CN116528908A - 治疗脑缺血性中风的金团簇、组合物和方法 - Google Patents

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Abstract

配体结合的金团簇和含有配体结合的金团簇的组合物在治疗脑缺血性中风和在制备治疗脑缺血性中风药物中的用途。本发明还提供了治疗脑缺血性中风的方法。

Description

治疗脑缺血性中风的金团簇、组合物和方法
技术领域
本发明涉及脑疾病治疗领域，尤其涉及配体结合的金团簇(AuCs)，包含配体结合的金团簇的组合物，以及使用所述配体结合的金团簇和组合物来制备治疗脑缺血性中风的药物以及利用所述配体结合的金团簇和组合物来治疗脑缺血性中风的方法。
背景技术
当血管被血块阻塞或遭遇破裂时，就会发生脑卒中。脑卒中有三种类型，即脑出血性中风、脑缺血性中风和短暂性缺血性发作(TIA)。
脑出血性中风是由于血管破裂并阻止血液流向大脑而引起的。常见症状包括突然虚弱、身体任何部位瘫痪、不能说话、呕吐、行走困难、昏迷、意识丧失、脖子僵硬和头晕。目前尚无特效药物。
脑缺血性中风，又称脑局部缺血和脑缺血，是人类最常见的疾病之一和导致死亡和致残的主要原因。脑缺血性中风约占所有中风的87％。脑缺血性中风是由于向大脑供血的动脉中出现血块或斑块等堵塞而引起的，阻塞出现在颈部或颅骨内，使大脑的血流和氧气减少，导致脑细胞受损或死亡。如果血液循环不能迅速恢复，脑损伤可能是永久性的。
脑缺血性中风的具体症状取决于大脑的哪个区域受到影响。大多数缺血性中风的常见症状包括视力问题、四肢无力或瘫痪、头晕和眩晕、神志不清、协调能力丧失和一侧面部下垂。一旦出现症状，尽快接受治疗是至关重要的，这样就不太可能造成永久性损伤。
脑缺血性中风的主要治疗方法是静脉注射组织纤溶酶原激活剂(tPA)，它可以分解血栓。必须在中风开始后4个半小时内给予tPA才能有效。然而，tPA会导致出血，因此如果患者有出血性中风、脑出血、近期大手术或头部受伤史，则不能使用tPA治疗。长期治疗包括阿司匹林或抗凝剂以防止进一步血栓形成。
Amani等人公开了将OX26-PEG与25nm胶体金纳米粒子表面结合形成的纳米颗粒OX26@GNPs能显著增加梗死脑组织，裸露的GNPs和PEG化GNPs对梗死体积无影响；结果表明：OX26@GNPs不适合脑缺血性中风的治疗。
Zheng等人公开了在其OGD/R损伤大鼠模型中，20nm Au-NPs增加了细胞活力，减轻了神经元凋亡和氧化应激，改善了线粒体呼吸。然而，Zheng等人同时证明5nm金纳米粒子具有相反的作用，不能用于缺血性中风的治疗。
TIA是由暂时性血栓引起的。常见症状包括虚弱、身体一侧的麻木或瘫痪、言语模糊不清或混乱、失明和眩晕。目前尚无特效药物。
仍然需要更好的策略和药物来治疗脑缺血性中风。
发明内容
本发明提供配体结合的金团簇在治疗受试者脑缺血性中风中的用途，利用配体结合的金团簇治疗受试者脑缺血性中风的方法，和配体结合的金团簇在制备治疗受试者脑缺血性中风的药物中的用途。
本发明的一些实施方案利用配体结合的金团簇治疗受试者脑缺血性中风，其中所述配体结合的金团簇包含金核，和与所述金核结合的配体。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述金核的直径为0.5-3nm。在一些实施方案中，所述金核的直径为0.5-2.6nm。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、和其他含硫醇化合物中的一种。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，并且所述D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽，其中所述含半胱氨酸的二肽选自L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸二肽(CR)、L(D)-精氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(RC)、L(D)-组氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(HC)和L(D)-半胱氨酸-L(D)-组氨酸二肽(CH)。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的三肽，其中所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(GCR)、L(D)-脯氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(PCR)、L(D)-赖氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-脯氨酸三肽(KCP)和L(D)-谷胱甘肽(GSH)。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的四肽，其中所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GCSR)。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的五肽，其中所述含半胱氨酸的五肽选自半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(CDEVD)和天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(DEVDC)。
在该治疗用途的一些实施方案中，所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L(D)-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、十二烷基硫醇、2-氨基乙硫醇(CSH)、3-巯基丙酸(MPA)和4-巯基苯甲酸(p-MBA)。
本发明的一些实施方案使用配体结合的金团簇来制备用于治疗受试者脑缺血性中风的药物，其中所述配体结合的金团簇包含金核，和与所述金核结合的配体。
在该制备用途的一些实施方案中，所述金核的直径为0.5-3nm。在一些实施方案中，所述金核的直径为0.5-2.6nm。
在该制备用途的一些实施方案中，所述配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物、和其他含硫醇化合物中的一种。
在该制备用途的一些实施方案中，所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在该制备用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽，其中所述含半胱氨酸的二肽选自L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸二肽(CR)、L(D)-精氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(RC)、L(D)-组氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(HC)和L(D)-半胱氨酸-L(D)-组氨酸二肽(CH)。
在该制备用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的三肽，其中所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(GCR)、L(D)-脯氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(PCR)、L(D)-赖氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-脯氨酸三肽(KCP)和L(D)-谷胱甘肽(GSH)。
在该制备用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的四肽，其中所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GCSR)。
在该制备用途的一些实施方案中，所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的五肽，其中所述含半胱氨酸的五肽选自半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(CDEVD)和天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(DEVDC)。
在该制备用途的一些实施方案中，所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L(D)-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、十二烷基硫醇、2-氨基乙硫醇(CSH)、3-巯基丙酸(MPA)和4-巯基苯甲酸(p-MBA)。
从以下结合附图对本发明优选实施例的详细描述，本发明的目的和优点将变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图描述根据本发明的优选实施例，其中相同的附图标记表示相同的元件。
图1显示具有不同粒径的配体L-NIBC修饰的金纳米粒子(L-NIBC-AuNPs)的紫外-可见(UV)光谱、透射电子显微镜(TEM)图像和粒度分布图。
图2显示具有不同粒径的配体L-NIBC结合的金团簇(L-NIBC-AuCs)的紫外-可见(UV)光谱、TEM图像和粒度分布图。
图3显示具有不同粒径的L-NIBC-AuCs的红外光谱。
图4显示配体CR结合的金团簇(CR-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图5显示配体RC结合的金团簇(RC-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图6显示配体1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L-脯氨酸(即Cap)结合的金团簇(Cap-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图7显示配体GSH结合的金团簇(GSH-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图8显示配体D-NIBC结合的金团簇(D-NIBC-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图9显示配体L-半胱氨酸结合的金团簇(L-Cys-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图10显示配体2-氨基乙硫醇结合的金团簇(CSH-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图11显示配体3-巯基丙酸结合的金团簇(MPA-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图12显示配体4-巯基苯甲酸结合的金团簇(p-MBA-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图13显示配体4-半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(CDEVD)结合的金团簇(CDEVD-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图14显示配体4-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(DEVDC)结合的金团簇(DEVDC-AuCs)的UV、红外、TEM和粒度分布图。
图15显示各组大鼠的神经行为学评分(每个时间点的柱状图中，从左至右分别为假手术组(空白)、模型对照组、A1低剂量组、A1高剂量组、A2低剂量组、A2高剂量组、A3低剂量组、A3高剂量组、A4低剂量组、A4高剂量组、B1低剂量组、B1高剂量组、B2低剂量组、B2高剂量组)。
图16显示各组大鼠脑梗死面积的百分比(柱状图中，从左至右分别为假手术组(空白)、模型对照组、A1低剂量组、A1高剂量组、A2低剂量组、A2高剂量组、A3低剂量组、A3高剂量组、A4低剂量组、A4高剂量组、B1低剂量组、B1高剂量组、B2低剂量组、B2高剂量组)。
图17显示金团簇药物给药和金纳米粒子给药后MCAO大鼠大脑组织的示例性TTC染色图像，其中(1)假手术组；(2)模型对照组；(3)A1低剂量组；(4)A1高剂量组；(5)B1低剂量组；(6)B1高剂量组。
具体实施方式
通过参考以下对本发明一些实施方案的详细描述，可以更容易地理解本发明。
在引用出版物的情况下，这些出版物的公开内容被整体引用到本申请中，以便更全面地描述本发明相关的现有技术。
如本文所用，“给药”是指口服(“po”)给药，栓剂给药，局部接触给药，静脉给药(“iv”)，腹腔注射给药(“ip”)，肌肉注射给药(“im”)，病灶内给药，海马内给药，侧脑室注射给药，鼻腔给药或皮下给药(“sc”)或将缓释装置例如微型渗透泵或易蚀植入物植入受试者。给药可以通过包括肠胃外和跨粘膜的任何途径进行(例如口服，鼻，阴道，直肠或透皮)。肠胃外给药包括例如静脉注射，肌肉注射，小动脉内，皮内，皮下，腹腔注射，心室内和颅内。其他递送方式包括但不限于使用脂质体制剂，静脉输注，透皮贴剂等。
术语“系统性给药”是指将化合物或组合物给予哺乳动物以使该化合物或组合物通过循环系统被递送至体内的部位，包括药物作用的靶部位的方法。系统性给药包括但不限于口服，鼻内，直肠和肠胃外给药(即通过消化道以外的其他途径，例如肌肉注射，静脉注射，动脉内，透皮和皮下给药)，但附带条件是，如本文所用，系统性给药不包括通过除循环系统以外的其他方式直接给药至脑区域，例如鞘内注射和颅内给药。
如本文所用，术语“治疗”是指，对于该术语所适用的疾病或症状，延迟其发生，或延缓/逆转其发展，或减轻/预防所述疾病或症状。
术语“患者”，“受试者”或“个体”可互换地是指哺乳动物，例如人类或非人类哺乳动物，包括灵长类动物(例如猕猴、黑猩猩、类人猿pongo)、家养哺乳动物(例如猫科动物、犬科动物)、农业哺乳动物(例如牛、绵羊、猪、马)和实验室哺乳动物或啮齿动物(例如大鼠、小鼠、兔形目、仓鼠、豚鼠)。
配体结合的金团簇(AuCs)是存在于金原子和金纳米粒子之间的金的特殊形式。配体结合的金团簇的金核尺寸小于3nm，由仅仅几个到几百个金原子组成，导致金纳米粒子的面心立方堆叠结构的崩溃。因此，与金纳米粒子的连续或准连续能级不同，金团簇表现出具有不同HOMO-LUMO间隙的分子状离散电子结构。这导致常规金纳米粒子所具有的表面等离子体共振效应和相应的在紫外-可见光谱下等离子体共振吸收带(520±20nm)的消失。
本发明提供配体结合的金团簇。
在一些实施方案中，配体结合的金团簇包含配体和金核，其中配体与金核结合。配体与金核的结合表示配体通过共价键、氢键、静电力、疏水力、范德华力等等与金核一起形成在溶液中稳定的复合物。在一些实施方案中，金核的直径为0.5-3nm。在一些实施方案中，金核的直径在0.5-2.6nm的范围内。
在一些实施方案中，配体结合的金团簇的配体是含硫醇的化合物或寡肽。在一些实施方案中，配体通过Au-S键与金核键合以形成配体键合的金团簇。
在一些实施方案中，配体是，但不限于，L-半胱氨酸，D-半胱氨酸或半胱氨酸衍生物。在一些实施方案中，半胱氨酸衍生物是N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)或N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
在一些实施方案中，配体是，但不限于，含半胱氨酸的寡肽及其衍生物。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的二肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的二肽是L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸二肽(CR)、L(D)-精氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(RC)或L(D)-半胱氨酸-L(D)-组氨酸二肽(CH)。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的三肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的三肽是甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(GCR)、L(D)-脯氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(PCR)或L(D)-谷胱甘肽(GSH)。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的四肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的四肽是甘氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GSCR)或甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GCSR)。在一些实施方案中，含半胱氨酸的寡肽是含半胱氨酸的五肽。在一些实施方案中，含半胱氨酸的五肽是半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(CDEVD)，或天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(DEVDC)。
在一些实施方案中，配体是含硫醇的化合物。在一些实施方案中，含硫醇的化合物是1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L(D)-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸,十二烷基硫醇、2-氨基乙硫醇(CSH)、3-巯基丙酸(MPA)、或4-巯基苯甲酸(p-MBA)。
本发明提供用于治疗脑缺血性中风的药物组合物。在一些实施方案中，受试者是人。在一些实施方案中，受试者是宠物动物，例如狗。
在一些实施方案中，药物组合物包含如上公开的配体结合的金团簇和药学上可接受的赋形剂。在一些实施方案中，赋形剂是磷酸盐缓冲溶液或生理盐水。
本发明提供上述公开的配体结合的金团簇在用于制造治疗脑缺血性中风的药物中的用途。
本发明提供了上述公开的配体结合的金团簇治疗受试者的脑缺血性中风的应用，或利用上述公开的配体结合的金团簇治疗受试者的脑缺血性中风的方法。在一些实施方案中，治疗方法包括向受试者施用药学上有效量的配体结合的金团簇。药学上有效量可通过常规体内研究确定。在一些实施方案中，配体结合的金团簇的药学上有效量为0.001毫克/kg/天、0.005毫克/kg/天、0.01毫克/kg/天、0.05毫克/kg/天、0.1毫克/kg/天、0.05毫克/kg/天、1毫克/kg/天、2毫克/kg/天、3毫克/kg/天、4毫克/kg/天、5毫克/kg/天、6毫克/kg/天、7毫克/kg/天、8毫克/kg/天、9毫克/kg/天、10毫克/kg/天、15毫克/kg/天、20毫克/kg/天、30毫克/kg/天、40毫克/kg/天、50毫克/kg/天、60毫克/kg/天、70毫克/kg/天、80毫克/kg/天、90毫克/kg/天或100毫克/kg/天。
提供以下实施例仅用于说明本发明的原理；它们决不是要限制本发明的范围。
实施例
实施例1、制备配体结合的金团簇
1.1将HAuCl4溶于甲醇、水、乙醇、正丙醇或乙酸乙酯中，得到溶液A，其中HAuCl4的浓度为0.01-0.03M；
1.2将配体溶解在溶剂中得到溶液B，其中配体的浓度为0.01～0.18M；配体包括，但不限于，L-半胱氨酸，D-半胱氨酸和其他半胱氨酸衍生物，如N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)、N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)，含半胱氨酸的寡肽及其衍生物，包括，但不限于，二肽，三肽，四肽，五肽和其他含有半胱氨酸的肽，例如L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸二肽(CR)，L(D)-精氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(RC)，L(D)-半胱氨酸L(D)-组氨酸(CH)，甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(GCR)，L(D)-脯氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(PCR)，L(D)-谷胱甘肽(GSH)，甘氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GSCR)，甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GCSR)，半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸五肽(CDEVD)和天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸五肽(DEVDC)，和其他含巯基化合物，如1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L(D)-脯氨酸，巯基乙酸，巯基乙醇，苯硫酚，D-3-巯基缬氨酸，十二烷基硫醇，2-氨基乙硫醇(CSH)，3-巯基丙酸(MPA)，和4-巯基苯甲酸(p-MBA)中的一种或多种；溶剂是甲醇，乙酸乙酯，水，乙醇，正丙醇，戊烷，甲酸，乙酸，乙醚，丙酮，苯甲醚，1-丙醇，2-丙醇，1-丁醇，2-丁醇，戊醇，乙酸丁酯，三丁基甲基醚，乙酸异丙酯，二甲基亚砜，甲酸乙酯，乙酸异丁酯，乙酸甲酯，2-甲基-1-丙醇和乙酸丙酯中的一种或多种；
1.3将溶液A和溶液B混合，使HAuCl4与配体的摩尔比为1：(0.01～100)，在冰浴中搅拌0.1-48h，加入0.025-0.8M NaBH4水、乙醇或甲醇溶液，继续在冰水浴中搅拌反应0.1-12h。NaBH4与配体的摩尔比为1：(0.01-100)；
1.4反应结束后，用MWCO 3K-30K超滤管以8000-17500r/min的速度离心反应液10-100min，得到不同平均粒径的配体结合的金团簇沉淀。不同MWCO的超滤管的过滤膜的孔直接决定了可以通过膜的配体结合的金团簇的尺寸。可以任选地省略该步骤；
1.5将在步骤(1.4)中得到的不同平均粒径的配体结合的金团簇沉淀溶于水中，置于透析袋中，室温下在水中透析1-7天；
1.6透析后冷冻干燥配体结合的金团簇12-24h，得到粉末状或絮凝剂物质，即配体结合的金团簇。
如所检测的，通过前述方法获得的粉末状或絮凝剂物质的粒度小于3nm(通常分布在0.5-2.6nm)。在520nm处没有明显的吸收峰。确定所获得的粉末或絮凝物是配体结合的金团簇。
实施例2、制备和鉴定用不同配体结合的金团簇
2.1制备L-NIBC结合的金团簇，即L-NIBC-AuCs
以配体L-NIBC为例，详细描述了制备和鉴定配体L-NIBC结合的金团簇。
2.1.1称取1.00g HAuCl4，将其溶于100mL甲醇中，得到0.03M溶液A；
2.1.2称取0.57g L-NIBC，将其溶于100mL冰醋酸(乙酸)中，得到0.03M溶液B；
2.1.3量取1mL溶液A，分别与0.5mL、1mL、2mL、3mL、4mL、或5mL溶液B混合(即HAuCl4与L-NIBC之间的摩尔比分别为1：0.5、1：1、1：2、1：3、1：4、1：5)，在冰浴中搅拌反应2h，当溶液从亮黄色变为无色时，快速加入1mL新制备的0.03M(通过称取11.3mg NaBH4并溶于10mL乙醇中制得)NaBH4乙醇溶液，在溶液变为深棕色后继续反应30分钟，并加入10mL丙酮终止反应。
2.1.4反应后，将反应溶液进行梯度离心，得到不同粒径的L-NIBC-AuCs粉末。具体方法：反应完成后，将反应液转移至MWCO为30K，体积为50mL的超滤管中，以10000r/min离心20min，将内管中的保留物溶于超纯水中，获得粒径约为2.6nm的粉末。然后，将外管中的混合溶液转移至体积为50mL，MWCO为10K的超滤管中，并以13,000r/min离心30分钟。将内管中的保留物溶解在超纯水中，得到粒径约为1.8nm的粉末。然后将外管中的混合溶液转移至体积为50mL，MWCO为3K的超滤管中，并以17,500r/min离心40分钟。将内管中的保留物溶解在超纯水中，得到粒径约为1.1nm的粉末。
2.1.5沉淀通过梯度离心得到的三种不同粒径的粉末，分别除去溶剂，用N2吹干粗产物，溶于5mL超纯水中，放入透析袋(MWCO为3KDa)，将透析袋放入2L超纯水中，每隔一天换水，透析7天，冷冻干燥后备用。
2.2鉴定L-NIBC-AuCs
对上面得到的粉末(L-NIBC-AuCs)进行鉴定实验。同时，配体L-NIBC修饰的金纳米粒子(L-NIBC-AuNPs)用作对照。配体为L-NIBC的金纳米粒子的制备方法参考文献(W.Yan,L.Xu,C.Xu,W.Ma,H.Kuang,L.Wang and N.A.Kotov,Journal of the American ChemicalSociety 2012,134,15114；X.Yuan,B.Zhang,Z.Luo,Q.Yao,D.T.Leong,N.Yan and J.Xie,Angewandte Chemie International Edition 2014,53,4623)。
2.2.1通过透射电子显微镜(TEM)观察形态
将测试粉末(L-NIBC-AuCs样品和L-NIBC-AuNPs样品)溶解在超纯水中至2mg/L作为样品，然后通过悬滴法制备测试样品。更具体地，将5μL样品滴在超薄碳膜上，自然挥发直至水滴消失，然后通过JEM-2100F STEM/EDS场发射高分辨率TEM观察样品的形态。
L-NIBC-AuNPs的四个TEM图像显示在图1的B幅，E幅，H幅和K幅中；L-NIBC-AuCs的三个TEM图像显示在图2的B幅，E幅和H幅中。
图2中的图像表明每个L-NIBC-AuCs样品具有均匀的粒径和良好的分散性，并且L-NIBC-AuCs的平均直径(指金核的直径)分别为1.1nm、1.8nm和2.6nm，与图2的C幅，F幅和I幅中的结果完全一致。相比之下，L-NIBC-AuNPs样品具有更大的粒径。它们的平均直径(指金核的直径)分别为3.6nm、6.0nm、10.1nm和18.2nm，与图1的C幅，F幅，I幅和L幅中的结果有很好地一致。
2.2.2紫外(UV)-可见(vis)吸收光谱
将测试粉末(L-NIBC-AuCs样品和L-NIBC-AuNPs样品)溶解在超纯水中直至浓度为10mg·L-1，并在室温下测量UV-vis吸收光谱。扫描范围为190-1100nm，样品池是标准石英比色皿，光程为1cm，参比池内充满超纯水。
具有不同尺寸的四种L-NIBC-AuNPs样品的UV-vis吸收光谱示于图1的A幅，D幅，G幅和J幅中，并且粒度的统计分布示于图1的C幅，F幅，I幅和L幅中；具有不同尺寸的三种L-NIBC-AuCs样品的UV-vis吸收光谱示于图2的A幅，D幅和G幅中，并且粒度的统计分布示于图2的C幅，F幅和I幅中。
图1表明，由于表面等离子体效应，L-NIBC-AuNPs在约520nm处具有吸收峰。吸收峰的位置与粒径有关。当粒径为3.6nm时，UV吸收峰出现在516nm处；当粒径为6.0nm时，UV吸收峰出现在517nm处；当粒径为10.1nm时，UV吸收峰出现在520nm处，当粒径为18.2nm时，吸收峰出现在523nm处。四个样品中没有一个在560nm以上具有任何吸收峰。
图2表明，在三种不同粒径的L-NIBC结合的金团簇样品的紫外吸收光谱中，520nm处的表面等离子体效应吸收峰消失，在560nm以上出现两个明显的吸收峰，吸收峰的位置随着金团簇的粒径略有差异。这是因为由于面心立方结构的坍塌，金团簇表现出类分子的性质，这导致金团簇的状态密度的不连续性、能级分裂、等离子共振效应的消失和在长波方向新的吸收峰的出现。可以得出结论，上面获得的三种不同粒径的粉末样品都是配体结合的金团簇。
2.2.3傅里叶变换红外光谱
红外光谱在Bruker制造的VERTEX80V型傅立叶变换红外光谱仪上采用固体粉末高真空全反射模式测定，扫描范围为4000-400cm-1，扫描64次。以L-NIBC-AuCs样品为例，测试样品为三种粒径不同的L-NIBC-AuCs干粉，对照样品纯净L-NIBC粉末。结果见图3。
图3为具有不同粒径的L-NIBC-AuCs的红外光谱。与纯L-NIBC(底部曲线)相比，不同粒径的L-NIBC-AuCs在2500-2600cm-1之间的S-H伸缩振动均完全消失，而仍观察到L-NIBC的其他特征峰。证明L-NIBC分子通过金硫键成功结合到金团簇表面。该图还显示配体结合的金团簇的红外光谱与其尺寸无关。
用上述类似的方法制备由其它配体结合的金团簇，只是溶液B的溶剂、HAuCl4与配体之间的进料比、反应时间和加入的NaBH4的量稍作调整，例如：当使用L-半胱氨酸、D-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)或N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)作为配体时，选择乙酸作为溶剂；当使用二肽CR、二肽RC或1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸作为配体时，选择水作为溶剂，依此类推；其他步骤类似，因此这里不再提供进一步的细节。
本发明通过上述方法制备并获得了一系列配体结合的金团簇。配体和制备方法的参数如表1所示。
表1.本发明不同配体结合的金团簇的制备参数
表1中列出的样品通过前述方法确认。11种不同配体结合的金团簇的特征示于图4(CR-AuCs)，图5(RC-AuCs)，图6(Cap-AuCs)(Cap表示1-[(2S)-2-甲基-3-巯基-1-氧代丙基]-L-脯氨酸)，图7(GSH-AuCs)，图8(D-NIBC-AuCs)，图9(L-Cys-AuCs)，图10(CSH-AuCs)，图11(MPA-AuCs)，图12(p-MBA-AuCs),图13(CDEVD-AuCs)，和图14(DEVDC-AuCs)。图4-图12显示UV光谱(A幅)，红外光谱(B幅)，TEM图像(C幅)和粒度分布(D幅)。图13和图14显示UV光谱(A幅)，TEM图像(B幅)和粒度分布(C幅)。
结果表明，用表1得到的不同配体结合的金团簇的直径均小于3nm。紫外光谱还显示在520±20nm处峰的消失，并且在其他位置出现吸收峰。该吸收峰的位置随配体和粒径以及结构的不同而有所变化，有的情况并不出现特殊的吸收峰，这主要是由于多种尺寸不同和结构不同的金团簇形成混合物，或者某些特殊金团簇使吸收峰的位置在常规紫外-可见吸收光谱测定范围之外。同时，傅里叶变换红外光谱也显示配体硫醇的红外吸收峰消失(图4-8中B幅的虚线之间)，而其他红外特征峰都保留，表明所有配体分子已成功与金原子结合形成了配体结合的金团簇，以及本发明成功地获得了用表1中列出的配体结合的金团簇。
实施例3脑缺血性中风动物模型试验
3.1测试样品
金团簇：
A1：L-NIBC配体结合的金团簇(L-NIBC-AuCs)，粒径分布范围为0.5-3.0nm；
A2：L-Cys配体结合的金团簇(L-Cys-AuCs)，粒径分布范围为0.5-3.0nm；
A3：L-NAC配体结合的金团簇(L-NAC-AuCs)，粒径分布范围为0.5-3.0nm；
A4：DEVDC配体结合的金团簇(DEVDC-AuCs)，粒径分布范围为0.5-3.0nm。
金纳米粒子：
B1：L-NIBC结合的金纳米粒子(L-NIBC-AuNPs)，粒径分布范围为6.1±1.5nm；
B2：L-NAC结合的金纳米粒子(L-NAC-AuNPs)，粒径分布范围为9.0±2.4nm。
所有测试样品的制备方法参照前述方法，略有改动；他们的质量通过了上述方法的鉴定。
3.2试验方法
3.2.1大鼠大脑中动脉梗塞模型(MCAO)建立及受试物给药
雄性SPF级Sprague Dawley(SD)大鼠(220-260g)购自上海斯莱克实验动物有限公司。所有大鼠在实验前适应环境7天。将大鼠随机分为14组(每组10只)，分别为假手术组，模型对照组，金团簇药物A1、A2、A3和A4的低(2mg/Kg大鼠体重)和高剂量组(10mg/Kg大鼠体重)，以及金纳米粒子B1和B2的低(2mg/Kg大鼠体重)和高剂量组(10mg/Kg大鼠体重)。实验当天，用10％水合氯醛(350mg/kg体重)麻醉大鼠。通过颈中线切口暴露右边颈总动脉，颈内动脉和颈外动脉。将栓线经颈外动脉(ECA)，插入颈内动脉(ICA)18mm±0.5mm，直到堵住MCA区域血流供应，使其发生脑梗死。1.5h后将栓线撤回ECA进口端，进行再灌注。采用血流仪分别测量手术前基础脑血流(CBF)和栓塞后的脑血流。CBF持续降低(rCBF≥70％)的动物被认为是大鼠大脑中动脉梗塞模型(Middle cerebral artery occlusion，MCAO)的建模成功。大鼠再灌注后，在0h、24h、48h、72h通过腹腔注射分别给予受试药物或溶媒(生理盐水)，在0h、24h、48h、72h、96h进行神经行为学评分。术后96h终止实验，大鼠安乐死后进行脑收集和TTC染色，脑片拍照，并计算脑梗死面积百分比。
3.2.2神经行为学评分
0分：与正常老鼠无异；1分：右前爪伸不直，头向对侧转；2分：在空旷地行走不连续转圈；3分：在空旷地行走连续转圈；4分，无意识行走，向一侧瘫倒；5分：死亡。
3.2.3梗死面积(TTC染色)
大鼠通过吸入二氧化碳安乐死，取脑放入脑槽进行冠状切片(2mm)，2％TTC在常温避光染色，拍照后用ImageJ分析梗死面积。梗死面积的百分比(％)＝(对侧半球面积-(同侧半球面积-梗死面积))/对侧半球面积×100％。
3.2.4统计学分析
采用Graph Pad Prism软件7.0(CA,US)进行统计分析。数据以平均值±标准误差表示，统计分析采用单因素方差分析Dunnett检验。P<0.05为差异有统计学意义。
3.3实验结果
3.3.1脑缺血区域脑血流
大鼠脑缺血区域脑血流降低70％(脑血流减少,rCBF≥70％)以上，视为MACO模型成功构建，除假手术组外，其余各组rCBF>70％，平均在80％左右，说明各组MACO模型均造模成功。
3.3.2各受试药物对大鼠神经行为学的影响
图15显示各组大鼠的神经行为学评分(每个时间点的柱状图中，从左至右分别为假手术组(空白)、模型对照组、A1低剂量组、A1高剂量组、A2低剂量组、A2高剂量组、A3低剂量组、A3高剂量组、A4低剂量组、A4高剂量组、B1低剂量组、B1高剂量组、B2低剂量组、B2高剂量组)。假手术组大鼠神经行为均正常，行为学评分为0分；模型对照组大鼠在术后0h、24h、48h、72h和96h，表现出严重的行为功能缺陷(相对于假手术组P<0.001，###)。与模型对照组比较，A1、A2、A3、A4低剂量组和高剂量组的神经行为学评分在术后24小时无显著性改善。在术后48h时，A1、A2、A3和A4低剂量组和高剂量组的神经行为学评分均开始下降，但无统计学差异(相对于模型对照组P>0.05)。在术后72h时，四种药物的神经行为学评分进一步下降，其中A1低剂量组、A1高剂量组和A2高剂量组呈现显著性差异(相对于模型对照组P<0.05，*)。在术后96h时，四种药物的低剂量组和高剂量组均出现显著性差异(相对于模型对照组P<0.05，*)。以上结果表明四种金团簇药物均能明显改善缺血性脑卒中所致的神经行为学功能缺陷，且这种作用表现出一定的剂量依赖性。
与模型组比较，金纳米粒子B1、B2低和高剂量组在术后24h、48h、72h和96h给药均未显著性改善MACO模型大鼠的神经行为学评分，显示金纳米粒子无法显著改善脑缺血性中风所致的行为学障碍。
3.3.3各药物对MACO模型大鼠脑梗死面积的影响
图16显示各组大鼠脑梗死面积的百分比(柱状图中，从左至右分别为假手术组(空白)、模型对照组、A1低剂量组、A1高剂量组、A2低剂量组、A2高剂量组、A3低剂量组、A3高剂量组、A4低剂量组、A4高剂量组、B1低剂量组、B1高剂量组、B2低剂量组、B2高剂量组)。假手术组大鼠脑组织正常，无梗死情况发生，梗死面积为0％。模型对照组梗死面积为44.7％±4.5％(相对于假手术组P<0.001，###)。与模型对照组相比，A1、A2、A3、A4低和高剂量组脑梗死面积百分比均有明显的下降，但低剂量组均未表现出显著性差异，而高剂量组则表现出显著性差异(相对于模型对照组P<0.05，*)。以A1为例，低剂量组梗死面积由44.7±4.5％降低至36.0±4.0％(相对于模型对照组P>0.05)，而高剂量组则降低至27.8±3.4％(相对于模型对照组P<0.05，*)。
图17展示了以A1为代表的金团簇药物给药和以B1为代表的金纳米粒子给药后MCAO大鼠大脑组织TTC染色的示例图像。图17中，(1)假手术组；(2)模型对照组；(3)A1低剂量组；(4)A1高剂量组；(5)B1低剂量组；(6)B1高剂量组。由图17可以看到，假手术组大鼠未发生脑梗死，而模型对照组发生大幅度脑梗死(右边白色部分)。A1药物低剂量给药后脑梗死面积有所减少(右边白色部分减少)，A1药物高剂量给药则大幅度减少了脑梗死面积(右面白色部分大幅度减少)，而B1低剂量和高剂量给药对脑梗死面积几乎无影响(右边白色部分没有任何缩小)。A2、A3和A4表现出与A1相似的显著减少梗死面积的效果，B2则与B1相似，对梗死面积的减少无作用。
其他配体结合的金团簇也具有同样治疗脑缺血性中风的效果，它们的效果会有所差别。这里不再详细描述它们。
实施例4脑出血性中风动物模型试验
4.1测试样品
L-Cys配体结合的金团簇(L-Cys-AuCs)，粒径分布范围为0.5-3.0nm；L-NIBC结合的金纳米粒子(L-NIBC-AuNPs)，粒径分布范围为6.1±1.5nm.
4.2试验方法和结果
将大鼠麻醉并放置在立体定向框架内。在第0天，在5分钟内以0.4μl/min的速度立体定向注射VII型胶原酶至右侧纹状体(坐标：吻端0.0mm，前囟(bregma)侧3.0mm，颅骨下5.5mm)。试验药物在第0天到第4天进行腹腔注射，剂量为10mg/kg大鼠体重。第3天测量运动量。第4天处死大鼠进行分析和组织化学染色。结果表明，测试的金团簇药物和金纳米粒子对脑出血性中风的效果相似，没有明显的治疗效果。
虽然已经参考特定实施方案描述了本发明，但是应当理解，实施方案是说明性的，并且本发明的范围不限于此。本发明的替代实施方案对于本发明所属领域的普通技术人员来说将变得显而易见。这样的替代实施方案被认为是包含在本发明的保护范围内。因此，本发明的范围由所附权利要求限定，并得到前述描述的支持。
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Claims (20)

1.配体结合的金团簇在治疗受试者脑缺血性中风中的用途，其中所述配体结合的金团簇包括：
金核；和
与所述金核结合的配体。
2.根据权利要求1所述的用途，其中所述金核的直径为0.5-3nm。
3.根据权利要求1所述的用途，其中所述金核的直径为0.5-2.6nm。
4.根据权利要求1所述的用途，其中所述配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物和其它含硫醇化合物中的一种。
5.根据权利要求4所述的用途，其中所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，所述D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
6.根据权利要求4所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽，其中所述含半胱氨酸的二肽选自L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸二肽(CR)、L(D)-精氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(RC)、L(D)-组氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(HC)和L(D)-半胱氨酸-L(D)-组氨酸二肽(CH)。
7.根据权利要求4所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的三肽，其中所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(GCR)、L(D)-脯氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(PCR)、L(D)-赖氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-脯氨酸三肽(KCP)和L(D)-谷胱甘肽(GSH)。
8.根据权利要求4所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的四肽，其中所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GCSR)。
9.根据权利要求4所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的五肽，其中所述含半胱氨酸的五肽选自半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(CDEVD)和天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(DEVDC)。
10.根据权利要求4所述的用途，其中所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L(D)-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、十二烷基硫醇、2-氨基乙硫醇(CSH)、3-巯基丙酸(MPA)和4-巯基苯甲酸(p-MBA)。
11.配体结合的金团簇在制备用于治疗受试者脑缺血性中风的药物中的用途，其中所述配体结合的金团簇包含：
金核；和
与所述金核结合的配体。
12.根据权利要求11所述的用途，其中所述金核的直径为0.5-3nm。
13.根据权利要求11所述的用途，其中所述金核的直径为0.5-2.6nm。
14.根据权利要求11所述的用途，其中所述配体是选自L-半胱氨酸及其衍生物、D-半胱氨酸及其衍生物、含半胱氨酸的寡肽及其衍生物和其它含硫醇化合物中的一种。
15.根据权利要求14所述的用途，其中所述L-半胱氨酸及其衍生物选自L-半胱氨酸、N-异丁酰基-L-半胱氨酸(L-NIBC)和N-乙酰基-L-半胱氨酸(L-NAC)，所述D-半胱氨酸及其衍生物选自D-半胱氨酸、N-异丁酰基-D-半胱氨酸(D-NIBC)和N-乙酰基-D-半胱氨酸(D-NAC)。
16.根据权利要求14所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的二肽，其中所述含半胱氨酸的二肽选自L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸二肽(CR)、L(D)-精氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(RC)、L(D)-组氨酸-L(D)-半胱氨酸二肽(HC)和L(D)-半胱氨酸-L(D)-组氨酸二肽(CH)。
17.根据权利要求14所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的三肽，其中所述含半胱氨酸的三肽选自甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(GCR)、L(D)-脯氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸三肽(PCR)、L(D)-赖氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-脯氨酸三肽(KCP)和L(D)-谷胱甘肽(GSH)。
18.根据权利要求14所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的四肽，其中所述含半胱氨酸的四肽选自甘氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GSCR)和甘氨酸-L(D)-半胱氨酸-L(D)-丝氨酸-L(D)-精氨酸四肽(GCSR)。
19.根据权利要求14所述的用途，其中所述含半胱氨酸的寡肽及其衍生物是含半胱氨酸的五肽，其中所述含半胱氨酸的五肽选自半胱氨酸-天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸(CDEVD)和天冬氨酸-谷氨酸-缬氨酸-天冬氨酸-半胱氨酸(DEVDC)。
20.根据权利要求14所述的用途，其中所述其他含硫醇的化合物选自1-[(2S)-2-甲基-3-硫醇-1-氧代丙基]-L(D)-脯氨酸、硫代乙醇酸、巯基乙醇、苯硫酚、D-3-巯基缬氨酸、N-(2-巯基丙酰基)-甘氨酸、十二烷基硫醇、2-氨基乙硫醇(CSH)、3-巯基丙酸(MPA)和4-巯基苯甲酸(p-MBA)。
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