CN116555451A - 一种用于检测猪呼吸系统疾病五种主要病原细菌的lamp引物组合及应用 - Google Patents

一种用于检测猪呼吸系统疾病五种主要病原细菌的lamp引物组合及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于疾病检测技术领域，涉及用于检测猪呼吸系统五种主要细菌性病原微生物的LAMP引物组合及应用。本发明所述LAMP引物组包括外引物对F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，共计5套。本发明所提供的用于检测猪呼吸系统主要细菌性病原微生物的引物组合设计主要是针对Hp的infB、Mh16sRNA、Pm‑toxinA、Bb的DNT、APP的ApxIV相对保守特异的五个基因序列，并作为该发明的应用检测靶基因，设计的实时荧光环介导等温扩增引物组特异性与实用性强，能够实现发病或亚临床感染的呼吸系统源的同一临床样本检测，用时短。

Description

一种用于检测猪呼吸系统疾病五种主要病原细菌的LAMP引物 组合及应用
技术领域
本发明属于疾病检测技术领域，具体涉及一种用于检测猪呼吸系统疾病五种主要病原细菌的LAMP引物组合及应用。
背景技术
随着养猪业规模化程度的提升，猪群疾病发生的概率增加，因而对生猪传染类疾病的防控带来新的挑战。猪呼吸道疾病是近年来严重危害养猪业的疾病之一。该病的死亡率已占到了30％左右，主要发生在冬季。使得猪群饲料利用率降低，日增重达不到标准，猪出栏时间推迟、药物的费用增加等，有的甚至造成相当数量的猪只死亡，给我国养猪业带来巨大损失。就现阶段猪病流行的状况调查看，多种病原菌的混合感染是目前猪场疾病发展的一个趋势。而可引起猪呼吸系统疾病的细菌主要包括猪支气管败血波氏杆菌、猪多杀性巴氏杆菌、猪肺炎支原体、副猪嗜血杆菌、胸膜肺炎放线杆菌等。
鉴于生物安全和动物源肉品安全，减抗替抗已纳入国家食品安全法规。而猪源疾病多元化的发展趋势，不仅增加疾病的防控难度，同时影响猪肉安全。为了防控猪源细菌性疾病发生而带来的抗生素使用带来的负面影响，建立对规模化猪场发病猪的呼吸系统混合病原菌感染的快速检测与预警，及早制定治疗与防控措施至关重要。针对猪病原菌的检测技术主要包括传统的微生物学诊断技术、血清学诊断技术和分子生物学诊断技术。尽管以PCR为代表的分子生物学诊断技术及其衍生检测技术占据主体，但均存在这样或那样的局限性，如检测流程繁琐、工作量大、检测仪器要求高、容易污染、样品采集针对性不强、覆盖面不够等等。因此，开发一种能够同时检测统一来源的样品，进行多种病原菌的快速简便检测方法具有重要的实践意义。
发明内容
本发明提供一种用于检测猪呼吸系统疾病五种主要病原细菌的LAMP引物组合及应用。具体通过以下技术方案实现：
所述用于检测Hp infB基因的引物组合物，包括以下引物：F3的核苷酸序列如SEQID NO.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.4所示。
F3(SEQ ID No.1)：TCGGTGCATATCACGTTGAA；
B3(SEQ ID No.2)：GCTTTCGCGTGTTGGATTG；
FIP(SEQ ID No.3)：
GCATTGAGGTAAATGCCGCGTGACCGACGACGGTAAGATGA；
BIP(SEQ ID No.4)：
CGTGGTGCGAAAGCAACGGACATTACGCCATCGTCAGCT。
所述用于检测Mh 16s RNA基因的引物组合物，其特征在于，包括以下引物：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.8所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，BF的核苷酸序序列如SEQ ID NO.10所示。
F3(SEQ ID No.5)：ACCAAGAAATGGGGGTGC；
B3(SEQ ID No.6)：CCCGAAAGACTTCATCCTGC；
FIP(SEQ ID No.7)：
CCAGTGTGGCGGTACAACCTGGGTAAAAGCCTACCAAGACG；
BIP(SEQ ID No.8)：
GATTGAGATACGGCCCAGACTCCTAGCTGTGTCGCTCCATCAA；
LF(SEQ ID NO.9)：TGGCCCCGCTAAACATCA；
BF(SEQ ID NO.10)：CGGGAGGCAGCAGTAAGGAA。
所述用于检测Pm toxinA基因的引物组合物，其特征在于，包括以下引物：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.14所示。
F3(SEQ ID No.11)：ATCGCAACCTTCTTCAGA；
B3(SEQ ID No.12)：GCTTTCACTGGTTTTTCCA；
FIP(SEQ ID No.13)：
CTTCCATTTCAGGAAGATAAAGCGCGCGTTTGAATGCTTTTCGT；BIP(SEQ ID No.14)：
CAGATTCCTAACAAAGGTTCTGGT-CCATTTCATTCATGGCTGTAC。
所述用于检测Bb的DNT基因的引物组合物，其特征在于，包括以下引物：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.18所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，BF的核苷酸序列如SEQ ID NO.20所示。
F3(SEQ ID No.15)：CTTCCCCTGCAGAAAGTACG；
B3(SEQ ID No.16)：CGTTCGCAAGGACATCAGAC；
FIP(SEQ ID No.17)：
GCCCCAGGCAATATTCAATGCCTACAAGGTGCTGACATCGC；
BIP(SEQ ID No.18)：
TGACCGATCTGCCGGGTCTTTGCTCACCGTTGATGTTCGA；
LF(SEQ ID NO.19)：ATTCCACGCGCGATCAGCC；
BF(SEQ ID NO.20)：TCCATGATTCCAGCTGGCT。
所述用于检测APP的Apx IV基因的引物组合物，其特征在于，包括以下引物：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO：21所示，B3的核苷酸序列如SEQ IDNO：22所示；所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO：23所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO：24所示；所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO：25所示。
F3(SEQ ID No.21)：TCGCTTGAAGAGCCGAAAT；
B3(SEQ ID No.22)：GTCGGGTAATCCGGACCT；
FIP(SEQ ID No.23)：
GGTTGCCATACCGACCGCAAT-GGCACGCTTACCGCATAT；
BIP(SEQ ID No.24)：
ACGAATTAGCCGAAGCAAGCGT-GCACCACCGTCATTAACTCG；
LF(SEQ ID NO.25)：CCCATCGTGCCGTTCAGCAA。
所述的引物还可能包括将上述各F3、B3、FIP、BIP、LF和LB引物序列经过一个或几个核苷酸的取代和/或缺失和/或添加后具有与上述序列具有相同功能的DNA分子。
本发明提供了上述引物组合物在荧光环介导等温扩增方法中用以检测猪呼吸系统五种主要细菌性病原微生物(猪肺炎支原体Mh、产毒多杀性巴氏杆菌Pm、副猪嗜血杆菌Hp、支气管败血波氏杆菌Bb、猪胸膜肺炎放线杆菌APP)的相关保守特异基因。
所述的引物组合物在荧光环介导等温扩增(LAMP)方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4-8：4-8：2-3：2-3范围。
所述的环介导等温扩增反应条件为62-65℃范围。
本发明还提供了上述组合物在用于引起猪呼吸系统疾病的五种主要病原细菌的特异保守基因检测的试剂盒或芯片中的应用，具体为：
在制备检测猪肺炎支原体Mh、产毒多杀性巴氏杆菌Pm、副猪嗜血杆菌Hp、支气管败血波氏杆菌Bb、猪胸膜肺炎放线杆菌APP等五种细菌特异保守基因试剂盒和微流控芯片中的应用。包括将各条引物单独包装的步骤。
所述的试剂盒或芯片的检测步骤如下：
①提取待测细菌或来源于发病或亚临床感染的呼吸系统的待检样品中基因组DNA；
②以步骤①提取的基因为模版，采用上述引物组合物对猪肺炎支原体Mh、产毒多杀性巴氏杆菌Pm、副猪嗜血杆菌Hp、支气管败血波氏杆菌Bb、猪胸膜肺炎放线杆菌APP等五种细菌的特异保守基因进行荧光环介导等温扩增。
本发明所述的引物组合物可用于检测样本中是否含有猪肺炎支原体、产毒多杀性巴氏杆菌、副猪嗜血杆菌、支气管败血波氏杆菌、猪胸膜肺炎放线杆菌等五种病原的特异基因。
应用上述引物组合物可以对样品中所提的基因DNA模板特异性扩增，则待测样品中含有或疑似含有猪肺炎支原体Mh、产毒多杀性巴氏杆菌Pm、副猪嗜血杆菌Hp、支气管败血波氏杆菌Bb、猪胸膜肺炎放线杆菌APP这五种病原基因；如果不可以对样品中基因DNA模板特异性扩增，则待测样品中不含有猪肺炎支原体Mh、产毒多杀性巴氏杆菌Pm、副猪嗜血杆菌Hp、支气管败血波氏杆菌Bb、猪胸膜肺炎放线杆菌APP的基因。
本发明提供的用于检测猪肺炎支原体Mh、产毒多杀性巴氏杆菌Pm、副猪嗜血杆菌Hp、支气管败血波氏杆菌Bb、猪胸膜肺炎放线杆菌APP这五种病原基因的引物组合物，可简单、快速、准确地检测获得响应结果。在实际应用中，能够在60min内通过荧光扩增曲线获得检测结果。
本发明实施例具有如下优点：
本发明实施例根据Mh、Pm、Hp、Bb、APP的基因序列特征，设计特异性的LAMP引物组，实用性强，可凭借实时荧光信号及溶解曲线直接判定结果，特异性强，灵敏度高。
本发明实施例所建立的LAMP检测方法能在45-60min内检测小于100拷贝数/微升的病毒核酸，比常规PCR方法敏感10-100倍。
本发明实施例应用带有荧光染料Eva Green的IMM(Isothermal Master Mix)及相应仪器，反应结束后，无需开盖，结果判定可通过荧光值及扩增曲线的特异性来判断，降低了污染的可能性，更加适用于现场使用。
附图说明
图1：Hp infB/Mh 16s/Pm toxinA/Bb DNT/APPApx IV典型荧光扩增曲线示意图；
图2：Hp infB/Mh 16s/Pm toxinA/Bb DNT/APPApx IV引物分别对除自身基因外其他病原基因、猪基因组和空白对照的荧光扩增曲线示意图；
图3：Hp infB/Mh 16s/Pm toxinA/Bb DNT/APPApx IV的敏感性扩增曲线示意图。
具体实施方式
下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述和展示，所描述的实施例仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
下列实施中所用的试验方法，如无特殊说明，均为本领域常用的实验方法；
下列实施中所用的试验材料，如无特殊说明，均为本领域常用的实验材料；实施例1
利用人工合成的含Hp infB基因的质粒，以检测试剂盒检测副猪嗜血杆菌。
将合成的质粒作为模板，反应体系如下表；
结果如示意图1、2所示，示意图1Hp infB基因质粒荧光曲线，显示特异S型曲线；示意图2Hp infB引物对Mh、Pm、Bb、APP、猪基因组和空白对照的荧光扩增曲线。引物组合可以特异检测副猪嗜血杆菌。
荧光LAMP反应管20μL反应体系：
副猪嗜血杆菌各引物的核苷酸序列如下：
F3：TCGGTGCATATCACGTTGAA；
B3：GCTTTCGCGTGTTGGATTG；
FIP：GCATTGAGGTAAATGCCGCGTGACCGACGACGGTAAGATGA；
BIP：CGTGGTGCGAAAGCAACGGACATTACGCCATCGTCAGCT。
实施例2
利用人工合成含Mh 16s RNA基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪肺炎支原体。
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
结果如示意图1、2所示，图1Mh 16s RNA基因的质粒荧光扩增曲线为特异S型曲线；图2Hp、Pm、Bb、APP、猪基因组和空白对照荧光扩增曲线。引物组合可以特异检测猪肺炎支原体。
猪肺炎支原体各引物的核苷酸序列如下：
F3：ACCAAGAAATGGGGGTGC；
B3：CCCGAAAGACTTCATCCTGC；
FIP：CCAGTGTGGCGGTACAACCTGGGTAAAAGCCTACCAAGACG；
BIP：GATTGAGATACGGCCCAGACTCCTAGCTGTGTCGCTCCATCAA；
LF：TGGCCCCGCTAAACATCA；
BF：CGGGAGGCAGCAGTAAGGAA。
实施例3
利用人工合成含Pm toxinA基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪产毒多杀性巴氏杆菌。
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
结果如示意图图1、2所示，图1Pm toxinA基因质粒荧光扩增曲线为特异S型扩增曲线；图2Hp、Mh、Bb、APP、猪基因组和空白对照荧光扩增曲线。引物组合可以特异检测猪产毒多杀性巴氏杆菌。
猪产毒多杀性巴氏杆菌各引物的核苷酸序列如下：
F3：ATCGCAACCTTCTTCAGA；
B3：GCTTTCACTGGTTTTTCCA；
FIP：CTTCCATTTCAGGAAGATAAAGCGC-GCGTTTGAATGCTTTTCGT；BIP：CAGATTCCTAACAAAGGTTCTGGT-CCATTTCATTCATGGCTGTAC。
实施例4
利用人工合成含Bb DNT基因的质粒，用以检测猪败血波氏杆菌。
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
结果如示意图1、2所示，图1Bb DNT基因质粒荧光扩增曲线为特异S型曲线；图2Hp、Mh、Pm、APP、猪基因组和空白对照荧光扩增曲线。引物组合可以特异检测猪败血波氏杆菌。
猪败血波氏杆菌各引物的核苷酸序列如下：
F3：CTTCCCCTGCAGAAAGTACG；
B3：CGTTCGCAAGGACATCAGAC；
FIP：GCCCCAGGCAATATTCAATGCCTACAAGGTGCTGACATCGC；
BIP：TGACCGATCTGCCGGGTCTTTGCTCACCGTTGATGTTCGA；
LF：ATTCCACGCGCGATCAGCC；
BF：TCCATGATTCCAGCTGGCT。
实施例5
利用人工合成含APPApx IV基因的质粒，用以检测试剂盒检测猪胸膜肺炎放线杆菌。
将合成的质粒用作模板，反应体系同实施例1；
结果如示意图1、2所示，图1APPApxIV基因质粒荧光扩增曲线为特异S型曲线；图2Hp、Mh、Pm、Bb、猪基因组和空白对照荧光扩增曲线。引物组合可以特异检测猪胸膜肺炎放线杆菌。
猪胸膜肺炎放线杆菌各引物的核苷酸序列如下：
F3：TCGCTTGAAGAGCCGAAAT；
B3：GTCGGGTAATCCGGACCT；
FIP：GGTTGCCATACCGACCGCAAT-GGCACGCTTACCGCATAT；
BIP：ACGAATTAGCCGAAGCAAGCGT-GCACCACCGTCATTAACTCG；
LF：CCCATCGTGCCGTTCAGCAA。
实施例6检测五种病原细菌的敏感性
将合成的各特异基因的阳性质粒标准品分别进行10倍连续稀释，取拷贝数为2×101拷贝数/μl至2×105拷贝数/μl五个梯度的样品进行LAMP反应，确定检测敏感性，每个稀释度设2-3个重复。
LAMP方法敏感性结果。如图3所示，为本发明实施例敏感性扩增曲线图。
附件序列信息获得：
1、猪支气管败血波氏杆菌，GenBank：DQ787174.1。
2、猪肺炎支原体，GenBank:JN935889.1。
3、产毒多杀性巴氏杆菌，GenBank:MW142257.1Pasteurella multocida strainIndNivediPm30 dermonecrotic protein(toxA)gene,partial cds。
4、副猪嗜血杆菌，GenBank:HM243087.1。
5、猪胸膜肺炎放线杆菌，GenBank:GQ360052.1。

Claims (7)

1.一种用于检测猪呼吸系统五种主要细菌性病原微生物Mh、Pm、Hp、Bb、APP的LAMP引物组合，其特征在于，所述引物组合包括内引物对F3/B3、内引物对FIP/BIP、环引物对LF/BF，其中，
⑴Hp：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示；
FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ IDNO.4所示；
⑵Mh：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示；
所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.7所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ IDNO.8所示；
所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.9所示，BF的核苷酸序序列如SEQ IDNO.10所示；
⑶Pm：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.11所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.12所示；
所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.14所示；
⑷Bb：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.15所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.16所示；
所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.17所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.18所示；
所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.19所示，BF的核苷酸序序列如SEQ IDNO.20所示；
⑸APP：所述F3的核苷酸序列如SEQ ID NO.21所示，B3的核苷酸序列如SEQ ID NO.22所示；
所述FIP的核苷酸序列如SEQ ID NO.23所示，BIP的核苷酸序序列如SEQ ID NO.24所示；
所述LF的核苷酸序列如SEQ ID NO.25所示。
2.如权利要求1所述的LAMP引物组合，其特征在于，
Hp：所述引物合是针对副猪嗜血杆菌的infB基因保守区设计；
Mh：所述引物合是针对猪肺炎支原体的16s RNA基因保守区设计；
Pm：所述引物合是针对产毒多杀性巴氏杆菌的toxA基因保守区设计；
Bb：所述引物合是针对猪败血波氏杆菌的DNT基因保守区设计；
APP：所述引物合是针对胸膜肺炎放线杆菌的APX IV基因保守区设计。
3.一种用于环介导等温扩增检测检测猪呼吸系统五种主要细菌性病原微生物Hp、Mh、Pm、Bb、APP的试剂盒，其特征在于，包括权利要求1或2所述的引物组合。
4.根据权利要求3所述一种用于检测猪呼吸系统五种主要细菌性病原微生物基因的试剂盒，其特征在于，在环介导等温扩增方法中，引物组合物F3、B3、FIP、BIP、LF和LB的摩尔浓度比为1：1：4-8：4-8：2-3：2-3。
5.根据权利要求3所述的一种用于检测猪呼吸系统五种主要细菌性病原微生物基因的试剂盒，其特征在于，所述的环介导等温扩增反应条件为62-65℃，时间50-60min。
6.权利要求1所述的引物组合物的应用，其特征在于，源于发病或亚临床感染呼吸系统的同一临床样本五种细菌的基因检测试剂盒或芯片中的应用。
7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述的试剂盒或芯片的检测步骤如下：
⑴提取待测细菌或呼吸系统源待检样品中基因组DNA；
⑵以步骤(1)提取的基因为模板，采用上述引物组合物分别对Mh的infB、Mh-16s RNA、Pm toxinA、Bb的DNT、APP的Apx IV进行荧光环介导等温扩增。
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