CN116536201A - 一种用于修复盆底肌的后生元制剂及其制备方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于微生物和生物医药技术领域，具体涉及一种用于修复盆底肌的后生元制剂及其制备方法和应用。本发明成功获得一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Nice‑02，并基于该菌株成功开发出一款后生元制剂产品，经试验验证，其具有促进平滑肌收缩，修复盆底肌损伤，能较快修复压力性尿失禁情况的功效。同时，通过对该后生元制剂的制备工艺条件参数进行优化，对植物乳杆菌进行层级发酵，实现了发酵周期缩短、代谢产物全面丰富的优点，从而更加适于工业化生产，因此具有良好的实际应用之价值。
Description
技术领域
本发明属于微生物和生物医药技术领域，具体涉及一种用于修复盆底肌的后生元制剂及其制备方法和应用。
背景技术
公开该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不必然被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已经成为本领域一般技术人员所公知的现有技术。
女性盆底肌(PFMs)跨越骨盆出口，支撑骨盆和腹部内脏，帮助控制尿和粪便，并实现性功能。在人类中，PFM包括肛提肌复合体，由耻骨肌和髂尾肌的内侧(耻骨直肠)和外侧(耻骨尾骨)部分以及后尾肌组成。PFM功能障碍是盆底疾病发展的主要原因之一，包括盆腔器官脱垂、尿失禁和粪便失禁。衰老、妊娠和阴道分娩等因素可造成盆底肌收缩力下降或结构性损伤，盆底支持结构无法对抗腹腔压力，最终导致压力性尿失禁和盆底器官脱出。压力性尿失禁(stress urinary incontinence，SUI)，被喻为一种看不见的“社交癌”，是中老年女性常见病、多发病，被定义为咳嗽、大笑等腹压增加时尿液不自主溢出。发病时私密性高，患者常羞于启齿或求助无门，对患者的生活、人际关系和心理健康都产生了巨大的负面影响。
盆底功能障碍性疾病治疗方式目前包括保守治疗、药物治疗和外科治疗，保守治疗包括使用垫、导管或小便器、减肥、戒烟、行为治疗(即膀胱训练、液体/饮食改变、减少咖啡因摄入)、理疗以及骨盆底电生理刺激等。但是，缺乏动力、缺乏连续性和执行中的不一致性导致保守治疗的效果一般。抗胆碱能药物和/或β-3受体激动剂最常用于混合性尿失禁，但长期的服药副作用较大。手术选择有多种，尿道旁注射疗法、无张力阴道带、耻骨阴道或尿道中段尿道吊索以及伯奇阴道悬吊术等。然而，这些选择只能提供短期缓解，并且在长期来看，它们往往会导致并发症，如膀胱或阴道穿孔、排尿或储存功能障碍、慢性骨盆疼痛、尿道和阴道糜烂或物质感染等。
目前医学上除了上述3种方法外，尚无其他方法可以快速、有效改善女性盆底肌的问题，然而上述的治疗方法花费昂贵，容易出现术后疼痛、感染、发炎等难言之隐。大多数女性针对盆底肌问题经常羞于开口，畏惧自行前往问诊，因此通过口服调节剂逐渐改善盆底肌问题困扰是较好的解决方法。综合上述分析，透过口服后生元修复盆底肌，其优势明显大于医学性治疗。
发明内容
基于上述现有技术的不足，本发明提供一种用于修复盆底肌的后生元制剂及其制备方法和应用。经动物和人体试验验证，本发明制得的后生元制剂具有促进平滑肌收缩，修复盆底肌损伤的功效，从而有效解决现有治疗方法的副作用大、治疗效果不佳、患者依从性不佳等问题。基于上述研究成果，从而完成本发明。
为实现上述技术目的，本发明涉及以下技术方案：
本发明的一个方面，提供一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Nice-02，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2023年04月21日，其生物保藏号为CCTCC NO：M 2023571。
本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其至少含有上述植物乳杆菌和/或其发酵代谢产物。
进一步的，所述微生物菌剂包含灭活的植物乳杆菌及其发酵代谢产物，所述发酵代谢产物包括但不限于胞外多糖、多肽和氨基酸。此时，所述微生物菌剂即为后生元制剂。
因此，本发明的第三个方面，提供上述微生物菌剂的制备方法，所述制备方法包括：
S1、菌种活化：将所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Nice-02划线到活化培养基中获得纯种菌株；
S2、一级种子液准备：挑取步骤S1制得的植物乳杆菌Nice-02单菌落于28-30℃置于第一培养液中静置培养12-14小时得一级种子液；
S3、二级种子液准备：将上述一级种子液按照接种量为0.1-5％(优选为0.5％，v/v)接种至第二培养液中在30-40℃(优选37℃)静置培养10-12小时即得二级种子液。
S4、三级种子液准备：将上述培养的二级种子液在无菌条件下接种到含有第三培养液的种子罐中，接种量为0.5-5％(优选2％)，20-50转/分钟(优选为30转/分钟)搅拌培养，温度30-40℃(优选为37℃)，pH 7.0，罐压0.03-0.06MPa(优选为0.05Mpa)，培养10-12小时即得三级种子液；
S5、植物乳杆菌一级发酵：将上述三级种子液接种到含有灭菌的培养液的发酵罐中，接种量为0.5-5％(优选2％)，32℃，40-50r/min(优选为45r/min)，培养5-6小时；
S6、植物乳杆菌二级发酵：5-6小时后，发酵温度降温至30℃，搅拌转速升至50-70r/min(优选为60r/min)，罐压保持0.05MPa，pH自然，发酵3-4小时；
S7、植物乳杆菌三级发酵：8-10小时后，搅拌速度不变，发酵温度升至35℃，罐压保持0.05MPa，保持pH为6.5，发酵2小时；
S8、植物乳杆菌四级发酵：10-12小时后，搅拌转速降30-40r/min(优选为40r/min)，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，保持pH为6.5，发酵1-2小时；
S9、植物乳杆菌五级发酵：11-14小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.05-0.2％(优选为0.1％)的无菌脂磷壁酸，降温至20℃保持30分钟。
本发明的第四个方面，提供上述后生元制剂在制备修复盆底肌产品中的应用。
所述修复盆底肌的产品可以为食品或药品。
上述一个或多个技术方案的有益技术效果：
上述技术方案筛选获得一株植物乳杆菌，基于该菌株成功开发出一款后生元制剂产品，经试验验证，其具有促进平滑肌收缩，修复盆底肌损伤，能较快修复压力性尿失禁情况的功效。同时，通过对该后生元制剂的制备工艺条件参数进行优化，对植物乳杆菌进行层级发酵，实现了发酵周期缩短、代谢产物全面丰富的优点，从而更加适于工业化生产，因此具有良好的实际应用之价值。
具体实施方式
应该指出，以下详细说明都是示例性的，旨在对本发明提供进一步的说明。除非另有指明，本发明使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本发明申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
本发明的一个具体实施方式中，提供一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Nice-02，保藏于中国典型培养物保藏中心(地址：湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学)，保藏日期为2023年04月21日，其生物保藏号为CCTCC NO：M 2023571。
本发明的第二个方面，提供一种微生物菌剂，其至少含有上述植物乳杆菌和/或其发酵代谢产物。
进一步的，所述微生物菌剂包含灭活的植物乳杆菌及其发酵代谢产物，所述发酵代谢产物包括但不限于胞外多糖、多肽和氨基酸。此时，所述微生物菌剂即为后生元制剂。
因此，本发明的第三个方面，提供上述微生物菌剂的制备方法，所述制备方法包括：
S1、菌种活化：将所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Nice-02划线到活化培养基中获得纯种菌株；
其中，所述活化培养基的组成如下：酪蛋白0.05-0.2％，唾液酸0.05-0.2％，牛肉膏0.3-1.0％，蛋白胨0.5-2％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，琼脂粉1.5-2.0％，调pH至7.0；
更具体的，所述活化培养基的组成如下：酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，牛肉膏0.7％，蛋白胨1％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉2.0％，调pH至7.0。
S2、一级种子液准备：挑取步骤S1制得的植物乳杆菌Nice-02单菌落于28-30℃置于第一培养液中静置培养12-14小时得一级种子液；
所述第一培养液的组成如下：酪蛋白0.05-0.2％，唾液酸0.05-0.2％，低聚果糖1-5％，酵母粉0.1-1％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，调pH至7.0。
更具体的，所述第一培养液的组成如下：酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，低聚果糖3％，酵母粉0.5％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，调pH至7.0。
S3、二级种子液准备：将上述一级种子液按照接种量为0.1-5％(优选为0.5％，v/v)接种至第二培养液中在30-40℃(优选37℃)静置培养10-12小时即得二级种子液。
所述第二培养液的组成如下：酪蛋白0.1-1％，唾液酸0.05-0.2％，低聚果糖1-3％，酵母粉0.1-1％，吐温-80 0.05-0.2％，pH自然。
更具体的，所述第二培养液的组成如下：酪蛋白0.5％，唾液酸0.1％，低聚果糖1.5％，酵母粉0.5％，吐温-80 0.1％，pH自然。
S4、三级种子液准备：将上述培养的二级种子液在无菌条件下接种到含有第三培养液的种子罐中，接种量为0.5-5％(优选2％)，20-50转/分钟(优选为30转/分钟)搅拌培养，温度30-40℃(优选为37℃)，pH 7.0，罐压0.03-0.06MPa(优选为0.05Mpa)，培养10-12小时即得三级种子液。
所述第三培养液的组成如下：蛋白胨0.5-5％，低聚异麦芽糖1-5％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，甘氨酸0.5-5％，酪氨酸0.1-1％，吐温-80 0.05-0.2％，聚醚消泡剂0.05-0.2％，pH自然。
具体的，所述第三培养液的组成如下：蛋白胨1％，低聚异麦芽糖4％，磷酸氢二钾0.2％，甘氨酸1％，酪氨酸0.5％，吐温-80 0.1％，聚醚消泡剂0.1％，pH值自然。
S5、植物乳杆菌一级发酵：将上述三级种子液接种到含有灭菌的培养液的发酵罐中，接种量为0.5-5％(优选2％)，32℃，40-50r/min(优选为45r/min)，培养5-6小时；
所述培养液的组成如下：低聚异麦芽糖3％，酪蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH自然。
S6、植物乳杆菌二级发酵：5-6小时后，发酵温度降温至30℃，搅拌转速升至50-70r/min(优选为60r/min)，罐压保持0.05MPa，pH自然，发酵3-4小时；
S7、植物乳杆菌三级发酵：8-10小时后，搅拌速度不变，发酵温度升至35℃，罐压保持0.05MPa，保持pH为6.5，发酵2小时；
S8、植物乳杆菌四级发酵：10-12小时后，搅拌转速降30-40r/min(优选为40r/min)，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，保持pH为6.5，发酵1-2小时；
S9、植物乳杆菌五级发酵：11-14小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.05-0.2％(优选为0.1％)的无菌脂磷壁酸，降温至20℃保持30分钟。
所述制备方法还包括对步骤S9制得的发酵液进行高温灭活和喷雾干燥。其中，所述高温灭活具体为75℃保持40分钟进行灭活处理，降温后，可进行喷雾干燥。所述喷雾干燥设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元制剂粉末。
本发明的又一具体实施方式中，提供上述后生元制剂在制备修复盆底肌产品中的应用。
所述修复盆底肌的产品可以为食品或药品。
更具体的，所述药品还可以包括其他至少一种药物非活性成分。
所述药物非活性成分可以是药学上通常使用的载体、赋形剂及稀释剂等。而且，根据通常的方法，可以制作成粉剂、颗粒剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂、喷雾剂等的口服剂
所述可以包含的载体、赋形剂及稀释剂等非药物活性成分在领域内是熟知的，本领域普通技术人员能够确定其符合临床标准。
本发明的又一具体实施方式中，所述载体、赋形剂及稀释剂包括但不限于有乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油等。
以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中，各培养基(液)中组成成分“％”为质量体积百分比，单位为g/mL。
实施例1
一种修复盆底肌的后生元的制备方法，包括以下步骤：
在无菌操作台下，将-80℃低温冰箱保藏的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNice-02划线到培养基平板，筛选单菌落，重复活化单菌落3次，获得纯种菌株；
所述培养基的组成如下：每100毫升培养基中含有酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，牛肉膏0.7％，蛋白胨1％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉2.0％，氢氧化钾调pH至7.0。
挑取单菌落于100mL液体培养基(培养基置于15*200的试管中，液体培养基的组成如下：每100毫升培养基中含有酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，低聚果糖3％，酵母粉0.5％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，氢氧化钾调pH至7.0)，30℃静置培养12小时；
将以上培养好的种子液接种到三角瓶培养基中，接种量为0.5％，即二级种子培养液(每100毫升培养液中含有酪蛋白0.5％，唾液酸0.1％，低聚果糖1.5％，酵母粉0.5％，吐温-80 0.1％，pH自然)100mL，接入一级种子液为0.5mL，完毕后用灭菌纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养静置12h，此称为二级种子液；
将上述培养的二级种子液在无菌条件下接种到加入三级种子培养液(每100毫升培养基中含有蛋白胨1％，低聚异麦芽糖4％，磷酸氢二钾0.2％，甘氨酸1％，酪氨酸0.5％，吐温-80 0.1％，聚醚消泡剂0.1％，pH自然)的种子罐中去，接种量为2％(v/v)，30转/分钟搅拌培养，温度37℃，pH 7.0，罐压0.05MPa，培养12小时；
将三级种子液接种到含灭菌发酵液(每100毫升培养基中含有低聚异麦芽糖3％，酪蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH值自然)的发酵罐中，接种量为2％(v/v)，32℃，45r/min，培养5小时；5小时后，发酵温度降温至30℃，搅拌转速升至60r/min，罐压保持0.05MPa，pH值自然，发酵3小时；8小时后，搅拌速度不变，发酵温度升至35℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH值6.5，发酵2小时；10小时后，搅拌转速降至40r/min，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，通过酸、碱自动调控系统保持pH 6.5，发酵1小时；11小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.1％的无菌脂磷壁酸，降温至20℃保持30分钟，然后再升温至75℃保持40分钟灭活，再降温至30℃；
设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元粉末。
通过实施例1获得的后生元，胞外多糖含量为24％，多肽含量为20.8％，氨基酸含量为38.5％。
实施例2
一种修复盆底肌的后生元的制备方法，包括以下步骤：
在无菌操作台下，将-80℃低温冰箱保藏的植物乳杆菌Lactobacillus plantarumNice-02划线到培养基平板，筛选单菌落，重复活化单菌落3次，获得纯种菌株；
所述培养基的组成如下：每100毫升培养基中含有酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，牛肉膏0.7％，蛋白胨1％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉2.0％，氢氧化钾调pH至7.0。
挑取单菌落于100mL液体培养基(培养基置于15*200的试管中，液体培养基的组成如下：每100毫升培养基中含有酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，低聚果糖3％，酵母粉0.5％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，氢氧化钾调pH至7.0)，30℃静置培养12小时；
将以上培养好的种子液接种到三角瓶培养基中，接种量为0.5％，即二级种子培养液(每100毫升培养液中含有酪蛋白0.5％，唾液酸0.1％，低聚果糖1.5％，酵母粉0.5％，吐温-80 0.1％，pH自然)100mL，接入一级种子液为0.5mL，完毕后用灭菌纱布及牛皮纸将瓶口封好，用手稍加摇动使接入的菌种与培养液混合均匀，然后放恒温箱中在37℃的条件下培养静置12h，此称为二级种子液；
将上述培养的二级种子液在无菌条件下接种到加入三级种子培养液(每100毫升培养基中含有蛋白胨1％，低聚异麦芽糖4％，磷酸氢二钾0.2％，甘氨酸1％，酪氨酸0.5％，吐温-80 0.1％，聚醚消泡剂0.1％，pH自然)的种子罐中去，接种量为2％，30转/分钟搅拌培养，温度37℃，pH 7.0，罐压0.05MPa，培养12小时；
将三级种子液接种到含灭菌发酵液(每100毫升培养基中含有低聚异麦芽糖3％，酪蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-80 0.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH值自然)的发酵罐中，接种量为2％，32℃，45r/min，培养46小时；46小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.1％的无菌脂磷壁酸，降温至20℃保持30分钟，然后再升温至75℃保持40分钟灭活，再降温至30℃；
设置进风温度150-180℃，出风温度90-100℃，进行喷雾干燥得后生元粉末。
通过实施例2获得的后生元，胞外多糖含量为19％，多肽含量为17.8％，氨基酸含量为34％。
效果验证
1、体外肌肉收缩评测
采用十二指肠平滑肌作为实验对象，观察测定后生元产品对十二指肠平滑肌收缩性能的影响。实验方案：大鼠分为对照组和实验组，对照组正常喂食，实验组在食物中加喂0.5％(w/w)，1.0％和1.5％的后生元(均实施例1制备产品，三组实验组依次命名为实验组1-3)，约喂食2周后，麻醉大鼠并颈部脱臼致死，将大鼠腹部切开，以胃部幽门与十二指肠交界处为起点剪取肠管，将其剪成约1cm的肠段，用克氏液轻柔洗净，放置在克氏液中，保湿恒温为37℃，调节基础张力为1g，通气钩以每秒1-2个气泡的速度持续通混合气(950mL·L-1氧气和50mL·L-1二氧化碳)。小肠平滑肌收缩活动及变化信号经张力换能器引至BL-420生物机能实验多道生理信号采集处理系统，观察收缩曲线。结果如下表1所示。由表1结果表明，后生元具有促进平滑肌收缩的能力，且表现出一定的剂量依赖性。
表1后生元对大鼠离体肠段平滑肌运动的影响(n＝8)
| 组别 | 振幅(g) | 频率(hz) |
| 对照组 | 0.81±0.14 | 0.57±0.11 |
| 实验组1 | 1.61±0.26 | 1.04±0.23 |
| 实验组2 | 1.95±0.32 | 1.412±0.29 |
| 实验组3 | 1.72±0.31 | 1.24±0.41 |
2、盆底肌损伤治疗小规模临床实验
20名年龄在40-60岁的女性，自愿进行试验并能够完成调查表和记录，正饱受因盆底肌问题而引起的压力性尿失禁困扰者纳入试验组。每日早晨空腹口服600mg后生元(实施例1制备产品)，服用3周。期间每周跳绳测试漏尿情况。饮用期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。
服用周期结束后，100％的服用者表示，服用前的运动方式基本不会采用跳跃的方式，跳不了几下就会有漏尿的情况，服用结束后，整个跳绳过程中，完全没有漏尿的情况发生，甚至一点感觉都没有。
表2修复盆底肌的后生元人群试验统计情况表
| 编号 | 服用前情况 | 服用量和服用周期 | 服用后情况 |
| 1 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 2 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 3 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 4 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 5 | 慢跑漏尿 | 每天600mg服用2周 | 慢跑3公里轻微漏尿 |
| 6 | 咳嗽漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 7 | 慢跑漏尿 | 每天600mg服用2周 | 慢跑3公里轻微漏尿 |
| 8 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳轻微漏尿 |
| 9 | 咳嗽漏尿 | 每天600mg服用2周 | 剧烈咳嗽无漏尿情况 |
| 10 | 咳嗽漏尿 | 每天600mg服用2周 | 剧烈咳嗽无漏尿情况 |
| 11 | 慢跑漏尿 | 每天600mg服用2周 | 慢跑3公里无漏尿 |
| 12 | 慢跑漏尿 | 每天600mg服用2周 | 慢跑3公里无漏尿 |
| 13 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 14 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 15 | 咳嗽漏尿 | 每天600mg服用2周 | 剧烈咳嗽轻微漏尿 |
| 16 | 咳嗽漏尿 | 每天600mg服用2周 | 剧烈咳嗽无漏尿情况 |
| 17 | 慢跑漏尿 | 每天600mg服用2周 | 慢跑3公里无漏尿 |
| 18 | 慢跑漏尿 | 每天600mg服用2周 | 慢跑3公里无漏尿 |
| 19 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
| 20 | 跳跃漏尿 | 每天600mg服用2周 | 1500次跳绳无任何漏尿情况 |
上述效果验证实验表明，本发明制备的后生元制剂具有较强的盆底肌修复功能。
最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
Claims (10)
1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Nice-02，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏日期为2023年04月21日，其生物保藏号为CCTCC NO：M 2023571。
2.一种微生物菌剂，其特征在于，其至少含有权利要求1所述植物乳杆菌和/或其发酵代谢产物。
3.如权利要求2所述的微生物制剂，其特征在于，所述微生物菌剂包含灭活的植物乳杆菌及其发酵代谢产物。
4.权利要求2-3所述微生物菌剂的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括：
S1、菌种活化：将所述植物乳杆菌Lactobacillus plantarum Nice-02划线到活化培养基中获得纯种菌株；
S2、一级种子液准备：挑取步骤S1制得的植物乳杆菌Nice-02单菌落于28-30℃置于第一培养液中静置培养12-14小时得一级种子液；
S3、二级种子液准备：将上述一级种子液按照接种量为0.1-5％接种至第二培养液中在30-40℃静置培养10-12小时即得二级种子液；
S4、三级种子液准备：将上述培养的二级种子液在无菌条件下接种到含有第三培养液的种子罐中，接种量为0.5-5％，20-50转/分钟搅拌培养，温度30-40℃，pH 7.0，罐压0.03-0.06MPa，培养10-12小时即得三级种子液；
S5、植物乳杆菌一级发酵：将上述三级种子液接种到含有灭菌的培养液的发酵罐中，接种量为0.5-5％，32℃，40-50r/min，培养5-6小时；
S6、植物乳杆菌二级发酵：5-6小时后，发酵温度降温至30℃，搅拌转速升至50-70r/min，罐压保持0.05MPa，pH自然，发酵3-4小时；
S7、植物乳杆菌三级发酵：8-10小时后，搅拌速度不变，发酵温度升至35℃，罐压保持0.05MPa，保持pH为6.5，发酵2小时；
S8、植物乳杆菌四级发酵：10-12小时后，搅拌转速降30-40r/min，发酵温度升为40℃，罐压保持0.05MPa，保持pH为6.5，发酵1-2小时；
S9、植物乳杆菌五级发酵：11-14小时后，搅拌速度不变，温度升高至45℃，向发酵罐中加入发酵液体积0.05-0.2％的无菌脂磷壁酸，降温至20℃保持30分钟。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S1中，
所述活化培养基的组成如下：酪蛋白0.05-0.2％，唾液酸0.05-0.2％，牛肉膏0.3-1.0％，蛋白胨0.5-2％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，琼脂粉1.5-2.0％，调pH至7.0；
进一步的，所述活化培养基的组成如下：酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，牛肉膏0.7％，蛋白胨1％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，琼脂粉2.0％，调pH至7.0。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S2中，
所述第一培养液的组成如下：酪蛋白0.05-0.2％，唾液酸0.05-0.2％，低聚果糖1-5％，酵母粉0.1-1％，乙酸钠0.05-0.2％，磷酸二氢钾0.05-0.2％，调pH至7.0；
进一步的，所述第一培养液的组成如下：酪蛋白0.1％，唾液酸0.1％，低聚果糖3％，酵母粉0.5％，乙酸钠0.1％，磷酸二氢钾0.1％，调pH至7.0。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述步骤S3中，
所述第二培养液的组成如下：酪蛋白0.1-1％，唾液酸0.05-0.2％，低聚果糖1-3％，酵母粉0.1-1％，吐温-80 0.05-0.2％，pH自然；
更具体的，所述第二培养液的组成如下：酪蛋白0.5％，唾液酸0.1％，低聚果糖1.5％，酵母粉0.5％，吐温-80 0.1％，pH自然；
所述步骤S4中，所述第三培养液的组成如下：蛋白胨0.5-5％，低聚异麦芽糖1-5％，磷酸氢二钾0.1-0.5％，甘氨酸0.5-5％，酪氨酸0.1-1％，吐温-80 0.05-0.2％，聚醚消泡剂0.05-0.2％，pH自然；
更具体的，所述第三培养液的组成如下：蛋白胨1％，低聚异麦芽糖4％，磷酸氢二钾0.2％，甘氨酸1％，酪氨酸0.5％，吐温-80 0.1％，聚醚消泡剂0.1％，pH值自然。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，多级发酵过程中使用的培养液的组成如下：低聚异麦芽糖3％，酪蛋白0.2％，蛋白胨2％，低聚果糖5％，水溶性淀粉3％，吐温-800.1％，甘氨酸0.5％，酪氨酸0.5％，聚醚消泡剂0.2％，pH自然。
9.如权利要求4-8任一项所述制备方法，其特征在于，所述制备方法还包括对步骤S9制得的发酵液进行高温灭活和喷雾干燥。
10.权利要求1所述植物乳杆菌、权利要求2-3任一项所述微生物菌剂在制备修复盆底肌产品中的应用；所述修复盆底肌的产品为食品或药品。
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Legal Events
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|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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