电压可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，原代细胞可以是原代淋巴细胞。在一些情况下，原代细胞群体可以是淋巴细胞群体。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲宽度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔脉冲宽度可以小于约5毫秒。在一些情况下，电穿孔宽度可为至少约5毫秒、至少约6毫秒、至少约7毫秒、至少约8毫秒、至少约9毫秒、至少约10毫秒、至少约11毫秒、至少约12毫秒、至少约13毫秒、至少约14毫秒、至少约15毫秒、至少约16毫秒、至少约17毫秒、至少约18毫秒、至少约19毫秒、至少约20毫秒、至少约21毫秒、至少约22毫秒、至少约23毫秒、至少约24毫秒、至少约25毫秒、至少约26毫秒、至少约27毫秒、至少约28毫秒、至少约29毫秒、至少约30毫秒、至少约31毫秒、至少约32毫秒、至少约33毫秒、至少约34毫秒、至少约35毫秒、至少约36毫秒、至少约37毫秒、至少约38毫秒、至少约39毫秒、至少约40毫秒、至少约41毫秒、至少约42毫秒、至少约43毫秒、至少约44毫秒、至少约45毫秒、至少约46毫秒、至少约47毫秒、至少约48毫秒、至少约49毫秒或至少约50毫秒。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲宽度可以是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，30毫秒的电穿孔脉冲宽度可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于Jurkat细胞，约10毫秒的电穿孔宽度可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度的范围可以是最佳的。例如，对于人578T细胞，约20毫秒至约30毫秒的电穿孔宽度可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些实施方案中，可以改变电穿孔脉冲的数量以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔可包含单个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包含多于一个脉冲。在一些情况下，电穿孔可包括2个脉冲、3个脉冲、4个脉冲、5个脉冲、6个脉冲、7个脉冲、8个脉冲、9个脉冲或10个或更多个脉冲。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔脉冲数可以是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，使用单个脉冲的电穿孔可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于原代细胞，使用3个脉冲的电穿孔可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔宽度的范围可以是最佳的。例如，对于人细胞，使用约1至约3个脉冲的电穿孔可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
在一些情况下，可以改变电穿孔的起始细胞密度以优化转染效率和/或细胞存活力。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可以小于约1×105个细胞。在一些情况下，电穿孔的起始细胞密度可为至少约1×105个细胞、至少约2×105个细胞、至少约3×105个细胞、至少约4×105个细胞、至少约5×105个细胞、至少约6×105个细胞、至少约7×105个细胞、至少约8×105个细胞、至少约9×105个细胞、至少约1×106个细胞、至少约1.5×106个细胞、至少约2×106个细胞、至少约2.5×106个细胞、至少约3×106个细胞、至少约3.5×106个细胞、至少约4×106个细胞、至少约4.5×106个细胞、至少约5×106个细胞、至少约5.5×106个细胞、至少约6×106个细胞、至少约6.5×106个细胞、至少约7×106个细胞、至少约7.5×106个细胞、至少约8×106个细胞、至少约8.5×106个细胞、至少约9×106个细胞、至少约9.5×106个细胞、至少约1×107个细胞、至少约1.2×107个细胞、至少约1.4×107个细胞、至少约1.6×107个细胞、至少约1.8×107个细胞、至少一个约2×107个细胞、至少约2.2×107个细胞、至少约2.4×107个细胞、至少约2.6×107个细胞、至少约2.8×107个细胞、至少约3×107个细胞、至少约3.2×107个细胞、至少约3.4×107个细胞、至少约3.6×107个细胞、至少约3.8×107个细胞、至少约4×107个细胞、至少约4.2×107个细胞、至少约4.4×107个细胞、至少约4.6×107个细胞、至少约4.8×107个细胞、或至少约5×107个细胞。在一些情况下，最佳转染效率和/或细胞存活力所需的电穿孔起始细胞密度可以是细胞类型特异性的。例如，对于巨噬细胞，1.5×106个细胞的电穿孔的起始细胞密度可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在另一个实例中，对于人细胞，5×106个细胞的电穿孔的起始细胞密度可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。在一些情况下，对于给定的细胞类型，电穿孔的起始细胞密度范围可以是最佳的。例如，对于诸如T细胞的人细胞，电穿孔的起始细胞密度在5.6×106和5×107个细胞之间可以是最佳的(例如，提供最高的存活力和/或转染效率)。
提供了一种用于治疗淋巴恶性肿瘤的方法。该方法可以包括向有需要的患者施用工程化免疫细胞群体。群体中的单个工程化免疫细胞可以包含一种或多种嵌合抗原受体(CAR)，该一种或多种CAR包含结合部分，其中该结合部分可以包含能够结合免疫细胞抗原的抗原结合结构域，并且其中一种或多种CAR中的每个CAR还可包含跨膜结构域和细胞内信号传导区。群体中的单个工程化免疫细胞还可包含能够增强工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分。工程化免疫细胞的内源性T细胞受体(TCR)可被灭活。在一些情况下，在患者外周血中感染的细胞数或骨髓中感染的细胞数可以在最后给予工程化免疫细胞后的一段时间(例如，3周)内减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％％或更多。在一些情况下，最后给予工程化免疫细胞后的一段时间可为约1周、2周、3周、4周、5周或更长时间。患者的外周血中自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量可以在最后给予工程化免疫细胞后的一段时间(例如，3周)内开始增加。在一些情况下，最后给予工程化免疫细胞后的一段时间可为约1周、2周、3周、4周、5周或更长时间。
增强子部分可以增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。增强子部分可以被配置为组成性地增强工程化免疫细胞的一种或多种活性。可将增强子部分配置为组成性地上调工程化免疫细胞的一种或多种细胞内信号传导通路。一种或多种细胞内信号传导通路可以是一种或多种细胞因子信号传导通路。增强子部分可以是细胞因子或细胞因子受体。增强子部分可以选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19，TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
工程化免疫细胞还可包含诱导型细胞死亡部分，其在诱导型细胞死亡部分与细胞死亡激活剂接触时能够实现细胞死亡。诱导型细胞死亡部分可选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。例如，诱导型细胞死亡部分可以是EGFRt，并且细胞死亡激活剂可以是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是HSV-TK，并且细胞死亡激活剂可以是GCV。又例如，诱导型细胞死亡部分可以是iCasp9，并且细胞死亡激活剂可以是AP1903。
编码细胞内源性表面标志物的基因可以被灭活。内源性表面标志物在表达时能够与第一抗原结合结构域结合。内源性表面标志物可以是CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD16a、CD16b、CD25、CD27、CD28、CD30、CD38、CD45、CD48、CD50、CD52、CD56、CD57、CD62L、CD69、CD94、CD100、CD102、CD122、CD127、CD132、CD137、CD160、CD161、CD178、CD218、CD226、CD244、CD159a(NKG2A)、CD159c(NKG2C)、NKG2E、CD279、CD314(NKG2D)、CD305、CD335(NKP46)、CD337、CD319(CS1)、TCRα、TCRβ或SLAMF7。
在外周血中受感染的细胞数量或骨髓中受感染的细胞数量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多之前，患者的外周血中自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量可以开始增加。在外周血中的受感染的细胞数量或骨髓中受感染的细胞数量减少至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或更多之后，外周血中自体T细胞、粒细胞和NK细胞中任何一种或多种的数量可以开始增加。
实施例
尽管已经在本文中示出和描述了本发明的优选实施方案，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些实施方案仅作为实例提供。并非意图通过说明书中提供的具体实施例来限制本发明。尽管已经参考前述说明书描述了本发明，但是本文中的实施方案的描述和图示并不意味着以限制性的意义来解释。在不脱离本发明的情况下，本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和替换。此外，应当理解，本发明的所有方面不限于本文所阐述的具体描述、构造或相对比例，其取决于各种条件和变量。应该理解的是，本文描述的本发明的实施方案的各种替代方案可以用于实施本发明。因此，可以预期的是，本发明还应涵盖任何这样的替代、修改、变化或等同方案。所附权利要求旨在限定本发明的范围，并且由此涵盖这些权利要求范围内的方法和结构及其等同方案。
实施例1CAR T细胞的设计
CAR的结构的设计如图1A、图1B、图1C和图1D所例示。在图1A、图1B、图1C和图1D中，scFv片段代表CD7单克隆抗体的重链和轻链可变区(如SEQ ID No.16所示)、双重-scFv-成环(in loop)代表在环结构中的CD7-CD19双重scFv，还包括：(i)天然CD8铰链区(如SEQ IDNo.18所示)或延伸的CD8铰链区(如SEQ ID No.17所示)，(ii)天然CD8跨膜结构域(TM)(如SEQ ID No.20所示)或延伸的CD8跨膜结构域(TM)(如SEQ ID No.19所示)、天然CD28跨膜结构域(TM)(如SEQ ID No.22所示)或截短的CD28跨膜结构域(TM)(如SEQ ID No.21所示)，(iii)4-1BB共刺激结构域(如SEQ ID No.23所示)或CD28共刺激结构域(如SEQ ID No.24所示)，和(iv)天然CD3ζ细胞内信号传导区(如SEQ ID No.15所示)或截短的CD3ζ细胞内信号传导区(如SEQ ID No.11和SEQ ID No.14所示)，以及任选的(v)串联的失功能插入(图1B中如SEQ ID No.33所示的M1或如SEQ ID No.34所示的M2)。
特别地，图1A、图1B、图1C和图1D中的CAR的结构如表1所示。
表1.本申请的CAR结构的示例性设计
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将CAR基因克隆到pCCL慢病毒载体主链中MND的启动子下以形成pCCL-MND-CAR。通过使用Lipofectamine3000将pCCL-MND-CAR、慢病毒包膜质粒pMD2.G(Addgene，质粒#12259)和慢病毒包装质粒psPAX2(Addgene，质粒#12260)转染到293T细胞中，以制备完整的慢病毒表达载体。在48和72小时收集上清液，并进行超速离心(Merck Millipore)以浓缩。浓缩的病毒准备用于T细胞的转染。
实施例2CRISPR的设计与构建
在网站http：//crispr.mit.edu,www.idtdna.com和https：//www.synthego.com上评价基因编辑效率和脱靶风险后，选择用于基因编辑的CD7和TCR gRNA。本公开中使用的gRNA和HiFi-Cas9蛋白购自集成DNA技术有限公司(Integrated DNA Technologies,Inc(IDT))。
为了基因编辑，将3μg的Cas9蛋白和1.5μg的gRNA以20μl混合，并在37℃或室温下孵育15分钟以形成核糖核蛋白(RNP)。然后通过Lonza 4D核转染将RNP转染到T细胞中。基因敲除效率由如流式细胞术(FACS)检测的表达蛋白质的细胞比例来确定。
我们之前的研究表明TRAC-gRNA1对TCR具有更高的敲除效率。当一起使用CD7的gRNA和TRAC-gRNA以同时敲除CD7和TCR时，四个CD7-gRNA中的三个显示出高效率。选择CD7-gRNA1作为敲除CD7的gRNA。
TRAC-gRNA1：TTCGGAACCCAATCACTGAC，SEQ ID No.41；
CD7-gRNA1：GAGGTCAATGTCTACGGCTC，SEQ ID No.42。
实施例3CAR T细胞的制备
细胞分离和激活
单采血液成分法后，使用Histopaque-1077(西格玛-奥德里奇)通过密度梯度离心分离单核细胞。然后富集T细胞，通过与抗CD3/抗CD28偶联的磁珠激活、培养和扩增。
将具有5％ FBS、2mM L-谷氨酰胺、1mM丙酮酸钠和300IU/ml rhIL2的X-vivo 15用作UCAR T细胞培养基。将细胞孵育并在37℃、5％CO2下培养。
电穿孔和慢病毒感染
富集并激活T细胞后两天，将抗CD3/抗CD28磁珠去除并将细胞收集到管中，并以300g离心5分钟，然后用DPBS洗涤两次，并以50×106/ml的细胞密度重新悬浮在opti-mem中。基于细胞密度计算所需的cas9/gRNARNP的量，然后与细胞混合并转移至4D-Nucleofector System N(Lonza)系统进行电穿孔。然后，将细胞重悬于预热的培养基中达到2×106/ml的密度。将细胞进一步以2-8的MOI进行慢病毒转染，转移至烧瓶中，并在37℃、5％CO2的孵化器中培养。
细胞增殖与CAR阳性比检测
转染后3天，检测细胞数和CAR阳性细胞，并计算T细胞中CAR的阳性比。
实施例4本申请的CAR T细胞针对CCRF CEM细胞的杀伤活性
将CAR T候选细胞或对照T细胞(TCR/CD7双敲除T细胞)与4x104个CCRF CEM细胞以图2所示的E:T比混合在每个孔中，然后将混合物培养6小时。CCRF CEM细胞的杀伤通过萤光酶强度来测量。结果如图2所示。
从结果可以看出，在所有测试的E:T比下，相比于#1CAR T细胞和对照T细胞，#2、#5、#7和#11CAR T细胞针对CCRF CEM展示了更强的杀伤活性，表明通过修饰的CAR T结构改善了CAR T细胞的效力。
实施例5本申请的CAR T细胞的细胞因子释放
将CAR T候选细胞或对照T细胞(TCR/CD7双敲除T细胞)与4x104个CCRF CEM细胞以1:1的E:T比混合在每个孔中，然后将混合物培养24小时。收集细胞培养上清液，并通过CBA测定或ELISA来分析细胞因子，包括IL-2、IL-6、IL-4、IL-10、TNFα、GM-CSF和INF-γ。结果如图3所示。
从结果可以看出，相比于#1CAR T细胞，#2、#5、#7和#11CAR T细胞产生了较少的细胞因子，如促炎细胞因子IL2、IL6、GM-CSF、TNF-α、IFN-γ，表明通过修饰的CAR T结构减少了CRS风险。
实施例6本申请的CAR T细胞在小鼠中的体内抗肿瘤活性
将每只小鼠静脉内接种3x105个肿瘤细胞。4天后，静脉内输注CAR T细胞(每只小鼠3x105个细胞)。图4中的BLI成像结果显示，相比于#1和T细胞对照，#2、#5和#11CAR T细胞展示了强力的体内抗肿瘤效力，表明通过修饰的CAR T结构改善了CAR T功能。
实施例7本申请的双重CAR在T细胞中的表达
双重CAR T候选物在TCR/CD7双敲除T细胞上的表达通过流式细胞术测量，如图5所示。
从图5可以看出，#15、#16和#17双重CAR全部成功在T细胞上表达，而在T细胞上#16和#17双重CAR结构的表达水平与#15双重CAR结构相当。
包含修饰结构18-21的双重CAR T细胞的表达通过流式细胞术测量，如图9所示。可以看出，#18、#19、#20和#21双重CAR全部成功在T细胞上表达。在转导后8天，CAR T细胞展示了与CD7抗原和CD19抗原结合。
实施例8本申请的双重CAR T细胞针对Hela细胞的杀伤活性
将双重CAR T候选细胞或对照T细胞(TCR/CD7双敲除T细胞)与HeLa-CD7+细胞或HeLa-CD19+细胞分别以3:1或1:1的E:T比混合，如图6所示。然后通过xCELLigence实时细胞分析仪(RTCA)实验来测量双重CAR T细胞对HeLa-CD7+细胞和HeLa-CD19+细胞的杀伤。结果如图6所示。
从结果可以看出，在测试的E:T比下，#15、#16和#17双重CAR T细胞全部展示了针对HeLa-CD7+细胞和HeLa-CD19+细胞的杀伤活性，而相比于#15双重CAR T细胞，#16和#17双重CAR T细胞针对HeLa-CD7+细胞和HeLa-CD19+细胞展示了总体更强的杀伤活性，表明通过修饰的CAR T结构改善了双重CAR T细胞的效力。
实施例9本申请的双重CAR T细胞针对CCRF和Nalm6细胞的杀伤活性
将双重CAR T候选细胞或对照T细胞(TCR/CD7双敲除T细胞)与1x104个CCRF LucG细胞或NALM6-LucG细胞以3:1、1:1、1:3和1:9的E:T比混合在每个孔中，如图7所示，然后培养混合物，并分别在6小时和24小时后通过萤光素酶强度测量对CCRF LucG细胞或NALM6-LucG细胞的杀伤。结果如图7和图10所示。
从图7可以看出，在测试的E:T比下，#15、#16和#17双重CAR T细胞全部展示了针对CCRF LucG细胞或NALM6-LucG细胞的杀伤活性，而相比于#15双重CAR T细胞，#16和#17双重CAR T细胞针对CCRF LucG细胞或NALM6-LucG细胞展示了总体更强的杀伤活性，表明通过修饰的CAR T结构改善了双重CAR T细胞的效力。
图10示出了具有修饰结构18-21的双重CAR T的细胞杀伤效力，如从萤光素酶测定所测量的。将CCRF-CEM细胞(急性淋巴母细胞性白血病细胞系)、Nalm6细胞(B细胞前体白血病细胞系)或初代T细胞与包含修饰结构18-21的双重CAR T细胞以5:1、1:1或1:5的比例混合。在多个时间点测量细胞杀伤效力。从结果可以看出，在测试的E:T比下，#18、#19、#20和#21双重CAR T细胞全部展示了针对CCRF LucG细胞或NALM6-LucG细胞的杀伤活性，而相比于#19和#21双重CAR T细胞，#18和#20双重CAR T细胞针对CCRF LucG细胞或NALM6-LucG细胞展示了总体更强的杀伤活性。
实施例10本申请的双重CAR T细胞的细胞因子释放
将双重CAR T候选细胞或对照T细胞(TCR/CD7双敲除T细胞)与1x104个NALM6-LucG细胞以1:1的E:T比混合在每个孔中，然后将混合物培养24小时。收集细胞培养上清液，并通过CBA测定来分析细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-6、IL10、TNFα和IFNγ。结果如图8和图11所示。
从图8可以看出，#16和#17与#15CAR T细胞产生了相当的细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-6、IL10、TNFα和IFNγ，表明修饰的双重CAR T结构的安全性。
图11a和图11b示出了具有修饰结构18-21的双重CAR T细胞在杀伤癌细胞时的细胞因子释放(图11a，CCRF细胞；和图11b，Nalm6细胞)。用与双重CAR T细胞以1:1比例混合的CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞在24小时后进行细胞因子测量。用流式微珠阵列(CBA)测量细胞因子。可以看出，具有#18、#19、#20和#21的双重CAR T细胞与#15CAR T细胞产生了相当的细胞因子，包括IL-2、IL-4、IL-6、IL10、TNFα和IFNγ，表明修饰的双重CAR T结构的安全性。
实施例11经刺激的双重CAR T细胞的增殖
图12示出了具有修饰结构18-21的双重CAR T细胞的增殖，该增殖是通过将双重CAR T细胞与CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞以1:3比例混合而刺激的。在CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞的每轮杀伤后测量双重CAR T细胞的增殖。可以看出，当通过CCRF-CEM细胞刺激时，#19双重CAR T细胞与#21双重CAR T细胞相比增殖速率更快。当通过Nalm6细胞刺激时，#21双重CAR T细胞与#19双重CAR T细胞相比增殖速率更快。当通过CCRF-CEM细胞或Nalm6细胞刺激时，#18双重CAR T细胞和#20双重CAR T细胞类似地增殖。
实施方案
实施方案1.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含：能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
实施方案2.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案3.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述铰链结构域源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
实施方案4.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
实施方案5.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案6.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述ITAM3包含YXXL/I-X7-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
实施方案7.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其片段。
实施方案8.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其片段。
实施方案9.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.3的氨基酸序列或其片段。
实施方案10.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.4的氨基酸序列或其片段。
实施方案11.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含至少ITAM1和ITAM2。
实施方案12.如实施方案11所述的工程化免疫细胞，其中所述ITAM1包含YXXL/I-X7-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
实施方案13.如实施方案11所述的工程化免疫细胞，其中所述ITAM2包含YXXL/I-X8-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
实施方案14.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
实施方案15.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.9的氨基酸序列。
实施方案16.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
实施方案17.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
实施方案18.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
实施方案19.如实施方案18所述的工程化免疫细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
实施方案20.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自寡聚化自激活。
实施方案21.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自二聚化自激活。
实施方案22.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
实施方案23.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19、TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
实施方案24.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分用作反式激活因子或顺式激活因子。
实施方案25.如实施方案24所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子经由接头连接至所述CAR。
实施方案26.如实施方案25所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是可切割的接头。
实施方案27.如实施方案26所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是自切割肽。
实施方案28.如实施方案26所述的工程化免疫细胞，其中所述可切割的接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案29.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
实施方案30.如实施方案29所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分连接至所述诱导型细胞死亡部分。
实施方案31.如实施方案29所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
实施方案32.如实施方案31所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
实施方案33.如实施方案31所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
实施方案34.如实施方案31所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
实施方案35.如实施方案31所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
实施方案36.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
实施方案37.如实施方案36所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞是αβT细胞或γδT细胞。
实施方案38.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞源自于干细胞。
实施方案39.如实施方案38所述的工程化免疫细胞，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导多能干细胞(iPSC)。
实施方案40.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。
实施方案41.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自患有病况的受试者。
42.如实施方案1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自健康供体。
实施方案43.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含：能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
实施方案44.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案45.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述铰链结构域源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
实施方案46.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
实施方案47.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案48.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。
实施方案49.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。
实施方案50.如实施方案49所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。
实施方案51.如实施方案49所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。
实施方案52.如实施方案51所述的工程化免疫细胞，其中所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。
实施方案53.如实施方案51所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。
实施方案54.如实施方案43所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
实施方案55.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含：功能灭活的T细胞受体(TCR)；和包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3。
实施方案56.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含：功能灭活的T细胞受体(TCR)；和包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
实施方案57.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含：能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3。
实施方案58.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含：能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
实施方案59.在一个方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ IDNo.19的氨基酸序列，并且所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
实施方案60.如实施方案59所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
实施方案61.如实施方案59所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案62.如实施方案59所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案63.如实施方案62所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
实施方案64.在一个方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
实施方案65.如实施方案64所述的工程化免疫细胞，并且所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
实施方案66.如实施方案64所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。
实施方案67.如实施方案64所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。
实施方案68.如实施方案67所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。
实施方案69.如实施方案67所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。
实施方案70.如实施方案69所述的工程化免疫细胞，其中所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。
实施方案71.如实施方案67所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。
实施方案72.如实施方案64所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
实施方案73.如实施方案64所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案74.如实施方案64所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案75.如实施方案74所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
实施方案76.在一个方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
实施方案77.如实施方案76所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
实施方案78.如实施方案76所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案79.如实施方案78所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
实施方案80.在一个方面，提供了一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列，并且所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
实施方案81.如实施方案80所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。
实施方案82.如实施方案81所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。
实施方案83.如实施方案82所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。
实施方案84.如实施方案82所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。
实施方案85.如实施方案84所述的工程化免疫细胞，其中所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。
实施方案86.如实施方案82所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。
实施方案87.如实施方案80所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
实施方案88.如实施方案80所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案89.如实施方案88所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
实施方案90.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ IDNo.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
实施方案91.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案92.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
实施方案93.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案94.如实施方案93所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合CD7。
实施方案95.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案96.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
实施方案97.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
实施方案98.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR进一步包含第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ胞内信号传导结构域。
实施方案99.如实施方案98所述的工程化免疫细胞，其中所述第二铰链结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
实施方案100.如实施方案99所述的工程化免疫细胞，其中所述第二铰链结构域源自于CD8。
实施方案101.如实施方案100所述的工程化免疫细胞，其中所述第二铰链结构域包含SEQ ID NO.17的氨基酸序列。
实施方案102.如实施方案98所述的工程化免疫细胞，其中所述第二跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
实施方案103.如实施方案102所述的工程化免疫细胞，其中所述第二跨膜结构域源自于CD8。
实施方案104.如实施方案103所述的工程化免疫细胞，其中所述第二跨膜结构域包含SEQ ID NO.19的氨基酸序列。
实施方案105.如实施方案98所述的工程化免疫细胞，其中所述第二共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案106.如实施方案98所述的工程化免疫细胞，其中所述第二CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
实施方案107.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。
实施方案108.如实施方案107所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是可切割的接头。
实施方案109.如实施方案107所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是自切割肽。
实施方案110.如实施方案107所述的工程化免疫细胞，其中所述可切割的接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。
实施方案111.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步包含增强子部分，所述增强子部分能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性。
实施方案112.如实施方案90所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
实施方案113.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ IDNo.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
实施方案114.如实施方案113所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案115.如实施方案114所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于4-1BB。
实施方案116.如实施方案113所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
实施方案117.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
实施方案118.如实施方案117所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
实施方案119.如实施方案117所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。
实施方案120.如实施方案119所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案121.如实施方案119所述的工程化免疫细胞，其中所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案122.如实施方案117所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH1-VL1-VH2；(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；(v)VL2-VL1-VH1-VH2；(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
实施方案123.如实施方案117所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：(i)VL2-VH2-VL1-VH1；(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；(v)VH2-VL2-VL1-VH1；(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
实施方案124.如实施方案117所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。
实施方案125.如实施方案117所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR进一步包含第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ胞内信号传导结构域。
实施方案126.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
实施方案127.如实施方案126所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
实施方案128.如实施方案126所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
实施方案129.如实施方案128所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
实施方案130.如实施方案126所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
实施方案131.如实施方案130所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于4-1BB。
实施方案132.在一个方面，提供了一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
序列表
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Claims (132)

1.一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
2.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
3.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
4.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
5.如权利要求4所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域结合CD7。
6.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
7.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：
(i)VL2-VH1-VL1-VH2；
(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；
(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；
(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；
(v)VL2-VL1-VH1-VH2；
(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；
(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或
(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
8.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：
(i)VL2-VH2-VL1-VH1；
(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；
(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；
(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；
(v)VH2-VL2-VL1-VH1；
(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；
(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和
(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
9.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR进一步包含第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ胞内信号传导结构域。
10.如权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中所述第二铰链结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
11.如权利要求10所述的工程化免疫细胞，其中所述第二铰链结构域源自于CD8。
12.如权利要求11所述的工程化免疫细胞，其中所述第二铰链结构域包含SEQ IDNO.17或SEQ ID NO.18的氨基酸序列。
13.如权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中所述第二跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
14.如权利要求13所述的工程化免疫细胞，其中所述第二跨膜结构域源自于CD8。
15.如权利要求14所述的工程化免疫细胞，其中所述第二跨膜结构域包含SEQ IDNO.19的氨基酸序列。
16.如权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中所述第二共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
17.如权利要求9所述的工程化免疫细胞，其中所述第二CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
18.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。
19.如权利要求18所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是可切割的接头。
20.如权利要求18所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是自切割肽。
21.如权利要求18所述的工程化免疫细胞，其中所述可切割的接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。
22.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步包含增强子部分，所述增强子部分能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性。
23.如权利要求1所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
24.一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
25.如权利要求24所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
26.如权利要求24所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于4-1BB。
27.如权利要求24所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
28.一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.18的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
29.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
30.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域。
31.如权利要求30所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
32.如权利要求30所述的工程化免疫细胞，其中所述第二抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
33.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：
(i)VL2-VH1-VL1-VH2；
(ii)VH2-VL1-VH1-VL2；
(iii)VL1-VH2-VL2-VH1；
(iv)VH1-VL2-VH2-VL1；
(v)VL2-VL1-VH1-VH2；
(vi)VH2-VH1-VL1-VL2；
(vii)VL1-VL2-VH2-VH1；或
(viii)VH1-VH2-VL2-VL1；
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
34.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域从氨基末端至羧基末端按以下模式之一排列：
(i)VL2-VH2-VL1-VH1；
(ii)VL2-VH2-VH1-VL1；
(iii)VL1-VH1-VL2-VH2；
(iv)VL1-VH1-VH2-VL2；
(v)VH2-VL2-VL1-VH1；
(vi)VH2-VL2-VH1-VL1；
(vii)VH1-VL1-VL2-VH2；和
(viii)VH1-VL1-VH2-VL2，
其中VH1是所述第一抗原结合结构域的重链可变结构域，VL1是所述第一抗原结合结构域的轻链可变轻链结构域，VH2是所述第二抗原结合结构域的重链可变结构域，并且VL2是所述第二抗原结合结构域的轻链可变结构域。
35.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述第一抗原结合结构域和所述第二抗原结合结构域经由接头连接。
36.如权利要求28所述的工程化免疫细胞，其中所述CAR进一步包含第二铰链结构域、第二跨膜结构域、第二共刺激结构域和第二CD3ζ胞内信号传导结构域。
37.一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
38.如权利要求37所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域是截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，或CD3ζ细胞内信号传导结构域变体。
39.如权利要求37所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
40.如权利要求39所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
41.如权利要求37所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
42.如权利要求41所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于4-1BB。
43.一种工程化免疫细胞，包含嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CAR包含第一抗原结合结构域和第二抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
44.一种工程化免疫细胞，包含：
(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；
(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
45.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
46.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述铰链结构域源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
47.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
48.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
49.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述ITAM3包含YXXL/I-X7-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
50.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.1的氨基酸序列或其片段。
51.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.2的氨基酸序列或其片段。
52.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.3的氨基酸序列或其片段。
53.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少SEQ ID NO.4的氨基酸序列或其片段。
54.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含至少ITAM1和ITAM2。
55.如权利要求54所述的工程化免疫细胞，其中所述ITAM1包含YXXL/I-X7-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
56.如权利要求54所述的工程化免疫细胞，其中所述ITAM2包含YXXL/I-X8-YXXL/I的氨基酸序列并且每个X独立地为任何氨基酸。
57.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.8的氨基酸序列。
58.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.9的氨基酸序列。
59.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.10的氨基酸序列。
60.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
61.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分被配置为组成性地上调所述工程化免疫细胞的一个或多个细胞内信号传导通路。
62.如权利要求61所述的工程化免疫细胞，其中所述一个或多个细胞内信号传导通路是一个或多个细胞因子信号传导通路。
63.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自寡聚化自激活。
64.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分通过自二聚化自激活。
65.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分是细胞因子或细胞因子受体。
66.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分选自：IL-2、IL-3、IL-4、IL-6、IL-7、IL-8、IL-10、IL-11、IL-12、IL-15、IL-17、IL-18、IL-21、IL-23、PD-1、PD-L1、CD122、CSF1R、CTAL-4、TIM-3、CCL21、CCL19、TGFRβ、其受体、其功能片段、其功能变体及其组合。
67.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分用作反式激活因子或顺式激活因子。
68.如权利要求67所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子经由接头连接至所述CAR。
69.如权利要求68所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是可切割的接头。
70.如权利要求69所述的工程化免疫细胞，其中所述接头是自切割肽。
71.如权利要求69所述的工程化免疫细胞，其中所述可切割的接头选自P2A、T2A、E2A和F2A。
72.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞进一步包含诱导型细胞死亡部分，所述诱导型细胞死亡部分能够在所述嵌合多肽与细胞死亡激活剂接触时实现所述工程化免疫细胞的死亡。
73.如权利要求72所述的工程化免疫细胞，其中所述增强子部分连接至所述诱导型细胞死亡部分。
74.如权利要求72所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分选自：rapaCasp9、iCasp9、HSV-TK、ΔCD20、mTMPK、ΔCD19、RQR8、Her2t、CD30、BCMA和EGFRt。
75.如权利要求74所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是EGFRt，并且所述细胞死亡激活剂是结合EGFRt的抗体或其抗原结合片段。
76.如权利要求74所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是HSV-TK，并且所述细胞死亡激活剂是GCV。
77.如权利要求74所述的工程化免疫细胞，其中所述诱导型细胞死亡部分是iCasp9，并且所述细胞死亡激活剂是AP1903。
78.如权利要求74所述的工程化免疫细胞，其中所述细胞死亡激活剂包含核酸、多核苷酸、氨基酸、多肽、脂质、碳水化合物、小分子、酶、核糖体、蛋白酶体、其变体或其任何组合。
79.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是T细胞、NKT细胞或NK细胞。
80.如权利要求79所述的工程化免疫细胞，其中所述T细胞是αβT细胞或γδT细胞。
81.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞源自于干细胞。
82.如权利要求81所述的工程化免疫细胞，其中所述干细胞是造血干细胞(HSC)或诱导多能干细胞(iPSC)。
83.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞是自体细胞或同种异体细胞。
84.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自患有病况的受试者。
85.如权利要求44所述的工程化免疫细胞，其中所述工程化免疫细胞获自健康供体。
86.一种工程化免疫细胞，包含：
(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；
(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
87.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
88.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述铰链结构域源自于选自下组的多肽：IgG1-4、CD4、CD8、CD8α、CD8β、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
89.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述跨膜结构域源自于选自下组的多肽：CD8、CD8α、CD8β、CD4、CD27、CD28、CD40、CD45、CD84、CD166、4-1BB、PD1、OX40、ICOS、ICAM-1、CTLA-4和NKGD2。
90.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
91.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。
92.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。
93.如权利要求92所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。
94.如权利要求92所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。
95.如权利要求94所述的工程化免疫细胞，其中所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。
96.如权利要求94所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。
97.如权利要求86所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
98.一种工程化免疫细胞，包含：
(i)功能灭活的T细胞受体(TCR)，和
(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3。
99.一种工程化免疫细胞，包含：
(i)功能灭活的T细胞受体(TCR)，和
(ii)包含抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
100.一种工程化免疫细胞，包含：
(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；
(ii)包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3。
101.一种工程化免疫细胞，包含：
(i)能够增强所述工程化免疫细胞的一种或多种活性的增强子部分；
(ii)包含特异性结合CD7的抗原结合结构域、铰链结构域、跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体的嵌合抗原受体(CAR)，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
102.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列，并且所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
103.如权利要求102所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域包含SEQ ID NO.11的氨基酸序列。
104.如权利要求102所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
105.如权利要求102所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
106.如权利要求105所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
107.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
108.如权利要求107所述的工程化免疫细胞，并且所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
109.如权利要求107所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。
110.如权利要求107所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。
111.如权利要求110所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。
112.如权利要求110所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。
113.如权利要求112所述的工程化免疫细胞，其中所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。
114.如权利要求110所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。
115.如权利要求107所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
116.如权利要求107所述的工程化免疫细胞，其中所述共刺激结构域源自于选自下组的多肽：CD127、CD27、CD28、4-1BB(CD137)、OX40、CD30、CD40、PD-1、ICOS、MyD88、淋巴细胞功能相关抗原-1(LFA-1)、CD2、CD7、LIGHT、NKG2C、B7-H3和与CD83特异性结合的配体。
117.如权利要求107所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
118.如权利要求117所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
119.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列。
120.如权利要求119所述的工程化免疫细胞，其中所述截短的CD3ζ细胞内信号传导结构域缺少ITAM3或其片段。
121.如权利要求119所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
122.如权利要求121所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
123.一种嵌合抗原受体(CAR)，包含抗原结合结构域、CD8铰链结构域、CD8跨膜结构域、4-1BB共刺激结构域和CD3ζ细胞内信号传导结构域变体，
其中所述CD8铰链结构域包含SEQ ID No.17的氨基酸序列，并且所述CD8跨膜结构域包含SEQ ID No.19的氨基酸序列，并且所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含失功能突变。
124.如权利要求123所述的工程化免疫细胞，其中所述CD3ζ细胞内信号传导结构域变体包含两个失功能突变。
125.如权利要求124所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域中。
126.如权利要求125所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM1、ITAM2或ITAM3中。
127.如权利要求125所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的酪氨酸残基处。
128.如权利要求127所述的工程化免疫细胞，其中所述酪氨酸残基被苯丙氨酸置换。
129.如权利要求125所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的ITAM结构域的亮氨酸残基处。
130.如权利要求123所述的工程化免疫细胞，其中所述失功能突变存在于CD3ζ细胞内信号传导结构域的非ITAM区中。
131.如权利要求123所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域与选自下组的抗原结合：CS1、CD19、CD2、CD3、CD4、CD5、CD7、CD8、CD20、CD22、CD25、CD28、CD30、CD33、CD38、CD40、CD44V6、CD47、CD52、CD56、CD57、CD58、CD79b、CD80、CD86、CD81、CD123、CD133、CD151、CD171、CD276、CLL1、B7H4、BCMA、VEGFR-2、EGFR、GPC3、PMSA、CEACAM6、c-Met、EGFRvIII、ErbB2/HER2、ErbB3、HER-2、HER3、ErbB4/HER-4、EphA2、IGF1R、GD2、O-乙酰基GD2、O-乙酰基GD3、GHRHR、GHR、Flt1、KDR、Flt4、Flt3、CEA、CA125、CTLA-4、GITR、BTLA、TGFBR1、TGFBR2、TGFBR1、IL6R、gp130、Lewis、TNFR1、TNFR2、PD1、PD-L1、PD-L2、PSCA、HVEM、MAGE-A、MSLN、NY-ESO-1、PSMA、RANK、RORl、TNFRSF4、TWEAK-R、LTPR、LIFRP、LRP5、MUC1、MUC16、TCRa、TCRb、TLR7、TLR9、PTCH1、WT-1、Robol、卷曲蛋白、OX40、Notch-1-4、APRIL、MAGE3、密封蛋白18.2、叶酸受体α、叶酸受体β、GPC2、CD70、BAFF-R、TROP-2和4-1BB。
132.如权利要求131所述的工程化免疫细胞，其中所述抗原结合结构域结合CD7。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2990177A1 (en) * 2015-06-25 2016-12-29 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
US20200283534A1 (en) * 2016-06-24 2020-09-10 iCell Gene Therapeuticics LLC CHIMERIC ANTIGEN RECEPTORS (CARs), COMPOSITIONS AND METHODS THEREOF
SG10202109108UA (en) * 2017-06-21 2021-09-29 Icell Gene Therapeutics Llc Chimeric antigen receptors (cars), compositions and methods thereof
EP3732191A4 (en) * 2017-12-29 2021-12-22 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center IMPROVED ANTIGENIC CHEMICAL RECEPTORS AND THEIR USES
CN110526983B (zh) * 2018-05-24 2022-02-11 北京马力喏生物科技有限公司 改良型抗cd19 car-t细胞
CN111088231A (zh) * 2018-10-24 2020-05-01 艾生命序公司 Pd-l1抗体分泌的抗间皮素car-t细胞肿瘤免疫治疗
WO2020088631A1 (en) * 2018-11-01 2020-05-07 Gracell Biotechnologies (Shanghai) Co., Ltd. Compositions and methods for t cell engineering
WO2020172177A1 (en) * 2019-02-18 2020-08-27 Memorial Sloan-Kettering Cancer Center Combinations of multiple chimeric antigen receptors for immunotherapy
CN110669144B (zh) * 2019-10-12 2021-09-17 华夏源（上海）细胞基因工程股份有限公司 一种靶向b细胞成熟抗原的嵌合抗原受体及其应用
CN111411085A (zh) * 2020-04-10 2020-07-14 格源致善(上海)生物科技有限公司 一种嵌合抗原受体t细胞及其应用

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