CN116554276A - 一种达托霉素衍生物及其制备方法 - Google Patents

一种达托霉素衍生物及其制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种达托霉素衍生物及其制备方法，达托霉素衍生物的制备方法包括：提供一种玫瑰孢链霉菌突变菌株，所述的菌株中以下的基因被失活或敲除：瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3‑双加氧酶基因，瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸甲酰胺酶基因、瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸酶基因；在发酵培养基中，用突变合成元饲喂所述的玫瑰孢链霉菌突变菌株，进行发酵，从而产生达托霉素在13位犬尿氨酸芳环上H被取代的类似物。本发明提供了通过敲除负责达托霉素生物合成基因获得突变株，并结合化学喂养前体，获得达托霉素中的非天然氨基酸犬尿氨酸残基（Kyn13）芳环上的H进行氟取代而获得达托霉素类似物的方法，有助于制备其他类型达托霉素衍生物。

Description

一种达托霉素衍生物及其制备方法
技术领域
本发明属于药物领域和生物技术工程领域，具体地，本发明涉及一类新型达托霉素类似物及其制备方法。
背景技术
在过去的一个世纪里，抗生素被大规模生产和广泛使用，使得抗生素耐药性越发的严重和普遍，许多原来被认为是可控的感染再次成为潜在的生命威胁。随着多重耐药菌株的不断出现，使得新型抗生素的需求不断增加。除了利奈唑胺(恶唑烷酮)外，达托霉素是过去40年来唯一获得治疗批准的新型结构抗生素[Invest.Sturg,2013,26:167-169]。
达托霉素的抗菌谱涵盖了大多数临床相关的革兰氏阳性病原体，包括MRSA和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌(VRSA)、万古霉素耐药肠球菌(VRE)、耐糖肽金黄色葡萄球菌(GRSA)、凝固酶阴性葡萄球菌(CoNS)、耐青霉素肺炎链球菌(PRSP)等[Curr.Opin.Chem.Biol.,2009,13(2):144-151]。由于陆续已经有耐达托霉素的耐药菌出现，开发新型的达托霉素类似物显得尤为迫切和重要。
达托霉素是一种含有13个氨基酸残基的酸性环状脂多肽，最初是作为A21978C酸性脂肽的次要成分分离出来的，这些脂肽都是由13个氨基酸残基形成共同的母核，其母核的氨基酸序列是L-Trp1-L-Asn2-L-Asp3-L-Thr4-Gly5-L-Orn6-L-Asp7-D-Ala8-L-Asp9-Gly10-D-Ser11-L-threo-3mGlu12-L-Kyn13，母核上连有不同长度的酯酰基侧链。其中L-Kyn13的羧基和L-Thr4的羟基之间通过酯键相连，形成一个含有10个氨基酸的环状结构。由于其结构复杂，达托霉素的全合成需要经过繁琐的保护基团和去保护过程，且最终收率较低[J.Am.Chem.Soc.,2004,126(51):17025-17031]，使得通过化学全合成来获得达托霉素或其类似物是一项艰巨的挑战。
为了提高达托菌素的抗菌活性以及其他特性，本领域一直在尝试开发达托霉素各类衍生物或类似物，然而迄今为止尚未成功开发出制备达托霉素类似物的环保经济的方法。因此，本领域迫切需要开发各类新型的达托霉素类似物的制备方法。
发明内容
本发明的目的是提供了一种新型的达托霉素衍生物。
本发明的另一目的是提供了一种新型达托霉素类似物的制备方法。
本发明的另一目的是提供了一种用于制备达托霉素素类似物的突变合成元及其制备方法和用途。
本发明第一方面提供了一种新型的达托霉素衍生物，所述达托霉素类似物具有式I所示的结构：
其中，式I中苯环上的取代基R数量为1-4个，各自独立地选自下列之一：卤素，C1-C6烷基，-OH，C1-C6烷氧基，-SH，C1-C6烷硫基，-NH2，-NH(C1-C4烷基)，-N(C1-C4烷基)2，-C(O)H，-COOH，-COOC1-C4烷基，-CONH2，-CONH(C1-C4烷基)，-CON(C1-C4烷基)2，氧代基。
进一步地，式I中苯环上的取代基R数量优选为1个。
在另一优选例中，所述R为卤素。
在另一优选例中，所述R为F。
在另一优选例中，所述达托霉素类似物具有式Ia结构：
在另一优选例中，所述达托霉素类似物具有式Ib结构：
本发明第二方面是提供一种可用于产生达托霉素在第13位是取代犬尿氨酸的衍生物的瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)突变菌株，所述的菌株中下组基因被失活或敲除：瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因，瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸甲酰胺酶基因、瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸酶基因。
本发明第三方面提供了一种制备达托霉素类似物的方法，包括以下步骤：
(a)用突变合成元饲喂本发明第一方面所述的瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)突变菌株，进行发酵，从而产生达托霉素在第13位是取代犬尿氨酸的衍生物；
(b)从发酵产物中分离出所述的达托霉素类似物。
进一步地，所述突变合成元具有式II所示的结构，
式II中苯环上的取代基R与式I中相同。
在另一优选例中，所述R为卤素。
在另一优选例中，所述R为F。
在另一优选例中，所述R为4-F。
在另一优选例中，所述R为5-F。
在另有一优选例中，所述方法还包括合成所述突变合成元的步骤。
本发明第四方面提供了一种制备具有式II所示突变合成元的方法，包括步骤：
(a)式III化合物与L-丝氨酸在色氨酸合成酶的催化下进行反应，生成式IV化合物；
(b)式IV化合物在色氨酸2,3-双加氧酶的催化下进行反应，生成式V化合物；
(c)式V化合物在三氟乙酸的催化下进行反应，生成式II化合物；
式III、IV、V中苯环上的取代基R均与式II中相同。
在另一优选例中，步骤(a)中，所述的色氨酸合成酶为大肠杆菌来源的色氨酸合成酶K12-TrpS，即过表达色氨酸合成酶K12-TrpS的大肠杆菌菌体；其中，色氨酸合成酶K12-TrpS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在另一优选例中，步骤(a)所述方法中的催化反应的体系中还包括：磷酸吡哆醛。
在另一优选例中，步骤(a)所述的方法中，催化反应的体系中还包括缓冲液，缓冲液的pH为6.5-8.0；所述的缓冲液例如：磷酸缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，HEPES缓冲溶液和/或MOPS缓冲溶液等。
在另一优选例中，步骤(a)所述的方法中，优选的，所述的催化反应的条件是：25～37℃反应24～48h。
在另一优选例中，步骤(b)所述的方法中，优选的，所述色氨酸2,3-双加氧酶为大肠杆菌来源的色氨酸2，3-双加氧酶DptJ，即过表达色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的大肠杆菌菌体；其中，色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
在另一优选例中，步骤(b)所述的方法中，所述方法中的催化反应的体系中还包括缓冲液，缓冲液的pH为6.5-8.0；所述的缓冲液例如：磷酸缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，HEPES缓冲溶液和/或MOPS缓冲溶液等。
在另一优选例中，步骤(b)所述的方法中，优选的，所述的催化反应的条件是：25～45℃反应24～48h。
本发明第五方面提供了一种具有式II所示突变合成元的用途，用作本发明第二方面所述的瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)突变菌株的发酵特定饲喂原料。
本发明第六方面提供了一种用于本发明第一方面所述瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)突变菌株发酵的培养基，其特征在于，所述培养基含有式II所示的突变合成元。
应理解，在本发明范围内中，本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合，从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅，在此不再一一累述。
附图说明
图1表示突变合成元5-F-犬尿氨酸的合成路线。
图2为突变合成元5-F-犬尿氨酸的核磁1H-NMR(600MHz,D2O)。
图3为突变合成元5-F-犬尿氨酸的核磁19F-NMR(600MHz,D2O)。
图4为突变合成元4-F-犬尿氨酸的核磁1H-NMR(600MHz,D2O)。
图5为突变合成元4-F-犬尿氨酸的核磁19F-NMR(600MHz,D2O)。
图6为突变合成元4-F-达托霉素的核磁19F-NMR(600MHz,D2O)。
图7为突变合成元5-F-达托霉素的高分辨质谱分析。
图8为突变合成元4-F-达托霉素的高分辨质谱分析。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究，对达托霉素生物合成基因簇的克隆以及生物合成机制研究，利用突变生物合成方法，成功实现了达托霉素13位犬尿氨酸芳环上H被取代的衍生物。
一类优选的达托霉素类似物具有下式I所示的结构式：
式中，R如上所述。
如本文所用，术语“Dap”表示达托霉素。
突变合成元
如本文所用，术语“突变合成元”指参与本发明达托霉素衍生物生物合成的化合物，其中所述的化合物具有式II所述的结构。此化合物被用于合成或制备本发明的达托霉素衍生物，可以自行制备。
本发明还提供了一种制备具有式II所示突变合成元的方法，以式IIa化合物为例，所述方法包括步骤：
(a)式IIIa化合物与L-丝氨酸在色氨酸合成酶的催化下进行反应，生成式IVa化合物；
(b)IVa化合物在色氨酸2,3-双加氧酶的催化下进行反应，生成式Va化合物；
(c)Va化合物在三氟乙酸的催化下进行反应，生成式IIa化合物；
在另一优选例中，步骤(a)中，所述的色氨酸合成酶为大肠杆菌来源的色氨酸合成酶K12-TrpS，即过表达色氨酸合成酶K12-TrpS的大肠杆菌菌体；其中，色氨酸合成酶K12-TrpS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
在另一优选例中，步骤(a)所述方法中的催化反应的体系中还包括：磷酸吡哆醛。
在另一优选例中，步骤(a)所述的方法中，催化反应的体系中还包括缓冲液，缓冲液的pH为6.5-8.0；所述的缓冲液例如：磷酸缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，HEPES缓冲溶液和/或MOPS缓冲溶液等。
在另一优选例中，步骤(a)所述的方法中，优选的，所述的催化反应的条件是：25～37℃反应24～48h。
在另一优选例中，步骤(b)述的方法中，优选的，所述色氨酸2,3-双加氧酶为大肠杆菌来源的色氨酸2，3-双加氧酶DptJ，即过表达色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的大肠杆菌菌体；其中，色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
在另一优选例中，步骤(b)所述的方法中，催化反应的体系中还包括缓冲液，缓冲液的pH为6.5-8.0；所述的缓冲液例如：磷酸缓冲溶液，Tris-HCl缓冲溶液，HEPES缓冲溶液和/或MOPS缓冲溶液等。
在另一优选例中，步骤(b)所述的方法中，优选的，所述的催化反应的条件是：25～45℃反应24～48h。
本发明还提供了一种制备具有式II所示突变合成元的方法，以式IIb化合物为例，所述方法包括步骤：
(b-1)式IIIb化合物与L-丝氨酸在色氨酸合成酶的催化下进行反应，生成式IVb化合物；
(b-2)式IVb化合物在色氨酸2,3-双加氧酶的催化下进行反应，生成式Vb化合物；
(b-3)式Vb化合物在三氟乙酸的催化下进行反应，生成式IIb化合物；
出发菌株
如本文所用，术语“本发明出发菌株”或“本发明出发微生物”指编号为CGMCC4.7231的瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)。本发明的出发菌株保存在中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，编号为Streptomyces roseosporus CGMCC4.7231。应理解，出发菌株不仅包括编号为Streptomyces roseosporus CGMCC4.7231的菌株，还包括其衍生菌株。
工程菌及其制备
本发明还提供了可用于生产本发明化合物的工程菌。
在本发明的一个优选例中，提供了一种生产本发明达托霉素类似物的瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)突变菌株，其中，所述的菌株瑰孢链霉菌中瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因，瑰孢链霉菌基因组上在色氨酸降解途径中的犬尿氨酸甲酰胺酶基因、瑰孢链霉菌基因组上在色氨酸降解途径中的犬尿氨酸酶基因被敲除。
本发明的工程菌可以用任何含有达托霉素生物合成基因簇、能够产生达托霉素的菌株为出发菌株，通过基因敲除或失活的方法(例如通过同框缺失的手段)而构建。例如，目前常用的产生达托霉素的菌株包括(但并不限于)：瑰孢链霉菌(Streptomycesroseosporus)。
本发明还提供了一种构建可产生达托霉素类似物突变株的方法，它包括同框质粒的构建，将质粒导入野生型菌株，通过同源臂与野生型菌株基因组的重组，从而从基因组中敲除相应基因，从而获得基因同框缺失或失活的突变株。缺失瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因，瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸甲酰胺酶基因、瑰孢链霉菌基因组上的犬尿氨酸酶基因使瑰孢链霉菌无法正常合成达托霉素。
在本发明的一个优选例中，提供了一种构建突变株，并发酵突变株制备达托霉素类似物的方法，其中包括：
(a)构建瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因、犬尿氨酸甲酰胺酶基因、犬尿氨酸酶基因同框缺失质粒；
(b)制备瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因、犬尿氨酸甲酰胺酶基因、犬尿氨酸酶基因敲除重组菌株；
将步骤(a)构建的质粒转入瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)NO.CGMCC4.7231，通过阿普拉抗性筛选，获得瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因、犬尿氨酸甲酰胺酶基因、犬尿氨酸酶基因同框缺失的重组菌株，即为步骤(b)中所述重组菌株。
3.达托霉素类似物的制备
本发明还提供了一种制备达托霉素类似物的方法，包括步骤：
1)用突变合成元对突变菌株进行饲喂，具体为：将突变菌株进行发酵，在发酵过程中添加本发明的突变合成元，通过发酵产生达托霉素在13位犬尿氨酸芳环上H被取代的类似物。当突变合成元选择式IIa化合物时，对应生成上述式Ia所示结构的达托霉素类似物。当突变合成元选择式IIb化合物时，对应生成上述式Ib所示结构的达托霉素类似物。
2)从培养物中提取生成的达托霉素类似物：将甲醇浸泡液进行离心，除去沉淀，上清经减压蒸馏浓缩，获得的膏状物先用30um 120A的C18填料预装的反相柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，收集流出液，最终得到目标产物。
本发明人通过对式Ia或Ib化合物的大量发酵以及分离纯化并且初步确证了化合物的结构。
本发明的主要优点包括：
(a)提供了一种具有式I结构的新颖的达托霉素类似物的制备方法。
(b)以本发明的达托霉素类似物为基础，有助于制备其他类型达托霉素衍生物。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数为重量百分比和重量份数。
除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用,但不能限制本发明的内容。
实施例1
色氨酸合成酶K12-TrpS的异源表达
(a)色氨酸合成酶K12-TrpS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。K12-TrpS基因由九天基因公司经大肠杆菌偏好性密码子优化合成，将其通过NdeI和XhoI限制性酶切位点连接克隆于pET-22b+质粒载体上，获得的含有目的基因片段的质粒pET-22b-K12。将获得的含有目的基因片段的质粒pET-22b-K12转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得K12-TrpS过表达菌株。
(b)将K12-TrpS过表达菌株涂布到含有Amp抗性的LB培养基上，37℃过夜倒置培养；挑取单克隆菌落接种至5mL液体LB培养基中(含Amp抗性)，37℃摇床培养12h-16h；按1％接种量将菌液接种到含有LB液体培养基中(含Amp抗性)，37℃摇床培养至OD600达到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG，18℃诱导表达18h。室温8000rpm离心5min离心收集过表达K12-TrpS的大肠杆菌菌体，即为过色氨酸合成酶K12-TrpS的大肠杆菌湿菌体。
实施例2
色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的异源表达
(a)色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的编码基因的获得
色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQID NO.4所示。
对玫瑰孢链霉菌基因组进行提取，设计扩增引物DptJ-S(DptJ-S-上游引物GCCTGGTGCCGCGCGGCAGCATGACAGCGCAGGACACCCG)/DptJ-A(DptJ-A-下游引物CGACGGAGCTCGAATTCTTATCAGCCGGCGCCCCACGCCT)从玫瑰孢链霉菌的基因组上PCR扩增得到的色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的编码基因dptJ(738bp)基因片段，同时将载体pET28a用限制性内切酶NdeⅠ和BamHⅠ进行双酶切纯化回收。将酶切后的线性化载体pET28a与PCR扩增得到的dptJ片段进行重组，将重组产物化转至E.coli DH5α感受态细胞并涂布到含50μg/mL Amp抗性的LB平板上过夜培养。挑选单克隆用通用引物T7/T7-TER进行PCR验证，将构建成功的含有目的基因片段的质粒pET-28a-dptJ化转至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，获得DptJ过表达菌株。
(b)DptJ过表达菌株涂布到含有kan抗性的LB培养基上，37℃过夜倒置培养；挑取单克隆菌落接种至5mL液体LB培养基中(含kan抗性)，37℃摇床培养12h-16h；按1％接种量将菌液接种到含有LB液体培养基中(含kan抗性)，37℃摇床培养至OD600达到0.6-0.8，加入终浓度为0.1mM IPTG，18℃诱导表达18h。室温8000rpm离心5min离心过表达DptJ的大肠杆菌菌体，即为过色氨酸合成酶DptJ的大肠杆菌湿菌体。
实施例3
突变合成元IIb(4-F-犬尿氨酸)的合成
1.式IVb化合物(4-F-色氨酸)的合成
反应体系总体积为40mL，向50mM Tris-HCl(pH＝8)缓冲液中加入以下终浓度的物质：10mM 5-氟吲哚(式IIIb所示化合物)，50μL DMSO,10mM丝氨酸，2μM PLP(PLP即磷酸吡哆醛)。EP管密封，在提前加热的至30℃的水平金属摇床上反应2min，再加入10mg过色氨酸合成酶K12-TrpS的大肠杆菌湿菌体。将该反应置于30℃的水平金属摇床上反应24h后，取样1mL加入反应液等体积比例的乙腈，4℃、1200rpm离心10min。取上清过0.22μM膜，进行HPLC分析，剩余反应物冻干除去水分，加入20mL甲醇浸泡，离心取上清并减压蒸馏除去甲醇，即得4-F-色氨酸粗品。
HPLC分析条件
仪器：Agilent Technologies 1200 Series；
色谱柱：分析Ultimate LP-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：流动相A-乙腈、流动相B-水；
流速：分析1mL/min；制备3mL/min；
检测波长：280nm。
HPLC检测时间程序：
0-8min 12％A，8-10min 12-90％A，10-16min 90％A，16-18min 90-12％A。
2.突变合成元IIb(4-氟犬尿氨酸)的合成
1)反应体系总体积为20mL，向100mM Tris-HCl(pH＝8)缓冲液中加入以下终浓度的物质：400mg过表达色氨酸合成酶DptJ的大肠杆菌湿菌体，20mM抗坏血酸，10μM亚甲基蓝，0.1mg/mL过氧化氢酶，2mM取代色氨酸底物(4-F-色氨酸)。置于35℃水浴锅中搅拌开口反应24h。
2)然后加入体积分数30％三氟乙酸水溶液1mL，置于35℃水浴锅中反应30min。反应液10000rpm,离心10min。取上清，用无水Na2CO3调pH到7.0左右；用冻干机冻干除去水。再用少量甲醇溶解，离心，取上清。再用旋转蒸发仪浓缩，即得到4-氟犬尿氨酸粗品，粗品经HPLC制备获得突变合成元IIb(4-氟犬尿氨酸)纯品。
HPLC分析条件：
仪器：Agilent Technologies 1200 Series；
色谱柱：Ultimate LP-C18，4.6×250mm，5μm；
流动相：流动相A-乙腈、流动相B-15mM乙酸钠水溶液；流动相A:B＝5:95(体积比)。
流速：1mL/min；
检测波长：280nm。
HPLC半制备条件：
仪器：Agilent Technologies 1200 Series；
色谱柱：Ultimate LP-C18，10×250mm，10μm；
流动相：流动相A-乙腈、流动相B-水；
流速：4mL/min；
检测波长：280nm。
HPLC检测时间程序：
0-8min 12％A，8-10min 12-90％A，10-16min 90％A，16-18min 90-12％A。
对4-F-犬尿氨酸进行NMR和HR-MS鉴定，鉴定结果如下：
1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ7.83(dd,J＝9.1,6.4Hz,1H),6.56-6.42(m,2H),4.05–3.99(m,1H),3.54(s,2H).(突变合成元4-F-犬尿氨酸的核磁1H-NMR(600MHz,D2O)结果参见图4)。
19F-NMR(600MHz,Deuterium Oxide)δ103.61ppm.(突变合成元4-F-犬尿氨酸的核磁19F-NMR(600MHz,D2O)结果参见图5)。
LC-HRMS(EI-)m/z 225.0680[M-H]-.
实施例4
突变合成元IIa(5-F-犬尿氨酸)的合成，突变合成元5-F-犬尿氨酸的合成路线如图1所示：
5-F-犬尿氨酸的合成以5-F-吲哚(式IIIa所示化合物)为起始原料，合成步骤参照突变合成元IIb(4-F-犬尿氨酸)的合成步骤，不同之处仅在于“将式IIIb化合物替换为同等浓度的式IIIa化合物”。
对5-F-犬尿氨酸进行NMR和HR-MS鉴定，鉴定结果如下：
1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ7.53(dd,J＝10.2,3.0Hz,1H),7.20(ddd,J＝9.1,8.0,2.9Hz,1H),6.84(dd,J＝9.2,4.8Hz,1H),4.10(dd,J＝5.7,1.9Hz,1H),3.60(s,2H).(突变合成元5-F-犬尿氨酸的核磁1H-NMR(600MHz,D2O)结果参见图2)。
19F-NMR(600MHz,Deuterium Oxide)δ127.65ppm(突变合成元5-F-犬尿氨酸的核磁19F-NMR(600MHz,D2O)结果参见图3)。
LC-HRMS(EI-)m/z 225.0680[M-H]-.
实施例5
瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)重组菌株WT-SR-ΔTKK-3的构建
1.构建瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因(tdo)，瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸甲酰胺酶基因(kynF)、瑰孢链霉菌基因组上的犬尿氨酸酶基因(kyn)同框缺失质粒
以玫瑰孢链霉菌NO.CGMCC4.7231为模板，使用高保真酶Phanta，用TKK左臂正向引物5’-TTCGATATCGCGCGCGGCCGCCCAGCGGGATCAACAACG-3’，TKK左臂反向引物5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTTTCTGTCTCCTC GACA CGAGC-3引物进行PCR扩增获得用于TKK基因敲除的大小为933bp的左臂片段，以TKK右臂正向引物5’-GCTCGTGTCGCGGAGACAGAAGGTGAGTTCTCCGCCTGA-3’和TKK右臂反向引物5’-TGTAAAACGACGGCCAGTGCCAAGCTTATCACGTCCTCCGCCATG-3’进行PCR扩增获得用于TKK基因敲除的大小为819bp的右臂片段，将克隆后的两个片段凝胶电泳分离，切胶回收并纯化，分别加入限制性内切酶SpeI和XbaI以及XbaI和HindIII消化回收片段，将其连入用限制性内切酶SpeI和HindIII同样酶处理过的自杀型质粒pOJ260中，将连接体系转化到E.coli DH5α，挑取单克隆菌落于LB培养液(含有氨苄抗生素)中培养过夜。提取质粒经酶切验证后送测序进一步验证。将验证正确的质粒转化E.coli ET12567中，获得含有重组质粒的E.coli ET12567。
2.重组菌株WT-SR-ΔTKK-3的获得
收集玫瑰孢链霉菌NO.CGMCC4.7231工程菌的新鲜孢子，并用SET缓冲溶液清洗两次。再用TES buffer缓冲液进行重悬，50℃热激10min；热激后的孢子液在37℃培养萌发3小时左右，将预萌发的孢子混悬液和含有重组质粒的E.coil ET12567混悬液共同涂布在含10mmol/L MgCl2的MS固体培养基上，并30℃中培养16小时后用阿普拉霉素和萘啶酮酸覆盖平板。接合子在温箱培养2到3天后长出，挑选接合子到阿普拉霉素和萘啶酮酸抗性平板上30℃培养7天左右。选取长势良好的接合子于TSB(无抗性)液体培养基中传代三次以上，再于平板上划线筛选单菌落。通过阿普拉抗性筛选，选取不具有阿普拉抗性的菌株进行发酵和PCR基因型验证以获得TKK同框缺失的重组菌株WT-SR-ΔTKK-3，即为玫瑰孢链霉菌突变菌株。
实施例6
达托霉素衍生物式(式Ia或Ib)所示化合物的发酵、检测、分离纯化和结构鉴定
发酵种子培养基(即发酵种子液)：
称取马铃薯淀粉35g，胰蛋白大豆肉汤培养基30g，用水定容至1L。分装到500mL锥形瓶内，装液量为100mL，121℃下高压灭菌30min。
发酵培养基(即发酵液)：
称取3g酵母提取物、5g胰蛋白胨、3g麦芽提取物、10g葡萄糖、340g蔗糖，用800mL去离子水搅拌溶解，再用水定容到1L，分装到250mL锥形瓶内，装液量为35mL，每个锥形瓶内再加入0.98g体积比为1:1的癸酸和油酸甲酯混合物。115℃高压蒸汽灭菌25min。使用时加入700μL无菌的2.5M MgCl2溶液至终浓度为5mM。
用突变合成元(式IIa或式IIb)对经改造的工程菌株(实施例5获得的玫瑰孢链霉菌突变菌株)进行饲喂；将瑰孢链霉菌(Streptomyces roseosporus)突变菌株划线到无抗的MS平皿上，在30℃培养箱中倒置培养7天。分别挖取5个单菌落接到100mL发酵种子液，30℃，250rpm，培养22-24h。然后取2mL种子液接种到35mL发酵液，30℃，250rpm进行发酵。在发酵24、41、48、65h时，分四次添加终浓度为0.05％的犬尿氨酸衍生物(即式IIa或式IIb化合物)到发酵液中。继续发酵5天，将发酵液冻干除去水分，加入甲醇浸泡，取甲醇浸泡液进行HPLC分析。
HPLC分析条件
仪器：Agilent Technologies 1200 Series；
色谱柱：分析柱Ultimate XB-C8，4.6×250mm，5μm；
流动相：流动相A-乙腈、流动相B-3mM KH2PO4水溶液，pH 2.60-2.65；
流速：1mL/min；
检测波长：223nm。
HPLC检测时间程序：
0-2min 30％A，2-14min 30-55％A，14-16min 55-60％A，16-26min 60％A，26-28min 60-30％A，28-30min 30％A。
从培养物中提取式Ia或Ib化合物：将甲醇浸泡液进行离心，除去沉淀，上清液经减压蒸馏浓缩，获得的膏状物先用30um 120A的C18填料预装的反相柱进行粗分，再用HPLC制备进一步纯化，收集式I化合物的流出液，最终得到目标产物。
HPLC半制备条件
仪器：Agilent Technologies 1200 Series；
色谱柱：Ultimate LP-C18，10×250mm，10μm；
流动相：流动相A-乙腈、流动相B-3mM KH2PO4水溶液，pH 2.60-2.65；
流速：4mL/min；
检测波长：280nm。
HPLC检测时间程序：
0-2min 30％A，2-14min 30-55％A，14-16min 55-60％A，16-26min 60％A，26-28min 60-30％A，28-30min 30％A。
按照上述实验过程，突变合成元选择式IIa化合物时，对应生成上述式Ia所示结构的达托霉素类似物目标产物，对式Ia所示化合物5-F-达托霉素进行NMR和HR-MS鉴定，鉴定结果如下：
LC-HRMS(EI-)m/z 817.8409[M-2H]2-,544.8910[M-3H]3-.(达托霉素衍生物5-F-达托霉素的高分辨质谱分析结果参见图7)。
按照上述实验过程，突变合成元选择式IIb化合物时，对应生成上述式Ib所示结构的达托霉素类似物目标产物，对式Ib所示化合物4-F-达托霉素进行HR-MS鉴定，鉴定结果如下：
19F-NMR(600MHz,Deuterium Oxide)δ103.63ppm.(达托霉素衍生物4-F-达托霉素的核磁19F-NMR(600MHz,D2O)结果参见图6)。
LC-HRMS(EI-)m/z 817.8400[M-2H]2-,544.8912[M-3H]3-(达托霉素衍生物4-F-达托霉素的高分辨质谱分析结果参见图8)。

Claims (5)

1.一种达托霉素衍生物，其特征在于，所述衍生物如式I所示
其中，式I中苯环上的取代基R数量为1-4个，各自独立地选自下列之一：卤素，C1-C6烷基，-OH，C1-C6烷氧基，-SH，C1-C6烷硫基，-NH2，-NH(C1-C4烷基)，-N(C1-C4烷基)2，-C(O)H，-COOH，-COOC1-C4烷基，-CONH2，-CONH(C1-C4烷基)，-CON(C1-C4烷基)2，氧代基。
2.如权利要求1所述的一种达托霉素衍生物的制备方法，其特征在于所述达托霉素衍生物为达托霉素在13位犬尿氨酸芳环上H被取代的类似物，其制备方法包括以下步骤：
(a)提供一种可用于生产达托霉素在13位犬尿氨酸芳环上H被取代的类似物的玫瑰孢链霉菌突变菌株，所述的菌株中以下的基因被失活或敲除：瑰孢链霉菌基因组中色氨酸2，3-双加氧酶基因，瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸甲酰胺酶基因、瑰孢链霉菌基因组上犬尿氨酸酶基因；
(b)在发酵培养基中，用突变合成元饲喂所述的玫瑰孢链霉菌突变菌株，进行发酵，从而产生达托霉素在13位犬尿氨酸芳环上H被取代的类似物；
所述突变合成元为式II所示结构的化合物；
式II中苯环上的取代基R与式I中相同；
(c)从发酵产物中分离出所述的达托霉素类似物。
3.如权利要求1所述的一种达托霉素衍生物的制备方法，其特征在于式II所示结构的突变合成元的制备方法包括以下步骤：
(a)式III化合物与L-丝氨酸在色氨酸合成酶的催化下进行反应，生成式IV化合物；
(b)式IV化合物在色氨酸2,3-双加氧酶的催化下进行反应，生成式V化合物；
(c)式V化合物在三氟乙酸的催化下进行反应，生成式II化合物；
式III、IV、V中苯环上的取代基R均与式II中相同。
4.如权利要求3所述的一种达托霉素衍生物的制备方法，其特征在于所述的色氨酸合成酶为大肠杆菌来源的色氨酸合成酶K12-TrpS，即过表达色氨酸合成酶K12-TrpS的大肠杆菌菌体；其中，色氨酸合成酶K12-TrpS的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列如SEQID NO.2所示。
5.如权利要求3所述的一种达托霉素衍生物的制备方法，其特征在于所述色氨酸2,3-双加氧酶为大肠杆菌来源的色氨酸2，3-双加氧酶DptJ，即过表达色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的大肠杆菌菌体；其中，色氨酸2，3-双加氧酶DptJ的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
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