CN116554314A - 抗新型冠状病毒s蛋白受体结合域的纳米抗体及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于抗体制备技术领域，尤其涉及抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体及其应用。所述纳米抗体的重链可变区包括3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述纳米抗体选自(Nb1)‑(Nb4)中的至少一种。本发明提供的4株纳米抗体与新型冠状病毒S蛋白受体结合域的亲和力高，特异性结合能力强，还具有良好的病毒中和能力，对野生型和多种变异株均具有较高的中和活性，具有作为免疫学定性定量分析和检测新型冠状病毒的抗体材料的应用潜力和价值以及有望作为中和抗体用于治疗新型冠状病毒有效药物的研发。
Description
技术领域
本发明涉及抗体制备技术领域，特别涉及抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体及其应用。
背景技术
在对抗新型冠状病毒感染方面，中和抗体的开发是其中一个重要的方向。中和抗体通过与病毒表面的特异性抗原相结合，进而阻止病毒与细胞上表达的受体相结合并进入细胞内，这一特性可以防止病毒侵入尚未受到感染的细胞。SARS-CoV-2病毒表面具有糖基化的刺突蛋白(spike protein，S蛋白)，能与宿主细胞受体蛋白ACE-2相互作用并触发膜融合，该S蛋白含有两个亚基(subunit)，S1和S2，其中，S1主要包含有受体结合区(receptorbinding domain，RBD)，负责识别细胞的受体，通过中和抗体阻断S1蛋白与ACE2的结合是对抗新型冠状病毒感染的有效途径，因此，S1蛋白成为中和抗体作用的关键靶点。
目前，针对新型冠状病毒的中和抗体大致可以分为三类，(a)针对S1蛋白的RBD，(b)针对S1蛋白的N末端(NTD)，(c)其他针对S1蛋白的中和抗体，既不与RBD结合，也不识别NTD结构域。但是，有研究表明部分新型冠状病毒中和抗体可以增强新冠假病毒对原本不敏感的B细胞系的感染，这种增强感染是由抗体的Fc区域与B细胞表面的FcγRIIB直接相互作用而导致的。
纳米抗体不含Fc区域，是骆驼科动物缺失轻链的天然重链抗体的可变区(VHH)，其直径2.5nm，长4nm，分子量只有15KD。与传统抗体相比，纳米抗体结构上存在较大差异，传统抗体通过V区的六个CDR环与抗原结合，其中三个在重链可变区，三个在轻链可变区；而纳米抗体只含有重链可变区，由四个FR区连接三个CDR环组成，其与抗原之间的相互作用由三个CDR环介导，并由CDR3支配，以形成形状较小的凸状、凹槽状或口袋状等空腔，可识别常规抗体难以识别的表位；因此，纳米抗体虽然尺寸小，但抗原结合活性不亚于传统抗体，且由于其体积小，可瞬间穿透细胞进入胞内，高效捕获相关抗原。而且，与传统抗体相比，纳米抗体的FR2区的4个脂肪族氨基酸残基被亲水性氨基酸取代，使得亲水性大幅提高，且部分FR2被拉伸扭转的CDR3环覆盖，难以与外界水环境的接触，从而有效防止其二聚化，由此，纳米抗体的水溶解性更好，表达量通常也较高。此外，与传统抗体相比，纳米抗体具有更高的稳定性，主要归因于其内部存在额外的二硫键，由于二硫键不易断裂，构象不易发生改变，所以纳米抗体相对常规抗体更耐高温和高浓度的有机溶剂。当纳米抗体进入体内后，可高效穿透细胞来快速捕获抗原、中和病毒以达到治疗目的，针对新型冠状病毒S1蛋白RBD结构域的纳米抗体具有重要的应用价值。
虽然目前已研制出一些抗新型冠状病毒的纳米抗体，但新型冠状病毒变异快，陆续发现了多种类型的新型冠状病毒变异株，其传染性、宿主范围、传播力度、毒力、致病力、病情的严重程度、预后以及免疫原性也发生相应改变，这将显著影响纳米抗体的性能，已有的中和抗体较难靶向新的变异株，且亲和力有待提高。因此，开发新型的可识别和结合新型冠状病毒尤其是能靶向不同新型冠状病毒变异株的中和抗体具有重要意义和广阔的应用前景。
发明内容
针对现有技术中和抗体对抗原亲和力低或广谱性差的问题，本发明提供了一种抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，并提供了编码纳米抗体的多核苷酸、用于表达该多核苷酸的表达载体以及宿主细胞，并提供了前述纳米抗体、多核苷酸、表达载体和宿主细胞的应用。
为实现上述目的，本发明具体通过以下技术方案实现：
本发明第一方面提供了一种抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区包括3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述纳米抗体选自(Nb1)-(Nb4)中的至少一种；
(Nb1)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1第26-33位、第51-57位和第96-115位所示；
(Nb2)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2第26-33位、第51-58位和第97-117位所示；
(Nb3)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3第26-33位、第51-57位和第96-115位所示；
(Nb4)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4第26-33位、第51-57位和第96-115位所示。
进一步地，所述重链可变区还包括4个骨架区FR1、FR2、FR3和FR4，上述选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的所述骨架区的氨基酸序列如下所示；
(Nb1)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示；
(Nb2)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2第1-25位、第34-50位、第59-96位和第118-128位所示；
(Nb3)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示；
(Nb4)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示。
进一步地，选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的重链可变区的全长氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示。
进一步地，所述纳米抗体包括(Nb3)-(Nb4)中的至少一种。更进一步地，所述纳米抗体选自(Nb3)或(Nb4)中的一种。
本发明第二方面提供了一种多核苷酸，用于编码如上所述的纳米抗体。
进一步地，编码选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的多核苷酸序列分别如SEQ IDNO：5-8所示。
本发明第三方面提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
本发明第四方面提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带如上所述的多核苷酸或包含如上所述的表达载体。
本发明第五方面提供了如上所述的纳米抗体、如上所述的多核苷酸、如上所述的表达载体或如上所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒引起的肺炎预防和/或治疗药物中的应用。
本发明第六方面提供了如上所述的纳米抗体、如上所述的多核苷酸、如上所述的表达载体或如上所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
本发明的优点及积极效果为：
本发明具备上述所述的CDR序列的4株纳米抗体特异性结合抗原的能力强，与新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的亲和力高，具有作为免疫学定性定量分析和检测新型冠状病毒的抗体材料的应用潜力和价值。而且经过假病毒中和实验，本发明的上述抗体还具有病毒中和能力，对野生型和多种变异株均具有较高的中和活性，有望作为中和抗体用于治疗新型冠状病毒有效药物的研发。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将对实施例描述中所需要使用的附图作简单的介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1为本发明实施例第四次免疫后羊驼血清效价检测图；
图2为本发明实施例PCR扩增建库所需VHH基因的琼脂糖凝胶电泳图；
图3为本发明实施例建库时菌落PCR的琼脂糖凝胶电泳图；
图4为本发明实施例的纳米抗体对抗原结合能力检测结果图；
图5为本发明实施例的抗体株1/YRSS-18的亲和力曲线；
图6为本发明实施例的抗体株2/YRSS-7的亲和力曲线；
图7为本发明实施例的抗体株3/YRSS-19的亲和力曲线；
图8为本发明实施例的抗体株5/YRSS-44的亲和力曲线；
图9为本发明实施例的抗体株13/YRSS-12的亲和力曲线；
图10为本发明实施例的抗体株17的亲和力曲线；
图11为本发明实施例的抗体株22/YRSS-4的亲和力曲线；
图12为本发明实施例的抗体株34的亲和力曲线；
图13为本发明实施例的纳米抗体对不同新型冠状病毒假病毒中和实验结果图。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明。此处所描述的实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本发明包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本发明中所用的表示用量、百分比的所有数字以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。另外，术语“包括”、“包含”、“含有”、“具有”等类似词语的含义是非限制性的，即可加入不影响结果的其它步骤和其它成分。
需要说明的是，在本发明中使用的“和/或”应被视对在具有或不具有另一者的情况下两种指定特征或组分中的每一种的具体公开。例如，“A和/或B”将被视为(i)A、(ii)B、以及(iii)A和B。
为使本发明的上述目的、特征和优点能够更为明显易懂，下面结合附图对本发明的具体实施例做详细说明。
传统的抗体分子结构类似于“Y”形，是由两条重链(H)和两条轻链(L)构成的对称结构。重链和轻链靠近N端的氨基酸序列变化很大，其他部分氨基酸序列相对恒定，将轻链和重链中靠近N端氨基酸序列变化较大的区域称为可变区(variable region，V)，将靠近C端的氨基酸序列相对稳定的区域，称为恒定区(constant region，C)。重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)中氨基酸组成和排列顺序高度可变的区域称为高变区(hypervariableregion，HVR)或互补决定区(complementarity determining region，CDR)，VH与VL各有3个CDR，分别用CDR1、CDR2和CDR3表示；在可变区中，CDR区域之外的氨基酸组成和排列顺序相对保守，称为骨架区(framework region，FR)，VH与VL各有4个骨架区，分别用FR1、FR2、FR3和FR4表示，重链与轻链的3个CDR通过4个FR紧密地靠在一起并相互配合，共同组成抗体的抗原结合部位(antigen-binding site)，决定抗体的特异性。每个VH与VL按以下顺序从氨基端到羧基端排列：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3、FR4。轻链恒定区(CL)和重链恒定区(CH)不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。抗体CL与CH的氨基酸序列是本领域众所周知的。
在长期的进化过程中，一些骆驼科动物的免疫系统中出现了缺失轻链及重链CH1结构但完全保留抗原结合活性的重链抗体(heavy-chain antibody，HCAb)。HCAb特异性结合抗原的区域为其重链可变区(variable domain of heavy chain of heavy-chainantibody，VHH)，VHH是重链抗体中最小的完整功能结构，其分子量约为15kDa，大小仅为传统抗体分子质量的1/10，因此这种只包含一个VHH的抗体又被称为纳米抗体(nanobody，Nb)。
在本发明的上下文中，术语“纳米抗体”或“VHH抗体”、“VHH”具有相同的含义并可互换使用，均指仅由一个重链可变区组成的抗体，包括4个FR区和3个CDR区，相比于传统抗体，纳米抗体的轻链天然缺失，且CDR3长度比传统抗体的CDR3长，在一定的程度上弥补了因轻链可变区缺失而造成的结合力下降，从而使其具有较强的抗原结合能力。在一些实施例中，纳米抗体可通过噬菌体展示技术、酵母展示技术、单个B细胞筛选或单细胞测序法制备得到，其来源包括但不限于骆驼。
术语“抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的纳米抗体”、“针对新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的纳米抗体”、“结合新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的纳米抗体”等类似词语可互换使用，均指特异性结合新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的VHH抗体。
术语“特异性结合”是本领域众所周知的术语，如果分子与特定目标抗原或表位的反应比与其他目标抗原或表位的反应更频繁、更快速、持续时间更长和/或具有更大的亲和力，则其表现出“特异性结合”，“特异性结合”或称为“优先结合”，并不一定需要(尽管可以包括)排他结合。
本发明实施例提供了一种抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，所述纳米抗体的重链可变区(VHH)包括3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述纳米抗体选自(Nb1)-(Nb4)中的至少一种；
(Nb1)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1第26-33位、第51-57位和第96-115位所示(对应于抗体株1/YRSS-18)；
(Nb2)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2第26-33位、第51-58位和第97-117位所示(对应于抗体株3/YRSS-19)；
(Nb3)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3第26-33位、第51-57位和第96-115位所示(对应于抗体株17)；
(Nb4)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4第26-33位、第51-57位和第96-115位所示(对应于抗体株22/YRSS-4)。
纳米抗体的3个CDR环高度可变，这些环在折叠蛋白结构域的一侧形成扩展的结构界面，有利于形成抗原结合界面或互补位，非常适合插入对应抗原分子的沟槽或裂隙内，增大与抗原的相互作用面积，从而产生了多种抗原结合特异性。抗体对潜在抗原的亲和力和特异性大部分由纳米抗体CDR的氨基酸序列决定。本发明具备上述所述的CDR序列的4株纳米抗体特异性结合抗原的能力强，与新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的亲和力高，其中，1/YRSS-18纳米抗体的亲和力为4.3nM，3/YRSS-19纳米抗体的亲和力为4.2nM，17纳米抗体的亲和力为2.5nM，22/YRSS-4纳米抗体的亲和力为2.9nM，适用于高特异性和高灵敏性检测新型冠状病毒，具有作为免疫学定性定量分析和检测新型冠状病毒的抗体材料的应用潜力和价值。而且经过假病毒中和实验，本发明的上述抗体还具有病毒中和能力，对野生型和多种变异株均具有较高的中和活性，有望作为中和抗体用于治疗新型冠状病毒有效药物的研发。
可选地，所述重链可变区还包括4个骨架区FR1、FR2、FR3和FR4，上述选自(Nb1)-(Nb4)的纳米抗体的所述骨架区的氨基酸序列如下所示；
(Nb1)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示(对应于抗体株1/YRSS-18)；
(Nb2)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2第1-25位、第34-50位、第59-96位和第118-128位所示(对应于抗体株3/YRSS-19)；
(Nb3)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示(对应于抗体株17)；
(Nb4)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示(对应于抗体株22/YRSS-4)。
在本发明中，纳米抗体的4个所述骨架区与3个所述互补决定区按顺序交错排列，构成重链可变区(VHH)，选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的重链可变区(VHH)的全长氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1-4所示，对纳米抗体的氨基酸序列信息汇总如下。
表1本发明的纳米抗体的氨基酸序列信息汇总
需要说明的是，本发明(Nb1)-(Nb4)的纳米抗体可以单独使用，也可以任意组合使用，具体而言，单独使用抗体株1/YRSS-18、抗体株3/YRSS-19、抗体株17或抗体株22/YRSS-4存在4种情况，组合使用存在11种情况，包括：抗体株1/YRSS-18、抗体株3/YRSS-19、抗体株17和抗体株22/YRSS-4中任意2种组合、任意3种组合和4种组合的情形。
实验中发现，抗体株17和抗体株22/YRSS-4的亲和力更强，具有显著的新型冠状病毒中和活性和更广谱抗病毒活性。因此，在一些较佳的实施例中，所述纳米抗体优选包括(Nb3)-(Nb4)中的至少一种。更优选地，所述纳米抗体选自(Nb3)或(Nb4)中的一种。
本发明另一实施例提供了一种多核苷酸，所述多核苷酸用于编码如上所述的纳米抗体，所述纳米抗体选自(Nb1)-(Nb4)中的至少一种。
多核苷酸通常是RNA(例如mRNA)或DNA(例如cDNA或基因组DNA，核酸分子可以是单链或双链的。
示例性地，编码选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的多核苷酸序列分别如SEQ IDNO：5-8所示，对纳米抗体的多核苷酸序列信息汇总如下。
表2本发明的纳米抗体的多核苷酸序列信息汇总
需要注意的是，所述多核苷酸的序列依据氨基酸序列通过常规手段如密码子编码规则推导即可得到。本领域技术应当理解，由于遗传密码的简并性，不同于本发明所示例的多核苷酸序列同样可以编码得到本发明的兔单克隆抗体，因此，本发明提供的用于编码如上所述的抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体的多核苷酸不作为对本发明保护范围的限定。
本发明又一实施例提供了一种表达载体，所述表达载体用于表达如上所述的多核苷酸。
将编码本发明纳米抗体的多核苷酸序列可操作地连接至少一个表达调控元件，可以形成表达载体，之后通过将含有编码本发明多核苷酸序列的表达载体导入宿主细胞内，即可获得相应的特异性抗体。此为本领域的公知技术，在此不再详细介绍。
可选地，所述表达载体包括原核表达载体(如大肠杆菌表达载体、枯草杆菌表达载体)、真核表达载体(如酵母表达载体)或病毒表达载体(如慢病毒、腺病毒)。
本发明再一实施例提供了一种宿主细胞，所述宿主细胞携带如上所述的多核苷酸或包含如上所述的表达载体。
宿主细胞包括原核细胞和真核细胞，根据表达载体的类型选择，例如，当为原核表达载体时，宿主细胞选用原核细胞，常用的原核宿主细胞的例子包括大肠杆菌、枯草杆菌等。用于表达本发明的纳米抗体的宿主细胞包括但不限于大肠杆菌、枯草杆菌、酵母细胞、昆虫细胞等。在获得转化如上所述的多核苷酸或包含如上所述的表达载体的宿主细胞后，在适合条件下培养该细胞，即可表达出纳米抗体，然后再分离出表达的纳米抗体。
基于本发明提供的纳米抗体具有高亲和力和优良的中和病毒活性，本发明实施例还提供了如上所述的纳米抗体、如上所述的多核苷酸、如上所述的表达载体、如上所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒引起的肺炎预防和/或治疗药物中的应用。
本发明的纳米抗体具有对新型冠状病毒(SARS-CoV-2)野生型和多种变异株的中和活性，将其作为药物的活性成分，可以抑制SARS-CoV-2对细胞的感染，起到预防、缓解或治疗的作用。具体地，纳米抗体在制备新型冠状病毒引起的肺炎预防和/或治疗药物中的应用优势与如上所述的纳米抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
另外，基于本发明提供的纳米抗体具有高亲和力和优良的中和病毒活性，本发明实施例还提供了如上所述的纳米抗体、如上所述的多核苷酸、如上所述的表达载体、如上所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
本发明的纳米抗体对SARS-CoV-2S蛋白的亲和力高，将其作为抗原结合抗体，可用于识别并结合待检测样本中的SARS-CoV-2，同时抗原结合抗体可以与发光标记物连接或者与偶联有发光标记物的检测抗体特异性结合，发光标记物可以为胶体金、化学染料、荧光染料等中的一种，发光标记物用于产生可识别的信号变化，从而实现定性或定量检测SARS-CoV-2。具体地，纳米抗体在制备新型冠状病毒检测试剂和/或检测试剂盒中的应用优势与如上所述的纳米抗体相对于现有技术的优势相同，在此不再赘述。
可选地，定性或定量检测SARS-CoV-2的方法可以采用公知的免疫学分析方法，如酶免疫分析法(Enzyme immunoassay，EIA)、酶联免疫吸附法(Enzyme linkedimmunosorbent assay，ELISA)、酶联免疫斑点法(Enzyme-linked Immunospot，ELISPOT)、免疫组织化学法(Immunohistochemistry，IHC)、免疫荧光法(Immunofluorescence，IF)、免疫印迹法(Western blot，WB)、流式细胞术(Flow Cytometry，FCM)等。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如冷泉港实验室出版的《分子克隆实验指南(第四版)》中所述的条件，或者通常按照制造厂商所建议的条件。
实施例1抗新型冠状病毒RBD结构域抗原的纳米抗体的制备
一、新型冠状病毒S蛋白免疫羊驼及血清效价检测
羊驼免疫：使用购买的Recombinant SARS-CoV-2Spike S1 Protein(购自Sino，Catalog Number：40592-V08H121)为免疫原，首次免疫使用200μg免疫原，将免疫原与等量的完全弗式佐剂混合制成乳化剂，颈部皮下多点注射。间隔3周取100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，颈部皮下多点注射，加强免疫两次，三次免疫后取血清，通过酶联免疫吸附(ELISA)法测定血清效价。一周后用100μg免疫原与等量的不完全弗式佐剂混合制成乳化剂，颈部皮下多点注射，加强免疫一次，一周之后取血清，通过ELISA法测定血清效价。同时取100mL血液，用于后续噬菌体建库使用。
ELISA法测定血清效价：(1)使用0.5μg/mL的野生型新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)包被酶标板，4℃孵育过夜；(2)用含0.1％ Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.2，浓度0.05M)进行洗板；(3)用含有5％牛血清白蛋白、0.05％ Twee-20的磷酸盐缓冲液(pH7.2，浓度0.05M)进行封闭；(4)1:1000稀释血清样本，之后1：3进行稀释，稀释7个点，将稀释后的血清样本加入酶标板中，室温孵育1h；(5)用含0.1％Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.2，浓度0.05M)进行洗板；(6)加入用含1％牛血清白蛋白、0.05％ Tween-20的磷酸盐缓冲液(pH7.2，浓度0.05M)稀释的标记辣根过氧化物酶(HRP)的羊驼IgG二抗，室温孵育1h，洗涤液洗板；(7)加入TMB显色液，室温显色10min，加入草酸终止显色；(8)在450nm和630nm下测定吸光值，OD450减去OD630为校正后的吸光值，结果见图1，其中纵坐标为吸光度值，横坐标为血清稀释度，prebleed表示免疫前血清，bleed I和bleed II表示第四次免疫后血清。
在第四次免疫后，羊驼血清稀释度在1：243000时bleed II的吸光值大于prebleed吸光值的3倍，血清中抗体针对新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的效价≥1：243000，得到用于构建噬菌体文库的羊驼外周血淋巴细胞。
二、纳米抗体噬菌体库构建
(1)淋巴细胞分离：将收集的羊驼外周血使用Ficoll密度梯度离心法进行羊驼外周血单个核细胞(Peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离。
(2)提取总RNA：取0.5mL PBMC加入1.5mL离心管中，之后加入100μL氯仿，剧烈震荡15s后，室温放置5min；之后4℃、12000g离心15min，离心后出现分层，将最上层的透明层小心转移到新的无RNase和DNase的1.5mL离心管中，每管加入250μL的异丙醇，颠倒混匀后室温放置10min；再4℃、12000g离心10min，去除上清保留沉淀，每管加入1mL 75％乙醇，颠倒混匀，最后7500g离心5min，弃上清保留沉淀，室温干燥10min，加入DEPC处理水溶解，55℃孵育10min以确保RNA完全溶解，得到从PBMC中提取出的总RNA。
(3)反转录为cDNA：将Oligo(dT)18(50μM)1μL、dNTP Mix 1μL和总RNA 5μg加入到PCR管中，加无核酸酶水使体积达到13μL，置于65℃，反应5min；反应结束后向PCR管中加入5×FS Buffer 4μL、DTT(100mM)1μL、RNaseOUT(40U/μL)1μL和ABScriptⅡRT(200U/μL)1μL，吹打混匀，反应条件为42℃1h，85℃5min，反转录结束即获得cDNA。
(4)PCR扩增重链可变区(VHH)基因：以cDNA为模板进行第一轮PCR扩增，得到第一轮扩增产物；第一轮PCR扩增体系为：2×Gloria mix 12.5μL、Primer F 0.5μL、Primer R0.5μL和模板cDNA分别0.5μL，1μL，2μL，4μL，加入ddH2O至总体积25μL；第一轮PCR扩增程序为：98℃30s，98℃10s，64℃30s，72℃1min，72℃5min，16℃∞，30个循环。以第一轮扩增产物为模板进行第二轮PCR扩增，得到第二轮扩增产物；第二轮PCR扩增体系为：2×Gloria mix12.5μL、Primer F 0.5μL、Primer R 0.5μL和第一轮扩增产物10ng，ddH2O至总体积25μL；第二轮PCR扩增程序为：98℃30s，98℃10s，64℃30s，72℃1min，72℃5min，16℃∞，20个循环；使用琼脂糖凝胶纯化方式进行片段纯化，结果见图2。从图2中可以看出第一轮PCR产物有两条带，分别在1000bp和700bp，700bp的条带为含有VHH基因的条带，对其进行切胶回收，做为第二轮PCR的模板；第二轮PCR产物条带在500bp，为建库所需VHH基因。
(5)VHH基因与载体连接构建噬菌体文库：将第二轮PCR扩增产物与噬菌体载体共同使用PstI和EcoR91I进行双酶切；体系为：PstI 2μL、EcoR91I 2μL、扩增基因3μg和10×buffer 3μL，补足ddH2O到30μL；PstI 2μL、EcoR91I 2μL、载体10μg和10×buffer3μL，补足ddH2O到30μL，37℃过夜酶切。回收酶切产物，使用T4连接酶按照摩尔比3：1连接目的片段和载体，16℃过夜连接，之后回收连接产物。
(6)电转化至感受态细胞后建立噬菌体文库：将1μL回收后的连接产物加入25μL融化的TG1感受态细胞中，将混合后的感受态细胞和连接产物转移到预冷的电转杯中，使用TG1电转程序进行电转。电转后立即向电转杯中加入1mL SOC培养基，之后37℃、170rpm复苏60min。进行30个电转反应，将复苏后的TG1细胞混合摇匀后从中取100μL进行梯度稀释，之后涂在含有氨苄抗性的LB平板上过夜生长，作为质控板。第二天统计菌落数，计算库容量。剩余TG1细胞涂在有氨苄抗性的LB平板。将在上述培养板上生长的细胞用LB培养基和涂布棒冲洗刮下，加入甘油终浓度为20％，-80℃进行冻存，获得VHH噬菌体库。
(7)纳米抗体噬菌体库质检：将质控板上的菌落，1：1000板长菌落252个，1：10000板长菌落28个。经计算库容量为8.4×108。挑取50个单菌落进行PCR反应，可以看到50个单菌落都有插入，插入率为100％，结果见图3。对50个单菌落进行测序，使用Vector NTI对测序结果进行分析比对，得到46条完整的VHH开放阅读框(ORF)序列，有效插入率为92％。
三、噬菌体库富集与筛选
细菌库扩增：将菌落接种于60mL含2％葡萄糖的氨苄抗性的2×TY培养基中，37℃、200rpm培养3小时左右，至OD600达到0.5。取10mL菌液进行超染，37℃孵育30min，离心换液到50mL氨苄和卡那抗性的2×TY培养基中，37℃、200rpm培养过夜。用PEG6000/2.5M NaCl溶液回收噬菌体，之后感染TG1感受态细胞，计算噬菌体库滴度。经计算噬菌体滴度达到1012cfu/mL。
第一轮富集：使用SARS-CoV-2Omicron Spike RBD Protein(购自Sino，CatalogNumber：40592-V08H121)进行富集，按照2μg/mL加入到高吸附96孔板中，每孔150μL，60rpm、4℃过夜孵育，第二天封闭1h，洗板后加入噬菌体100μL，震荡孵育2h，洗板后加入100μL0.25mg/mL胰酶震荡孵育30min。每孔加入5μL 4mg/mL AEBSF溶液，即为第一轮富集后的噬菌体库。取50μL噬菌体感染TG1菌液10mL，从中取100μL菌液梯度稀释后涂平板，其余菌液37℃、170rpm过夜培养后保存细菌库。
第二轮富集：第二轮富集前需对第一轮的细菌库进行扩增，之后进行超染，收集噬菌体库后进行第二轮富集，富集流程同上。挑取第二轮富集后的菌落96个，IPTG诱导表达，收取上清进行ELISA检测、并将96个克隆进行测序。同时以第二轮富集的噬菌体文库为模板进行NGS测序。
综合阳性单克隆测序结果和NGS测序结果，从中选择8株纳米抗体进行酵母表达，通过ELISA进行结合能力检测，操作同“一、新型冠状病毒S蛋白免疫羊驼及血清效价检测”照中血清效价测定，结果见图4。
根据结合能力检测结果，1/YRSS-18、2/YRSS-7、3/YRSS-19、5/YRSS-44、13/YRSS-12、17、22/YRSS-4这7株抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的纳米抗体与新型冠状病毒S蛋白RBD具有优秀的结合能力。
实施例2抗新型冠状病毒RBD结构域的纳米抗体的性能测试
为了验证初步筛选的8株抗新型冠状病毒S蛋白RBD纳米抗体是否具备潜在应用价值，进行亲和力测定和假病毒中和等实验。
1、抗体亲和力测定：
使用Probe Life公司的Gator生物分子相互作用分析仪对8株纳米抗体进行亲和力测定，采用酵母表达的VHH带有his标签，将anti-his探针浸泡于VHH溶液中，使VHH与探针结合，之后将加载了VHH的探针浸泡于不同浓度的抗原蛋白溶液中，使之与抗原蛋白相结合。抗原蛋白浓度依次为：300nM、150nM、75nM、37.5nM和18.75nM，获得亲和力曲线，1/YRSS-18、2/YRSS-7、3/YRSS-19、5/YRSS-44、13/YRSS-12、17、22/YRSS-4和34的亲和力曲线分别见图5-12，其中，横坐标为时间，纵坐标为抗原与抗体结合后探针上生物膜的厚度，最终通过曲线拟合和计算得到8株纳米抗体的亲和力相关参数(见表3)，解离系数Koff用于表征抗体与抗原解离速度的常数，结合系数Kon用于表征抗体与其靶标结合速度的常数，亲和力常数Kd为Koff/Kon的比，表示抗体与其抗原之间的平衡解离常数。
表3兔单克隆抗体5F11和5C2的亲和力相关参数测定结果
注：E表示10。
从图5-12和表1可以看出，1/YRSS-18纳米抗体的亲和力为4.3nM，2/YRSS-7纳米抗体的亲和力为4.8nM，3/YRSS-19纳米抗体的亲和力为4.2nM，5/YRSS-44纳米抗体的亲和力为5.5nM，13/YRSS-12纳米抗体的亲和力为11.9nM，17纳米抗体的亲和力为2.5nM，22/YRSS-4纳米抗体的亲和力为2.9nM，34纳米抗体未检测到与抗原结合。其中，1/YRSS-18、3/YRSS-19、17和22/YRSS-4这4株纳米抗体具有高亲和力和灵敏度，有望应用于病毒检测。
2、抗体中和活性实验
通过假病毒中和实验验证8株抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域(RBD)的纳米抗体是否具备有效的病毒中和能力。SARS-CoV-2假病毒(G*ΔG-VSV)是用VSV-G假型病毒制备的，VSV-G假病毒基因组中的VSV基因被替换成荧光素酶表达模块，用VSV的假病毒表达新型冠状病毒S蛋白，共制备7种假病毒，分别为野生型(WT)、BA.1型、BA.2.75型、BA.4/5型、XBB.1型、BQ.1型、BF.7型。
将S蛋白假病毒和本发明的纳米抗体混合，抗体浓度50ng/mL，37℃孵育1h。同时将不表达S蛋白的VSV假病毒与抗体进行孵育，作为对照组。将孵育后的混合液转移到铺有2×104个Huh7细胞的96孔板中，37℃、5％CO2培养24h后加入荧光素酶底物，测量荧光值，计算纳米抗体浓度为50ng/mL的中和效率，结果见图13，其中，横坐标不同毒株，纵坐标中和率，中和率＝(对照组发光强度均值-样品组发光强度均值)/对照组发光强度均值×100％。
抗体株1/YRSS-18对野生型(WT)假病毒的中和率可到达95.54％，对BA.1型假病毒的中和率为11.83％，对BA.2.75型假病毒的中和率为3.68％，对BA.4/5型假病毒的中和率为53.63％，对XBB.1型假病毒的中和率为8.83％，不能结合BQ.1型假病毒，对BF.7型假病毒的中和率为78.1％。
抗体株2/YRSS-7对野生型(WT)假病毒的中和率可到达53.5％，对BA.1型假病毒的中和率为3.0％，对BA.2.75型假病毒的中和率为46.56％，不能结合BA.4/5型假病毒，对XBB.1型假病毒的中和率为6.52％，对BQ.1型假病毒的中和率为7.64％、对BF.7型假病毒的中和率为3.18％。
抗体株3/YRSS-19对野生型(WT)假病毒的中和率可到达85.43％，对BA.1型假病毒的中和率为4.52％，对BA.2.75型假病毒的中和率为25.46％，对BA.4/5型假病毒的中和率为65.2％，对XBB.1型假病毒的中和率为23.12％，对BQ.1型假病毒的中和率为3.8％，不能中合BF.7型假病毒。
抗体株5/YRSS-44对野生型(WT)假病毒的中和率可到达30.16％，对BA.1型假病毒的中和率为16.87％，对BA.2.75型假病毒的中和率为25.31％，对BA.4/5型假病毒的中和率为18.16％，对XBB.1型假病毒的中和率为1.45％，对BQ.1型假病毒的中和率为5.64％，不能中合BF.7型假病毒。
抗体株13/YRSS-12对野生型(WT)假病毒的中和率可到达17.89％，不能中和BA.1型假病毒，不能中和BA.2.75型假病毒，不能中和BA.4/5型假病毒，对XBB.1型假病毒的中和率为10.49％，不能结合BQ.1型假病毒，对BF.7型假病毒的中和率为8.08％。
抗体株17对野生型(WT)假病毒的中和率可到达90.47％，对BA.1型假病毒的中和率为85.04％，对BA.2.75型假病毒的中和率为83.0％，对BA.4/5型假病毒的中和率为18.35％，对XBB.1型假病毒的中和率为70.56％，对BQ.1型假病毒的中和率为72.41％，对BF.7型假病毒的中和率为23.62％。
抗体株22/YRSS-4对野生型(WT)假病毒的中和率可到达93.25％，对BA.1型假病毒的中和率为83.25％，对BA.2.75型假病毒的中和率为36.93％，对BA.4/5型假病毒的中和率为26.82％，对XBB.1型假病毒的中和率为56.24％，对BQ.1型假病毒的中和率为91.6％，对BF.7型假病毒的中和率为70.81％。
抗体株34对野生型(WT)假病毒的中和率可到达1.50％、不能中和BA.1型假病毒，不能中和BA.2.75型假病毒，不能中和BA.4/5型假病毒，对XBB.1型假病毒的中和率为2.0％，对BQ.1型假病毒中和率为3.18％，不能结合BF.7型假病毒。
综上所述，1/YRSS-18、3/YRSS-19、17和22/YRSS-4这4株纳米抗体对多种假病毒具有一定的中和效果，有望应用于新型冠状病毒治疗。尤其是17和22/YRSS-4这2株纳米抗体对新型冠状病毒有较强中和能力，有望应用于新型冠状病毒的治疗。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体的重链可变区包括3个互补决定区CDR1、CDR2和CDR3，所述纳米抗体选自(Nb1)-(Nb4)中的至少一种；
(Nb1)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1第26-33位、第51-57位和第96-115位所示；
(Nb2)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2第26-33位、第51-58位和第97-117位所示；
(Nb3)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3第26-33位、第51-57位和第96-115位所示；
(Nb4)：CDR1、CDR2和CDR3的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4第26-33位、第51-57位和第96-115位所示。
2.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，其特征在于，所述重链可变区还包括4个骨架区FR1、FR2、FR3和FR4，所述纳米抗体的所述骨架区的氨基酸序列如下所示；
(Nb1)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示；
(Nb2)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：2第1-25位、第34-50位、第59-96位和第118-128位所示；
(Nb3)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：3第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示；
(Nb4)：FR1、FR2、FR3和FR4的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：4第1-25位、第34-50位、第58-95位和第116-126位所示。
3.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，其特征在于，选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的所述重链可变区的全长氨基酸序列分别如SEQ IDNO：1-4所示。
4.根据权利要求1所述的抗新型冠状病毒S蛋白受体结合域的纳米抗体，其特征在于，所述纳米抗体包括(Nb3)-(Nb4)中的至少一种。
5.一种多核苷酸，其特征在于，用于编码如权利要求1-4任一项所述的纳米抗体。
6.根据权利要求5所述的多核苷酸，其特征在于，编码选自(Nb1)-(Nb4)的所述纳米抗体的多核苷酸序列分别如SEQ ID NO：5-8所示。
7.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体用于表达如权利要求5-6任一项的多核苷酸。
8.一种宿主细胞，其特征在于，所述宿主细胞携带如权利要求5-6任一项的多核苷酸或包含如权利要求7所述的表达载体。
9.如权利要求1-4任一项所述的纳米抗体、如权利要求5-6任一项的多核苷酸、如权利要求7所述的表达载体或如权利要求8所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒引起的肺炎预防和/或治疗药物中的应用。
10.如权利要求1-4任一项所述的纳米抗体、如权利要求5-6任一项的多核苷酸、如权利要求7所述的表达载体或如权利要求8所述的宿主细胞在制备新型冠状病毒检测试剂和/或检测试剂盒中的应用。
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Legal Events
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| PB01 | Publication | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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