CN116555087A - 一种枯草芽孢杆菌tn、活菌制剂及其制备方法和应用 - Google Patents

一种枯草芽孢杆菌tn、活菌制剂及其制备方法和应用 Download PDF

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CN116555087A CN202310386584.XA CN202310386584A CN116555087A CN 116555087 A CN116555087 A CN 116555087A CN 202310386584 A CN202310386584 A CN 202310386584A CN 116555087 A CN116555087 A CN 116555087A
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Abstract

本发明是关于一种枯草芽孢杆菌TN、活菌制剂及其制备方法和应用。属于微生物技术领域,该枯草芽孢杆菌TN于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,菌株保藏号为GDMCC No:63246,保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。本申请提供的枯草芽孢杆菌TN及活菌制剂应用在治疗烧伤创面时,能够有效避免因不适宜的包扎疗法导致的烧伤创面二次感染的问题,或因抗生素等生物制剂的滥用导致的菌群失调及耐药性问题,且具有消炎、抗氧化、抑制黑色素的产生和保湿等作用,有利于促进创面恢复、防止留疤的效果,并通过与营养液复配的方式,有效解决了枯草芽孢杆菌施用于伤口上时难以存活以及成膜止血效果差的问题。

Description

一种枯草芽孢杆菌TN、活菌制剂及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及微生物技术领域,尤其涉及一种枯草芽孢杆菌TN、活菌制剂及其制备方法和应用。
背景技术
烧伤是指由于火焰、电能、化学物质、放射线等产生热力物质所引起的组织损伤,主要表现为皮肤组织损害,严重者可伤及皮下或黏膜下组织,如肌肉、骨、关节甚至内脏。
由于烧伤创面存在大量毁损及失活组织,是细菌繁殖的良好场所,如烧伤后不及时正确的处理,可导致全身侵袭性感染,不仅会造成局部除皮肤损伤、腐烂、肿胀疼痛、淤血凝滞,热毒内陷损伤阴津外,还可造成脏腑阴阳失调、气血紊乱,更甚者会危及人的生命。随着现代工业飞速发展,各类热能导致的烧伤与日俱增,烧伤也就成了临床常见的严重危害人类且极为痛苦的外伤性疾病之一。
相关技术中,现代医学处理烧伤创面多采用包扎疗法和创面用药,包扎疗法主要是用敷料对烧伤创面进行治疗的一种常用方法,可减少外部刺激对创面造成的不利影响,但不适宜的包扎方法如包扎过紧往往会导致创面的二次感染造成坏疽、腐肉等情况,进而造成烧伤创面的二次感染,影响烧伤创面的恢复。创面用药主要以磺胺嘧啶银和抗生素等生物制剂,虽然磺胺嘧啶银有很好的抗菌作用,但会导致烧伤创面加深的副作用,造成烧伤创面留疤的问题,而采用抗生素等生物制剂治疗时,虽然效果较佳,又很容易因抗生素的滥用导致菌群失调及耐药性问题。
因此,急需一种具有抗菌抑菌作用、又能减轻烧伤创面疼痛的生物制剂,应用在治疗烧伤创面时,能够有效避免因不适宜的包扎疗法导致的烧伤创面二次感染的问题,或因抗生素等生物制剂的滥用导致的菌群失调及耐药性问题,且具有消炎、抗氧化、抑制黑色素的产生和保湿等作用,有利于促进创面恢复、防止留疤的效果。
发明内容
为克服相关技术中存在的问题,本申请提供一种枯草芽孢杆菌TN、活菌制剂及其制备方法和应用,该枯草芽孢杆菌TN及活菌制剂应用在治疗烧伤创面时,能够有效避免因不适宜的包扎疗法导致的烧伤创面二次感染的问题,或因抗生素等生物制剂的滥用导致的菌群失调及耐药性问题,且具有消炎、抗氧化、抑制黑色素的产生和保湿等作用,有利于促进创面恢复、防止留疤的效果。
本申请的目的之一是提供一种枯草芽孢杆菌TN,于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,菌株保藏号为GDMCC No: 63246,保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
本申请的目的之二是提供一种枯草芽孢杆菌活菌制剂,包括上述的枯草芽孢杆菌TN及其生理代谢产物和营养液。
在本发明较佳的技术方案中,所述生理代谢产物包括纳豆多糖和纳豆蛋白酶。
本申请的目的之三是提供一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,用于制备上述的枯草芽孢杆菌活菌制剂,主要包括以下步骤:
将枯草芽孢杆菌TN放入LB液体培养基中,37℃摇床培养24h,得枯草芽孢杆菌菌液;
将所述菌液与营养液混合,37℃培养箱中培养20h,过滤后即得枯草芽孢杆菌活菌制剂。
在本发明较佳的技术方案中,所述营养液的制备包括以下步骤:
将黄豆清洗后充分浸泡,并加入大豆蛋白胨和琼脂溶解;
溶解完成后,蒸或煮1h后,冷却,即得营养液。
在本发明较佳的技术方案中,所述枯草芽孢杆菌TN的制备包括以下步骤:
所述枯草芽孢杆菌TN的制备包括以下步骤:
将水稻秸秆进行预处理,得消毒后的水稻秸秆;
将消毒后的水稻秸秆研磨制成样品悬液,涂布于LB固体培养基上进行培养,生成菌落;
通过平板划线法对新长出的菌落进行分离纯化;
将纯化后的菌株保存于保存液中储存,得到枯草芽孢杆菌TN。
在本发明较佳的技术方案中,所述将水稻秸秆进行预处理包括:
将水稻秸秆用灭过菌的剪刀剪成3~5cm的小段,用2%的次氯酸钠浸泡2min,再用70%酒精浸泡2min后,用无菌水清洗若干次。
在本发明较佳的技术方案中,所述将水稻秸秆研磨制成样品悬液,包括:
将消毒后的水稻秸秆的两端各剪去1cm,加入无菌水和石英砂,用研磨棒充分研磨,并按10倍梯度稀释,分别得到浓度为10-4、10-5和10-6的样品悬浮液。
在本发明较佳的技术方案中,所述保存液包括以下组分:20%的甘油。
本申请的目的之四是提供一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的应用,上述的枯草芽孢杆菌活菌制剂在治疗烧伤创面的应用。
相比现有技术,本申请提供的技术方案可以包括以下有益效果:
(1)本申请提供的枯草芽孢杆菌TN可代谢分泌生成纳豆多糖和纳豆蛋白酶等物质,所述纳豆蛋白酶可分解已发炎部位的纤维蛋白凝结物,具有去除伤口表面的坏疽、腐肉和碎屑的功效,有效解决因烧伤等原因而产生非生理性坏死组织的情况下,内源性胶原酶因为生成受限不足以清除所有坏死组织的问题,通过纳豆蛋白酶能够水解清除深Ⅱ度创面基底部坏死的自身胶原,促进上皮生长加快深Ⅱ度创面的愈合;通过纳豆多糖对烧伤创面具有消炎、抗氧化、抑制黑色素的产生、保湿等作用,有利于促进烧伤创面的快速恢复并能有效防止留疤。
(2)本申请提供的枯草芽孢杆菌TN及枯草芽孢杆菌活菌制剂是一种具有抗菌抑菌作用、又能减轻烧伤创面疼痛的生物制剂,应用在治疗烧伤创面时,能够有效避免因不适宜的包扎疗法导致的烧伤创面二次感染的问题,或因抗生素等生物制剂的滥用导致的菌群失调及耐药性问题,且使用简单方便,只需将制剂直接涂抹于烧伤创面处即可。
(3)本发明提供的枯草芽孢杆菌活菌制剂,采用枯草芽孢杆菌菌液与营养液复配的方式,在创伤表面利用枯草芽孢杆菌活菌制剂中的营养物质及烧伤创面的渗出物作为营养物质快速增殖形成优势菌,并迅速形成菌膜,从而在创伤表面形成生物屏障以抑制其他细菌的繁殖,有效保护了烧伤创面,防止感染,且枯草芽孢杆菌发酵后产生大量粘稠物质,有助于伤口的愈合以及防止创面受到外界的刺激,同时,所述枯草芽孢杆菌活菌制剂能够加速对创面恢复有益菌株的繁殖,使得烧伤创面能够迅速止血和消炎,有效减轻了患者的疼痛,加快了烧伤创面的愈合。
应当理解的是,以上的一般描述和后文的细节描述仅是示例性和解释性的,并不能限制本申请。
附图说明
通过结合附图对本申请示例性实施方式进行更详细的描述,本申请的上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显,其中,在本申请示例性实施方式中,相同的参考标号通常代表相同部件。
图1是本申请实施例示出的平板划线法活化菌株TN于LB固体培养基上培养24小时后的菌落图;
图2是本申请实施例示出的产蛋白酶菌株的枯草芽孢杆菌菌株筛选图;
图3是本申请实施例示出的初烫伤的示意图;
图4是本申请实施例示出的烫伤后未涂抹枯草芽孢杆菌活菌制剂8h后的示意图;
图5是本申请实施例示出的伤口创面的示意图;
图6是本申请实施例示出的伤口创面涂抹枯草芽孢杆菌活菌制剂8h后的示意图。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明,但不用来限制本发明的范围。在不背离本发明精神和实质的情况下,对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换,均属于本发明的保护范围。若未特别指明,本发实施例中所用的实验材料、试剂、仪器等均可市售获得;若未具体指明,本发明实施例中所有的技术手段均为本领域技术人员所熟知的常规手段。
目前,现代医学处理烧伤创面多采用包扎疗法和创面用药,但不适宜的包扎方法如包扎过紧往往会导致创面的二次感染造成坏疽、腐肉等情况,进而造成烧伤创面的二次感染,影响烧伤创面的恢复。而采用抗生素等生物制剂治疗时,虽然效果较佳,又很容易因抗生素的滥用导致菌群失调及耐药性问题。
针对上述问题,本申请实施例提供一种枯草芽孢杆菌TN、活菌制剂及其制备方法和应用,能够有效避免因不适宜的包扎疗法导致的烧伤创面二次感染的问题,或因抗生素等生物制剂的滥用导致的菌群失调及耐药性问题,且具有消炎、抗氧化、抑制黑色素的产生和保湿等作用,有利于促进创面恢复、防止留疤的效果。
以下结合附图详细描述本申请实施例的技术方案。
实施例1TN菌株的获得
1、菌株分离、纯化、保存
从水稻秸秆分离纯化得到菌株TN,具体分离纯化步骤如下:
将水稻秸秆进行预处理,具体包括:首先将水稻秸秆用灭过菌的剪刀剪成3~5cm的小段,再用无菌水清洗表面灰尘,得洗净的水稻秸秆。将洗净的水稻秸秆放入2%的次氯酸钠溶液中,浸泡2min后,用无菌水清洗一次,再用70%的酒精将其浸泡2min,用无菌水清洗,优选的,用无菌水清洗8次,每次清洗5min,并将最后一次洗涤的无菌水涂布于LB固体培养基上进行培养,培养温度为37℃、培养时间为24-48h,当培养24h后,可观察LB固体培养基上细菌的生长情况,若24h后LB固体培养基上无细菌生长,则说明水稻秸秆已彻底消毒,得到消毒后的水稻秸秆。
将消毒后的水稻秸秆的两端各剪去1cm,得中段水稻秸秆,将中段水稻秸秆放入研钵中,加入无菌水和石英砂,用研磨棒充分研磨,得研磨液。需要注意的是,研磨操作需要在无菌的环境中进行,即所述研钵、石英砂和研磨棒均需提前灭菌。
吸取1mL上述研磨液,加入9mL无菌水中,充分混匀,然后继续用无菌水按10倍梯度稀释,稀释后得到浓度分别为10-4、10-5和10-6的样品悬浮液,分别取200μL浓度为10-4、10-5和10-6的样品悬浮液均匀涂布于已在121℃的高压下灭菌20min的LB固体培养基上培养,生成菌落。
通过平板划线法对新生成的菌落进行分离纯化,具体包括:用平板划线法挑取新生成的菌落在LB固体培养基上纯化,反复传代培养,直至菌落具有相同的颜色、形状、大小、质地和透明度。
需要说明的是,所述LB固体培养基包括蛋白胨9~12g/L、酵母提取物4~6g/L、NaCl9~12g/L、蔗糖14~18g/L,优选的,蛋白胨9g/L、酵母提取物6g/L、氯化钠(NaCl)9g/L、琼脂粉16g;pH值为7.0;用LB固体培养基传代培养的条件为温度为20-45℃,PH值为6.0~10.0,优选的,温度为37℃,PH值为7.0。
最后通过简单染色(石碳酸复红染色)和显微镜镜检(油镜),进一步观察其形态,以长度均一、宽度一致、染色情况统一为菌株纯化标准。将纯化后的菌株用已灭菌的接种环挑取3~4环保存于保存液(20%的甘油)中,并放至-20℃和-80℃的环境中保存,得到枯草芽孢杆菌TN(简称:菌株TN)。
纳豆菌也称纳豆芽孢杆菌,纳豆芽孢杆菌属于枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis),是枯草芽孢杆菌的一个亚种,本申请提供的枯草芽孢杆菌TN(BacillussubtilisTN)细分属于纳豆芽孢杆菌,由于纳豆芽孢杆菌可生产纳豆激酶,纳豆激酶是一种碱性丝氨酸蛋白酶,可水解蛋白酶平板形成透明圈,根据这一特性能够高效挑选有效菌株,具体包括:将脱脂牛奶和脱脂牛奶培养基的其他组分分开灭菌,待冷却至45℃-50℃时,将脱脂牛奶和其他组分混合均匀,倒平板,置于超净工作台中充分晾干脱脂牛奶平板表面的水分。用接种环挑取活化后的拮抗菌菌苔点种在脱脂牛奶培养基平板中央部位,然后将平板倒置培养于28℃恒温培养箱中,培养2d后观察脱脂牛奶平板中生长的菌落周围是否出现透明圈,出现则说明有蛋白酶产生,反之,则说明无蛋白酶产生,挑选产蛋白酶能力强的菌株即为有效菌株,该有效菌株即为菌株TN,并对所述菌株TN进行DNA提取。
实施例2菌株TN的16SrDNA分析。
提取实施例1分离纯化得到的菌株TN的DNA,用细菌通用引物27F(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG)和1492R(5’-TACCTTGTTACGACTT)扩增16SrDNA,并用琼脂糖凝胶检测,经PCR扩增产物送检验公司测序,获得菌株TN的16SrRNA基因序列,将16SrRNA基因序列输入GenBank进行Blast比对,初步确定本发明的菌株TN在分类学中的属、种的位置。结果发现本发明的菌株TN,与枯草芽孢杆菌模式菌株相似性为99.93%,因此将本发明的菌株TN应归属于枯草芽孢杆菌,更具体的,可归属于枯草芽孢杆菌中的纳豆芽孢杆菌。
其中,16SrDNA基因序列测定结果如下:
GGcGGcGTGCcTaATACATGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTTTGAACCGCATGGTTCAAACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCCGAAGGTGGGACAGATGATT。
本发明所述的枯草芽孢杆菌TN于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,菌株保藏号为GDMCC No: 63246,保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
实施例3枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备
枯草芽孢杆菌菌液的制备:用锥形瓶分装1LLB液体培养基,121℃灭菌30min后取出,冷却后加入实施例1获取的枯草芽孢杆菌菌株,并置于37℃摇床培养24小时,得枯草芽孢杆菌菌液。所述LB液体培养基包括蛋白胨8-10g/L、酵母提取物5-7g/L、NaCl8-10g/L,优选的,蛋白胨9g/L、酵母提取物6g/L、氯化钠(NaCl)9g/L;pH值为7.0。
营养液的制备:取颗粒饱满的黄豆60g清洗4-5次后,用纯水充分浸泡,使黄豆吸水膨胀至表面光滑、无皱皮、豆皮易脱落、掐之易断且断面已浸透无硬心,倒去水以去除杂质,再补足水分至1L,加入7g大豆蛋白胨和5g琼脂溶解,溶解完成后倒入托盘中,蒸或煮1h,冷却即得营养液,可将所述营养液分装锥形瓶,加塞、包扎,121℃灭菌30min后,取出冷却,密封保存。
将上述枯草芽孢杆菌菌液与营养液混合,并倒入已灭菌的托盘中,在37℃培养箱中培养20h,使得枯草芽孢杆菌菌液中的菌株产生大量菌膜及纳豆蛋白酶、纳豆多糖等粘稠性代谢产物,再用100目的滤网滤去黄豆颗粒,然后分装到灭菌的容器中,即得枯草芽孢杆菌活菌制剂。
实施例4枯草芽孢杆菌活菌制剂的应用
如图3-4所示,在烧伤创口表面直接涂抹枯草芽孢杆菌活菌制剂,8小时后,未涂抹枯草芽孢杆菌活菌制剂的烧伤创面并未发生明显的改善变化,如图5-6所示,8小时后,涂抹枯草芽孢杆菌活菌制剂的烧伤创面变黑并开始结痂。从创面愈合速度来看,枯草芽孢杆菌活菌制剂具有加快烧伤创面新生肉芽组织生长,促进烧伤组织愈合的良好效果。
关于上述实施例中的装置,其中各个模块执行操作的具体方式已经在有关该方法的实施例中进行了详细描述,此处将不再做详细阐述说明。
上文中已经参考附图详细描述了本申请的方案。在上述实施例中,对各个实施例的描述都各有侧重,某个实施例中没有详细描述的部分,可以参见其他实施例的相关描述。本领域技术人员也应该知悉,说明书中所涉及的动作和模块并不一定是本申请所必须的。另外,可以理解,本申请实施例方法中的步骤可以根据实际需要进行顺序调整、合并和删减,本申请实施例装置中的模块可以根据实际需要进行合并、划分和删减。
以上已经描述了本申请的各实施例,上述说明是示例性的,并非穷尽性的,并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范围和精神的情况下,对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更都是显而易见的。本文中所用术语的选择,旨在最好地解释各实施例的原理、实际应用或对市场中的技术的改进,或者使本技术领域的其它普通技术人员能理解本文披露的各实施例。

Claims (10)

1.一种枯草芽孢杆菌TN,其特征在于:于2023年3月8日保藏于广东省微生物菌种保藏中心,菌株保藏号为GDMCC No:63246,保藏地址为广东省广州市先烈中路100号。
2.一种枯草芽孢杆菌活菌制剂,其特征在于:包括如权利要求1所述的枯草芽孢杆菌TN及其生理代谢产物和营养液。
3.根据权利要求2所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂,其特征在于:
所述生理代谢产物包括纳豆多糖和纳豆蛋白酶。
4.一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,其特征在于:用于制备如权利要求2-3任一项所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂,主要包括以下步骤:
将枯草芽孢杆菌TN放入LB液体培养基中,37℃摇床培养24h,得枯草芽孢杆菌菌液;
将所述菌液与营养液混合,37℃培养箱中培养20h,过滤后即得枯草芽孢杆菌活菌制剂。
5.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,其特征在于:
所述营养液的制备包括以下步骤:
将黄豆清洗后充分浸泡,并加入大豆蛋白胨和琼脂溶解;
溶解完成后,蒸或煮1h后,冷却,即得营养液。
6.如权利要求4所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,其特征在于:
所述枯草芽孢杆菌TN的制备包括以下步骤:
将水稻秸秆进行预处理,得消毒后的水稻秸秆;
将消毒后的水稻秸秆研磨制成样品悬液,涂布于LB固体培养基上进行培养,生成菌落;
通过平板划线法对新长出的菌落进行分离纯化;
将纯化后的菌株保存于保存液中储存,得到枯草芽孢杆菌TN。
7.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,其特征在于:
所述将水稻秸秆进行预处理包括:
将水稻秸秆用灭过菌的剪刀剪成3~5cm的小段,用2%的次氯酸钠浸泡2min,再用70%酒精浸泡2min后,用无菌水清洗若干次。
8.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,其特征在于:
所述将水稻秸秆研磨制成样品悬液,包括:
将消毒后的水稻秸秆的两端各剪去1cm,加入无菌水和石英砂,用研磨棒充分研磨,并按10倍梯度稀释,分别得到浓度为10-4、10-5和10-6的样品悬浮液。
9.如权利要求6所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂的制备方法,其特征在于:
所述保存液包括以下组分:20%的甘油。
10.一种枯草芽孢杆菌活菌制剂的应用,其特征在于:如权利要求2-3任一项所述的枯草芽孢杆菌活菌制剂在治疗烧伤创面的应用。
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