CN116515898A - 一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，属于植物基因工程应用领域。所述方法包括无菌苗获得，外植体预培养、侵染、恢复培养、筛选、生根培养及炼苗和移栽的步骤；本发明通过研究不同光质和供光模式调控红薹芥蓝无菌幼苗株型、不同植物组织培养凝固剂配方、不同光照强度照射恢复培养基对外植体伤口褐化和培养基污染、不定芽再生率和转化效率的影响，建立一种光调控下农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化体系，同时该方法操作简单高效、可重复性高、转化所需时间短，转化结果稳定，遗传转化植株阳性率约为6％，显著优于现有芥蓝离体再生体系及遗传转化方法，对芸薹属植物基因功能研究和分子育种具有重要意义。

Description

一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法

技术领域

本发明涉及植物基因工程应用领域，特别是涉及一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法。

背景技术

芥蓝原产于华南地区，是华南地区栽培面积和产量最大的特产蔬菜。其以肥嫩的花薹和嫩叶供食用，质地脆嫩，风味清甜，具极高营养价值和保健作用，深受华南地区广大消费者的青睐。

自利用农杆菌介导法首次获得芸薹属转基因植株以来，芸薹属作物的组织培养与高频再生系统逐步建立，但在此基础上的转基因研究主要集中在白菜、油菜、菜心、芥菜等作物的遗传转化上，芥蓝遗传转化成功的报道较少，不仅缺乏系统性的遗传转化体系，还忽视了光环境对芥蓝组织培养的影响，同时存在再生困难，转化效率较低，试验可重复性差等问题。因此，亟需建立一套系统性强、光环境适宜的快速高效芥蓝遗传转化技术体系。

发明内容

本发明的目的是提供一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，以解决上述现有技术存在的问题，本发明采用不同光质和供光模式调控红薹芥蓝无菌幼苗株型、不同植物组织培养凝固剂配方、不同光照强度照射恢复培养基对外植体伤口褐化和培养基污染、不定芽再生率和转化效率的影响，建立一种光调控下农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化体系，为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。

为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

本发明提供一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获得：将红薹芥蓝种子消毒处理后接种于播种培养基，催芽后，暗处理3d、白光处理2d获得无菌苗；

(2)外植体的预培养：切取所述无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，分别接入预培养基中避光预培养；

(3)外植体的侵染：采用农杆菌介导方法侵染预培养后的外植体；

(4)外植体的共培养：将侵染后的外植体接种于共培养基进行共培养；

(5)外植体的恢复培养：将共培养后的外植体转移至恢复培养基，于光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光环境中培养20～25d；

(6)外植体的筛选、生根培养：切取恢复培养的外植体长出的不定芽，将所述不定芽转移至筛选培养基中，筛选培养20～30d，之后剥离完整的绿芽，转移至筛选生根培养基，培养20～30d，得到抗性芽；将所述抗性芽转移至生根培养基光照培养20～30d，得到组培苗；

(7)组培苗的炼苗及移栽：将得到的组培苗开盖炼苗，之后栽植至育苗基质中，进行常规管理，之后经阳性检测后获得红薹芥蓝遗传转化阳性植株；

在步骤(1)～(2)和步骤(4)～(6)中，所用培养基的凝固剂均为4g·L^-1的琼脂粉和2.5g·L^-1的植物凝胶。

进一步地，在步骤(1)中，所述白光处理具体为光照强度为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光，所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3；所述播种培养基的组成为：2.37g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，调pH至5.86。

进一步地，在步骤(2)中，所述避光预培养的条件为：于22℃温度下避光倒置预培养2d；所述预培养基和步骤(4)中所述共培养基的组成均为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，调pH至5.86，灭菌后加0.025mg·L^-1吲哚-3-乙酸，2mg·L^-1反玉米素，7mg·L^-1AgNO₃。

进一步地，在步骤(3)中，所述侵染的具体步骤为：将含外源基因的表达载体转入农杆菌中，用侵染培养基重悬菌体，震荡培养，得到农杆菌侵染液，将步骤(2)预培养后的外植体转移至所述农杆菌侵染液中，侵染10min；所述侵染培养基的组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，1.0mg·L^-1乙酰丁香酮，调pH至5.85。

进一步地，在步骤(5)中，将共培养2d后的外植体转移至恢复培养基，所述恢复培养基的组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，调pH至5.88，灭菌后加0.025mg·L^-1吲哚-3-乙酸，2mg·L^-1反玉米素，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1特美汀。

进一步地，在步骤(6)中，所述筛选、生根培养的条件均为：在光照强度为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养20～30d，所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3；

所述筛选培养基组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，500μL·L^-1植物组培抑菌剂，调pH至5.88，灭菌后加0.05mg·L^-1吲哚-3-乙酸，2mg·L^-1反玉米素，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1特美汀，4mg·L^-1草铵膦；

所述筛选生根培养基组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，500μL·L^-1植物组培抑菌剂，调pH至5.88，灭菌后加0.3mg·L^-1吲哚-3-乙酸，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1mg·L^-1特美汀，6mg·L^-1草铵膦；

所述生根培养基组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，500μL·L^-1植物组培抑菌剂，调pH至5.88，灭菌后加0.45mg·L^-1吲哚-3-乙酸，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1特美汀。

进一步地，在步骤(7)中，所述常规管理的光环境为光照强度为160±5μmol·m^-2·s^-1的LED红白光，所述LED红白光中红光与蓝光的光照强度比值为1.7，红光与远红光的光照强度比值为21.3。

本发明公开了以下技术效果：

(1)本发明通过研究不同光质和供光模式调控红薹芥蓝无菌幼苗株型、不同植物组织培养凝固剂配方、不同光照强度照射恢复培养基对外植体伤口褐化和培养基污染、不定芽再生率和转化效率的影响，建立一种光调控下农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化体系，为芸薹属植物基因功能研究和分子育种奠定基础。

(2)本发明构建的红薹芥蓝遗传转化体系结合PCR检测和GUS染色双重检测，获得转基因植株。本发明关注植物组织培养过程中的光环境，选择琼脂粉和植物凝胶作为培养基凝固剂，接种后避光催芽3天，暗处理3天，适宜光质下正常光照2天，促进无菌苗下胚轴的伸长和子叶光合色素的合成，显著降低外植体真菌污染，极大程度提高无菌苗利用率，恢复培养阶段40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光(LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3)极大改善红薹芥蓝外植体褐化及培养基污染情况，提高外植体的再生率及转化效率；此外，整个操作过程简单高效、可重复性高、转化所需时间短，转化结果稳定，遗传转化植株阳性率约为6％，显著优于现有芥蓝离体再生体系及遗传转化方法，对芸薹属植物基因功能研究和分子育种具有重要意义。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

图1是本发明采用的重组质粒pCAMBIA3301-35S-MYC3的结构示意图；

图2是红薹芥蓝遗传转化过程光环境的光谱图；

图3是本发明获得的转基因红薹芥蓝植株的遗传转化展示图；其中，1：播种，2：暗处理3d的无菌苗，3：光照2d的无菌苗，4-5：预培养，6-7：共培养，8-9：恢复培养，10：筛选培养，11：筛选生根培养，12：生根培养，13：开盖炼苗，14：套袋缓苗，15-16：转基因植株常规管理；

图4是转化植株的目的基因PCR检测结果图；其中，M：Marker，图左边为marker条带大小，1：水，2：野生型，3：质粒，4-14为不同转化株系；

图5是转化植株目的基因测序结果比对图；

图6是转化植株GUS染色结果图，其中，1：野生型，2：转基因红薹芥蓝。

具体实施方式

现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值，以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本发明说明书和实施例仅是示例性的。

关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

实施例1

1材料准备

1.1植物材料

试验在华南农业大学园艺学院蔬菜栽培与生理实验室、分子实验室和组培室内进行，供试芥蓝品种为华南农业大学园艺学院蔬菜栽培与生理实验室保存的红薹芥蓝“红脚”。

1.2红薹芥蓝基因表达载体构建

(1)引物设计

利用MYC3序列(登录号：XM_013742789.1)和primerpremier 5软件设计引物(表1)

表1引物序列表

(2)基因克隆

取红薹芥蓝嫩叶用液氮研磨成粉末状，用SteadyPure植物RNA提取试剂盒(艾科瑞，湖南)提取RNA，并使用该公司的Evo M-MLV反转录预混型试剂盒完成cDNA的合成。以红薹芥蓝cDNA为模板，用超表达载体引物进行PCR扩增，产物纯化后与线性化载体pCAMBIA3301(鼎国)采用一步克隆试剂盒HieffPlus One Step CloningKit(翌胜，上海)进行重组连接，载体采用Xba I和Sma I限制酶进行双酶切线性化。将连接好的重组质粒pCAMBIA3301-35S-MYC3通过常规方法转入大肠杆菌DH5α(擎科，北京)，培养获取阳性单菌落，抽提质粒后通过冻融法导入农杆菌GV3101(唯地，上海)，培养获取阳性单菌落用于后续侵染。图1为本发明采用的重组质粒pCAMBIA3301-35S-MYC3的结构示意图。

1.3培养基：遗传转化过程中培养基见表2。

表2培养基配方

2试验方法

2.1红薹芥蓝遗传转化步骤

(1)无菌苗的获得

选取籽粒饱满的红薹芥蓝种子于离心管，在超净工作台中按以下步骤进行表面消毒：无菌水冲洗5次，75％(体积分数)乙醇浸泡2min，无菌水冲洗2次，5％(质量分数)NaClO溶液浸泡10min，无菌水冲洗5次，用无菌漏勺过滤后置于无菌滤纸上吸干多余水分；将种子均匀接种于播种培养基，每瓶20粒；将接种完的播种培养基置于组培室避光催芽3d后进行不同光处理，总PPFD为80±5μmol·m^-2·s^-1(表3)。组培室环境条件：22±0.5℃，光周期16h·d^-1；

表3无菌苗的不同光供光模式

	光处理
		W	白光5d
FR	远红光5d
		UV	紫外光5d
D	暗处理3d
		DW	暗处理3d，白光2d
WD	白光3d，暗处理2d

注：W为LED白光灯，其中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3。

(2)外植体的预培养

在超净工作台中选取子叶展平的红薹芥蓝无菌苗，切取带子叶柄的子叶(简称带柄子叶，子叶柄的长度为0.2～0.3cm)和下胚轴(长度为0.5～0.9cm，若无菌苗下胚轴长度适宜，下胚轴可切多段)为外植体，其中带柄子叶伤口插入预培养基，下胚轴平铺于预培养基表面；将预培养基置于22℃组培室避光倒置预培养2d；

(3)外植体的侵染

挑取1.2中的阳性单菌落初摇过夜后转入锥形瓶中扩摇5h，5000rpm离心10min，弃上清液；用侵染培养基重悬菌体，调节光密度值OD₆₀₀为0.4～0.5，28℃摇床200rpm振荡培养60min，得到活化的农杆菌侵染液；在超净工作台中将预培养2d的外植体转移至农杆菌侵染液中，振荡侵染10min；

(4)外植体与菌液的共培养

用无菌漏勺过滤菌液，将侵染完的外植体置于无菌滤纸上吸干多余菌液；另取大小适宜的无菌滤纸平铺于共培养基上，吸取2.0mL添加了0.05mg·L^-1吲哚-3-乙酸、2mg·L^-1反玉米素和7mg·L^-1AgNO₃的侵染培养基润湿滤纸；将外植体平铺在共培养基上，保证外植体切口接触到滤纸，避光正置共培养2d；

(5)外植体的恢复培养

将共培养2d的外植体转移至恢复培养基，带柄子叶伤口插入恢复培养基，下胚轴放入用无菌镊子划出的槽中，保证下胚轴两端切口与恢复培养基接触；置于总PPFD为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下倒置培养20～25d，转移不定芽后更换一次恢复培养基，所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3，组培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1；

(6)外植体的筛选培养

①切取恢复培养中外植体上的不定芽，转移至筛选培养基中，在总PPFD为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养20～30d；

②剥离筛选培养基中正常生长的不定芽上单一完整的绿芽，转移至筛选生根培养基，置于总PPFD为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养20～30d，得到正常生长的绿芽，即抗性芽；

所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3，组培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1；

(7)抗性芽的生根培养

选取筛选生根培养基中抗性芽，切去老化伤口，剥离单一完整的抗性芽，转移至生根培养基，置于总PPFD为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养20～30d，得到组培苗。所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3，组培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1；

(8)组培苗的炼苗及移栽

待组培苗不定根数量较多且生长健壮时，开盖，套上一次性塑料薄膜手套，炼苗7d后洗去根上所有培养基，移栽至质量比3:1的泥炭土和蛭石混合育苗基质中，保鲜袋套袋缓苗7d，置于总PPFD为160±5μmol·m^-2·s^-1的LED红白光下常规管理；所述LED红白光中红光与蓝光的光照强度比值为1.7，红光与远红光的光照强度比值为21.3，组培室及栽培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1；

(9)再生植株的阳性检测

a)PCR检测

待组培苗长成完整植株后，取再生植株叶片，用CTAB法提取DNA；再以pCAMBIA3301-35S-MYC3质粒为阳性对照，野生型红薹芥蓝DNA为阴性对照，无菌水为空白对照，进行PCR扩增；PCR反应结束后用1％(质量分数)琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物；将与阳性质粒条带一致的PCR产物进行测序分析，通过NCBI数据库中BLAST网络服务工具对测序结果与参考序列进行比对；

b)GUS染色

根据PCR检测结果，取序列比对一致的再生植株新叶于2.0mL离心管，加入GUS染色工作液至完全浸没叶片，抽真空20min，37℃避光反应8h；用95％(体积分数)的乙醇溶液洗脱叶片3次，保存于95％(体积分数)的乙醇溶液中。肉眼观察到阴性对照呈白色，阳性对照呈蓝色，阳性植株叶片蓝色或白色背景上有蓝色。

表4PCR反应体系

表5PCR反应程序

3结果与分析

3.1无菌苗株型对外植体再生率及转化率的影响

无菌苗的培养是红薹芥蓝遗传转化过程中不可或缺的步骤。采用不同供光模式能有效调控无菌苗株型，利于壮苗的培育，对遗传转化效率有显著影响。在催芽后采用不同光质的供光模式，无菌苗的下胚轴和子叶差异显著，其中经过明暗处理的无菌幼苗下胚轴显著伸长，带柄子叶与持续光照的子叶无明显差异。其中，暗处理3d，光照2d的无菌苗外植体不仅有带柄子叶，还有下胚轴，外植体数量最多，极大提高无菌苗利用率，同时外植体的再生率显著高于其他处理，恢复培养20d的外植体褐化率最低，后期共得到2株转基因红薹芥蓝(表6)。因此，种子催芽3d后暗处理3d，再在80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养2d，此供光模式在红薹芥蓝遗传转化中最适宜。所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3。

表6不同光处理对再生率及转化率的影响

注：褐化率＝褐化外植体数/外植体总数×100％；再生率＝分化不定芽个数/外植体总个数×100％。

实施例2

筛选凝固剂组成

1材料准备

1.1植物材料：同实施例1；

1.2培养基

凝固剂组成：①琼脂粉8g；②植物凝胶(CP8581Z，酷来博，北京)5g；③琼脂粉4g及植物凝胶2.5g；培养基其他组分同实施例1；

1.3农杆菌：同实施例1；

1.4检测引物：同实施例1；

2试验方法：同实施例1；

3结果与分析

凝固剂是固体培养基不可或缺的组分，培养基的硬度、透明度都受到凝固剂的影响。单一的琼脂粉会使培养基透明度变差，播种培养基真菌污染时难以及时剔除，种子利用率低，无菌苗污染严重，后期外植体真菌污染难以抑制，在各个阶段均会出现真菌污染，导致外植体再生率显著下降，同时受凝固剂硬度的影响，在pH适宜外植体生长的情况下，组培苗清洗困难，根系受损严重，影响移栽后再生植株的成活率；当凝固剂为植物凝胶且pH为5.88±0.05时，培养基透明度高，组培苗生根率高，根系清洗简单，但凝固效果差，培养基化水严重，外植体愈伤组织玻璃化加剧，再生率低；当琼脂粉4g与植物凝胶2.5g搭配使用时，在培养基pH不变的情况下，凝固效果、培养基硬度和透明度均显著优于单一的植物凝固剂，且培养基真菌污染显著降低，再生率及转化率显著提高，后期共得到2株转基因植株(表7)。故琼脂粉4g与植物凝胶2.5g的组合为红薹芥蓝遗传转化过程中固体培养基的最佳凝固剂搭配。

表7不同凝固剂对再生率及转化率的影响

注：污染率＝真菌细菌污染的外植体数/外植体总数×100％。

实施例3

恢复培养光照强度筛选

1材料准备

1.1植物材料：同实施例1；

1.2培养基：遗传转化过程中培养基配方见表8；

1.3农杆菌：同实施例1；

1.4检测引物：同实施例1。

表8培养基配方

2试验方法

2.1红薹芥蓝遗传转化步骤

将接种并催芽3d的播种培养基暗处理3d，再置于80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下生长2d，用子叶展平的无菌苗带柄子叶和下胚轴为外植体，避光预培养2d；用活化的农杆菌侵染液振荡侵染10min，避光共培养2d后转移至恢复培养基，带柄子叶伤口插入恢复培养基，下胚轴放入用无菌镊子划出的槽中，保证下胚轴两端切口与恢复培养基接触；将数量相同的带柄子叶和下胚轴分别置于PPFD为20、40、80μmol·m^-2·s^-1的LED白光下倒置培养20～25d，转移不定芽后更换一次恢复培养基；其余步骤同实施例1保持一致。

所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3，组培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1；

3结果与分析

光照强度是影响恢复培养阶段外植体不定芽分化和再生率、转化率的重要因素。光照强度过低，培养基中农杆菌滋生，外植体污染严重，后期抑制农杆菌困难，外植体再生困难；光照强度过高，恢复培养20d后的外植体伤口褐化严重，抑制不定芽的分化，再生率和转化率显著降低，该处理仅得到2株转基因红薹芥蓝；在总PPFD为40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下，外植体褐化及农杆菌滋生的情况得到明显抑制，外植体再生率及转化率最高，共得到6株转基因红薹芥蓝。故总PPFD为40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光为恢复培养阶段的最佳光照强度。所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3。

表9光照强度对再生率及转化率的影响

注：污染率＝(褐化外植体数+农杆污染外植体)/外植体总数×100％。

实施例4

根据实施例1、2、3，建立红薹芥蓝遗传转化体系：将接种并催芽3d的播种培养基避光生长3d，置于80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养2d，以子叶展平的无菌苗带柄子叶和下胚轴为外植体，避光倒置预培养2d，用侵染培养基重悬后OD₆₀₀为0.4至0.5，28℃摇床200rpm振荡培养60min的活化农杆菌侵染液振荡侵染10min，避光正置共培养2d，在40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下恢复培养，待长出不定芽后筛选培养20d，剥离正常生长的不定芽上单一且完整的绿芽转移至筛选生根培养基两次筛选培养20d，将得到的抗性芽转移至生根培养基培养，待不定根数量多且健壮时开瓶炼苗，移栽缓苗后在总PPFD为160±5μmol·m^-2·s^-1的LED红白光下常规管理，其他操作细节同实施例1。所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3，所述LED红白光中红光与蓝光的光照强度比值为1.7，红光与远红光的光照强度比值为21.3，组培室及栽培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1。

图2是红薹芥蓝遗传转化过程光环境的光谱图。图3是本发明获得的转基因红薹芥蓝植株的遗传转化展示图；其中，1：播种，2：暗处理3d的无菌苗，3：光照2d的无菌苗，4-5：预培养，6-7：共培养，8-9：恢复培养，10：筛选培养，11：筛选生根培养，12：生根培养，13：开盖炼苗，14：套袋缓苗，15-16：转基因植株常规管理。

以pCAMBIA3301-35S-MYC3质粒为阳性对照，野生型红薹芥蓝为阴性对照，无菌水为空白对照，进行PCR检测。由图4可以看出，有11个株系扩增出目标条带，野生型和无菌水未扩增出任何条带。将PCR产物进行测序分析，用NCBI数据库中BLAST网络服务工具对核苷酸序列进行检索和比对，如图5所示，有11个样品与参考序列的相似度达99％。

以野生型红薹芥蓝为阴性对照，分别取序列比对高度相似的11株再生植株新叶于2.0mL离心管，加入GUS染液染色，用95％(体积分数)的乙醇溶液进行脱色。观察叶片染色情况，发现阴性对照叶片呈白色，6株叶片呈蓝色或白色背景上有蓝色，证明6株再生植株成功转化。图6是转化植株GUS染色结果图，其中，1：野生型，2：转基因红薹芥蓝。

综上，本发明建立红薹芥蓝遗传转化体系：以琼脂粉4g，植物凝胶2.5g为固体培养基凝固剂，选用催芽3天后，暗处理3天，80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养2d的无菌幼苗带柄子叶和下胚轴为外植体，避光倒置预培养2d，用重悬后OD₆₀₀为0.4至0.5，28℃摇床200rpm振荡培养40～60min的活化农杆菌侵染液振荡侵染10min，避光正置共培养2d，在光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下恢复培养，待长出不定芽后筛选培养20～30d，剥离其中单一完整的绿芽剥离，转移至筛选生根培养基培养20d，将抗性芽转移至生根培养基培养至不定根数量多且健壮时开瓶炼苗，并在移栽缓苗后于160±5μmol·m^-2·s^-1的LED红白光下常规管理。100个外植体共得到6株转基因红薹芥蓝，转化率为6％。所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3，所述LED红白光中红光与蓝光的光照强度比值为1.7，红光与远红光的光照强度比值为21.3，组培室及栽培室环境条件为22±0.5℃，光周期16h·d^-1。

以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

Claims (7)

1.一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)无菌苗的获得：将红薹芥蓝种子消毒处理后接种于播种培养基，催芽后，暗处理3d、白光处理2d获得无菌苗；

(2)外植体的预培养：切取所述无菌苗的子叶和下胚轴为外植体，分别接入预培养基中避光预培养；

(3)外植体的侵染：采用农杆菌介导方法侵染预培养后的外植体；

(4)外植体的共培养：将侵染后的外植体接种于共培养基进行共培养；

(5)外植体的恢复培养：将共培养后的外植体转移至恢复培养基，于光照强度为40±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光环境中培养20～25d；

(6)外植体的筛选、生根培养：切取恢复培养的外植体长出的不定芽，将所述不定芽转移至筛选培养基中，筛选培养20～30d，之后剥离完整的绿芽，转移至筛选生根培养基，培养20～30d，得到抗性芽；将所述抗性芽转移至生根培养基光照培养20～30d，得到组培苗；

(7)组培苗的炼苗及移栽：将得到的组培苗开盖炼苗，之后栽植至育苗基质中，进行常规管理，之后经阳性检测后获得红薹芥蓝遗传转化阳性植株；

在步骤(1)～(2)和步骤(4)～(6)中，所用培养基的凝固剂均为4g·L^-1的琼脂粉和2.5g·L^-1的植物凝胶。

2.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，在步骤(1)中，所述白光处理具体为光照强度为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光，所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3；所述播种培养基的组成为：2.37g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，调pH至5.86。

3.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，在步骤(2)中，所述避光预培养的条件为：于22℃温度下避光倒置预培养2d；所述预培养基和步骤(4)中所述共培养基的组成均为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，调pH至5.86，灭菌后加0.025mg·L^-1吲哚-3-乙酸，2mg·L^-1反玉米素，7mg·L^-1AgNO₃。

4.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，在步骤(3)中，所述侵染的具体步骤为：将含外源基因的表达载体转入农杆菌中，用侵染培养基重悬菌体，震荡培养，得到农杆菌侵染液，将步骤(2)预培养后的外植体转移至所述农杆菌侵染液中，侵染10min；所述侵染培养基的组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，1.0mg·L^-1乙酰丁香酮，调pH至5.85。

5.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，在步骤(5)中，将共培养2d后的外植体转移至恢复培养基，所述恢复培养基的组成为：4.74g·L^{- 1}MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，调pH至5.88，灭菌后加0.025mg·L^-1吲哚-3-乙酸，2mg·L^-1反玉米素，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1特美汀。

6.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，在步骤(6)中，所述筛选、生根培养的条件均为：在光照强度为80±5μmol·m^-2·s^-1的LED白光下培养20～30d，所述LED白光中红光与蓝光的光照强度比值为2.2，红光与远红光的光照强度比值为3.3；

所述筛选培养基组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，500μL·L^-1植物组培抑菌剂，调pH至5.88，灭菌后加0.05mg·L^-1吲哚-3-乙酸，2mg·L^-1反玉米素，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1特美汀，4mg·L^-1草铵膦；

所述筛选生根培养基组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，500μL·L^-1植物组培抑菌剂，调pH至5.88，灭菌后加0.3mg·L^-1吲哚-3-乙酸，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1mg·L^-1特美汀，6mg·L^-1草铵膦；

所述生根培养基组成为：4.74g·L^-1MS培养基，30g·L^-1蔗糖，4g·L^-1琼脂粉，2.5g·L^-1植物凝胶，500μL·L^-1植物组培抑菌剂，调pH至5.88，灭菌后加0.45mg·L^-1吲哚-3-乙酸，7mg·L^-1AgNO₃，300mg·L^-1特美汀。

7.根据权利要求1所述的一种农杆菌介导的红薹芥蓝遗传转化方法，其特征在于，在步骤(7)中，所述常规管理的光环境为光照强度为160±5μmol·m^-2·s^-1的LED红白光，所述LED红白光中红光与蓝光的光照强度比值为1.7，红光与远红光的光照强度比值为21.3。