CN116531571A - 一种载中药单体的复合凝胶支架及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种载中药单体的复合凝胶支架及其制备方法和应用。本发明的复合凝胶支架具有多孔结构，原料包括促成骨中药单体、含钙硅酸盐、含羟基和羧基的天然多糖、天然蚕茧蛋白和交联剂。本发明的复合凝胶支架制备方法简单，原料易得，便于规模化生产和推广应用。本发明的复合凝胶支架具有良好的易塑性、生物力学强度、以及较好的促成骨、血管化、神经化和止血功能，可应用于制备组织工程材料。

Description

一种载中药单体的复合凝胶支架及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及组织工程技术领域，特别涉及一种载中药单体的复合凝胶支架及其制备方法和应用。

背景技术

肿瘤切除、粉碎性骨折或骨髓炎病灶切除后大块骨缺损的临床治疗仍是骨科医生面临的挑战。自体骨移植一直是治疗骨缺损的金标准，但其存在移植区疼痛、出血、来源受限等缺点。近年来，同种异体骨作为自体骨的替代品，在临床上得到了广泛的应用。但其高昂的成本、病毒的传播及免疫排斥反应限制了其临床应用。因此，开发模拟天然骨结构、成分和性能，无免疫原性，骨融合率高的骨替代材料成为国内外学者的研究热点。在骨愈合过程中，血管化和成骨分化对骨愈合极其重要。骨折后血管供应中断导致损伤部位形成血肿，血管破裂导致缺氧造成大量细胞死亡、成骨细胞分化延迟，在出血环境下的骨再生仍是挑战。

骨组织由有机胶原蛋白和无机磷灰石组成，其中插有血管和神经。在新骨组织的形成过程中，血管化的程度至关重要，因为血管有助于骨修复细胞的气体交换、营养供应和代谢废物清除。其次，分布在骨中的神经和血管可以通过影响骨细胞的功能来调节骨再生和重塑过程，因此，提高成骨性能和神经血管化功能对骨缺损修复都是至关重要的。为了模仿无机磷灰石和增强骨修复，研究人员开发了具有良好的生物降解、血管生成和骨传导特性的含钙硅酸盐生物材料。其中，生物活性玻璃(BG)具有良好的矿化活性，已用于创伤外科和颅颌面外科的骨再生。此外，BG还可以促进血管生成，这对骨再生很重要。但BG不能单独使用，直接注射在缺损区域，易被血液冲走，需要与其他材料复合。

发生骨折时，持续出血往往导致愈合不良，急需立即止血。止血对于降低失血性休克的风险、拯救生命和降低器官衰竭的可能性至关重要。因此开发新的止血材料对有效止血具有重要意义。近年来，天然有机生物材料(蛋白质、多糖等)在组织工程和载药领域发展迅速，富含羧基和羟基的天然多糖，如海藻酸钠、纤维素和羧甲基壳聚糖等，具有良好的生物相容性和止血性能。其中羧甲基壳聚糖(CMCS)无毒、可降解、生物相容性好、可溶于水，在骨科研究中应用广泛。它在溶液中以两性电解质的形式存在，氨基可以被质子化产生正离子，羧基可以被离子化产生负离子，可以增加红细胞的聚集和血小板的粘附，加速凝血过程，缩短凝血时间。然而，CMCS通常需要与其他材料交联以形成支架或水凝胶。丝素蛋白(SF)作为一种天然高分子材料，具有良好的力学性能和良好的细胞相容性。但是丝素蛋白的止血性能有待提高。

尽管含钙硅酸盐具有良好的成骨活性，但其复合材料骨诱导性能仍有待提高。近年来，淫羊藿、三七皂苷、柚皮苷等用于成骨的中药单体在成骨方面显示出独特优势。学者发现它们具有促进骨形成和血管生成的显著特征，但中药单体存在溶解度低等问题。

发明内容

本发明旨在至少解决现有技术中存在的上述技术问题之一。为此，本发明的目的在于开发一种载中药单体的复合凝胶支架，并通过大鼠颅骨缺损模型评估该支架的体外理化性质和细胞生物相容性及其作为骨缺损修复材料应用在骨再生的潜力，为开发及临床推广新型骨缺损治疗材料奠定基础，开辟组织工程的新方向，同时为实现中药局部控释起效提供理论依据，丰富中医药现代理论。

为了实现上述目的，本发明所采取的技术方案是：

本发明的第一个方面提出了一种复合凝胶支架。

本发明的第二个方面提出了一种复合凝胶支架的制备方法。

本发明的第三个方面提出了一种复合凝胶支架的应用。

根据本发明的第一个方面，提出一种复合凝胶支架，所述复合凝胶支架具有多孔结构，所述复合凝胶支架的原料包括促成骨中药单体、含钙硅酸盐、含羟基和羧基的天然多糖、天然蚕茧蛋白和交联剂。

在本发明的一些实施方式中，所述含羟基和羧基的天然多糖和天然蚕茧蛋白通过交联剂交联形成多孔结构，所述促成骨中药单体和含钙硅酸盐分散在多孔结构中。

在本发明的一些实施方式中，所述促成骨中药单体选自柚皮苷、淫羊藿素、三七皂苷、槲皮素中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述含钙硅酸盐选自生物玻璃、硅酸钙、镁黄长石、透辉石、锌黄长石中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述含羟基和羧基的天然多糖选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、纤维素中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述天然蚕茧蛋白选自丝素蛋白、丝胶蛋白中的至少一种。

在本发明的一些实施方式中，所述交联剂选自京尼平、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺中的至少一种。

根据本发明的第二个方面，提出一种第一方面所述复合凝胶支架的制备方法，包括如下步骤：

S1：将促成骨中药单体和天然蚕茧蛋白分别溶解于溶剂中，得到促成骨中药单体溶液和天然蚕茧蛋白溶液；

S2：将S1制得的所述促成骨中药单体溶液、所述天然蚕茧蛋白溶液与含钙硅酸盐、含羟基和羧基的天然多糖、交联剂混合，交联，固化，得到所述复合凝胶支架。

在本发明的一些实施方式中，所述促成骨中药单体、含钙硅酸盐、含羟基和羧基的天然多糖、天然蚕茧蛋白及交联剂的质量比为(0.0001～10)：(0.01～20)：(1～100)：(1～100)：(0.01～50)，优选为(0.001～5)：(0.1～10)：(1～50)：(1～50)：(0.05～20)，更优选为(0.1～5)：(1～10)：(1～25)：(1～25)：(0.1～10)，如0.5：1：5：5：0.5、1：5：10：10：2、2：10：25：25：8等。

在本发明的一些实施方式中，S1所述溶剂独立选自甲醇、乙醇、丙酮、醋酸、稀碱溶液和热水中的至少一种；所述稀碱溶液的质量浓度为0.5％～15％，所述热水的温度为75～100℃。

在本发明的一些实施方式中，S1所述促成骨中药单体溶液的浓度为0.0001～10mg/mL，优选为2～10mg/mL。

在本发明的一些实施方式中，S1所述天然蚕茧蛋白的质量浓度为3％～6％，分子量为3000Da～14000Da。

在本发明的一些实施方式中，S2所述的交联剂的质量浓度为0.01％～5％，优选为0.1～0.5％，更优选为0.1％～0.25％。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2所述交联的温度为20℃～60℃。

在本发明的一些优选的实施方式中，S2所述交联的时间为10min～80min，优选为15min～20min。

在本发明的一些更优选的实施方式中，S2所述固化为真空冷冻干燥，所述真空冷冻干燥的时间为40h～50h，温度为-40～-60℃。

根据本发明的第三个方面，提出第一方面所述的复合凝胶支架或第二方面所述的方法制备的复合凝胶支架在制备组织工程材料中的应用。

在本发明的一些实施方式中，所述组织工程材料为骨缺损修复材料。

本发明的有益效果是：

1.本发明的复合凝胶支架，具有良好的易塑性、生物力学强度、以及较好的促成骨、血管化、神经化和止血功能，从而能够适用于形状各异的骨缺损区，且效果持久，具有较强的骨组织修复能力。

2.本发明的复合凝胶支架制备方法简单，原料易得，便于规模化生产和推广应用。

附图说明

图1为本发明实施例1～3(SCB-N1、SCB-N2、SCB-N3)和对比例1～2(SC、SCB)制备的复合凝胶支架的FTIR光谱图。

图2本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架的SEM图。

图3为本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架的应力-应变曲线图(a)和应力图(b)。

图4为本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架的吸水溶胀率图(a)和孔隙率图(b)。

图5为本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架的大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)增殖活性图。

图6为本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架与大鼠BMSCs共培养后的成骨分化基因表达图。

图7为本发明实施例1～3和对比例2的柚皮苷和离子释放图。

图8为本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架的治疗骨缺损的疗效图。

图9为本发明实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架体外凝血检测结果。

图10为本发明实施例2制备的复合凝胶支架体内止血特性。

具体实施方式

以下通过具体的实施例对本发明的内容作进一步详细的说明。实施例和对比例中所用的原料、试剂或装置如无特殊说明，均可从常规商业途径得到，或者可以通过现有技术方法得到。除非特别说明，试验或测试方法均为本领域的常规方法。

以下各实施例中，所述丝素蛋白按以下方法制备：

将5g脱胶蚕丝加入9.3M溴化锂溶液50mL至溶解；用8层纱布过滤上述液体，6700rpm离心10min，离心后溶液转移到透析袋(3000～14000Da)中，透析3天，在-50℃下冻干48h后备用。

所述丝胶蛋白按以下方法制备：

1)称取10g蚕茧并用剪刀剪成小块，放入烧杯中，用超纯水清洗三次；

2)向烧杯中加入300mL的0.5％Na₂CO₃(w/v)溶液，置于水浴锅，加热煮沸(100℃)30min；

3)过滤去除不溶解的物质，3000rpm离心5min，收集上清液；

4)将收集的上清液转入透析袋(3000～14000Da)中，室温透析48h，每隔8h换一次超纯水，在-50℃下冻干48h后备用。

实施例1

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将10mg柚皮苷单体溶解于乙醇中，得到柚皮苷溶液；

2)将上述丝素蛋白溶解于80℃热水中，得到丝素蛋白溶液；

3)将柚皮苷溶液、生物玻璃、羧甲基壳聚糖、京尼平与丝素蛋白溶液混合，随后在37℃成胶20min，在-50℃下真空冷冻干燥48h，得到复合凝胶支架(SCB-N1)。

本实施例中所述支架组成的浓度为柚皮苷(0.05wt％)、生物玻璃(0.4wt％)、羧甲基壳聚糖(2wt％)、丝素蛋白(2wt％)、京尼平(0.25wt％)，其比例为0.5：4：20：20：2.5。

实施例2

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将柚皮苷单体溶解于乙醇中，得到柚皮苷溶液；

2)将丝素蛋白溶解于80℃热水中，得到丝素蛋白溶液；

3)将柚皮苷溶液、生物玻璃、羧甲基壳聚糖、京尼平与丝素蛋白溶液混合，随后在37℃成胶20min，真空冷冻干燥，得到复合凝胶支架(SCB-N2)。

本实施例中所述支架组成的浓度为柚皮苷(0.1wt％)、生物玻璃(0.4wt％)、羧甲基壳聚糖(2wt％)、丝素蛋白(2wt％)、京尼平(0.25wt％)，其比例为1：4：20：20：2.5。

实施例3

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将柚皮苷单体溶解于乙醇中，得到柚皮苷溶液；

2)将丝素蛋白溶解于80℃热水中，得到丝素蛋白溶液；

3)将柚皮苷溶液、生物玻璃、羧甲基壳聚糖、京尼平与丝素蛋白溶液混合，随后在37℃成胶20min，真空冷冻干燥，得到复合凝胶支架(SCB-N3)。

本实施例中所述支架组成的浓度为柚皮苷(0.2wt％)、生物玻璃(0.4wt％)、羧甲基壳聚糖(2wt％)、丝素蛋白(2wt％)、京尼平(0.25wt％)，其比例为2：4：20：20：2.5。

实施例4

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将三七皂苷R1单体溶解于乙醇中，得到皂苷溶液；

2)将丝胶蛋白溶解于80℃热水中，得到丝胶蛋白溶液；

3)将R1溶液、硅酸钙、海藻酸钠、京尼平与丝胶蛋白溶液混合，随后在25℃成胶60min，真空冷冻干燥，得到复合凝胶支架。

本实施例中所述支架组成的浓度为三七皂苷R1(0.1wt％)、硅酸钙(1wt％)、海藻酸钠(1wt％)、丝胶蛋白(3wt％)、京尼平(0.75wt％)，其比例为1：10：20：20：7.5。

实施例5

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将淫羊藿单体溶解于乙醇中，得到淫羊藿溶液；

2)将丝胶蛋白溶解于80℃热水中，得到丝胶蛋白溶液；

3)将淫羊藿溶液、锌黄长石、纤维素、京尼平与丝胶蛋白溶液混合，随后在45℃成胶15min，真空冷冻干燥，得到复合凝胶支架。

本实施例中所述支架组成的浓度为淫羊藿(1wt％)、锌黄长石(2wt％)、纤维素(2wt％)、丝胶蛋白(4wt％)、京尼平(0.5wt％)，其比例为1：2：2：4：0.5。

实施例6

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将槲皮素单体溶解于乙醇中，得到槲皮素溶液；

2)将丝胶蛋白溶解于80℃热水中，得到丝胶蛋白溶液；

3)将槲皮素溶液、镁黄长石、纤维素、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与丝胶蛋白溶液混合，随后在45℃成胶15min，真空冷冻干燥，得到复合凝胶支架。

本实施例中所述支架组成的浓度为槲皮素(0.06wt％)、镁黄长石(7wt％)、纤维素(3wt％)、丝胶蛋白(3wt％)、EDC(0.1wt％)，其比例为0.06：7：3：3：0.1。

实施例7

本实施例制备了一种复合凝胶支架，具体过程为：

1)将三七皂苷Ft1单体溶解于乙醇中，得到Ft1溶液；

2)将丝胶蛋白溶解于80℃热水中，得到丝胶蛋白溶液；

3)将三七皂苷Ft1溶液、透辉石、透明质酸、1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳酰二亚胺(EDC)与丝胶蛋白溶液混合，随后在25℃成胶60min，真空冷冻干燥，得到复合凝胶支架。

本实施例中所述支架组成的浓度为三七皂苷Ft1(0.0005wt％)、透辉石(1wt％)、透明质酸(5wt％)、丝胶蛋白(5wt％)、EDC(0.9wt％)，其比例为0.005：10：50：50：9。

对比例1

本对比例制备了一种复合凝胶支架(SC)，与实施例1的区别在于不含柚皮苷和生物玻璃，具体过程参照实施例1进行。

对比例2

本对比例制备了一种复合凝胶支架(SCB)，与实施例1的区别在于不含柚皮苷，具体过程参照实施例1进行。

试验例

成分表征

应用FTIR分析实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架的组成，在500cm^-1～3500cm^-1的扫描范围内测试，扫描32次，分辨率为2cm^-1。

对比例1～2(SC、SCB)和实施例1～3(SCB-N1、SCB-N2、SCB-N3)的支架FTIR光谱如图1所示。各组支架出现了羧甲基壳聚糖的特征红外吸收峰，分别位于1589cm^-1，1411cm^-1，1319cm^-1。复合支架中丝素蛋白的酰胺I、酰胺II和酰胺III基团吸收峰分别位于1649cm^-1，1525cm^-1和1235cm^-1；在1051cm^-1和791cm^-1处的吸收峰属于BG，分别标志着Si–O(s)和Si–O(b)的震动吸收峰。对于柚皮苷，1071cm^-1的谱带对应于C-O的特征吸收峰。1160～1170cm^-1左右的吸收峰与京尼平中的C-O基团有关。这表明柚皮苷和生物玻璃的添加，并没有改变支架的基体组成，各组分之间具有良好的相容性。

形态检测

将实施例1～3和对比例1～2的复合凝胶支架材料溅射金，分别进行形貌和显微结构评价，结果如图2所示，其中(a)组图比例尺均为20μm；(b)组图比例尺均为5μm；(c)图比例尺均为500nm。

从图2中可知，5组支架材料均为蜂窝状多孔结构，孔隙结构相似；孔隙以圆形和椭圆形为主，孔隙大小在100μm左右；孔的表面较为光滑，孔隙之间相互贯通，这能为血管形成和细胞的迁移生长提供良好的环境，并有利于细胞扩散和营养物质的交换。当将生物玻璃加入到复合凝胶支架，生物玻璃颗粒能够较好地附着在丝素蛋白基质中，整体均匀地分散在丝素蛋白支架中。进一步添加柚皮苷后，随着其含量的增加，复合凝胶支架的孔隙结构变得更为规则，孔隙变大，这有利于骨和血管等组织长入。

力学性能评价

使用Instron测试仪和软件分别测试实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架。配备有最大50N的负载单元，通过施加位移(60％应变)并随时间监控压缩力直到达到平衡，所用的十字头速度约为2mm/min，测试结果见图3，其中(a)图为应力-应变图，(b)图为应力柱状图。

由图3可知，5组复合凝胶支架的压缩应力均随着应变的增加呈上升趋势。对比例2(SCB)的支架在10％应变处的压缩应力低于1MPa；添加生物玻璃后，4组支架的压缩应力明显增大，均高于1.5MPa，显著高于对比例2组(p<0.01)；而当进一步添加柚皮苷至0.2wt％时，复合材料的压缩强度大于2MPa；这些结果表明生物玻璃和柚皮苷有利于提高复合凝胶支架材料的抗压强度，其中实施例3(SCB-N3)制备的复合凝胶支架的抗压强度最大，这有利于促进成骨。

吸水率及孔隙率评价

分别将实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架浸入2mL PBS中，并在不同时间节点(0h，0.5h，1h，2h，4h，6h，10h，12h，24h)测量样品的质量(Mt)。原始干燥状态下样品的质量为M0，并根据公式计算吸水率。吸水溶胀率(％)＝(Mt-M0)/M0，平行测试3次，取平均值。

取干态水凝胶称重，记为Md，用无水乙醇浸没样品，用真空泵进行抽真空，直到干态水凝胶沉底，取出称重为Ms，计算孔隙率P，P＝(Ms-Md)/ρV*100％。其中，ρ是乙醇在24.5℃时的密度(0.79g/mL)，V为支架的体积。每组3个样品，取平均值。结果如图4所示，其中(a)为吸水溶胀率；(b)为孔隙率。

从图4的(a)中可以看出，各组复合凝胶支架在前1天内以较快速度吸收大量水分，表现出良好的溶胀性能，这可能是因为复合凝胶支架内部存在三维连通孔结构和较高比表面积，从而具有较强的吸水能力。随着浸泡时间延长，各组样品吸水量增加，但吸水速率降低，在浸泡的第24h基本达到溶胀平衡，对比例1(SC)制备的复合支架溶胀比最高，实施例3(SCB-N3)制备的复合支架溶胀比最低，由此也可知，随着生物活性玻璃的添加和柚皮苷浓度的增加，复合凝胶支架的溶胀比逐渐减小，这可能是因为：随着生物活性玻璃和柚皮苷的增加，基体材料的交联作用增强，从而降低了其吸水能力，溶胀比下降。适当的溶胀比有利于营养物质和代谢产物的输送，但是过高的溶胀比会使过量水分进入支架内部，从内部对支架施加压力，从而导致孔隙增大，结构坍塌，机械强度降低，降解速度加快。因此，BG和NG的添加能调控支架具有较为合适的溶胀能力。

通过阿基米德排水法测得实施例1～3和对比例1～2的复合凝胶支架的孔隙率如图4(b)所示。通过与对比例1组支架对比发现，对比例1及实施例1～3组支架的孔隙率均＞80％，高于对比例1组支架，且实施例2、实施例3组支架的孔隙率明显高于对比例1组支架的。大量研究表明，在骨修复过程中，组织工程支架应具备较大的孔隙率(＞80％)，对于营养物质运输、细胞迁移、骨组织长入、血管形成、生物活性因子输送起到关键作用。由此说明实施例制备的复合凝胶支架孔隙率良好，满足骨修复的组织工程要求。

生物相容性评价

将大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs分别种植在实施例1～3和对比例1～2制得的支架(n＝3)上(支架已灭菌)，没有支架的设为Blank组，将BMSCs与复合材料共培养1、4和7天后，通过使用分光光度计检测450nm处的吸光度(OD)值来检测细胞增殖，每组3个重复，结果见图5。

如5所示，随着培养时间的延长，BMSCs在所有复合凝胶支架上均表现出稳定的增殖能力。在共培养1天后，所有组都具有相似的细胞增殖活性；当共培养时间延长到4天和7天，实施例和对比例都比Blank组具有更好的细胞增殖活性；这表明支架具有良好的细胞相容性。

体外成骨评价

将大鼠骨髓间充质干细胞BMSCs分别种植在实施例1～3和对比例1～2制得的支架(n＝3)上(支架已灭菌)，将BMSCs与复合材料共培养7天和14天后，使用Quantitect SYBRGreen PCR试剂盒，根据试剂盒的说明，通过实时RT-qPCR，检测骨生成基因(OCN和BMP-2)、血管化标记基因(VEGF)和神经化标记基因(TB3、GFAP)这5种具有代表性的骨修复相关标志基因的表达，评估复合凝胶支架对细胞成骨的影响，结果见图6，其中A图为共培养7天的结果，B图为共培养14天的结果。

由图6可见，培养7天后，与对比例1组支架相比，对比例2及实施例1～3组支架显示出较高的骨生成基因(OCN和BMP-2)，血管化标记基因(VEGF)和神经化标记基因(TB3、GFAP)表达，实施例3组的支架的基因相对表达量最高，表明生物玻璃和柚皮苷能共同促进BMSCs成骨分化。培养14天后，与对比例1组支架相比，对比例2及实施例1～3组显示出较高的骨生成基因(BMP-2)，血管化标记基因(VEGF)和神经化标记基因(TB3、GFAP)表达。这些结果表明，载中药单体的复合凝胶支架满足骨生成过程中成骨、成血管、成神经的要求。

柚皮苷和离子释放研究

将实施例1～3和对比例2组制备的复合凝胶支架分别加入离心管中，分别用1mL的PBS浸泡，并置于37℃恒温振荡器中。1h，24h，72h，168h时，完全取出样品溶液，并加入等量的PBS。将样品溶液离心，通过孔径为0.45μm的水溶性微孔膜过滤，通过HPLC使用C18柱(250mm×4.6mm，5μm)测定柚皮苷的释放浓度。流动相为V_甲醇：V_水：V_乙酸＝39.5：60：0.5；柱烘箱温度为35℃；流速为1.0mL/min；检测波长为282nm；液体运行时间为10min；PDA运行时间为10min。

将实施例1～3和对比例2组制备的复合凝胶支架分别加入离心管中，分别用1mL的PBS浸泡，并置于37℃恒温振荡器中。在不同时间点(1、24、72和168h)收集上清液，用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP)检测溶液中Ca和Si离子的浓度，每组三个样品，取平均值。

上述实验结果见图7。由图7可见，柚皮苷从支架中释放，约60％的封装药物在前3天内释放(a)，累积释放量随时间和柚皮苷含量的增加而增加(b)。实施例2和实施例3支架在7天内都释放更多的Ca和Si离子，并且从实施例3支架释放的Ca和Si离子的浓度在所有时间点都高于其他组(c、d)。

体内成骨评价

采用雄性SD大鼠(体重200g～250g)。分为4个组，分别为：空白对照组(Control)、对比例1组支架(SC)、对比例2组支架(SCB)、实施例2组支架(SCB-N2)，首先用1wt％戊巴比妥钠(40mg/kg)麻醉、剃毛和消毒。在大鼠颅顶骨的中位形成一个直径为6mm的全长颅骨缺损，并在缺损处植入支架，术后3个月采集大鼠颅骨标本，进行micro-CT检查，观察对比植入的不同支架对骨缺损的修复效果，结果如图8所示。

图8可见，植入3个月后，Control组骨缺损新骨形成量很少，对比例1～2及实施例2组支架组的新骨量比control组多，实施例2组新骨量最多，表明复合凝胶中的生物玻璃和柚皮苷一起促进了新骨形成。

体外止血研究

1.溶血实验：收集雄性SD大鼠的血液并放入抗凝血试管中。分别将实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架(6×4mm)和纱布加入到试管中，并在37℃预热30min，然后分别加入175μL血液和70μL 0.2MCaCl₂，接着加入10mL生理盐水；阴性对照和阳性对照分别使用含175μL血液的生理盐水和去离子水。将上述各组样品分别置于37℃水浴60min，并以500rpm离心10min。将每组的上清液置于96孔板中，用分光光度计在540nm处测量吸光度(OD)，溶血率(％)＝(OD_样品–OD_{阴性对照组})/(OD_{阳性对照组}–OD_{阴性对照组})×100，结果见图9(a)。

2.凝血时间

分别将实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架(6×4mm)加入到EP管中，并在37℃下预孵育。不含复合凝胶支架的EP管用作对照组(Control)。然后加入70μL 0.2M氯化钙(CaCl₂)溶液，并置于37℃水浴中。试管每15s倾斜30°，观察血液的流动状态，直至血液完全凝固如图9(e)。记录从加入血液到血液在EP管底部完全凝固所需的时间，结果见图9(b)。

3.凝血指数(BCI)

分别将实施例1～3和对比例1～2制备的复合凝胶支架(6×4mm)预装在5mL的EP管中，并在37℃预热5min，将含CaCl₂的全血溶液(50μL CaCl₂与1mL全血混合)分别加入，并在37℃水浴中孵育180s。当达到设定的时间点时，缓慢加入5mL去离子水，并以500rpm离心10min。纱布作为对照组，生理盐水作为阴性对照组。装有血液和去离子水的试管用作阳性对照组。将各组上清液转移至96孔板，并使用酶标仪在540nm处测量(记录为As)。阳性对照组的测量值为Abs。最后，通过公式BCI＝As/Abs*100计算样品的BCI，结果见图9(c)和(f)。

图9中，(a)为溶血率；(b)为凝血时间；(c)为180秒时的凝血指数；(d)为溶血试验照片；(e)为凝血时间测试照片；(f)为180秒凝血指数测试照片。如图9(a)和(d)所示，对比例1-2组和实施例1-3组的溶血度均低于5％，且未观察到对红细胞的显著破坏作用，表明未引起溶血反应，满足生物材料对溶血率的要求。如图9(b)和(e)所示，对照组的体外凝血时间超过600s，而纱布接近400s。对比例1～2组的凝血时间约为300s。随着柚皮苷含量的增加，支架的凝血时间进一步缩短。实施例2和3组的凝血效果最好，凝血时间小于200s。与纱布组相比，所有添加NG的支架的BCI值均小于50％，支架的凝血能力也与NG浓度有关(图9(c)和(f))。实施例2和3组的BCI均低于25％，接近阴性对照组，表明实施例2和3组具有优异的凝血能力(p<0.05)。

体内止血试验

大鼠断尾模型止血试验：将12只SD大鼠随机分为3组。用手术刀将每只老鼠的尾巴切掉2厘米。第一滴血流出后，除阴性对照组(Control)外，在各组流血的尾巴上分别覆盖不同的材料。尾部出血停止后，记录出血量和止血时间数据。本实验采用实施例2制备的复合凝胶支架作为实验组，对于阴性对照，不处理尾部出血；对于阳性对照，用医用纱布和商业明胶止血海绵处理尾部出血。至少三个独立样本用于统计分析。

大鼠肝损伤模型止血试验:将12只SD大鼠随机分为3组。切开腹部露出肝脏，用一块纱布清除少量腹腔液。用解剖刀在肝脏上开一个10mm的手术伤口，除阴性对照组(Control)外，用不同的材料覆盖。记录出血时间和失血数据。本实验采用实施例2制备的复合凝胶支架作为实验组，对于阴性对照，不处理尾部出血；阳性对照伤口用医用纱布或商用明胶海绵覆盖。至少三个独立样本用于统计分析。

图10中，(a，b，c)为对照组、纱布组和SCB-N2组的大鼠尾部伤口止血性能(*p<0.05)、尾部出血图像(a)、凝血时间(b)和失血量(c)；(d，e，f)为不同组中大鼠肝脏伤口的止血性能(*p<0.05)、出血图像(d)、凝血时间(e)和失血量(f)。结果如图10所示，在大鼠切尾和肝出血模型中评价了支架的止血作用。选择实施例2进行检测，如图10中a和d显示，实施例2组失血量少于对照组和纱布组。止血时间分析(图10中b、e图)，实施例2组治疗显著加快尾侧出血模型的止血进程。实施例2组止血时间(56.25±2.5s)明显短于对照组(161.7±7.6s)和纱布组(146.3±4.8s)(p<0.05)。实施例2组肝出血模型止血时间(18.7±5.5s)也明显短于对照组(93.7±3.5s)和纱布组(72±2.4s)(p<0.05)。失血量的统计结果如图10中c、f所示。对照组的尾部和肝脏出血模型的失血量分别为约396和208mg，而纱布组的失血量分别为约313和125mg。然而，实施例2组架治疗后的失血量分别降至134和108mg，与阴性对照组比较，在尾侧出血和肝出血模型中SCB-N2组失血量均明显减少(p<0.05)。表明添加BG和NG的支架在体内具有良好的止血性能，为止血材料的研究提供了新的方向。

实施例4～7制备的复合凝胶支架有与上述实施例1～3相当的效果，此不赘述。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种复合凝胶支架，其特征在于，所述复合凝胶支架具有多孔结构，所述复合凝胶支架的原料包括促成骨中药单体、含钙硅酸盐、含羟基和羧基的天然多糖、天然蚕茧蛋白和交联剂；所述含羟基和羧基的天然多糖和天然蚕茧蛋白通过交联剂交联形成多孔结构，所述促成骨中药单体和含钙硅酸盐分散在多孔结构中。

2.根据权利要求1所述的复合凝胶支架，其特征在于，所述复合凝胶支架中所述促成骨中药单体、所述含钙硅酸盐、所述含羟基和羧基的天然多糖、所述天然蚕茧蛋白及交联剂的质量比为(0.0001～10)：(0.01～20)：(1～100)：(1～100)：(0.01～50)。

3.根据权利要求1所述的复合凝胶支架，其特征在于，所述促成骨中药单体选自柚皮苷、淫羊藿素、三七皂苷、槲皮素中的至少一种。

4.根据权利要求1所述的复合凝胶支架，其特征在于，所述含钙硅酸盐选自生物玻璃、硅酸钙、镁黄长石、透辉石、锌黄长石中的至少一种。

5.根据权利要求1所述的复合凝胶支架，其特征在于，所述含羟基和羧基的天然多糖选自羧甲基壳聚糖、透明质酸、海藻酸钠、纤维素中的至少一种。

6.根据权利要求1所述的复合凝胶支架，其特征在于，所述天然蚕茧蛋白选自丝素蛋白、丝胶蛋白中的至少一种。

7.一种权利要求1～6任一项所述的复合凝胶支架的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：将促成骨中药单体和天然蚕茧蛋白分别溶解于溶剂中，得到促成骨中药单体溶液和天然蚕茧蛋白溶液；

S2：将S1制得的所述促成骨中药单体溶液、所述天然蚕茧蛋白溶液与含钙硅酸盐、含羟基和羧基的天然多糖、交联剂混合，交联，固化，得到所述复合凝胶支架。

8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S1所述促成骨中药单体溶液的浓度为0.0001mg/mL～10mg/mL。

9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于，S2所述交联的温度为20℃～60℃，时间为10min～80min。

10.权利要求1～6任一项所述的复合凝胶支架在制备组织工程材料中的应用。