CN105755076B - 利用突变合成获得sansanmycin结构类似物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种利用突变合成获得sansanmycin结构类似物的方法。所述方法包括如下步骤：(1)敲除野生型Streptomyces sp.SS菌株中的ssaX基因获得突变株；(2)发酵突变株并饲喂突变株氨基酸或氨基酸类似物作为突变合成底物；(3)回收通过菌株发酵获得的突变合成产物并纯化。本发明还涉及由该方法制备获得的sansanmycin结构类似物及其在制备抗结核分枝杆菌中的应用。

Description

利用突变合成获得SANSANMYCIN结构类似物的方法

技术领域

本发明属于生物技术中的微生物催化合成领域，具体而言，涉及一种利用突变合成获得sansanmycin结构类似物的方法。

背景技术

Sansanmycins[1]是一组由Streptomyces sp.SS产生的尿苷肽类抗生素，此类抗生素还包括Pacidamycins[2],Napsamycins[3],Mureidomycins[4]等，它们含有一个相同并且独特的化学结构母核(见图1所示)：3’-脱氧尿苷通过4,5-烯酰胺键与假四/五肽骨架中的N-甲基-2,3-二氨基丁酸(DABA)相连；这个连接发生在DABA的羧基上，它的两个氨基均被酰化[5]。肽链骨架中还存在一个脲基，其和DABA的存在，使得肽链在延伸的过程中发生了两次方向转换，这在非核糖体肽组装中较为罕见。

尿苷肽类抗生素的作用特异性较好，几乎只对铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa)和结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)具有抑制活性[6]。据世界卫生组织(WHO)报道，2014年全球共有150万人因结核病(tuberculosis,TB)死亡，结核病仅仅是继艾滋病之后，在全世界由单一传染性病原体引起的最大杀手[7]。随着多重耐药结核病(MDR-TB)及广泛耐药结核病(XDR-TB)的增长，结核病的治疗变得更加困难。所以发展一种与现有临床上在用的抗生素无交叉耐药的新型的抗结核药物迫在眉睫。Sansanmycins及其他尿苷肽类抗生素成为了人们研究的热点，因为它们以细菌细胞壁合成过程中的关键酶UDP-N-乙酰胞壁酸-五肽转位酶(MraY，转位酶I)为靶点产生抑菌活性[8]，目前临床上还没有在用的MraY抑制剂，与现用的药物不会产生交叉耐药。Sansanmycin具有独特的化学结构、良好的作用特异性和新颖的作用靶点，因此成为寻找新型抗结核药物的先导化合物之一。

近年来，pacidamycins[5,9]，napsamycins[10]和sansanmycins[11]的生物合成基因簇被陆续成功克隆，并初步揭示了此类抗生素中的假四肽骨架是由高度分离状态的非核糖体肽合成酶(nonribosomal peptide synthetases,NRPSs)催化形成[12]。此外，pacidamycins中五肽肽链的生物合成是由一个tRNA依赖的氨酰转移酶PacB催化形成，PacB负责将丙氨酰残基从丙氨酰-tRNA转移到四肽骨架的N端[13]。与核糖体肽合成方式相比，非核糖体肽不仅含有20种蛋白质源氨基酸，而且还含有许多不同的组成模块，例如DABA、D型氨基酸、羟基化氨基酸、N-和C-甲基化氨基酸等。其中，非蛋白质源氨基酸间位酪氨酸(meta-tyrosine,m-Tyr)在细菌次级代谢产物中较为罕见。尿苷肽类抗生素和sanglifehrin A(SFA)就是两个以m-Tyr作为组成模块的例子。在SFA的生物合成过程中，m-Tyr的生物合成推测可能是由SfaA催化形成[14]。在pacidamycins生物合成基因簇中存在的SfaA的同源蛋白PacX可以在体外催化Phe向m-Tyr转化[15]。在sansanmycins生物合成基因簇中，通过蛋白序列比对发现SsaX与PacX在全长范围内具有高度的同源性(Identities，80％；Positives，85％)，推测SsaX是苯丙氨酸-3-羟化酶，负责sansanmycin生物合成过程中m-Tyr的生物合成。

尽管天然的尿苷肽类抗生素具有治疗难治性感染的潜力，但目前还没有任何一个尿苷肽类抗生素进入临床试验研究，这可能是由于它们较易被降解，稳定性不高。在之前的研究中，此类抗生素中四肽骨架的N端氨基酸对抑制MraY非常重要[16]，质子化的铵离子结合在MraY的活性位点，替代了辅因子Mg²⁺从而抑制MraY活性[17]。在已知的尿苷肽类抗生素中，N端氨基酸基本上是由m-Tyr或可能衍生于m-Tyr的双环氨基酸组成，除了有些pacidamycins的N端氨基酸是Ala。

本申请通过突变合成对N端氨基酸进行取代来获得结构新颖的sansanmycin类似物。突变合成在产生新的抗生素衍生物中是一个非常有效的方法[18]，它可以扩展次级代谢产物的化学结构多样性，并且产生具有改善的理化性质或生物活性的新化合物。例如，突变合成已经成功的用来获得新型的核苷肽类抗生素如nikkomycin类似物[19]和新的ansamycin类似物[20]。然而，突变合成还没有应用于获得尿苷肽类抗生素类似物。

发明内容

基于此，本发明涉及利用突变合成法合成Sansanmycins及其结构衍生物的方法，Sansanmycins的系列结构衍生物及其应用。

本发明首先涉及一种通过突变合成法合成Sansanmycins结构衍生物的方法，包括如下步骤：

(1)敲除野生型Streptomyces sp.SS菌株中的ssaX基因获得突变株；

(2)发酵突变株并饲喂突变株氨基酸或氨基酸类似物作为突变合成底物；

(3)对通过菌株发酵获得的突变合成产物进行分离纯化。

步骤(1)敲除法为利用同框敲除法进行基因敲除，优选的，所述同框敲除法为采用PCR-targeting技术进行同框敲除，最优选的，所述的PCR-targeting技术为采用λ-RED介导的PCR-targeting敲除技术：

步骤(2)所述的发酵突变株并饲喂突变株氨基酸或氨基酸类似物作为突变合成底物的方法为，

1)突变株在S5斜面培养基上生长7天后，接种于种子培养基(发酵培养基中加0.01％K₂HPO₄)中，28℃、200rpm震荡培养48h；

2)以5％的接种量平行转接于3瓶100ml含突变合成底物的发酵培养基，28℃、200rpm继续培养5天，

所述的发酵培养基的配方为：葡萄糖2～5％，工业淀粉0.2～1％，蛋白胨0.2～1％，硫酸铵0.3～1％，碳酸钙0.1～0.5％，用自来水配制

所述的发酵培养基的配方优选为：葡萄糖3％，工业淀粉0.5％，蛋白胨0.6％，硫酸铵0.7％，碳酸钙0.2％，用自来水配制；

步骤(2)所述的饲喂为在发酵液中添加氨基酸或氨基酸类似物，优选的，所述的氨基酸或氨基酸类似物的浓度为1～10mM，最优选的，所述的氨基酸或氨基酸类似物的浓度为3mM。

步骤(2)所述的氨基酸或氨基酸类似物为，

1)侧链为六元环的酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)；

或2)侧链六元环被卤素原子或氨基修饰的苯丙氨酸类似物；

或3)侧链六元环被五元环取代的氨基酸类似物，所述的五元环优选为含氧原子或硫原子的杂环。

优选的，步骤(2)所述的氨基酸或氨基酸类似物为如下式(1)～式(6)所示底物。

其中，R＝F,Cl,Br,Me。

步骤(3)所述的发酵产物分离纯化的步骤为，

1)将50L发酵液合并，离心，取上清液上大孔吸附树脂D4006，用30％丙酮水溶液将目的组分洗脱下来，减压浓缩，真空冷冻干燥，得粗品；

2)将粗品溶于0.02M Tris(pH8.5)的缓冲溶液中，上DEAE-葡聚糖凝胶-A25柱，用不同浓度的NaCl溶液洗脱，将HPLC检测纯度大于50％的组分收集，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得各组分的次纯品；

3)通过制备液相纯化得纯品，所述的制备液相的制备条件为：

色谱柱：XBridge BEH C₁₈OBD Prep Column,

5μm,20mm×250mm；

流速：5ml/min；

检测波长：254nm；

柱温：40℃；

流动相：0.1％(NH₄)₂CO₃：甲醇；

按峰收集，HPLC检测其纯度，合并纯度≥95％的部分，通过大孔吸附树脂X5脱盐，减压浓缩，真空冷冻干燥。

本发明还涉及到一组由所述突变合成法合成获得的Sansanmycins的结构衍生物，其结构式为如下式(1)所述

式(7)：Sansanmycins结构衍生物结构

其中，AA1为：

1)酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)或色氨酸(Trp)或氢原子(H)或甲硫氨酸(Met)；

或2)侧链六元环被卤素原子或氨基修饰的苯丙氨酸类似物；

或3)侧链六元环被五元环取代的氨基酸类似物，所述的五元环优选为含氧原子或硫原子的杂环。

AA4为：

1)酪氨酸(Tyr)或苯丙氨酸(Phe)或色氨酸(Trp)；

或2)侧链六元环被卤素原子或氨基修饰的苯丙氨酸类似物；

或3)侧链六元环被五元环取代的氨基酸类似物，所述的五元环优选为含氧原子或硫原子的杂环。

表1，Sansanmycins的结构衍生物的AA1和AA4取代基团

化合物	AA<sub>1</sub>	AA<sub>4</sub>
			MX-2	Tyr	Trp
MX-3	Phe	Tyr
			MX-7	2-Furyl-Ala	Trp
MX-8	2-Thienyl-Ala	Trp
			MX-9	4-NH<sub>2</sub>-Phe	Trp
MX-10	Phe	4-NH<sub>2</sub>-Phe
			MX-1	H	Trp
MX-6	Met	Trp
			MX-5(注)	Met	Trp

注：MX-5的结构为如下式(8)所示，其中AA3为Met^SO(甲硫亚砜)。

本发明还涉及所述的突变合成法在筛选具有抗结核分枝杆菌的抑制剂/药物中的应用。

优选的，所述的结核分枝杆菌为MDR-TB型抗性菌株(对异烟肼和利福平有抗性的菌株)；最优选得，所述的结核分枝杆菌为XDR-TB型抗性菌株(对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素和氧氟沙星均有抗性的菌株)。

本发明还涉及所述Sansanmycins的结构衍生物在制备抗结核分枝杆菌的抑制剂/药物中的应用。

优选的，所述的结核分枝杆菌为MDR-TB型抗性菌株(对异烟肼和利福平有抗性的菌株)；最优选的，所述的结核分枝杆菌为XDR-TB型抗性菌株(对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素和氧氟沙星均有抗性的菌株)。

附图说明

图1已知尿苷肽类抗生素化学结构

图2ssaX敲除后对sansanmycin产生的影响。

(A)ssaX阻断菌株(SS/XKO)的构建及PCR鉴定(引物PT-X-7和PT-X-8)。引物PT-X-1和PT-X-2用来扩增链霉素抗性基因(aadA)，bla为氨苄青霉素抗性基因，aac(3)IV为阿普霉素抗性基因。

(B和C)Southern blot结果。野生型菌株(WT)和阻断菌株(SS/XKO)的基因组DNA采用BamHI酶切，(B)以被敲除片段为探针进行杂交，(C)以ssaX下游的片段为探针进行杂交。

(D)各菌株发酵产物HPLC分析。

(E)各菌株发酵产物抗菌活性检测。1是野生型菌株(WT)；2是阻断菌株(SS/XKO)；3是回复菌株(SS/XKO/pL-ssaX)；4是过表达菌株(SS/pL-ssaX)。

图3SS/XKO饲喂间位酪氨酸(m-Tyr)、酪氨酸(Tyr)和苯丙氨酸(Phe)后的影响。

(A)饲喂不同底物后发酵产物的HPLC分析。

(B)饲喂不同底物后发酵产物的抗菌活性检测。

图4十个新sansanmycin类似物的(+)-ESI-MS/MS数据及结构

图5sansanmycin MX-1的结构鉴定。

(A)sansanmycin MX-1的¹H NMR谱图(600MHz，DMSO-d₆)。

(B)sansanmycin MX-1的¹³C NMR谱图(150MHz,DMSO-d₆)。

(C)sansanmycin MX-1的关键的2D NMR相关结构图。

图6新的sansanmycin类似物的产生。

(A)SS/XKO饲喂卤代苯丙氨酸产生的新化合物结构。

(B)新的sansanmycin衍生物1～4在不同菌株中产量的比较。氯霉素作为外标。

图7SS/XKO饲喂的非蛋白质源氨基酸的结构。饲喂底物中，底物1～6成功的掺入到产物的N端或C端。

图8sansanmycin A、MX-2和MX-4的稳定性比较。

(A)sansanmycin A在室温下在pH 6.0的KH₂PO₄缓冲液中在不同时间的HPLC分析。

(B)sansanmycin A、MX-2和MX-4随时间的变化。所有的样品均通过HPLC分析，根据峰面积定量。蓝线代表sansanmycin MX-2，红线代表sansanmycin MX-4，绿线代表sansanmycin A。

图9重组质粒pL-ssaX结构图

具体实施方式

实施例1.对ssaX的同框敲除及回复

为了研究ssaX在sansanmycin生物合成中的作用，我们利用PCR-targeting方法[21]成功构建了ssaX同框缺失的突变株。为了促进同源重组，首先将粘粒13R-1(质粒全序列/结构信息参考文献11上有公开，13R-1以pOJ446为载体，含有大部分sansanmycin生物合成基因包括ssaX)[11]上的链霉菌质粒复制子SCP2*用Amp抗性基因bla替换，得到粘粒13R-1-SCP2KO。然后将13R-1-SCP2KO上的ssaX同框敲除，得到的13R-1-SCP2KO-XKO通过接合转移导入野生型菌株(1965年分离自中国贵州安顺的一份土壤样品，中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心菌种保藏号为CGMCC No.1764)中(图2A)。

具体试验方法如下：

野生型菌株Streptomyces sp.SS来自中国药学微生物菌种保藏管理中心(ChinaPharmaceutical Culture Collection,CPCC 200442)。

一、采用λ-RED介导的PCR-targeting[21]技术将ssaX基因进行体内阻断敲除(图2)。

1.粘粒13R-1[11]含有包括ssaX在内的sansanmycin生物合成大部分基因及链霉菌质粒SCP2*的复制子，在进行ssaX的阻断之前，利用Amp抗性基因bla将13R-1上SCP2*的最小复制子部分进行了替换，获得重组粘粒13R-1-SCP2KO；

2.将重组粘粒13R-1-SCP2KO导入到Red/ET重组系统的专用宿主菌E.coliBW25113/pIJ790中，

设计一对引物

PT-X-1：

(5’-GCGGGAGGCCCCGCTGAACAGGGCCGCGATGCTGTCGTCATTCCGGGGATCCGTCGACC-3’)

和PT-X-2：

(5’-GTCACCGACACCGCCTATGAGAAGCGCCGCGAGGAGATCTGTAGGCTGGAGCTGCTTC-3’)，

通过PCR获得中间为链霉素抗性基因(aadA)、两端为39bp同源臂的线性打靶DNA，通过电击转化将该线性打靶DNA转到E.coli BW25113/pIJ790/13R-1-SCP2KO中，完成对ssaX的定向敲除得到靶基因被置换的粘粒13R-1-SCP2KO-XKO(aadA)，

3.再将该13R-1-SCP2KO-XKO(aadA)粘粒导入E.coli DH5α/BT340删除替换的链霉素抗性基因(aadA)，从而得到ssaX被敲除的粘粒。

4.经过PCR验证和限制性内切酶酶切验证正确后，将粘粒13R-1-SCP2KO-XKO导入E.coli ET12567/pUZ8002，通过接合转移导入野生型菌株Streptomyces sp.SS中，利用菌株对抗生素的敏感性挑选双交换菌株。

二、ssaX同框敲除的突变株SS/XKO利用引物PT-X-7和PT-X-8经PCR验证(图2A)，并进一步通过Southern blot鉴定(图2B,C)。

1.PCR鉴定时所用引物设计在距离39bp同源序列以外约100bp左右的位置，基因删除前后经PCR扩增所得的产物大小不同。

所用引物为：

PT-X-7(5’-TGAAGCCCGCCGCCTTTC-3’)

和PT-X-8(5’-TCTGCCTTCCGCCTGACCAT-3’)。

2.Southern blot分析采用Roche公司DIG Prime DNA Labeling and DetectionStarter Kit I(for color detection with NBT/BCIP)试剂盒。

野生型菌株和双交换菌株的基因组DNA采用BamHI酶切，先以被敲除片段为探针(由SB-X-1(5’-CTCGACCTCGTTCATGGAGT-3’)和SB-X-2(5’-AGTACGTCGACTGGGAGCAC-3’)经PCR扩增所得)，正确的双交换菌株无杂交条带，野生型菌株应能杂交到4.4Kb的条带(图2B)；

再以ssaX下游的片段为探针(由SB-X-3(5’-AGAAACCACGATGCGAAATC-3’)和SB-X-4(5’-TGGATTTTTCGCTTCAAACC-3’)经PCR扩增所得)，正确的双交换菌株应能杂交到3.7Kb的条带，而野生型菌株仍杂交到4.4Kb的条带(图2C)。鉴定正确的双交换菌株命名为SS/XKO。

三、为排除极性效应，将重组质粒pL-ssaX(该质粒的结构以pL646为载体，pL646[34]来自于pSET152[22]，为整合型质粒，含有attP位点，可以整合至链霉菌的attB位点，其多克隆位点上游含有强启动子ermE*p和tuf1基因的SD序列。质粒结构见图9)导入阻断株SS/XKO中，得到回复菌株SS/XKO/pL-ssaX。

1.首先设计一对引物：

pL-ssaX-F(5’-CGCATATGCAAGGGCATCGCGAC-3’)

和pL-ssaX-R(5’-ATAGGATCCTCAGCGCCGGGTGCC-3’)来扩增ssaX基因编码区片段，

2.将克隆产物转至pGEM-T载体中，经测序确定序列正确后，再克隆至pL646的NdeI和BamHI位点，得到重组质粒pL-ssaX。

3.重组质粒pL-ssaX通过接合转移分别导入到阻断菌株SS/XKO和野生型菌株中，利用阿普霉素抗性(Am^r)筛选阳性接合子，获得回复菌株SS/XKO/pL-ssaX和过表达菌株SS/pL-ssaX。pSET152也分别导入阻断菌株SS/XKO和野生型菌株中得到相应的对照菌株。

四、将野生型菌株、阻断菌株和回复菌株进行发酵，取发酵液进行生物活性检测和HPLC分析。

1.各菌株在S5斜面培养基上生长7天后，先接种于种子培养基(发酵培养基中加0.01％K₂HPO₄)中，28℃、200rpm震荡培养48h。然后以5％的接种量平行转接于3瓶100ml发酵培养基，28℃、200rpm继续培养5天。

2.每隔24h取5ml发酵液离心，菌体放于60℃恒温烘箱中至恒重，用于测定生长曲线，上清液进行生物活性测定和HPLC分析。

3.上清液用Waters Sep-Pak Classic Cartridge小柱进行富集，用60％的甲醇洗脱，洗脱液用HPLC分析，条件为：XBridge^TM C₁₈色谱柱(4.6×150mm,3.5μm,Waters,Dublin,Ireland)；流动相A：0.1％(NH₄)₂CO₃，流动相B：甲醇；流速：1ml/min；柱温：40℃；检测波长：254nm；梯度洗脱:在40min内，0.1％(NH₄)₂CO₃-MeOH从80:20逐渐变换到40:60。

4.抗菌活性测定是利用牛津杯法，以绿脓杆菌为检定菌。

在野生型菌株发酵液中，sansanmycin A是其主要组分，且其肽链的氨基端为m-Tyr。在阻断菌株的发酵液中，用HPLC并未检测到sansanmycin A(图2D)，同时也未出现抑菌圈(图2E)。在回复菌株的发酵液中，HPLC重新检测到sansanmycin A(图2D)，抑菌圈也重新出现(图2E)，并且sansanmycin A的产量可完全恢复到野生型菌株的水平(图2D)。

除了对阻断菌株SS/XKO进行体内遗传回复外，还在体外进行化学回复，即在阻断菌株SS/XKO的发酵培养基中添加m-Tyr(3mM)进行回复。HPLC检测到发酵产物中的主成分为sansanmycin A，且产量比野生型菌株有显著提高(图3A)，生物活性测定结果与HPLC分析结果一致，其发酵液出现抑菌圈，且比野生型菌株抑菌圈大(图3B)。所有的这些结果证明SsaX在sansanmycin生物合成过程中负责催化m-Tyr的生物合成。

为了进一步研究ssaX的作用，我们将重组质粒pL-ssaX通过接合转移导入野生型菌株得到过表达菌株SS/pL-ssaX，同时也将pSET152[22]导入野生型菌株得到对照菌株SS/pSET152。对过表达菌株SS/pL-ssaX进行发酵，HPLC检测发现，在与野生型菌株生长同步时，其发酵液中sansanmycin A的产量约比野生型菌株提高了30％(图2D)，并且其发酵液的抑菌圈比野生型菌株发酵液抑菌圈大(图2E)。此结果，结合化学回复的结果，提示我们SsaX在体内催化的酶促反应可能是sansanmycin生物合成过程的限速步骤。

实施例2ssaX阻断菌株中sansanmycin类似物的分离与结构鉴定

1.ssaX阻断菌株的发酵培养方法同实施例1，将50L发酵液合并，离心，取上清液上大孔吸附树脂D4006，用30％丙酮水溶液将目的组分洗脱下来，减压浓缩，真空冷冻干燥，得粗品。

2.将粗品溶于0.02M Tris(pH8.5)的缓冲溶液中，上DEAE-葡聚糖凝胶-A25柱，用不同浓度的NaCl溶液洗脱，将HPLC检测纯度大于50％的组分收集，收集洗脱液，减压浓缩，冷冻干燥得各组分的次纯品。

3.再经制备液相纯化，制备条件：色谱柱：XBridge BEH C₁₈OBD Prep Column,

5μm,20mm×250mm，流速：5ml/min，检测波长：254nm，柱温：40℃，流动相：0.1％(NH₄)₂CO₃：甲醇，按峰收集，HPLC检测其纯度，合并纯度≥95％的部分，减压浓缩，真空冷冻干燥，最后得到各个组分的纯品。

4.得到纯品后，对各组分纯品进行质谱(ESI-MS及ESI-MS/MS，ThermoFisher LTQOrbitrap XL质谱仪)及核磁共振光谱(Varian,SYS-600MHz,USA，氘代DMSO为溶剂，以TMS作内标，检测温度40℃)分析。

最后得到了十个组分的纯品，分别命名为sansanmycin MX-1～10。他们的结构经ESI-MS/MS(图4)和NMR分析后得到确证。

Sansamycin MX-1、MX-2、MX-4、MX-6的分子量分别是700、863、847、831。ESI-MS/MS的结果(图4)表明它们和sansanmycin A具有相同的碎片模式，都有一个和A相同的碎片峰m/z 701，即缺失N端氨基酸后的碎片(AA₁)，说明他们的N端氨基酸不同。并且，它们的¹H NMR数据(MX-1(图5A)、MX-2、MX-4、MX-6)也和sansanmycin A非常相似，不同的是sansanmycinA中N端氨基酸m-Tyr(δ7.23(t,1H),6.78(d,1H),6.75(d,1H),6.72(s,1H),4.04(m,1H),2.51(m,1H),2.89(m,1H))[1]被不同的氨基酸取代。在sansanmycin MX-1中为氢原子－NH(δ10.78)，在sansanmycin MX-2中为酪氨酸Tyr(δ7.51(d,2H),6.97(d,2H),4.15(m,1H),3.08(m,1H),2.97(dd,1H))，在sansanmycin MX-4中为苯丙氨酸Phe(δ7.34(m,2H)7.15(m,2H),7.27(m,1H),3.92(m,1H),2.73(m,1H),2.86(m,1H))，在sansanmycin MX-6中为甲硫氨酸Met(δ4.31(m,1H),2.47(m,1H),2.37(m,1H),1.99(s,3H),1.81(m,1H))。¹³C(图5B)和2DNMR图谱数据也确证了这些化合物的结构。

MX-3的分子量是824，比sansanmycin H[23]少16个质量数，推测可能是少了一个氧原子。进一步分析MX-3的ESI-MS/MS数据发现它有一个和sansanmycin H相同的碎片峰m/z 678，这是缺失N端氨基酸m-Tyr后的碎片，说明sansanmycin H中的m-Tyr在MX-3中可能被Phe取代。此外，MX-3的¹H NMR图谱数据与sansanmycin H在苯环上也有些许差异，MX-3中Phe(δ7.15(m,2H),7.15(m,2H),7.27(m,1H))取代了m-Tyr(δ7.23(t,1H),6.78(d,1H),6.75(d,1H),6.72(s,1H))[23]，进一步证实MX-3的N端为Phe。

MX-5的分子量是863，比sansanmycin MX-4多16个质量数，推测可能是多了一个氧原子。与MX-4相比,MX-5的¹H NMR图谱数据显示有一组甲基质子信号向低场迁移(从δ2.01(-SCH₃)到2.46(–SOCH₃))，因此推测MX-4中的甲硫氨酸氧化为MX-5中的甲硫亚砜。ESI-MS/MS分析结果(图4)也进一步证实了这个结构。

六个小组分均是尿苷肽类抗生素中首次报道的新结构。与sansanmycin A相比，sansanmycin MX-1是一个三肽中间体，缺失了N端氨基酸，此化合物是证明SsaX的生物学功能的直接证据，SsaX是负责催化N端m-Tyr生物合成的关键酶。其它的五个化合物不同于已知的sansanmycins，主要体现在N端氨基酸的变化，分别被Tyr，Phe和Met所替代。具有不同N端氨基酸的新的sansanmycin类似物的产生说明负责肽链骨架合成的NRPS尤其是负责N端氨基酸掺入的NRPS具有一定的底物宽容性，提示我们有些sansanmycin类似物可以利用ssaX阻断株通过突变合成得到。

实施例3.利用ssaX阻断株产生结构多样的sansanmycin类似物

首先饲喂20种氨基酸包括Tyr，Phe和Met来探讨突变合成的可行性。当饲喂Tyr时(3mM)，N端氨基酸为Tyr的sansanmycin MX-2的产量增加到187％(图3)。当饲喂Phe时(3mM)，N端氨基酸为Phe的sansanmycin MX-4的产量提高一倍(图3)。但是当饲喂其他氨基酸包括Met时，HPLC的峰形并无明显变化。这可能是由于NRPS的底物偏爱性，它偏向于选择Phe和Tyr而不是其他氨基酸。这个结果与SS/XKO中sansanmycin类似物的产量一致。同时sansanmycin MX-2和MX-4产量的提高提示我们突变合成可能适合用来产生N端被替代的sansanmycin类似物。

卤原子掺入到化合物中可能对其理化性质有显著影响[24,25]。有报道在野生型菌株中饲喂卤代Phe来获得sansanmycin类似物，发现卤代Phe偏爱于掺入到肽链骨架的C端[26]。为了使卤代Phe有效的掺入到N端，在ssaX阻断株SS/XKO中进行了相同的饲喂实验，产生了一些新的类似物，他们的结构通过ESI-MS/MS进行鉴定。产生的sansanmycin类似物可以分为三类(图6A)：第一类和第二类化合物分别为卤代Phe掺入到N端(例如化合物1和2)或同时掺入到N端和C端(例如化合物3和4)；第三类化合物为卤代Phe掺入到C端，但N端由Phe替换m-Tyr(例如化合物5和6)。此外，与野生型菌株饲喂结果相比，卤代Phe掺入到N端的新化合物的产量明显提高。以饲喂2-Cl-和2-Br-Phe(3mM)为例，化合物1和2的产量分别增加11和16倍，化合物3和4的产量分别提高10和13倍。总之，ssaX阻断株SS/XKO是一个更好的宿主来获得N端取代的sansanmycin类似物，因为他去除了最适內源底物的竞争。

受到之前饲喂实验的鼓励，以及为了扩大sansanmycin的结构多样性，20多种非蛋白质源氨基酸类似物在ssaX阻断菌株中进行了饲喂(图7)，图中实线上的1～6号化合物成功饲喂到sansanmycin骨架中，实线下的化合物饲喂不成功，其中以虚线分开，包括α-氨基酸和β-氨基酸。这些氨基酸类似物含有丰富多样的侧链基团，有脂肪族侧链、含取代基的芳香族苯环侧链以及芳香族和非芳香族的杂环基团。结果表明实验中的β-氨基酸不能掺入到sansanmycin的肽链骨架中。当饲喂甲基取代的Phe时，主要的产物为C端衍生物，但N端被Phe取代。当饲喂4-氨基-Phe时，得到两个产物sansanmycin MX-9和MX-10，分别为4-氨基-Phe掺入到N端和C端。出乎意料的是，两个芳香族杂环α-氨基酸，2-呋喃基丙氨酸和2-噻吩基丙氨酸，可以掺入到N端从而产生sansanmycin MX-7和MX-8。Sansanmycin MX-7～10的结构通过ESI-MS/MS进行鉴定(图4)。MX-7，MX-8和MX-9的分子量和预测一致，并且他们拥有和sansanmycin A相同的特征碎片峰，缺失N端氨基酸后的m/z 701，提示饲喂的前体掺入到了N端(图4)。MX-10拥有和MX-4相同的特征碎片峰，缺失C端氨基酸后的m/z 644，提示4-氨基-Phe掺入到了C端(图4)。这些结果提示我们ssaX阻断株SS/XKO可以接受其它的非天然底物，尤其是具有芳香性的α-氨基酸。

实施例4新的sansanmycin类似物抗菌活性和稳定性测定

我们对十个化合物进行了抗菌活性的测定，有革兰氏阴性菌和革兰氏阳性菌包括结核分枝杆菌H₃₇R_v(M.tuberculosis H₃₇R_v)和临床上分离的多重耐药(MDR)和广泛耐药(XDR)的结核分枝杆菌(表2)。和预期的一样，所有测试的化合物(除了MX-3)对E.coli ΔtolC都有不同程度的抑制活性，这可能与尿苷肽类抗生素可以被E.coli中的AcrAB-TolC外排泵排出相关[27]。其中，sansanmycin MX-2和MX-6保留了对P.aeruginosa抑菌活性，与sansanmycin A相当。有趣的是，sansanmycin MX-6对革兰氏阳性菌B.subtilis具有抑菌活性，这是天然的尿苷肽类抗生素所不具备的。对于M.tuberculosis H₃₇R_v，sansanmycin MX-1、MX-2、MX-4、MX-6和MX-7具有和sansanmycin A相当的抑菌活性。值得注意的是，这些测试化合物对临床分离的多重耐药(MDR)和广泛耐药的结核分枝杆菌株(XDR-TB)也具有相同的抑菌活性。这些结果可能是由于MraY是临床上尚未开发的一个靶点，提示尿苷肽类化合物可作为新型的抗结核药物先导化合物。

表2.sansanmycin类似物的活性测定结果

M.tuberculosis H₃₇Rv是结核分枝杆菌标准菌株。FJ05189、FJ05120和FJ05195是临床上分离的结核分枝杆菌。FJ05189和FJ05120是MDR-TB，对异烟肼和利福平有抗性。FJ05195是XDR-TB，对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素和氧氟沙星均有抗性。

在早期对sansanmycin A的研究中，我们发现sansanmycin A的结构在室温下并不稳定(图8A)。由于化合物sansanmycin MX-2和MX-4比较容易获得，sansanmycin A、MX-2和MX-4的稳定性试验在室温下在KH₂PO₄缓冲液中(pH 6.0)进行。在此条件下，sansanmycinMX-2和MX-4经过6天以后基本保持不变，然而sansanmycin A只剩下不到10％，此结果说明sansanmycin MX-2和MX-4比sansanmycin A更稳定。

最后需要说明的是，以上实施例仅用于帮助本领域技术人员理解本发明技术方案的实质，并不用作对本发明保护范围的限定。

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Claims (4)

1.Sansanmycin的结构衍生物，其结构式如下式所述

其中，所述的化合物的AA1和AA4的取代基团如下表所示

化合物 AA₁ AA₄ MX-1 H Trp MX-2 Tyr Trp MX-6 Met Trp MX-7 2-Furyl-Ala Trp

。

2.权利要求1所述Sansanmycin的结构衍生物在制备抗结核分枝杆菌的抑制剂或药物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌为对异烟肼和利福平有抗性的MDR-TB型抗性。

4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的结核分枝杆菌为对异烟肼、利福平、乙胺丁醇、链霉素、卡那霉素和氧氟沙星均有抗性的XDR-TB型抗性菌株。

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