KR20230088760A - 뇌졸중의 치료를 위한 금 클러스터, 조성물 및 방법 - Google Patents

뇌졸중의 치료를 위한 금 클러스터, 조성물 및 방법 Download PDF

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KR20230088760A
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Abstract

리간드-결합된 금 클러스터 및 리간드-결합된 금 클러스터를 포함하는 조성물은 뇌졸중 치료 및 뇌졸중 치료용 약제 제조에 사용된다. 뇌졸중을 치료하기 위한 방법.

Description

뇌졸중의 치료를 위한 금 클러스터, 조성물 및 방법
본 발명은 뇌 질환 치료의 기술 분야, 특히 리간드-결합된 금 클러스터(AuC), 리간드-결합된 AuC를 포함하는 조성물, 뇌졸중 치료용 약물(medications)을 제조하기 위한 리간드-결합된 AuC의 용도, 및 방법에 관한 것이다. 뇌졸중 치료를 위한 리간드-결합된 AuC 및 뇌졸중 치료를 위한 리간드-결합된 AuC 및 조성물을 사용하는 방법에 관한 것이다.
뇌졸중(stroke)은 혈관이 혈전에 의해 막히거나 파열을 겪게 될 때 발생한다. 뇌졸중에는 3가지 유형, 즉 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중, 및 일과성 허혈성 발작(TIA)이 있다.
뇌출혈성 뇌졸중은 혈관 파열로 인해 뇌로 가는 혈류가 막혀 유발된다. 일반적인 증상으로는 갑작스러운 쇠약, 신체 어느 부분의 마비, 말을 할 수 없음, 구토, 보행 곤란, 혼수 상태, 의식 상실, 뻣뻣한 목 및 어지러움(dizziness)이 있다. 이용가능한 특정 약물이 없다.
뇌 허혈 및 뇌성 허혈로도 알려진 뇌허혈성 뇌졸중은 인간에서 가장 널리 퍼진 병리 중 하나이며 사망 및 장애의 주요 원인이다. 뇌허혈성 뇌졸중은 전체 뇌졸중의 대략 87%를 차지한다. 뇌허혈성 뇌졸중은 뇌에 혈액을 공급하는 동맥에 혈전이나 플라크와 같은 막힘으로 유발되며, 이 막힘은 목이나 두개골에 나타나, 뇌로 가는 혈류와 산소를 감소시켜, 뇌 세포의 손상 또는 사멸을 일으키게 된다. 혈액 순환이 빨리 회복되지 않으면, 뇌 손상이 영구적일 수 있다.
뇌허혈성 뇌졸중의 특정 증상은 영향을 받은 뇌의 영역에 따라 다르다. 대부분의 허혈성 뇌졸중의 일반적인 증상으로는 시력 문제, 사지의 쇠약 또는 마비, 어지러움과 현기증(vertigo), 혼돈, 협응 상실, 및 한쪽 얼굴 처짐이 있다. 일단 증상이 시작되면, 가능한 한 빨리 치료를 받아 손상이 영구적으로 될 가능성을 줄이는 것이 중요하다.
뇌허혈성 뇌졸중에 사용할 수 있는 치료법은 매우 제한적이다. 뇌허혈성 뇌졸중의 임상적으로 이용가능한 주요 치료제는 혈전clots)을 분해하는 조직 플라스미노겐 활성화제(tPA)인데, tPA는 뇌졸중 발생 후 4시간 30분 이내에 정맥으로 제공되어야 효과를 볼 수 있다. 그러나, tPA는 출혈을 일으켜, 출혈성 뇌졸중, 뇌내 출혈, 및 최근 대수술이나 두부 손상 병력이 있는 환자는 tPA로 치료할 수 없다. 장기 치료에는 추가 혈전을 예방하기 위한 아스피린 또는 항응고제가 포함된다.
Amaniet 등은 OX26-PEG를 25 nm 콜로이드성 금 나노입자의 표면에 컨쥬게이션함으로써 형성된 OX26@GNP가 경색된 뇌 조직을 상당히 증가시켰고, 노출된(bare) GNP 및 PEG화된 GNP는 경색 부피에 영향을 미치지 않았음을 개시하였으며; 이들의 결과는 OX26@GNP가 뇌졸중 치료에 적합하지 않음을 제시했다.
Zheng 등은 OGD/R 손상 랫트 모델에서 20 nm Au-NPs가 세포 생존력을 증가시키고, 신경 세포 아폽토시스 및 산화 스트레스를 완화하고, 미토콘드리아 호흡을 개선한다고 밝혔다. 그러나 Zheng 등은 또한 5nm Au NP가 뇌졸중 치료에 적합하지 않은 반대 효과를 나타냄을 입증했다.
TIA는 일시적인 혈전으로 인해 유발된다. 일반적인 증상으로는 신체 한쪽의 쇠약, 무감각 또는 마비, 불분명하거나 왜곡된 말하기, 실명, 및 현기증이 있다. 이용가능한 특정 약물이 없다.
뇌졸중의 치료는 뇌허혈 또는 뇌출혈로 유발되는 뇌 신경 세포의 손상 또는 사멸로 인한 환자의 신경학적 기능장애 또는 사망을 피하거나 완화하기 위해 적시에 이루어져야 한다. 뇌출혈성 뇌졸중 및 TIA에 대한 특이적인 치료 약물은 없으며; 뇌허혈성 뇌졸중 치료를 위한 tPA와 같은 주요 약물은 출혈을 유발하며; 따라서 환자가 뇌허혈성 뇌졸중이지만 뇌출혈성 뇌졸중이 아닌 것으로 확정적으로 진단된 후에만 뇌허혈성 뇌졸중 치료를 위한 약물을 사용하도록 결정이 내려질 수 있다. 그러나, 이러한 확정적 진단 과정은 뇌허혈성 뇌졸중을 적시에 치료하는 데 소중한 시간을 소비하게 한다.
뇌졸중 치료를 위한 효과적인 방법 및 약물, 특히 뇌출혈성 뇌졸중 및 뇌허혈성 뇌졸중 둘 모두에 대해 치료 효과를 나타낼 수 있는 약물에 대한 필요성은 여전히 있다. 뇌출혈성 뇌졸중과 뇌허혈성 뇌졸중의 원인은 근본적으로 다르기 때문에, 상기 문헌에서의 모든 약물 개발은 뇌출혈성 뇌졸중 또는 뇌허혈성 뇌졸중 중 어느 하나와 관련되어 있으며; 따라서 환자가 뇌출혈 뇌졸중이든 뇌허혈성 뇌졸중이든 상관없이 뇌졸중인 환자를 치료할 수 있는 약물을 개발하는 것은 상상할 수 없는 도전이었거나 업계에서 특별히 금기시되어 왔을 수 있다.
본 발명은 대상체의 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터, 리간드-결합된 금 클러스터로 대상체의 뇌졸중을 치료하는 방법, 및 대상체의 뇌졸중 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터를 제공한다.
특정 실시형태에서, 리간드-결합된 금 클러스터는 대상체에서 뇌졸중의 치료를 위해 사용되며, 여기서 리간드-결합된 금 클러스터는 금 코어, 및 금 코어에 결합된 리간드를 포함하고; 여기서 뇌졸중은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중, 및 일과성 허혈성 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 금 코어는 0.5-3 nm 범위의 직경을 갖는다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형ㅌo에서, 금 코어는 0.5-2.6 nm 범위의 직경을 갖는다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 리간드는 L-시스테인 및 이의 유도체, D-시스테인 및 이의 유도체, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체, 및 기타 티올-함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, L-시스테인 및 이의 유도체는 L-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), 및 N-아세틸-L-시스테인(L-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되고, 그리고 D-시스테인 및 이의 유도체는 D-시스테인, N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 디펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L(D)-히스티딘-L(D)-시스테인 디펩티드(HC), 및 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 트리펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-리신-L(D)-시스테인-L(D)-프롤린 트리펩티드(KCP), 및 L(D)-글루타티온(GSH)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 테트라펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR), 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 펜타펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 펜타펩타이드는 시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산(CDEVD) 및 아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산-시스테인(DEVDC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터의 특정 실시형태에서, 기타 티올-함유 화합물은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신, 도데실 머캅탄, 2-아미노에탄티올(CSH), 3-머캅토프로피온산(MPA), 및 4-머캅토벤조산(p-MBA, 4-mercaptobenzoic acid)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
특정 실시형태에서, 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)는 대상체의 뇌졸중 치료를 위한 약제의 제조에 사용되며, 리간드-결합된 금 클러스터는 금 코어, 및 금 코어에 결합된 리간드를 포함하며; 여기서 뇌졸중은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중 및 일과성 허혈성 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 금 코어는 0.5-3 nm 범위의 직경을 갖는다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 금 코어는 0.5-2.6 nm 범위의 직경을 갖는다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 리간드는 L-시스테인 및 이의 유도체, D-시스테인 및 이의 유도체, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이의 유도체, 및 기타 티올-함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택된 것이다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, L-시스테인 및 이의 유도체는 L-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), 및 N-아세틸-L-시스테인(L-NAC)으로 이루어진 그룹에서 선택되고, D-시스테인 및 이의 유도체는 D-시스테인, N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC) 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 디펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L(D)-히스티딘-L(D)-시스테인 디펩티드(HC), 및 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 트리펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-리신-L(D)-시스테인-L(D)-프롤린 트리펩티드(KCP), 및 L(D)-글루타티온(GSH)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 테트라펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR), 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체는 시스테인-함유 펜타펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 펜타펩타이드는 시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산(CDEVD) 및 아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산-시스테인(DEVDC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)의 특정 실시형태에서, 기타 티올-함유 화합물은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신, 도데실 머캅탄, 2-아미노에탄티올(CSH), 3-머캅토프로피온산(MPA), 및 4-머캅토벤조산(p-MBA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 목적 및 이점은 첨부된 도면과 연계하여 바람직한 실시형태에 대한 이하의 상세한 설명으로부터 명백해질 것이다.
본 발명에 따른 바람직한 실시형태가 이제 도면을 참조하여 설명될 것이며, 도면에서 같은 참조 번호는 같은 요소를 나타낸다.
도 1은 입자 크기가 다른 리간드 L-NIBC-변형된 금 나노입자(L-NIBC-AuNP)의 자외선-가시광선(UV) 스펙트럼, 투과전자현미경(TEM) 이미지, 및 입자크기 분포도를 나타내는데; 도 1a는 3.6nm L-NIBC-AuNP의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 1b는 3.6nm L-NIBC-AuNP의 TEM 이미지를 나타내고; 도 1c는 3.6nm L-NIBC-AuNP의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내고; 도 1d는 6.0nm L-NIBC-AuNP의 UV 스펙트럼을 나타내고 6.0nm L-NIBC-AuNPs; 도 1e는 6.0nm L-NIBC-AuNP의 TEM 이미지를 나타내고; 도 1f는 6.0nm L-NIBC-AuNP의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내고; 도 1g는 10.1nm L-NIBC-AuNP의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 1h는 10.1nm L-NIBC-AuNP의 TEM 이미지를 나타내고; 도 1i는 10.1nm L-NIBC-AuNP의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내고; 도 1j는 18.2nm L-NIBC-AuNP의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 1k는 18.2nm L-NIBC-AuNP의 TEM 이미지를 나타내고; 도 1l은 18.2nm L-NIBC-AuNP의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 2는 입자 크기가 다른 리간드 L-NIBC-결합된 금 클러스터(L-NIBC-AuC)의 자외선 가시광선(UV) 스펙트럼, TEM 이미지, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 2a는 1.1nm L-NIBC-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 2b는 1.1nm L-NIBC-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 2c는 1.1nm L-NIBC-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내고; 도 2d는 1.8nm L-NIBC-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 2e는 1.8nm L-NIBC-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 2f는 1.8nm L-NIBC-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내고; 도 2g는 2.6nm L-NIBC-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 2h는 2.6nm L-NIBC-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 2i는 2.6nm L-NIBC-AuCs의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 3은 1.1nm, 1.8nm 및 2.6 L-NIBC-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타낸다.
도 4는 리간드 CR-결합된 금 클러스터(CR-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 4a는 CR-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 4b는 CR-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 4c는 CR-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 4d는 CR-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 5는 리간드 RC-결합된 금 클러스터(RC-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 5a는 RC-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 5b는 RC-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 5c는 RC-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 5d는 RC-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 6은 리간드 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린(즉, Cap)-결합된 금 클러스터(Cap-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포도를 나타내는데; 도 6a는 Cap-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 6b는 Cap-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 6c는 Cap-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 6d는 Cap-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 7은 리간드 GSH-결합된 금 클러스터(GSH-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 7a는 GSH-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 7b는 GSH-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 7c는 GSH-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 7d는 GSH-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 8은 리간드 D-NIBC-결합된 금 클러스터(D-NIBC-AuC)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 8a는 D-NIBC-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 8b는 D-NIBC-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 8c는 D-NIBC-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 8d는 D-NIBC-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 9는 리간드 L-시스테인-결합된 금 클러스터(L-Cys-AuCs)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포도를 나타내는데; 도 9a는 L-Cys-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 9b는 L-Cys-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 9c는 L-Cys-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 9d는 L-Cys-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 10은 리간드 2-아미노에탄티올-결합된 금 클러스터(CSH-AuCs)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 10a는 CSH-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 10b는 CSH-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 10c는 CSH-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 10d는 CSH-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 11은 리간드 3-머캅토프로피온산-결합된 금 클러스터(MPA-AuCs)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 11a는 MPA-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 11b는 MPA-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 11c는 MPA-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 11d는 MPA-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 12는 리간드 4-머캅토벤조산-결합된 금 클러스터(p-MBA-AuCs)의 UV, 적외선, TEM, 및 입자 크기 분포 다이어그램을 나타내는데; 도 12a는 p-MBA-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 12b는 p-MBA-AuC의 적외선 스펙트럼을 나타내고; 도 12c는 p-MBA-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 12d는 p-MBA-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 13은 리간드 4-시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산(CDEVD)-결합된 금 클러스터(CDEVD-AuCs)의 UV, TEM, 및 입자 크기 분포 다이아그램을 나타내는데; 도 13a는 CDEVD-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 13b는 CDEVD-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 13c는 CDEVD-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 14는 리간드 4-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산-시스테인(DEVDC)-결합된 금 클러스터(DEVDC-AuCs)의 UV, TEM, 및 입자 크기 분포 다이아그램을 나타내는데; 도 14a는 DEVDC-AuC의 UV 스펙트럼을 나타내고; 도 14b는 DEVDC-AuC의 TEM 이미지를 나타내고; 도 14c는 DEVDC-AuC의 입자 크기 분포 다이어그램을 나타낸다.
도 15는 각 그룹 랫트의 신경학적 행동 점수를 나타낸 것이다(각 시점의 히스토그램에서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로 모의(sham) 수술 그룹(블랭크), 모델 대조 그룹, A1 저용량 그룹, A1 고용량 그룹, A2 저용량 그룹, A2 고용량 그룹, A3 저용량 그룹, A3 고용량 그룹, A4 저용량 그룹, A4 고용량 그룹, B1 저용량 그룹, B1 고용량 그룹, B2 저용량 그룹 및 B2 고용량 그룹).
도 16은 각 그룹의 랫트의 뇌경색 영역의 백분율을 나타낸다(히스토그램에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로 모의 수술 그룹(블랭크), 모델 대조 그룹, A1 저용량 그룹, A1 고용량 그룹, A2 저용량 그룹, A2 고용량 그룹, A3 저용량 그룹, A3 고용량 그룹, A4 저용량 그룹, A4 고용량 그룹, B1 저용량 그룹, B1 고용량 그룹, B2 저용량 그룹 및 B2 고용량 그룹).
도 17은 금 클러스터 약물 및 금 나노입자를 투여한 후 MCAO 랫트에서 뇌 조직의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타내는데, 도 17a는 모의 수술 그룹의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타내고; 도 17b는 모델 대조 그룹의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타내고; 도 17c는 A1 저용량 그룹의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타내고; 도 17d는 A1 고용량 그룹의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타내고; 도 17e는 B1 저용량 그룹의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타내고; 도 17f는 B1 고용량 그룹의 예시적인 TTC 염색 이미지를 나타낸다.
도 18은 모델링 완료 후 상이한 시간에 따른 mNSS 신경 기능 점수의 결과를 나타내며, 여기서 NC: 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹; BL: 약물 B 저용량 투여 그룹; BH: 약물 B 고용량 투여 그룹이다. 도 18a는 모델링 12시간 후 mNSS 신경학적 기능 점수를 나타내고; 도 18b는 모델링 후 1일차 mNSS 신경학적 기능 점수를 나타내고; 도 18c는 모델링 후 2일차 mNSS 신경학적 기능 점수를 나타내고; 도 18d는 모델링 후 4일차 mNSS 신경학적 기능 점수를 나타내고; 도 18e는 모델링 후 7일차 mNSS 신경학적 기능 점수를 나타낸다. ***: IVH 그룹 대비, P<0.001.
도 19는 에반스 블루 염색(Evans Blue Staining)에 의한 혈액-뇌 장벽(BBB)의 투과성 측정에서 모든 그룹의 랫트 뇌 조직 균질액의 상층액에서 에반스 블루의 함량을 나타내며, 여기서 NC: 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹이다. *: IVH 그룹 랫트 대비, P<0.05; **: IVH 그룹 랫트 대비, P<0.01; ***: IVH 그룹 랫트 대비 P<0.001.
도 20은 건조/습윤(dry/wet) 중량법으로 측정한 랫트 뇌 조직의 수분 함량을 나타내며, 여기서 NC: 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹이다. *: IVH 그룹 랫트 대비, P<0.05; **: IVH 그룹 랫트 대비, P<0.01; ***: IVH 그룹 랫트 대비, P<0.001.
도 21은 상이한 그룹의 뇌 조직의 예시적인 H&E 염색 이미지를 나타낸다. 도 21a: NC 그룹; 도 21b: SHAM 그룹; 도 21c: IVH 그룹; 도 21d: AL 그룹; 도 21e: AH 그룹.
도 22는 랫트 뇌 조직의 iNOS 면역형광 염색의 예시적인 이미지를 보여주며; 도 22a: NC 그룹; 도 22b: SHAM 그룹; 도 22c: IVH 그룹; 도 22d: AL 그룹; 도 22e: AH 그룹이다.
도 23은 WB 실험에서 각 그룹의 랫트의 뇌 조직에서 MMP9 단백질의 발현을 나타내며; 여기서 NC는 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹이다. 도 23a는 MMP9 단백질 밴드가 6개의 병렬 샘플에서 검출되었음을 보여주며; 도 23b는 MMP9 단백질의 상대적인 단백질 발현을 나타낸다(참조로서 GAPDH). IVH 그룹 대비, *, P<0.05.
도 24는 각 그룹의 랫트의 뇌 조직에서 MDA 수준을 나타내며, 여기서 NC: 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹이다. ***: IVH 그룹 대비, P<0.001; **: IVH 그룹 대비, P<0.01.
도 25는 각 그룹의 랫트의 뇌 조직에서 SOD 수준을 보여주며, 여기서 NC: 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹이다. ***: IVH 그룹 대비, P<0.001.
도 26은 뇌 조직의 초박(ultra-thin) 절편에 대한 투과전자현미경 검사 결과를 보여준다. 도 26a: NC 그룹; 도 26b: SHAM 그룹; 도 26c: IVH 그룹; 도 26d: AL 그룹; 도 26e: AH 그룹.
본 발명은 본 발명의 특정 실시형태에 대한 이하의 상세한 설명을 참조하여 더 쉽게 이해될 수 있다.
본 출원 전체에 걸쳐, 간행물이 참조되는 경우, 이들 간행물의 개시는 본 발명이 속하는 최신 기술을 보다 완전하게 설명하기 위해 그 전문이 본 명세서에 참조로 통합된다.
본 명세서에서 사용되는 "투여(administering)"는 경구("po") 투여, 좌약으로서의 투여, 국소 접촉, 정맥내("iv"), 복강내("ip"), 근육내("im"), 병소내, 해마내, 뇌실내, 비강내 또는 피하("sc") 투여, 또는 서방출(slow-release) 장치, 예를 들어, 미니-삼투압 펌프 또는 분해성 임플란트의 대상체로의 이식을 의미한다. 투여는 비경구 및 경점막(예를 들어, 경구, 비강, 질, 직장, 또는 경피)을 포함하는 임의의 경로로 이루어진다. 비경구 투여는, 예를 들어, 정맥내, 근육내, 세동맥내(intra-arteriole), 진피내, 피하, 복강내, 심실내, 및 두개내 투여를 포함한다. 다른 전달 방식은 리포솜 제형, 정맥내 주입, 경피 패치 등의 사용을 포함하지만 이로만 제한되는 것은 아니다.
용어 "전신 투여(systemic administration)" 및 "전신적으로 투여되는(systemically administered)"은, 화합물 또는 조성물이, 순환계를 통해, 약제학적 작용의 표적 부위를 포함하는 신체 부위에 전달되도록 화합물 또는 조성물을 포유동물에게 투여하는 방법을 지칭한다. 전신 투여는 경구, 비강내, 직장 및 비경구(즉, 근육내, 정맥내, 동맥내, 경피 및 피하와 같은, 소화관을 통하는 것 이외의 것) 투여를 포함하나 이로만 제한되는 것은 아니며, 단 본 명세서에 사용된 바와 같이, 전신 투여는 척수강내 주사 및 두개내 투여와 같은 순환계를 통하는 것 이외의 수단에 의한 뇌 영역으로의 직접적인 투여를 포함하지 않는다.
본 명세서에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료하는(treating)" 및 "치료(treatment)"는 이 용어가 적용되는 질환 또는 상태, 또는 그러한 질환 또는 상태의 하나 이상의 증상의 개시를 지연시키거나, 이의 진행을 지연시키거나 역전시키거나, 또는 이를 완화시키거나 예방하는 것을 지칭한다.
용어 "환자(patient)", "대상체(subject)" 또는 "개체(individual)"는 상호교환적으로 포유동물, 예를 들어, 영장류(예를 들어, 마카크, 혈거동물(pan troglodyte), 퐁고), 길들여진 포유동물(예를 들어, 고양이과, 개과), 농업용 포유동물(예를 들어, 소, 양, 돼지, 말) 및 실험용 포유동물 또는 설치류(예를 들어, 라투스, 뮤린, 토끼류(lagomorpha), 햄스터, 기니피그)를 포함하는, 인간 또는 비안간 포유동물을 지칭한다.
금 클러스터(AuC)는 금 원자와 금 나노 입자 사이에 존재하는 특별한 형태의 금이다. AuC는 3 nm 보다 작은 크기를 갖고, 단지 수개 내지 수백 개의 금 원자로 구성되며, 이는 금 나노 입자의 면심 입방 적층 구조의 붕괴를 야기한다. 결과적으로, AuC는 금 나노입자의 연속적 또는 준연속적 에너지 준위와 달리 뚜렷한 HOMO-LUMO 갭을 가진 분자-유사 특정 전자 구조(molecule-like discrete electronic structures)를 나타낸다. 이것은 표면 플라즈몬 공명 효과 및 통상적인 금 나노 입자가 보유한 uv-vis 스펙트럼에서의 상응하는 플라즈몬 공명 흡수 밴드(520±20 nm)의 소실을 야기한다.
본 발명은 리간드-결합된 AuC를 제공한다.
특정 실시형태에서, 리간드-결합된 AuC는 리간드 및 금 코어를 포함하고, 여기서 리간드는 금 코어에 결합된다. 리간드가 금핵과 결합한다는 것은 리간드가 공유결합, 수소결합, 정전기력, 소수력, 반데르발스 힘 등을 통해 금 코어와 용액 내 안정한 착물(stable-in-solution complexes)을 형성하는 것을 의미한다. 특정 실시형태에서, 금 코어의 직경은 0.5 내지 3 nm 범위이다. 특정 실시형태에서, 금 코어의 직경은 0.5 내지 2.6 nm의 범위에 있다.
특정 실시형태에서, 리간드-결합된 AuC의 리간드는 티올-함유 화합물 또는 올리고펩티드이다. 특정 실시형태에서, 리간드는 금 코어에 결합하여 Au-S 결합을 통해 리간드-결합된 AuC를 형성한다.
특정 실시형태에서, 리간드는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, L-시스테인, D-시스테인, 또는 시스테인 유도체를 포함한다. 특정 실시형태에서, 시스테인 유도체는 N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), N-아세틸-L-시스테인(L-NAC), 또는 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)이다.
특정 실시형태에서, 리간드는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이의 유도체이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 디펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), 또는 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 트리펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), 또는 L(D)-글루타티온(GSH)이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 테트라펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR) 또는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 올리고펩티드는 시스테인-함유 펜타펩티드이다. 특정 실시형태에서, 시스테인-함유 펜타펩티드는 시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산(CDEVD) 또는 아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산-시스테인(DEVDC)이다.
특정 실시형태에서, 리간드는 티올 함유 화합물이다. 특정 실시형태에서, 티올 함유 화합물은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, 도데실 머캅탄, 2-아미노에탄티올(CSH), 3-머캅토프로피온산(MPA) 또는 4-머캅토벤조산(p-MBA)이다.
본 발명은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중, 및 일과성 허혈 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 뇌졸중 치료용 약제학적 조성물을 제공한다. 특정 실시형태에서, 대상체는 인간이다. 특정 실시형태에서, 대상체는 개와 같은 애완동물이다.
특정 실시형태에서, 약제학적 조성물은 상기 개시된 바와 같은 리간드-결합된 AuC 및 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함한다. 특정 실시형태에서, 부형제는 포스페이트-완충 용액, 또는 생리 식염수이다.
본 발명은 대상체에서 뇌졸중의 치료를 위한 약물을 제조하기 위한 상기 개시된 리간드-결합된 AuC의 용도를 제공하며, 여기서 뇌졸중은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중, 및 일과성 허혈성 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.
본 발명은 대상체에서 뇌성 뇌졸중을 치료하기 위한 상기 개시된 리간드-결합된 AuC의 용도 또는 상기 개시된 리간드-결합된 AuC를 사용하여 대상체에서 뇌성 뇌졸중을 치료하는 방법을 제공하며, 여기서 뇌성 뇌졸중은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중 및 일과성 허혈성 발작(TIA)으로 구성된 군으로부터 선택된다. 특정 실시형태에서, 치료 방법은 약제학적 유효량의 리간드-결합된 AuC를 대상체에게 투여하는 단계를 포함한다. 약제학적 유효량은 정규의 생체내(in vivo) 연구에 의해 확인할 수 있다. 특정 실시형태에서, 리간드-결합된 AuC의 치료적 유효량은 적어도 0.001 mg/kg/일, 0.005 mg/kg/일, 0.01 mg/kg/일, 0.05 mg/kg/일, 0.1 mg/kg/일, 0.5 mg/kg/일, 1 mg/kg/일, 2 mg/kg/일, 3 mg/kg/일, 4 mg/kg/일, 5 mg/kg/일, 6 mg/kg/일, 7 mg/kg/일, 8 mg/kg/일, 9 mg/kg/일, 10 mg/kg/일, 15 mg/kg/일, 20 mg/kg/일, 30 mg/kg/일, 40 mg/kg/일, 50 mg/kg/일, 60 mg/kg/일, 70 mg/kg/일, 80 mg/kg/일, 또는 100 mg/kg/일의 투여량(dosage)이다.
이하의 실시예는 본 발명의 원리를 설명하기 위한 목적으로만 제공되며; 이들은 결코 본 발명의 범위를 제한하도록 의도되지 않는다.
실시형태
실시형태 1. 리간드-결합된 AuC의 준비
1.1 HAuCl4를 메탄올, 물, 에탄올, n-프로판올, 또는 에틸아세테이트에 용해시켜 HAuCl4 농도가 0.01 내지 0.03 M인 용액 A를 얻음;
1.2 리간드를 용매에 용해시켜 리간드의 농도가 0.01 내지 0.18 M인 용액 B를 얻음; 리간드는, 이로만 제한되는 것은 아니지만, L-시스테인, D-시스테인 및 기타 시스테인 유도체, 예컨대 N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), N-아세틸-L-시스테인(L-NAC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC), 시스테인-함유 올리고펩티드 및 디펩티드, 트리펩티드, 테트라펩티드 및 시스테인을 함유하는 기타 펩티드를 포함하나 이에 제한되지 않는 이들의 유도체, 예컨대 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L-시스테인 L-히스티딘(CH), 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-글루타티온(GSH), 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR) 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR), 시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산 펜타펩티드(CDEVD) 및 아스파르트산-글루타민산-발린-아스파르트산-시스테인 펜타펩티드(DEVDC), 및 기타 티올-함유 화합물, 예컨대 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, 도데실 메르캅탄, 2-아미노에탄티올(CSH), 3-머캅토프로피온산(MPA) 및 4-머캅토벤조산(p-MBA) 중 하나 이상,을 포함하고; 용매는 메탄올, 에틸 아세테이트, 물, 에탄올, n-프로판올, 펜탄, 포름산, 아세트산, 디에틸 에테르, 아세톤, 아니솔, 1-프로판올, 2-프로판올, 1-부탄올, 2-부탄올, 펜탄올, 부틸 아세테이트, 트리부틸 메틸 에테르, 이소프로필 아세테이트, 디메틸 술폭시드, 에틸 포르메이트, 이소부틸 아세테이트, 메틸 아세테이트, 2-메틸-1-프로판올 및 프로필 아세테이트 중 1종 이상임;
1.3 용액 A와 용액 B를 HAuCl4와 리간드의 몰비가 1:(0.01~100)이 되도록 혼합하고, 그런 다음 빙욕으로 0.1 내지 48시간 동안 교반하면서, 0.025 내지 0.8M NaBH4 물, 에탄올 또는 메탄올 용액을 첨가하고, 계속하여 빙수욕에서 교반하고 0.1 내지 12시간 동안 반응시킴. NaBH4와 리간드의 몰비는 1:(0.01~100)임;
1.4 MWCO 3K 내지 30K 한외여과 튜브를 사용하여 반응 종료 후 10 내지 100분 동안 구배로 반응 용액을 8000 내지 17500 r/min의 속도로 원심분리하여 다양한 평균 입자 크기의 리간드-결합된 AuC 침전물을 얻음. 다양안 MWCO의 한외여과 튜브용 여과막의 구멍은 막을 통과할 수 있는 리간드-결합된 AuC의 크기를 직접적으로 결정함. 이 단계는 선택적으로 생략할 수 있음;
1.5 단계(1.4)에서 얻은 서로 다른 평균 입자 크기의 리간드-결합된 AuC 침전물을 물에 녹여, 투석백에 담아 실온의 물에서 1 내지 7일 동안 투석함;
1.6 투석 후 리간드-결합된 AuC를 12 내지 24시간 동안 동결 건조하여 분말 또는 응집 물질, 즉 리간드-결합된 AuC를 얻음.
검출된 바와 같이, 전술한 방법에 의해 수득된 분말 또는 응집(flocculant) 물질의 입자 크기는 3 nm보다 작다(일반적으로 0.5 내지 2.6 nm로 분포함). 520 nm에서 명백한 흡수 피크를 나타내지 않는다. 얻어진 분말 또는 응집물질(floc)은 리간드-결합된 AuC인 것으로 결정된다.
실시형태 2. 다른 리간드와 결합된 AuC의 제조 및 특성규명
2.1 L-NIBC 결합 AuC, 즉 L-NIBC-AuC의 제조
리간드 L-NIBC를 예로 들어, 리간드 L-NIBC와 결합된 AuC의 제조 및 확인을 상세하게 설명한다.
2.1.1 HAuCl4 1.00g을 계량하고 메탄올 100 ㎖에 용해시켜 0.03M 용액 A를 얻음;
2.1.2 L-NIBC 0.57g을 계량하고 빙초산(아세트산) 100 ㎖에 용해시켜 0.03M 용액 B를 얻음;
2.1.3 용액 A 1 ㎖를 측정하고, 각각 용액 B 0.5 ㎖, 1 ㎖, 2 ㎖, 3 ㎖, 4 ㎖, 또는 5 ㎖와 혼합하고(즉, HAuCl4와 L-NIBC의 몰비는 각각 1:0.5, 1:1, 1:2, 1:3, 1:4, 1:5임), 빙욕에서 2시간 동안 교반하면서 반응시키고, 용액이 담황색에서 무색이 되면, 새로 조제한 0.03 M NaBH4 에탄올 용액(11.3 ㎎의 NaBH4를 계량하여 10 ㎖의 에탄올 용액에 용해시켜 조제함) 1 ㎖를 재빨리 첨가하고, 용액이 암갈색으로 된 후 30분간 반응을 계속하고, 아세톤 10 ㎖를 첨가하여 반응을 종결시킴.
2.1.4 반응 후, 반응 용액을 구배 원심분리에 적용하여 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC 분말을 얻음. 구체적인 방법: 반응 종료 후 반응 용액을 MWCO 30K, 부피 50 ㎖의 한외여과 튜브에 옮겨 10000 r/min의 속도로 20분간 원심분리하고, 안쪽 튜브 내의 잔류물을 초순수에 녹여 약 2.6 nm의 입자 크기를 갖는 분말을 얻음. 그런 다음, 바깥쪽 튜브의 혼합 용액을 부피가 50 ㎖이고 MWCO가 10K인 한외여과 튜브로 옮기고 13,000 r/min의 속도로 30분간 원심분리함. 안쪽 튜브의 잔류물을 초순수에 용해하여 약 1.8 nm의 입자 크기를 갖는 분말을 얻음. 그런 다음, 외부 튜브의 혼합 용액을 부피가 50 ㎖이고 MWCO가 3K인 한외여과 튜브로 옮기고 17,500 r/min의 속도로 40분간 원심분리함. 내부 튜브의 잔류물을 초순수에 녹여 입자크기가 약 1.1 nm인 분말을 얻음.
2.1.5 구배 원심분리에 의해 얻은 3가지 입자 크기의 분말을 각각 침전시키고 용매를 각각 제거하고 조 생성물에 N2를 취입하여 건조시키고, 초순수 5 mL에 용해시키고, 투석 백(MWCO는 3KDa)에 넣고 2L의 초순수에 투석백을 넣고, 격일로 물을 갈아주고, 7일 동안 투석하고, 동결건조시키고 추후 사용을 위해 보관함.
2.2 L-NIBC-AuC의 특성규명
앞에서 얻은 분말(L-NIBC-AuCs)에 대해 특성규명 실험을 수행했다. 한편, 대조 그룹으로 리간드 L-NIBC-변형된 금 나노입자(L-NIBC-AuNPs)를 사용했다. 리간드가 L-NIBC인 금 나노입자 제조 방법은 참고문헌(W. Yan, L. Xu, C. Xu, W. Ma, H. Kuang, L. Wang and N. A. Kotov, Journal of the American Chemical Society 2012, 134, 15114; X. Yuan, B. Zhang, Z. Luo, Q. Yao, D. T. Leong, N. Yan and J. Xie, Angewandte Chemie International Edition 2014, 53, 4623)을 참조했다.
2.2.1 투과전자현미경(TEM)에 의한 형태학 관찰
테스트 분말(L-NIBC-AuCs 샘플 및 L-NIBC-AuNPs 샘플)을 샘플로 초순수에 2 ㎎/L이 되도록 용해시킨 후, 적하법(drop method)을 수행하여 시료를 제조했다. 보다 구체적으로, 5 ㎕의 샘플을 초박형 탄소 필름에 적하하고, 물방울이 사라질 때까지 자연적으로 휘발시킨 후, JEM-2100F STEM/EDS 전계 방출 고분해능 TEM으로 샘플의 형태를 관찰했다.
L-NIBC-AuNP의 4개의 TEM 이미지는 도 1의 도 1b, 도 1e, 도 1h 및 도 1k에 나타나 있으며; L-NIBC-AuC의 3가지 TEM 이미지는 도 2의 도 2b, 도 2e 및 도 2h에 나타나 있다.
도 2의 이미지는 각각의 L-NIBC-AuC 샘플이 균일한 입자 크기와 양호한 분산성을 나타내며, L-NIBC-AuC의 평균 직경(금 코어 직경 참조)이, 각각, 1.1 nm, 1.8 nm, 및 2.6 nm임을 나타내며, 이는 도 2의 도 2c, 도 2f, 및 도 2i의 결과와 잘 일치한다. 대조적으로, L-NIBC-AuNP 샘플은 더 큰 입자 크기를 갖는다. 이들의 평균 직경(금 코어의 직경 참조)은 각각 3.6 nm, 6.0 nm, 10.1 nm 및 18.2 nm이며, 이는 도 1의 도 1c, 도 1f, 도 1i, 및 도 1l의 결과와 잘 일치한다.
2.2.2 자외선(UV)-가시(vis) 흡수 스펙트럼
테스트 분말(L-NIBC-AuCs 샘플 및 L-NIBC-AuNPs 샘플)을 초순수에 농도가 10 mg·L-1이 될 때까지 용해시키고 실온에서 UV-vis 흡수 스펙트럼을 측정했다. 스캐닝 범위는 190-1100nm이고, 샘플 셀은 광경로가 1cm인 표준 석영 큐벳이었고, 기준 셀을 초순수로 채웠다.
크기가 다른 4개의 L-NIBC-AuNP 샘플의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 도 1의 도 1a, 도 1d, 도 1g, 및 도 1j에 나타나 있고, 입자 크기의 통계적 분포는 도 1의 도 1c, 도 1f, 도 1i, 및 도 1l에 나타나 있고; 크기가 다른 3개의 L-NIBC-AuC 샘플의 UV-vis 흡수 스펙트럼은 도 2의 도 2a, 도 2d, 및 도 2g에 나타나 있으며, 입자 크기의 통계적 분포는 도 2의 도 2c, 도 2f, 및 도 2i에 나타나 있다.
도 1은 표면 플라즈몬 효과로 인해 L-NIBC-AuNPs가 약 520 nm에서 흡수 피크를 가짐을 나타낸다. 흡수 피크의 위치는 입자 크기와 관련이 있다. 입자 크기가 3.6 nm일 때, UV 흡수 피크는 516 nm에서 나타나며; 입자 크기가 6.0 nm일 때, UV 흡수 피크는 517 nm에서 나타나며; 입자 크기가 10.1 nm일 때, UV 흡수 피크가 520 nm에서 나타나고, 입자 크기가 18.2 nm일 때, 흡수 피크가 523 nm에서 나타난다. 4개의 샘플 중 어느 것도 560 nm 이상의 흡수 피크를 나타내지 않는다.
도 2는 입자 크기가 다른 3개의 L-NIBC-AuC 샘플의 UV 흡수 스펙트럼에서, 520 nm에서 표면 플라즈몬 효과 흡수 피크가 사라지고, 560 nm 이상에서 두 개의 뚜렷한 흡수 피크가 나타나며, 흡수 피크의 위치는 AuC의 입자 크기에 따라 약간 다르다는 것을 보여준다. 이것은 AuC가 면심입방구조의 붕괴로 인해 분자-유사 특성을 나타내기 때문이며, 이는 AuC의 상태 밀도의 불연속성, 에너지 준위 분할, 플라즈몬 공명 효과의 소멸 및 장파 방향에서 새로운 흡수 피크의 출현을 야기한다. 위에서 얻은 서로 다른 입자 크기의 3가지 분말 샘플은 모두 리간드-결합된 AuC라는 결론을 내릴 수 있다.
2.2.3 푸리에 변환 적외선 분광법
적외선 스펙트럼을 고체 분말 고진공 전반사 모드에서 Bruker에 의해 제조된 VERTEX80V 푸리에 변환 적외선 분광계로 측정했다. 스캐닝 범위는 4000 내지 400 cm-1이고 스캔 횟수는 64회이다. L-NIBC-AuC 샘플을 예로 들어 설명하면, 테스트 샘플은 3가지 다른 입자 크기를 가진 L-NIBC-AuC 건조 분말이었고 대조 그룹 샘플은 순수한 L-NIBC 분말이었다. 그 결과는 도 3에 제시되어 있다.
도 3은 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC의 적외선 스펙트럼을 보여준다. 순수한 L-NIBC(하단 곡선)와 비교하여, 입자 크기가 다른 L-NIBC-AuC의 S-H 신축 진동은 모두 2500 내지 2600 cm-1에서 완전히 사라졌지만, L-NIBC의 다른 특징적인 피크는 여전히 관찰되었으며, 이는 L-NIBC 분자가 Au-S 결합을 통해 AuC의 표면에 성공적으로 결합되었음을 입증한다. 이 도면은 또한 리간드-결합된 AuC의 적외선 스펙트럼이 크기와 관련이 없음을 보여준다.
용액 B의 용매, HAuCl4와 리간드의 공급 비율, 반응 시간 및 NaBH4의 첨가량을 약간 조절한 것을 제외하고는, 상기 방법과 유사한 방법으로 다른 리간드와 결합된 AuC를 제조했다. 예를 들어: L-시스테인, D-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC) 또는 N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC)을 리간드로 사용한 경우, 아세트산을 용매로 선택하고; 디펩티드 CR, 디펩티드 RC 또는 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린을 리간드로 사용하는 경우, 물을 용매로 선택하는 등; 다른 단계는 유사하므로, 여기에 세부사항을 추가로 제공하지는 않는다.
본 발명은 전술한 방법으로 일련의 리간드-결합된 AuC를 제조하여 얻었다. 리간드 및 제조 공정의 파라미터는 표 1에 제시되어 있다.
본 발명에서의 다양한 리간드와 결합된 AuC의 제조 파라미터
리간드 파라미터
용액 B에 사용된 용매 HAuCl4와 리간드 간의 공급 비 NaBH4 첨가 전 교반하의 빙욕에서의 반응 시간 HAuCl4와 NaBH4 간의 몰비 NaBH4 첨가 후 교반하의 빙욕에서의 반응 시간
1 L-시스테인 아세트산 1:3 2h 1:2 0.5h
2 D-시스테인 아세트산 1:3 2h 1:2 0.5h
3 N-아세틸-L-시스테인 에탄올 1:4 1h 1:1 0.5h
4 N-아세틸-D-시스테인 에탄올 1:4 1h 1:1 0.5h
5 L-NIBC 물 1:4 0.5h 1:2 0.5h
6 D-NIBC 물 1:4 0.5h 1:2 0.5h
7 기타 시스테인 유도체 가용성 용매 1: (0.1~100) 0.5h~24h 1: (0.1~100) 0.1~24h
8 CR 물 1:4 22h 2:1 0.5h
9 RC 물 1:4 20h 2:1 0.5h
10 HC 물 1:3 12h 1:2 2h
11 CH 에탄올 1:4 16h 1:3 3h
12 GSH 물 1:2 12h 1:1 3h
13 KCP 물 1:3 15h 1:2 1h
14 PCR 물 1:4 16h 1:3 2h
15 GSCR 물 1:4 16h 1:3 1.5h
16 GCSR 물 1:3 12h 1:2 2h
17 CDEVD 물 1:7 1h 1:0.1 0.5h
18 DEVDC 물 1:7 1h 1:0.1 0.5h
19 시스테인 함유 기타 올리고펩티드 가용성 용매 1:(0.1~100) 0.5h~24h 1:(0.1~100) 0.1~24h
20 1-[(2S)-2-메틸-3-
티올-1-옥소프로필]-L-프롤린		 물 1:8 2h 1:7 1h
21 머캅토에탄올 에탄올 1:2 2h 1:1 1h
22 티오글리콜산 아세트산 1:2 2h 1:1 1h
23 티오페놀 에탄올 1:5 5h 1:1 1h
24 D-3-트롤로볼 물 1:2 2h 1:1 1h
25 N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신 물 1:2 2h 1:1 1h
26 도데실 머캅탄 메탄올 1:5 5h 1:1 1h
27 2-아미노에탄티올(CSH) 물 1:5 2h 8:1 0.5h
28 3-머캅토프로피온산(MPA) 물 1:2 1h 5:1 0.5h
29 4-머캅토벤조산(p-MBA) 물 1:6 0.5h 3:1 2h
30 티올 함유 기타 화합물 가용성 용매 1:(0.01~100) 0.5h~24h 1:(0.1~
100)		 0.1~24h
표 1에 열거된 샘플은 전술한 방법에 의해 확인된다. 11(11)가지 다른 리간드-결합된 AuC의 특성은 도 4(CR-AuC), 도 5(RC-AuC), 도 6(Cap-AuC)(Cap은 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린을 나타냄), 도 7(GSH-AuCs), 도 8(D-NIBC-AuCs), 도 9(L-Cys-AuCs), 도 10(CSH-AuCs), 도 11(MPA-AuCs), 도 12(p-MBA-AuCs), 도 13(CDEVD-AuCs), 및 도 13(DEVDC-AuCs), 및 도 14(DEVDC-AuCs)에 나타나 있다. 도 4a 내지 도 12a는 UV 스펙트럼; 도 4b 내지 도 12b는 적외선 스펙트럼; 도 4c 내지 도 12c는 TEM 이미지; 도 4d 내지 도 12d는 입자 크기 분포를 보여준다. 도 13a 및 14a는 UV 스펙트럼; 도 13b 및 도 14b는 TEM 이미지; 및 도 13c 및 도 14c는 입자 크기 분포를 보여준다.
결과는 표 1에서 얻은 서로 다른 리간드와 결합한 AuC의 직경이 모두 3 nm 보다 작다는 것을 나타낸다. 자외선 스펙트럼은 또한 520±20 nm에서 피크의 소실과, 다른 위치에서 흡수 피크의 출현을 보여준다. 흡수 피크의 위치는 리간드와 입자 크기를 비롯한 구조에 따라 달라질 수 있다. 특정 상황에서, 주로 다른 입자 크기와 구조를 가진 AuC 혼합물의 형성 또는 UV-vis 스펙트럼 범위를 넘어 흡수 피크의 위치를 이동시키는 특정 특별한 AuC의 형성으로 인해, 특별한 흡수 피크가 없다. 한편, 푸리에 변환 적외선 스펙트럼은 리간드 티올 적외선 흡수 피크(도 4b 내지 도 8b의 점선 사이)의 소멸을 보여주지만, 다른 적외선 특성 피크는 모두 유지되며, 이는 모든 리간드 분자가 금 원자에 성공적으로 결합되어 리간드-결합된 AuC를 형성했고, 본 발명은 표 1에 열거된 리간드와 결합된 AuC를 성공적으로 얻었음을 시사한다.
실시형태 3. 뇌허혈성 뇌졸중 동물모델 실험
3.1 테스트 샘플
금 클러스터:
A1: 리간드 L-NIBC-결합된 금 클러스터(L-NIBC-AuCs), 0.5-3.0 nm 범위의 크기 분포;
A2: 리간드 L-시스테인-결합된 금 클러스터(L-Cys-AuCs), 0.5-3.0 nm 범위의 크기 분포;
A3: 리간드 N-아세틸-L-시스테인-결합된 금 클러스터(L-NAC-AuCs), 0.5-3.0 nm 범위의 크기 분포; 및
A4: 리간드 DEVDC-결합된 금 클러스터(DEVDC-AuCs), 0.5-3.0 nm 범위의 크기 분포.
금 나노입자:
B1: L-NIBC-결합된 금 나노입자(L-NIBC-AuNPs), 6.1±1.5 nm의 크기 분포 범위; 및
B2: L-NAC-결합된 금 나노입자(L-NAC-AuNPs), 9.0±2.4 nm의 크기 분포 범위.
모든 테스트 샘플은 약간 변형하여 위에서 설명한 방법에 따라 준비했으며, 위에서 설명한 방법을 사용하여 품질을 특성화했다.
3.2 실험 프로토콜
3.2.1 랫트 중뇌 동맥 폐색(MCAO, middle cerebral artery occlusion) 모델 구축 및 테스트 물질 투여
수컷 SPF 등급 Sprague Dawley(SD) 랫트(220-260g)를 Shanghai Shrek Experimental Animal Co., Ltd.에서 구입했다. 모든 랫트를 실험 전 7일 동안 환경에 순응시켰다. 랫트를 무작위로 14개 그룹(n=10)으로 나누었으며, 여기에는 모의 수술 그룹, 모델 대조 그룹, 저용량(2 mg/kg 랫트 체중) 및 고용량 그룹(10 mg/kg 랫트 체중)의 금 클러스터 약물 A1, A2, A3 및 A4, 그리고 저용량(2 mg/kg 랫트 체중) 및 고용량 그룹(10 mg/kg 랫트 체중)의 금 나노입자 B1 및 B2이 포함되었다. 실험 당일 랫트를 10% 클로랄 하이드레이트(350 mg/kg 체중)로 마취시켰다. 우측 총경동맥(common carotid artery), 내경동맥(internal carotid artery), 외경동맥(external carotid artery)을 정중선 절개를 통해 노출시켰다. MCA 국소 혈액 공급이 차단되어 뇌경색이 발생할 때까지, 봉합사를 외경동맥(ECA)을 통해 내경동맥(ICA) 내로 18mm±0.5mm 삽입했다. 1.5시간 후, 재관류를 위해 봉합사를 ECA 입구로 빼냈다. 수술 전과 색전술 후 기본 뇌혈류량(CBF, cerebral blood flow)을 유량계로 측정했다. CBF가 지속적으로 감소한(rCBF ≤0%) 동물을 중뇌 동맥 폐색(MCAO)의 성공적인 모델로 간주했다. 재관류 후, 랫트에게 각각 0시, 24시, 48시 및 72시에 약물 또는 용매(일반 식염수)를 복강내 주사했다. 신경학적 행동 점수를 0시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 평가했다. 실험은 수술 후 96시간에 종료했다. 안락사 후 뇌 채취 및 TTC 염색을 시행했다. 뇌 절편의 이미지를 촬영하고 뇌경색 영역의 백분율을 계산했다.
3.2.2 신경학적 행동 점수
0점: 정상 랫트와 차이 없음; 1점: 오른쪽 앞발 뻗음(extension)이 똑바르지 않고, 반대쪽으로 향함. 2점: 개방된 공간에서 불연속적인 원을 그리며 보행. 3점: 개방된 공간에서 연속적인 원을 그리며 보행. 4점, 무의식 보행, 한쪽으로 쓰러짐; 5점: 죽음.
3.2.3 경색 영역(TTC 염색)
랫트를 이산화탄소 흡입으로 안락사시켰다. 뇌를 채취하여 관상 절편(2mm)을 위해 뇌 트로프(brain trough)에 넣었다. 염색을 실온에서 암실에서 2% TTC로 실시했다. 사진 촬영 후 경색 영역을 ImageJ로 분석했다. 경색 영역의 백분율(%) = (반대측 반구 면적 - (동측 반구 면적 - 경색 면적))/반대측 반구 면적 Х 100%.
3.2.4 통계 분석
통계 분석을 Graph Pad Prism Software 7.0(CA, US)으로 수행했다. 데이터를 평균±표준오차로 나타내었고, 통계분석을 Dunnett test로 수행했다. P<0.05는 통계적으로 유의함을 나타낸다.
3.3 결과
3.3.1 뇌 허혈 영역의 뇌 혈류
랫트 뇌 혈류의 70% 이상 감소(뇌혈류 감소, rCBF≥70%)는 MACO 모델의 성공적인 확립을 나타낸다. 모의 수술 그룹을 제외하고 나머지 모든 그룹은 rCBF가 70% 이상, 평균 약 80%로 나타났으며, 이는 성공적인 MCAO 모델 확립을 입증한다.
3.3.2 랫트의 신경학적 행동에 대한 각 약물의 효과
도 15는 각 그룹의 랫트의 신경학적 행동 점수를 나타낸 것이다(각 시점의 히스토그램에서, 왼쪽으로부터 오른쪽으로 모의 수술 그룹(블랭크), 모델 대조 그룹, A1 저용량 그룹, A1 고용량 그룹, A2 저용량 그룹, A2 고용량 그룹, A3 저용량 그룹, A3 고용량 그룹, A4 저용량 그룹, A4 고용량 그룹, B1 저용량 그룹, B1 고용량 그룹, B2 저용량 그룹 및 B2 고용량 그룹). 모의 수술 그룹의 랫트는 정상적인 신경학적 행동을 보였고, 행동 점수는 0점이었으며: 모델 대조 그룹의 랫트는 수술 후 0시간, 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 심각한 행동 기능 결함을 나타냈다(모의 수술 그룹 대비, P<0.001, ###). 모델 대조 그룹과 비교하여, A1, A2, A3, A4 저용량 그룹과 고용량 그룹의 신경학적 행동 점수는 수술 후 24시간에 유의한 개선이 없었다. 수술 후 48시간에, A1, A2, A3 및 A4 저용량 그룹과 고용량 그룹의 신경학적 행동 점수가 감소하기 시작했지만 통계적 차이는 없었다(모델 대조 그룹 대비, P>0.05). 수술 후 72시간에, 4가지 약물의 신경학적 행동 점수는 더욱 감소하였으며, 그 중 A1 저용량 그룹, A1 고용량 그룹, 및 A2 고용량 그룹에서 유의한 차이가 나타났다(모델 대조 그룹 대비, P<0.05, *). 수술 후 96시간째, 4가지 약물의 저용량 그룹과 고용량 그룹 둘 다에서 유의한 차이가 있었다(모델 대조 그룹 대비, P<0.05, *). 이러한 결과는 4가지 금 클러스터 약물 모두 허혈성 뇌졸중으로 유발된 신경학적 행동 결손을 크게 개선할 수 있으며, 그 효과는 어느 정도 용량 의존적임을 시사한다.
모델 대조 그룹과 비교하여, 금 나노입자 B1 및 B2의 저용량 및 고용량 그룹에서는 수술 후 24시간, 48시간, 72시간 및 96시간에 MACO 모델 랫트의 신경학적 행동 점수가 유의하게 개선되지 않았으며, 이는 금 나노입자가 뇌허혈성 뇌졸중으로 유발되는 행동 장애를 유의하게 개선할 수 없었음을 나타낸다.
3.3.3.3 MACO 모델 랫트의 뇌경색 영역에 대한 각 약물의 효과
도 16은 각 그룹의 랫트의 뇌경색 영역 백분율을 나타낸 것이다(히스토그램에서 왼쪽으로부터 오른쪽으로 모의 수술 그룹(블랭크), 모델 대조 그룹, A1 저용량 그룹, A1 고용량 그룹, A2 저용량 그룹)의 뇌경색 부위 비율을 나타낸 것이다. 용량군, A2 고용량 그룹, A3 저용량 그룹, A3 고용량 그룹, A4 저용량 그룹, A4 고용량 그룹, B1 저용량 그룹, B1 고용량 그룹, B2 저용량 그룹 및 B2 고용량 그룹). 모의 수술 그룹에서 뇌 조직은 정상이었고 경색은 발생하지 않았으며; 경색 면적은 0%이었다. 모델 대조 그룹의 경색 면적은 44.7%±4.5%(P<0.001, ###)이었다. 모델 대조 그룹과 비교하여, A1, A2, A3, A4 저용량 그룹과 고용량 그룹에서 뇌경색 부위의 백분율이 확연히 감소하였으나, 저용량 그룹에서는 유의한 차이가 없었고, 한편 고용량 그룹에서는 유의한 차이가 확인되었다(모델 대조 그룹 대비, P<0.05, *). A1을 예로 들면, 저용량 그룹의 경색 면적은 44.7±4.5%에서 36.0±4.0%로 감소한 반면(모델 대조 그룹 대비, P>0.05), 고용량 그룹의 경색 면적은 27.8±3.4%로 감소했다(모델 대조 그룹 대비, P<0.05, *).
도 17은 A1으로 표시되는 금 클러스터 약물 및 B1로 표시되는 금 나노입자의 투여 후 MCAO 래트의 TTC 염색 뇌 조직의 예시적인 이미지를 나타낸다. 도 17에서, 도 17a: 모의 수술 그룹; 도 17b: 모델 대조 그룹; 도 17c: A1 저용량 그룹; 도 17d: A1 고용량 그룹; 도 17e: B1 저용량 그룹; 도 17f: B1 고용량 그룹. 도 17에서 알 수 있는 바와 같이, 모의 수술 그룹의 랫트에서는 뇌경색이 나타나지 않았으며, 한편 모델 대조 그룹에서는 대규모 뇌경색이 나타났다(오른쪽 흰 부분). A1 약물의 저용량 투여 후 뇌경색 면적이 감소(오른쪽 흰색 부분이 감소)한 반면, A1 약물의 고용량 투여에 의해 뇌경색 면적이 유의하게 감소(오른쪽 흰색 부분이 현저히 감소)한 반면, B1의 저용량 및 고용량 투여는 뇌경색 부위에 영향을 미치지 않았다(오른쪽 흰색 부분은 감소하지 않음). A2, A3, 및 A4는 경색 면적 감소에 있어서 A1과 유사한 효과를 나타낸 반면, B2는 B1과 유사하게 경색 면적 감소 효과를 나타내지 않았다.
다른 리간드-결합된 AuC도 뇌허혈성 뇌졸중 치료에 유사한 효과를 나타내지만, 이들의 효과는 어느 정도 차이가 있다. 본 명세서에서는 이들에 대해 자세히 설명하지 않을 것이다.
실시예 4. 뇌출혈성 뇌졸중 동물모델 실험
4.1 재료 및 방법
4.1.1 테스트 약물
약물 A: L-NIBC-변형 금 나노클러스터(L-NIBC-AuCs), 금 코어 직경이 0.5-3.0nm 범위임;
약물 B: L-Cys-변형 금 나노클러스터(L-Cys-AuCs), 금 코어 직경이 0.5-3.0nm 범위임.
4.1.2 동물과 그룹핑
140마리의 SD 암컷 랫트(8주령, 190-220g)를 7일 동안 SPF에서 적응 사육한 후 무작위로 7개 그룹으로 나누었다.
(1) 정상 대조 그룹(NC), 랫트 20마리, 평균 체중 214.0±5.1g;
(2) 모의 수술(SHAM) 그룹, 랫트 20마리, 평균 체중 213.5±6.5g;
(3) 모델 대조(IVH) 그룹, 랫트 20마리, 평균 체중 214.7±6.1g;
(4) 약물 A 저용량(4mg/kg 체중) 투여(AL) 그룹, 랫트 20마리, 평균 체중 212.5±7.3g;
(5) 약물 A 고용량(10mg/kg 체중) 투여(AH) 그룹, 래트 20마리, 평균 체중 212.1±6.8g;
(6) 약물 B 저용량(4mg/kg 체중) 투여(BL) 그룹, 랫트 20마리, 평균 체중 213.2±6.3g; 및
(7) 약물 B 고용량(10mg/kg 체중) 투여(BH) 그룹, 랫트 20마리, 평균 체중 211.2±7.1g.
그룹 간의 체중에는 유의미한 차이가 없었다.
4.1.3 모델링, 약물 투여, 및 테스트 프로토콜
랫트에서 심실내 출혈(IVH; intraventricular hemorrhage) 모델 확립:
IVH 그룹과 각 약물 투여 그룹의 랫트에 2% 바비투레이트(50mg/kg)를 복강내 주사하여 마취시켰다. 마취 후 머리 피부를 소독했고; 랫트를 엎드린 자세로 스테레오 로케이터에 고정했다. 스테레오 로케이터를 조정하여, 랫트의 앞니를 앞니 갈고리에 고정하여, 앞천문과 뒤천문이 같은 높이가 되도록 했다. 그런 다음 귀 막대를 조절하여 랫트의 머리가 움직이지 않도록 고정했다. 랫트의 머리 피부와 털을 소독한 후, 랫트 머리 중앙에 피부를 절개하고, 골막을 3% 과산화수소로 벗겨내어, 앞천문과 뒤천문, 관상 봉합사를 노출시켰다. 직경 약 1mm의 작은 구멍을 경막과 뇌 조직을 손상시키지 않고 앞천문 뒤 0.2mm, 정중선 옆 3mm에 치과용 드릴로 뚫었다. 그런 다음, 랫트 꼬리를 40℃의 미지근한 물로 세척했다. 충혈 후, 랫트 꼬리를 에탄올로 소독하고, 비항응고제 동맥혈을 1ml 주사기를 이용하여 50μl 채혈했다. 혈액이 담긴 주사기를 스테레오 로케이터에 고정했다. 마이크로 주사기를 구멍을 통해 6mm 깊이로 삽입하고, 자가 동맥혈을 2회 주입하고; 10μl의 동맥혈을 고르게 주입하고; 2분 동안 혈액 주입을 중단하고; 그런 다음 40μl의 동맥혈을 고르게 천천히 다시 주입하고; 바늘을 4분 동안 그대로 두고; 바늘을 약 2.0mm 빼고; 바늘을 다시 4분 동안 그대로 두고; 그런 다음 천천히 주사기를 완전히 뺐다. 절개 부위를 봉합한 후, 멸균된 면봉을 사용하여 압박하여 지혈했다. 랫트를 매일 검사하여 상처 치유 및 가능한 감염을 관찰했다.
랫트가 깨어난 후 랫트의 행동을 관찰했다. mNSS 신경 기능 점수를 랫트 모델링을 평가하는 데 사용했다. 수술 후, 약물을 매일 1일, 2일, 3일, 4일, 5일, 6일 및 7일에 복강내 주사했고, AL 그룹과 AH 그룹의 용량은 각각 4와 10 mg/체중 kg이었다. NC 그룹과 SHAM 그룹의 랫트에게 해당 시점에 같은 양의 생리 식염수를 복강 내 주사했다. 모든 랫트를 복강내 주사 후 12h, 24h, 3d, 5d 및 7d에 mNSS 점수로 평가했다.
4.1.4. 에반스 블루 염색에 의한 혈액뇌장벽의 투과도 측정
처리된 랫트에게 에반스 블루 염색액(0.5%)을 정맥주사했고, 랫트의 눈과 피부가 파랗게 되었다. 0.5 내지 1시간 후 랫트를 희생시켜 뇌조직을 적출했다. 뇌조직을 1.5 ml 원심분리 튜브에 넣고 1 ml PBS를 첨가한 후, 신속하게 조직균질기로 뇌조직을 균질화하고 원심분리했다. 상청액을 취하고, 동량의 트리클로로아세트산을 첨가하고 4℃에서 인큐베이션했다. 15분 동안 원심분리했다. 상청액을 취하고, 분광광도계로 620 nm에서 흡광도 값(OD 값)을 측정했다. 동시에 알려진 다양한 기울기를 가진 표준 에반스 블루의 OD 값을 측정하고 표준 곡선을 작도했다. 표준 곡선에 따라 테스트할 샘플의 에반스 블루 함량을 계산했다.
4.1.5. 뇌 수분 함량 측정
건조/습윤 중량 방식을 채택했다. 허혈-재관류 24시간 후, 랫트를 과잉 마취시켰다. 참수 후, 뇌를 취하고, 후각망울, 소뇌 및 하부 뇌간을 제거하고, 좌우 대뇌 반구를 분리하고, 즉시 중량을 측정하여 습식 중량을 기록하고; 뇌조직을 110℃의 전기오븐에서 24시간 동안 건조시킨 후 건조된 뇌조직의 중량을 재빨리 측정하여 건조중량을 기록했다. 뇌 수분 함량(%) = (습윤 중량-건조 중량)/습윤 중량×100%를 계산했다.
4.1.6. H&E 염색
뇌 조직을 꺼내어 내장 상자에 넣었다. 탈수, 투명화, 왁스 침지, 포매, 절편화, 베이킹의 단계를 순차적으로 수행한 후, H&E 염색을 수행했다: 오븐에서 절편을 꺼내고, 절편을 각 15분 동안 자일렌으로 2회 처리한 다음, 절편을 각각 100%, 95%, 80%, 70% 에탄올로 5분 동안 처리한 후, 절편을 초순수로 매회 5분씩 2회씩 처리하여 탈납 단계를 완료하고; 5분 동안 헤마톡실린 염료로 절편을 염색하고 절편을 초순수로 3회 헹구고; 수돗물로 10분간 세척하여 세포핵이 파란색으로 변한 후, 절편을 0.5% 에오신 염료로 5분간 염색하고 수돗물로 5회 세척한 후 60℃ 오븐에서 건조시켜, 최종적으로 중성 수지로 절편을 밀봉했다. 광학현미경을 이용하여 200배의 시야에서 영상을 관찰하고 수집했다.
4.1.7 면역형광(IF) 염색
랫트의 뇌 조직을 꺼내어 내장 상자에 넣었다. 탈수, 투명화, 왁스 침지, 포매, 절편화, 베이킹의 단계를 순차적으로 수행했다. 절편을 오븐에서 꺼내 탈랍시켰다. 그런 다음 항원 회복, 세척, 투과, iNOS 1차 항체 처리, 염소 항-토끼 2차 항체 처리, 및 DAPI 염색의 단계를 수행했다. 마지막 단계로 건조 및 밀봉을 수행했다. 형광현미경을 이용하여 200배의 시야에서 영상을 관찰하고 수집했다.
4.1.8 웨스턴 블롯(WB)
먼저, 단백질 샘플을 준비했다. 냉동된 조직을 냉장고에서 꺼내어 조직의 적당량을 칭량하고, 프로테아제 억제제가 포함된 용해 완충액을 1:9의 비율로 첨가하고, 4℃에서 모든 조직 조각이 부서질 때까지 진탕시켰다. 샘플을 얼음에 20분 동안 놓고, 4℃에서 20분 동안 12000 rpm으로 원심분리하고, 상등액을 취했다. BCA 단백질 농도 분석 키트를 사용하여 각 샘플의 단백질 농도를 결정했다. 다른 그룹 간의 단백질 농도의 일관성을 보장하기 위해 농도 결정 결과에 따라 단백질 농도를 조정했다. 95℃에서 5분간 끓인 후, 샘플을 로딩하고, 나머지 샘플을 -80℃에 보관했다.
그런 다음 다음 단계에 따라 WB를 수행했다:
전기 영동 겔의 제조: 유리판을 세척 및 건조시킨 후, 겔 메이커에 고정시고; 그런 다음 분리 겔 준비를 시작하여, 분리 겔을 유리 플레이트의 틈에 적당한 높이로 붓고, 겔이 완전히 중합될 때까지 분리 겔을 무수 에탄올로 덮어 두었다. 무수에탄올을 붓고, 이차 증류수로 부드럽게 씻은 후, 여과지로 빨아 올려 건조시켰다. 그런 다음 농축 겔을 적절한 높이로 추가하고 빗을 삽입했다. 농축 겔이 완전히 중합된 후, 빗을 꺼냈다.
전기영동: 처리된 샘플을 웰당 총 40μg의 양으로 로딩했다. 전기영동을 농축 겔의 경우 80V, 분리 겔의 경우 120V 및 정전압 전원 공급 장치로 수행하고; 표적 단백질의 위치를 예비-염색 마커의 분자량과 표적 단백질의 상대적인 위치에 따라 결정했다. 표적 단백질이 분리 겔 하단 1/3의 최적 분해능 위치에 있을 때, 전기영동 분리를 중단했다.
막 이송: 절단된 PVDF 막을 메탄올에 10초 동안 담근 다음, 새로운 멤브레인 이송 용액에 넣어 사용했다. 겔을 꺼내, 마커에 따라 표적 스트립을 절단하고, 증류수로 헹구고; 동일한 크기의 PVDF 필름과 여과지를 PAGE 겔로 절단하고, PVDF 필름과 여과지를 전기이송(electrotransfer) 버퍼에 담갔다. 검은색 플레이트-섬유매트-여과지-겔-PVDF 막-여과지-섬유매트-흰색 플레이트의 순서에 따라 순차적으로 놓고 플레이트를 고정한 후, 막 이송 장치에 넣고 검은색 플레이트 측면을 검은색 음극에 연결했다. 막 이송 버퍼를 전기이송 탱크에 채우고 막 이송을 개시시켰다. 공정은 4℃(얼음욕)에서 진행하였고, 조건은 200mA, 90분(0.45μm 막) 또는 200mA, 60분(0.2μm 막)이었다.
차단: 막을 TBST로 3회 세척한 후 실온의 진탕 테이블에서 2시간 동안 5% 밀크를 함유하는 TBST 차단 용액으로 차단했다.
1차 항체: 상응하는 1차 항체를 3% BSA를 함유하는 TBST로 희석하고, PVDF 막을 1차 항체 인큐베이션 용액에 담그고 4℃에서 밤새 인큐베이션했다. MMP9는 1:1000으로, iNOS는 1:2000으로 희석했다. 인큐베이션 후 PVDF 막을 TBST로 3회, 10분/시간 동안 세척하여 과량의 1차 항체를 제거했다.
2차 항체: HRP 표지된 2차 항체(1:5000)를 차단 용액으로 희석하고 PVDF 막을 2차 항체 인큐베이션 용액에 담그고 실온에서 1시간 동안 인큐베이션했다. 인큐베이션 후, PVDF 막을 TBST로 10분/회 3회 세척하여 과량의 2차 항체를 제거했다.
노출: ECL 키트에서 현상 용액(Enhancement solution)과 안정한 퍼옥시다제 용액을 1:1 비율로 혼합하여 작업 용액을 준비하고 PVDF 필름에 작업 용액을 적당량 떨어뜨린 후, 자동 화학발광 이미지 분석 시스템으로 노출시켰다.
용리에 의한 막의 재생: 노출 후 PVDF 막을 TBST로 5분/회으로 3회 세척하고 PVDF 막을 막 재생용액 적당량을 첨가하여 막 재생용액에 담근 후, 실온에서 20분 동안 진탕 테이블에서 용리시켰다. 용리 후, PVDF 막을 TBST로 3회, 5분/시간 동안 완전히 세척하여, 과잉 막 재생 용액을 제거했다.
2차 차단, 내부 대조 그룹 인큐베이션, 2차 항체 결합 및 노출에 대한 구체적인 과정은 상기 실험 과정과 동일하며, β-튜불린과 GAPDH를 모두 1:5000의 비율로 희석했다.
노출 결과는 Image J 소프트웨어로 분석했다.
4.1.9 지질 과산화 분석
샘플 준비: PBS를 조직에 첨가하고(w/v: 1:9), 완전히 균질화하고, 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 분석을 위해 상청액을 취했다.
말론디알데하이드(MDA) 키트를 분석에 사용했다. 블랭크 튜브, 표준 튜브, 측정 튜브 및 대조 튜브를 지침에 따라 준비했다. 532nm에서 흡광도(OD) 값을 검출했다. 상청액 중의 MDA 함량을 다음과 같이 계산했다: MDA 함량(nmol/ml) = (측정된 OD 값-대조 OD 값)/(표준 OD 값-블랭크 OD 값) × 표준 농도(10nmol/ml).
4.1.10 SOD(Superoxide dismutase) 지수 분석
샘플 준비: PBS를 조직에 첨가하고(w/v: 1:9), 완전히 균질화하고, 얼음 위에서 10분 동안 인큐베이션하고, 4000rpm에서 10분 동안 원심분리하고, 분석을 위해 상청액을 취했다.
지침에 따라 SOD 키트를 분석에 사용했다. 다음 공식에 따라 계산했다: SOD 저해율(%) = ((대조 웰의 OD 값 - 대조 블랭크 웰의 OD 값) - (측정 웰의 OD 값 - 측정 블랭크 웰의 OD 값))/(대조 웰의 OD 값) 대조 그룹 웰-대조 블랭크 웰의 OD 값) ×100%; SOD 활성도(U/mgprot) = SOD 저해율÷50%×반응계 희석율÷시료의 단백질 농도(mgprot/ml)
4.1.11 전자현미경 검사
약 1 제곱 밀리미터의 조직 블록을 취했다. 고정, 탈수, 포매 및 경화 후, 조직 블록을 초박형 슬라이서로 70nm 두께의 절편으로 슬라이스했다. 그런 다음 2% 우라닐 아세테이트-납 구연산염으로 절편을 이중 염색했다. 투과 전자 현미경을 사용하여 관찰하고 사진을 찍었다.
4.2 결과
도 18은 모델링 완료 후 상이한 시간에 따른 mNSS 신경 기능 점수의 결과를 나타내며, 여기서 NC: 정상 대조 그룹; SHAM: 모의 수술 그룹; IVH: 모델 대조 그룹; AL: 약물 A 저용량 투여 그룹; AH: 약물 A 고용량 투여 그룹; BL: 약물 B 저용량 투여 그룹; BH: 약물 B 고용량 투여 그룹이다.
도 18a에 나타낸 바와 같이, 모델링 12시간 후, 신경학적 기능의 평균 mNSS 점수는 정상 대조 그룹(NC) 그룹(0.0±0.0), 모의 수술(SHAM) 그룹(0.0±0.0), 모델 대조(IVH) 그룹(14.7±1.2), 약물 A 저용량(AL) 투여 그룹(14.7±1.0), 약물 A 고용량(AH) 투여 그룹(14.4±1.1), 약물 B 저용량(BL) 투여 그룹(14.7±1.3), 약물 B 고용량(BH) 투여 그룹(14.7±1.1)으로 나타났다. IVH 그룹과 비교하여, NC 그룹과 SHAM 그룹은 유의한 차이가 나타난(P<0.001, ***) 반면, 그 외의 그룹은 IVH 그룹과 비교하여 유의한 차이가 없었다.
도 18b에 나타낸 바와 같이, 결과는 모델링 후 1일차 신경학적 기능의 평균 mNSS 점수가 다음과 같음을 보여주었다: NC 그룹(0.0±0.0), SHAM 그룹(0.0±0.0), IVH 그룹(14.3±1.3), AL 그룹(14.6±1.1), AH 그룹(14.3±1.0), BL 그룹(14.9±0.9), BH 그룹(14.3±1.0). IVH 그룹과 비교하여 NC 그룹, SHAM 그룹, IVH 그룹에서 유의한 차이가 나타난(P<0.001, ***) 반면, 그 외의 그룹은 IVH 그룹과 비교하여 유의한 차이가 없었다.
도 18c에 나타낸 바와 같이, 결과는 모델링 후 2일차에 신경학적 기능의 평균 mNSS 점수가 다음과 같음을 보여주었다: NC 그룹(0.0±0.0), SHAM 그룹(0.0±0.0), IVH 그룹(11.0±0.9), AL 그룹(8.6±1.5) , AH 그룹(7.7±1.7), BL 그룹(9.9±1.8), BH 그룹(10.2±1.9). IVH 그룹과 비교하여 NC 그룹, SHAM 그룹, AL 그룹, AH 그룹에서 유의한 차이가 있었다(P<0.001, **). 그러나 IVH 그룹과 비교하여 BL 그룹과 BH 그룹은 mNSS 점수가 IVH 그룹보다 낮지만 유의한 차이를 나타내지 않았다.
도 18d에 나타낸 바와 같이, 결과는 모델링 후 4일차에 신경학적 기능의 평균 mNSS 점수가 다음과 같음을 보여주었다: NC 그룹(0.0±0.0), SHAM 그룹(0.0±0.0), IVH 그룹(8.0±1.5), AL 그룹(6.0±1.8), AH 그룹(6.1±1.7), BL 그룹(7.2±1.8), BH 그룹(7.0±1.8). IVH 그룹과 비교하여 BL 그룹과 BH 그룹은 유의한 차이가 없었으나, 나머지 그룹은 모두 유의한 차이를 나타냈다(P<0.001, **).
도 18e에 나타낸 바와 같이, 결과는 모델링 후 7일째에 신경학적 기능의 평균 mNSS 점수가 다음과 같음을 보여주었다: NC 그룹(0.0±0.0), SHAM 그룹(0.0±0.0), IVH 그룹(5.4±1.7), AL 그룹(2.9±0.9) , AH 그룹(2.8±1.0), BL 그룹(4.5±1.8), BH 그룹(4.1±1.6). IVH 그룹과 비교하여 BL 그룹과 BH 그룹은 유의한 차이가 없었으나, 나머지 그룹은 모두 유의한 차이를 나타냈다(P<0.001, **).
이러한 결과는 상이한 용량의 약물 A가 모델링 후 2일째부터 IVH 랫트의 mNSS 신경 기능 점수를 크게 향상시킬 수 있음을 나타내며, 이는 약물 A가 IVH 랫트의 치료에 탁월한 효과가 있음을 나타낸다. 그러나, 2일째부터 약물 B의 mNSS 점수는 IVH 그룹보다 낮았으나 유의한 차이는 없었으며(P>0.05), 이는 IVH 모델 랫트의 치료에 약물 B가 효과가 없음을 나타냈다.
IVH 모델 랫트에 대한 약물 A의 치료 효과를 추가로 연구하기 위해 여러 관점에서 연구를 수행했다.
도 19는 BBB(Blood-Brain Barrier) 투과도 측정을 위한 에반스 블루 염색 결과를 나타낸 것이다. 에반스 블루 염색 후 IVH 그룹에서 NC 그룹과 SHAM 그룹에 비해 에반스 블루 함량이 유의하게 높았음을 알 수 있다(P<0.001, ***). 랫트의 뇌 조직에서 에반스 블루의 함량은 저용량 투여(AL) 그룹과 고용량 투여(AH) 그룹에서 IVH 그룹에 비해 유의하게 낮았다(P<0.05, *; P<0.01, **). 결과는 IVH 모델링이 랫트의 혈액-뇌 장벽의 투과성을 크게 증가시키고, 약물 A 저용량 및 고용량 투여 모두 IVH 모델링으로 인한 혈액-뇌 장벽의 투과성 증가를 크게 개선할 수 있음을 보여준다.
IVH 모델링으로 인한 뇌부종은 두개내압 증가, 뇌 탈장 및 동물 사망의 중요한 원인이다. 랫트 뇌 조직의 수분 함량을 감지하기 위해 건조/습윤 중량 방법을 사용하여 랫트 뇌 부종의 상황을 평가할 수 있다. 도 20은 건조/습윤 중량 방법으로 랫트 뇌 조직의 수분함량을 측정한 결과이다. 분석을 통해, NC 그룹과 SHAM 그룹에서 뇌 조직의 수분 함량이 IVH 모델 랫트에 비해 현저히 낮았으며(P<0.001, ***), 약물 A 저용량 투여(AL) 그룹과 고용량 투여(AH) 그룹도 IVH 그룹보다 유의하게 낮았음을 밝혀냈다(P<0.05, *; P<0.01, **). 이러한 결과는 약물 A의 저용량 및 고용량 투여 모두 IVH 모델링으로 인한 뇌 부종을 크게 개선하여 동물의 예후를 개선할 수 있음을 보여준다.
도 21은 H&E 염색의 예시적인 이미지를 보여준다. 그 결과 NC 그룹에서는 혈관과 세포 주변에 약간의 간극이 있었고(도 21a), SHAM 그룹에서는 경미한 손상이 있었고(도 21b), IVH 그룹에서는 혈관과 세포 주변의 간극이 확연히 확대되어 있었으며, 심각한 뇌 손상을 나타내는 세포 변성 및 액포가 동반되었다(도 21c). 약물 A 저용량(AL)(도 21d) 및 고용량(AH) 투여(도 21e)는 IVH 모델 랫트의 뇌 손상을 상당히 감소시킬 수 있다.
손상 유발 산화질소 합성효소(iNOS)는 뇌 손상 후 발현된다. 도 22는 래트 뇌 조직에서 iNOS 면역형광 염색의 예시적인 이미지를 보여준다. IVH 그룹에서 iNOS의 양성 발현이 상대적으로 더 높았음을 알 수 있다(도 22c). NC 그룹(도 22a), SHAM 그룹(도 22b), AL 그룹(도 22d) 및 AH 그룹(도 22e)을 포함하는 다른 그룹에서 iNOS의 발현은 IVH 그룹과 비교하여 다양한 정도로 감소했다. 이것은 IVH 모델링 후 랫트의 뇌 조직에서 iNOS의 발현이 증가하고 약물 A의 저용량 및 고용량 투여가 iNOS의 발현을 감소시켜 뇌 손상에 대한 보호 효과를 발휘할 수 있음을 나타낸다.
겔라티나아제 B(MMP9)는 정상적인 뇌 조직에서 발현되지 않거나 적게 발현된다. 그러나, IVH 모델링으로 인한 뇌 손상 후 MMP9는 혈액-뇌 장벽을 파괴함으로써 혈관신생 뇌부종 및 기타 뇌 손상 과정에서 중요한 역할을 할 수 있다. 도 23은 각 그룹의 랫트의 뇌 조직에서 MMP9 단백질의 발현을 나타낸다. 도 23a는 WB 테스트로부터 얻은 6개의 병렬 샘플의 MMP9 단백질 밴드를 나타내고, 도 23b는 MMP9의 상대적인 단백질 발현을 나타낸다(GAPDH를 기준으로 함). NC 그룹, SHAM 그룹, AL 그룹, AH 그룹의 뇌 조직에서 MMP9의 상대적인 발현이 IVH 그룹에 비해 유의하게 낮았음을 알 수 있다(P<0.05, *). 이러한 결과는 약물 A의 저용량 및 고용량 모두 모델 랫트에서 뇌 손상으로 유도된 MMP9 단백질의 증가된 발현을 상당히 감소시킬 수 있음을 나타내며, 이는 약물 A가 뇌 손상에 대한 보호 효과가 있음을 나타낸다.
말론디알데하이드(MDA)는 자유 라디칼과 세포막의 불포화 지방산 사이의 과산화 반응의 최종 생성물이다. 이것은 지질 산화적 손상의 중요한 바이오마커이다. 이것은 조직 과산화 손상 정도를 간접적으로 반영할 수 있다. 이것의 수준은 뇌졸중의 병인에서 임상 증상의 중증도와 밀접한 관련이 있으며, 뇌졸중의 진단, 치료 및 예후에 중요한 임상적 의의를 갖는다. 도 24는 각 그룹의 랫트의 뇌 조직에서 MDA의 발현을 나타낸다. NC, SHAM, AL 및 AH 그룹의 MDA 발현이 IVH 그룹보다 현저히 낮은 것을 확인할 수 있으며, 이는 IVH 모델링으로 인한 뇌 손상이 뇌에서 MDA 발현의 상당한 증가를 유발함을 나타내었으며(P<0.001, *** IVH 그룹 대비 NC 그룹과 SHAM 그룹), 반면 약물 A의 저용량 및 고용량 투여는 뇌 손상과 관련된 MDA 발현을 유의하게 감소시킬 수 있다(IVH 그룹 대비, 각각, P<0.01, ** 및 0.001, ***).
SOD(Superoxide dismutase)는 신체에서 가장 효과적인 자유 라디칼 소거 효소이다. 신체에서 생성된 SOD는 신체의 자유 라디칼 상황을 반영할 수 있다. 일부 연구에서는 출혈성 뇌졸중 뇌 조직에서 SOD의 발현과 활성이 정상 뇌 조직보다 현저히 낮은 것으로 나타났다. 도 25는 각 그룹의 랫트의 뇌 조직에서 SOD의 발현 정도를 나타낸 것이다. 결과는 NC, SHAM, AL 및 AH 그룹의 SOD 발현 수준이 IVH 그룹보다 유의하게 높았음을 보여주며, 이는 IVH 모델링으로 인한 뇌 손상이 뇌에서 SOD 발현을 유의하게 감소시켰음을 나타내며(IVH 그룹 대비, NC 그룹 및 SHAM 그룹 모두: P<0.001, ***) 반면, 저용량 및 고용량의 약물 A 투여는 뇌에서 SOD 발현을 상당히 증가시킬 수 있음을 제시한다(IVH 그룹 대비, P<0.001, ***).
도 26은 뇌 조직의 극박 절편에 대한 투과 전자 현미경 검사 결과를 보여준다.
도 26a에 나타낸 바와 같이, NC 그룹에서, 아교세포의 형태는 정상이거나 약간 불규칙적이고; 핵(N)은 불규칙한 타원형이며; 세포질의 미토콘드리아(M)는 짧은 원형 또는 짧은 막대 형상이고, 구조적으로 온전하며, 내부 능선은 약간 흐릿하고; 소포체(ER)는 약간 확장되어 있었다.
도 26b에 나타낸 바와 같이, SHAM 그룹에서, 아교세포의 형태는 약간 불규칙적이고; 핵(N)은 타원형이며; 세포질의 미토콘드리아(M)는 내부 능선이 흐릿한 덤벨 형상이고; 소포체(ER)가 약간 확장되어 있었다.
도 26c에 나타낸 바와 같이, IVH 그룹에서, 아교세포의 형태는 불규칙적이고; 핵(N)은 불규칙적이며; 세포질의 미토콘드리아(M)는 둥글고 명확하게 부풀어 올라 있고; 소포체(ER)가 명확하게 확장되어 있으며; 자가포식체(AP)가 나타났으며; 이는 IVH 모델링이 뇌 조직 세포의 심각한 손상을 초래한다는 것을 나타낸다.
도 26d에 나타낸 바와 같이, Al 그룹에서, 아교세포의 형태는 약간 불규칙적이고; 핵(N)은 타원형이며; 세포질의 미토콘드리아(M)는 둥글거나 타원형이고 약간 부풀어 올라 있고; 내부 능선은 일부 부서져 있고; 소포체(ER)는 약간 확장되어 있고, 소량의 리포푸신(L)을 확인할 수 있었으며; 이는 저용량의 약물 A 투여가 IVH 모델링으로 인한 뇌 조직의 세포 손상을 개선하거나 복구할 수 있음을 보여준다.
도 26e에 나타낸 바와 같이, AH 그룹에서, 아교세포의 형태는 기본적으로 규칙적이거나 약간 불규칙적이고; 핵(N)은 타원형이며; 세포질의 미토콘드리아(M)는 타원형 또는 긴 막대 형상으로, 명확한 내부 능선과 온전한 구조를 가지고 있고; 소포체(ER)가 약간 확장되어 있고; 소량의 리포푸신(L)을 일부 부위에서 확인할 수 있었으며; 이것은 고용량의 약물 A 투여가 IVH 모델링으로 인한 뇌 조직의 세포 손상을 개선 또는 복구할 수 있으며, NC 그룹과 AH 그룹 사이의 뇌 조직 세포의 차이가 거의 없음을 보여준다.
위의 결과는 L-NIBC를 리간드로 하는 금 클러스터가 출혈성 뇌졸중 치료에 예상치 못한 치료 효과를 가지며 출혈성 뇌졸중 치료제 개발에도 사용될 수 있음을 입증한다.
본 발명이 특정 실시형태를 참조하여 설명되었지만, 실시형태는 예시적이며 본 발명의 범위가 이로 제한되지 않는다는 것이 이해될 것이다. 본 발명의 대안적인 실시형태는 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 명백할 것이다. 이러한 대안적인 실시형태는 본 발명의 범위 내에 포함되는 것으로 간주된다. 따라서, 본 발명의 범위는 첨부된 청구범위에 의해 정의되고 전술한 설명에 의해 뒷받침된다.
참고문헌
Amani H, Mostafavi E, Mahmoud Reza Alebouyeh MR, Arzaghi H, Akbarzadeh A, Pazoki-Toroudi H, Webster TJ. Would Colloidal Gold Nanocarriers Present An Effective Diagnosis Or Treatment For Ischemic Stroke? Int J Nanomedicine. 2019 Oct 7; 14: 8013-8031.
Zheng Y, Wu Y, Liu Y, Guo Z, Bai T, Zhou P, Wu J, Yang Q, Liu Z, Lu X. Intrinsic Effects of Gold Nanoparticles on Oxygen-Glucose Deprivation/Reperfusion Injury in Rat Cortical Neurons. Neurochem Res. 2019 Jul; 44 (7) : 1549-1566.

Claims (20)

  1. 대상체에서 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터로서, 상기 리간드-결합된 금 클러스터는,
    금 코어; 및
    상기 금 코어에 결합된 리간드를 포함하고,
    상기 뇌졸중은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중 및 일과성 허혈성 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  2. 제1항에 있어서,
    금 코어가 0.5 내지 3 nm 범위의 직경을 갖는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  3. 제1항에 있어서,
    금 코어가 0.5 내지 2.6 nm 범위의 직경을 갖는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  4. 제1항에 있어서,
    리간드가 L-시스테인 및 이의 유도체, D-시스테인 및 이의 유도체, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체, 및 기타 티올-함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  5. 제4항에 있어서,
    L-시스테인 및 이의 유도체가 L-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), 및 N-아세틸-L-시스테인(L-NAC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고, D-시스테인 및 이의 유도체가 D-시스테인, N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  6. 제4항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 디펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L(D)-히스티딘-L(D)-시스테인 디펩티드(HC) 및 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  7. 제4항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 트리펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-리신-L(D)-시스테인-L(D)-프롤린 트리펩티드(KCP), 및 L(D)-글루타티온(GSH)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  8. 제4항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 테트라펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR), 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  9. 제4항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩타이드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 펜타펩타이드이고, 여기서 시스테인-함유 펜타펩타이드는 시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산(CDEVD) 및 아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산-시스테인(DEVDC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  10. 제4항에 있어서,
    기타 티올-함유 화합물이 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신, 도데실 머캅탄, 2-아미노에탄티올(CSH), 3-머캅토프로피온산(MPA), 및 4-머캅토벤조산(p-MBA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 뇌졸중 치료에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  11. 대상체에서 뇌졸중 치료용 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC)로서, 상기 리간드-결합된 금 클러스터는,
    금 코어; 및
    상기 금 코어에 결합된 리간드를 포함하고,
    상기 뇌졸중은 뇌출혈성 뇌졸중, 뇌허혈성 뇌졸중 및 일과성 허혈성 발작(TIA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터.
  12. 제11항에 있어서,
    금 코어가 0.5 내지 3nm 범위의 직경을 갖는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  13. 제11항에 있어서,
    금 코어가 0.5 내지 2.6 nm 범위의 직경을 갖는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  14. 제11항에 있어서,
    리간드가 L-시스테인 및 이의 유도체, D-시스테인 및 이의 유도체, 시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체, 및 기타 티올-함유 화합물로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  15. 제14항에 있어서,
    L-시스테인 및 이의 유도체가 L-시스테인, N-이소부티릴-L-시스테인(L-NIBC), 및 N-아세틸-L-시스테인(L-NAC)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것이고, D-시스테인 및 이의 유도체가 D-시스테인, N-이소부티릴-D-시스테인(D-NIBC), 및 N-아세틸-D-시스테인(D-NAC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  16. 제14항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 디펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 디펩티드는 L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 디펩티드(CR), L(D)-아르기닌-L(D)-시스테인 디펩티드(RC), L(D)-히스티딘-L(D)-시스테인 디펩티드(HC) 및 L(D)-시스테인-L(D)-히스티딘 디펩티드(CH)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  17. 제14항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 트리펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 트리펩티드는 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(GCR), L(D)-프롤린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 트리펩티드(PCR), L(D)-리신-L(D)-시스테인-L(D)-프롤린 트리펩티드(KCP), 및 L(D)-글루타티온(GSH)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  18. 제14항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩티드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 테트라펩티드이고, 여기서 시스테인-함유 테트라펩티드는 글리신-L(D)-세린-L(D)-시스테인-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GSCR), 및 글리신-L(D)-시스테인-L(D)-세린-L(D)-아르기닌 테트라펩티드(GCSR)로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  19. 제14항에 있어서,
    시스테인-함유 올리고펩타이드 및 이들의 유도체가 시스테인-함유 펜타펩타이드이고, 여기서 시스테인-함유 펜타펩타이드는 시스테인-아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산(CDEVD) 및 아스파르트산-글루탐산-발린-아스파르트산-시스테인(DEVDC)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
  20. 제14항에 있어서,
    기타 티올-함유 화합물이 1-[(2S)-2-메틸-3-티올-1-옥소프로필]-L(D)-프롤린, 티오글리콜산, 머캅토에탄올, 티오페놀, D-3-트롤로볼, N-(2-머캅토프로피오닐)-글리신, 도데실 머캅탄, 2-아미노에탄티올(CSH), 3-머캅토프로피온산(MPA), 및 4-머캅토벤조산(p-MBA)으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 것인, 약제의 제조에 사용하기 위한 리간드-결합된 금 클러스터(AuC).
KR1020237016181A 2020-11-27 2021-08-16 뇌졸중의 치료를 위한 금 클러스터, 조성물 및 방법 KR20230088760A (ko)

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