CN116515726A - 定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体、突变株及其方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体、突变株及其方法，属于废水生物脱氮领域。本发明利用fepA基因敲除的大肠杆菌突变株，该突变株仅产生一种针对Ca.Brocadia的特异性铁载体，特异性铁载体通过重新分配铁资源，可以实现Ca.Brocadia在厌氧氨氧化(Anammox)生物群落中的定向富集。将上述特异性铁载体应用于Anammox生物反应器进行了废水脱氮处理，30天内Ca.Brocadia占Anammox功能菌的99.9％，与初始相比，Ca.Brocadia绝对丰度提高了2.91倍。添加铁载体的Anammox生物反应器中，总氮去除率和总氮去除效率均高于未添加铁载体反应器，说明该铁载体有利于提升脱氮效能，为废水脱氮的定向调控提供技术储备。
Description
技术领域
本发明属于废水生物脱氮领域，具体涉及一种定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体、突变株及其方法。
背景技术
生物脱氮是解决废水高氮问题经济有效的方式。厌氧氨氧化(Anammox)是一种新型生物脱氮工艺，指在无氧条件下，以氨为电子供体，亚硝酸盐为电子受体，产生氮气的生物过程。相较于传统的废水脱氮工艺，Anammox工艺具有脱氮效率高、运行费用低、能耗低等优点，目前在中国、荷兰、美国、德国、瑞士等都有广泛的Anammox的工程分布，因此Anammox工艺具有应用广、潜力大等优点。
厌氧氨氧化细菌作为核心功能菌驱动了Anammox过程，厌氧氨氧化菌的生长代谢活性影响着Anammox工艺的脱氮效能。然而，厌氧氨氧化菌生长缓慢，倍增时间长(通常需要2～30d)，且对环境因子要求很高，温度、pH、溶解氧等因素波动都会对严重影响厌氧氨氧化菌的生长代谢活性，这也导致Anammox工艺启动周期长、运行不稳定、易崩溃。Ca.Brocadia为厌氧氨氧化细菌模式属，是一类常见的用于厌氧氨氧化工艺的功能菌，对Anammox工艺脱氮效能具有重要作用。从已有的研究分析，Ca.Brocadia在实际工程应用中常被检出，且表现出较好的环境适应能力。然而，Ca.Brocadia在现有污泥中的占比通常在<0.01％至34.52％不等，目前研究尚未实现包括Ca.Brocadia在内的厌氧氨氧化菌的纯培。Ca.Brocadia的富集培养受限，从而影响Anammox工艺的脱氮效能，限制了Anammox工艺进一步的推广与应用。
铁对厌氧氨氧化菌生长代谢至关重要，稳定供应面向厌氧氨氧化菌的铁十分重要。然而铁在环境中的生物有效性很低(10-9～10-18mol·L-1)，微生物可通过产生铁载体实现铁资源的重新分配，来竞争稀缺的Fe3+资源来获得生长优势。肠杆菌素Enterobactin是一类被广泛研究的铁载体，其余游离Fe3+形成铁-铁载体复合物，经微生物外膜特异性受体蛋白进入膜内空间，游离Fe3+被释放后为微生物吸收利用。
Ca.Brocadia自身不产生铁载体，其铁转运蛋白与铁载体enterobactin具有很高的亲和性。因此，亟需制备一种针对Ca.Brocadia特异性铁载体，助于Ca.Brocadia摄取更多铁资源以获得生长优势，用于定向富集Ca.Brocadia，增强Anammox工艺脱氮潜力，拓宽工艺适用范围。
发明内容
本发明的目的在于解决目前厌氧氨氧化工艺中厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia富集培养受限、脱氮效能低的问题，提供了一种定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体、突变株及其方法。该铁载体具有定向调控、快速、高效的特点。
本发明所采用的具体技术方案如下：
第一方面，本发明提供一种能够产生定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的突变株，该突变株的制备步骤如下：
S1：分别扩增fepA序列两端基因片段，将扩增后的两端基因片段通过融合PCR方法连接至一起，得到融合片段。将融合片段重组至自杀载体pHGM01上，得到重组的第一表达质粒；
S2：通过CaCl2法将上述重组的第一表达质粒转化至E.coli WM3064菌株的感受态细胞中诱导表达，得到第二表达质粒；通过接合作用将第二表达质粒转移至E.coli K-12MG1655菌株，并采用含有抗生素的筛选培养基进行筛选培养fepA基因敲除的大肠杆菌突变株。筛选培养基中包括LB营养肉汤、庆大霉素和2,6-二氨基庚二酸。能够在筛选培养基上生长的即为能够产生定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的突变株。
作为优选，上述筛选培养基中2,6-二氨基庚二酸的浓度为50mg/L，庆大霉素的浓度为50mg/L，筛选培养基中LB营养肉汤的配方如下：10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠和15g/L的琼脂粉。
第二方面，本发明提供一种利用第一方面所述的突变株制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，具体如下：
将突变株加至缺铁的M9基础培养基中进行恒温培养。待培养完毕后，将菌液进行第一次离心后得到含有特异性铁载体的第一上清液。将第一上清液通过0.22μm水系滤膜过滤后进行浓缩，待液体完全蒸发留下盐结晶后，加入醇类使特异性铁载体完全溶解后进行第二次离心，得到第二上清液。将第二上清液通过0.22μm有机系滤膜过滤，得到定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体。
作为优选，上述S3中的缺铁的M9基础培养基包括磷酸氢二钠6.78g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵1.0g/L、硫酸镁0.24g/L、葡萄糖4g/L、氯化钙0.011g/L、酪蛋白氨基酸3.0g/L。
作为优选，上述S3中的恒温培养条件如下：在温度为37℃的恒温气浴摇床中，以150r/min的振荡速率培养16～20h。
作为优选，上述S3中的第一次离心过程是在高速离心机中以5000rpm的速率离心5min，第二次离心是在高速离心机中以12000rpm的速率离心15min，S3中的浓缩过程采用旋转蒸发仪。
作为优选，上述S3中的醇类为异丙醇或甲醇。
进一步的，上述醇类为异丙醇。
第三方面，本发明提供一种根据第二方面所述方法制备的定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体。
第四方面，本发明提供一种第三方面所述的铁载体的应用，将该铁载体添加至厌氧氨氧化生物反应器进行废水脱氮处理。
本发明相对于现有技术而言，具有以下有益效果：
(1)本发明提供了一种能够定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的制备方法，该方法通过敲除大肠杆菌中的fepA基因，得到能够产生特异性铁载体的大肠杆菌突变株。大肠杆菌为常见的模式生物，代时短，因此该制备方法操作简单。
(2)本发明制备得到的铁载体能够被厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia特异性吸收与利用，促进Ca.Brocadia竞争获得更多铁资源用于生长代谢。通过实验可知，添加铁载体的生物反应器运行30天后，Ca.Brocadia占功能菌的99％，且绝对丰度达到1.78×1013copies/(gVSS)，是未添加铁载体的生物反应器中Ca.Brocadia绝对丰度的2.60倍。
(3)本发明制备得到的铁载体定向富集Ca.Brocadia有助于提高厌氧氨氧化Anammox工艺的脱氮效能。通过实验可知，添加铁载体的生物反应器运行30天后，总氮去除率较未添加铁载体的反应器提高了15.93％；总氮去除速率较未添加铁载体的反应器提高了20.26％。说明本发明制备的铁载体在废水生物脱氮领域具有广泛的应用潜力。
附图说明
图1为实施例1中FepA序列与Ca.Brocadia的5种转运蛋白序列同源性对比结果；
图2为实施例2中两组生物反应器中总氮去除率(a)和总氮去除速率(b)对比图。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式对本发明做进一步阐述和说明。本发明中各个实施方式的技术特征在没有相互冲突的前提下，均可进行相应组合。
实施例1
本实施例提供一种定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的制备方法，具体制备方法如下：
(1)铁载体转运蛋白与厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia外膜转运蛋白的同源性比对。
根据目前已知的铁载体转运蛋白和Ca.Brocadia外膜转运蛋白的种类与名称，在NCBI平台获得其蛋白序列(FASTA格式)。随后在NCBI平台中，对铁载体转运蛋白与厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia外膜转运蛋白进行BLAST同源性比对，筛选E值小于10-6的铁载体转运蛋白序列。E值越小表明两种序列越相似，即序列同源性越高，当E值小于10-6时表明两种序列同源性很高。
根据上述同源性对比，E.coli K-12MG1655菌株的铁载体enterobactin转运蛋白FepA序列(NCBI中的编号为NC_000913.3)与Ca.Brocadia外膜转运蛋白序列的同源性最高。将该FepA序列与Ca.Brocadia的5种转运蛋白序列进行对比验证，结果如图1所示。发现FepA序列与KKO18117.1蛋白序列的同源性最高，E值为9e-30，KKO20023.1与FepA蛋白序列同源性比对结果为无显著性差异。
(2)基于融合PCR方法构建大肠杆菌突变株
采用引物分别扩增上述fepA序列两端基因片段，将扩增后的两端基因片段通过融合PCR方法连接至一起，得到融合片段。通过Gate BP clonaseⅡenzyme mix(Invitrogen)将融合片段重组至自杀载体pHGM01上，得到重组的表达质粒。扩增过程中采用的引物信息如表1所示。
表1扩增引物名称和序列情况
| 引物名称 | 序列(5’→3’) |
| 5entF | CCAGTCTTCAAACGTGTTCA GTTTTATTCCTGCATTTTTGC |
| 5entR | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTAAAAATCCATACACGC |
| 3entF | TGAACACGTTTGAAGACTGG GATGCTAACGTCAGATTGTTG |
| 3entR | GGGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTTGGTAAAAATCCATACACGC |
通过CaCl2法将上述重组的表达质粒转化至DAP营养缺陷型的E.coli WM3064菌株的感受态细胞中诱导表达，并采用含有抗生素的筛选培养基进行筛选培养。筛选培养基中的组分包括LB营养肉汤(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠和15g/L的琼脂粉)、50mg/L的庆大霉素(Gm)和50mg/L的2,6-二氨基庚二酸(DAP)。筛选培养的条件为：37℃过夜培养。通过接合作用，将得到的质粒从WM3064转移进入至E.coli K-12 MG1655中，即将融合PCR片段整合到K-12 MG1655的基因组上。接着将接合得到的K-12 MG1655接种于含有抗生素的筛选培养基进行筛选培养。筛选培养基中的组分包括LB营养肉汤(10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠和15g/L的琼脂粉)、50mg/L的庆大霉素(Gm)。37℃培养箱过夜培养后，挑选所得的长出的菌，进行PCR验证和测序鉴定。最后，将所得菌接种至LB液体培养基中37℃扩大培养至对数生长期(OD600＝0.4-0.6)，-80℃保藏，最终得到fepA基因精准敲除的大肠杆菌突变株。
筛选培养基中的庆大霉素属于一种抗生素，用于验证生长出来的大肠杆菌突变株中的质粒是否重组成功。E.coli WM3064菌株是一种营养缺陷型的大肠杆菌菌种，没有办法合成DAP，因此需要在培养基中额外添加DAP。
为了验证筛选出来的大肠杆菌突变株中的fepA基因被精准敲除，需要对大肠杆菌突变株进行PCR验证和测序，验证过程用到的引物如表2所示。
表2验证引物名称和序列情况
(3)能够定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的制备与检测。
将步骤(2)中得到的大肠杆菌突变株加至缺铁的M9基础培养基，在37℃的恒温气浴摇床150r/min振荡培养16h。待培养完毕后，将菌液置于高速离心机中，以5000rpm的转速离心5min得到含有特异性铁载体的第一上清液。将第一上清液通过0.22μm水系滤膜过滤后用旋转蒸发仪将滤液浓缩，待液体完全蒸发留下盐结晶后，加入异丙醇使特异性铁载体完全溶解，随后置于高速离心机中，以12000rpm的转速离心15min得到第二上清液。将第二上清液通过0.22μm有机系滤膜过滤，得到能够定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体。
为了验证筛选出来的大肠杆菌突变株能够产生定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体，采用CAS固体培养基平板进行检测。
将活化后的大肠杆菌突变株接种至缺铁的M9基础培养基扩大培养后，采用液体接种法，将4μL菌液接种至CAS固体培养基平板上，并置于37℃培养10～12h，观察菌斑形态以及晕圈大小，橘黄色晕圈直径越大说明产铁载体能力越强。在相同培养时间内，这株大肠杆菌变异株和野生型大肠杆菌的菌斑直径一致，表面光滑，呈圆形，但是两个菌株产生的晕圈直径有明显差异。这株能够高产定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia铁载体的大肠杆菌突变株的菌落周围形成明显的橘黄色晕圈，且直径约为菌斑直径的4倍；而野生型菌株在菌斑周围形成远小于菌斑直径的晕圈，即野生型菌株产生分泌极少量的铁载体。这株大肠杆菌突变株产生的橘黄色晕圈远大于大于野生型菌株分泌的晕圈，说明这株大肠杆菌突变株具有很强的产定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的能力。
上述缺铁的M9基础培养基中包括5×M9基础盐溶液(磷酸氢二钠6.78g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、氯化钠20.5g/L、氯化铵1.0g/L)、硫酸镁0.24g/L、葡萄糖4.0g/L、氯化钙0.11g/L、酪蛋白氨基酸3.0g/L。
实施例2
本实施例提供了一种利用实施例1制备方法得到的定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体在厌氧氨氧化(Anammox)生物反应器中进行了废水脱氮处理的应用。
本实施例同步运行2组相同的Anammox生物反应器(内径4cm，高径比为20，有效体积为1.0L的有机玻璃反应器)，对照组A1未添加任何铁载体，实验组A2添加实施例1制备得到的铁载体。反应器的污泥接种物均来自浙江省某污水处理厂。
2组Anammox生物反应器运行30天内，进水NH4 +-N、NO2 --N浓度分别为140mg/L、160mg/L，Fe3+浓度为17.98μmol/L，其余模拟废水组分同目前已报道的Anammox生物反应器组分一致(如表3所示)，每3天更换1次模拟废水，并测定氨氮、亚硝氮出水浓度。实验组A2中特异性铁载体添加量为17.98μmol/L(与进水Fe3+浓度相同)，随模拟废水溶液一同添加至反应器中，温度依据常规Anammox温度控制。
表3模拟废水组分
Ca.Brocadia绝对丰度变化值具体数据如表4所示。与未添加铁载体的A1相比，运行30天后，A2中Ca.Brocadia的绝对丰度达到1.78×1013copies/(g VSS)，是A1中Ca.Brocadia绝对丰度的2.60倍。与运行第0天时的A2相比，运行30天后，Ca.Brocadia的绝对丰度提高了2.91倍，占Anammox功能菌99.9％。此外，本实施例提供的Anammox系统中厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的绝对丰度比现有研究中厌氧氨氧化菌总绝对丰度还提高了2129.19倍[1]和2.23×106倍[2]，说明了本发明制备得到的铁载体能够定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia。
表4 Ca.Brocadia绝对丰度变化值
实施例1制备得到的铁载体用于厌氧氨氧化Anammox系统的废水脱氮处理效果如图2所示。在0～30天内，未添加铁载体的A1组，总氮去除率从76.33％提高至77.96％，总氮去除率提高了2.13％。而添加铁载体的A2组，总氮去除率从76.33％提高至93.89％，总氮去除率提高了23.00％。结果表明添加了特异性铁载体的A2反应器运行30天后，总氮去除率较未添加铁载体的反应器A1提高了15.93％。
在0～30天内，未添加铁载体的A1组，总氮去除速率从3.82kg N/m3/day提升至3.90kg N/m3/day，总氮去除速率提高了2.09％。而添加铁载体的A2组，总氮去除速率从3.82kg N/m3/day提升至4.69kg N/m3/day，总氮去除速率提高了22.77％。结果表明添加了特异性铁载体的A2反应器运行30天后，总氮去除速率较未添加铁载体的反应器A1提高了20.26％。
综上所述，与未添加铁载体的反应器A1相比，运行末期，添加铁载体的反应器A2总氮去除率、总氮去除速率都有明显提升。本发明制备得到的铁载体能够定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia，Ca.Brocadia作为实现Anammox工艺脱氮的功能菌，定向富集Ca.Brocadia有利于实现Anammox工艺脱氮的定向调控，进一步提升了Anammox工艺的脱氮效能。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，然其并非用以限制本发明。有关技术领域的普通技术人员，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，还可以做出各种变化和变型。因此凡采取等同替换或等效变换的方式所获得的技术方案，均落在本发明的保护范围内。
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Claims (10)
1.一种能够产生定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的突变株，其特征在于，该突变株的制备步骤如下：
S1：分别扩增fepA序列两端基因片段，将扩增后的两端基因片段通过融合PCR方法连接至一起，得到融合片段；将所述融合片段重组至自杀载体pHGM01上，得到重组的第一表达质粒；
S2：通过CaCl2法将所述重组的第一表达质粒转化至E.coli WM3064菌株的感受态细胞中诱导表达，得到第二表达质粒；通过接合作用将第二表达质粒转移至E.coli K-12MG1655菌株，并采用含有抗生素的筛选培养基进行筛选培养fepA基因敲除的大肠杆菌突变株；所述筛选培养基中包括LB营养肉汤、庆大霉素和2,6-二氨基庚二酸；能够在筛选培养基上生长的即为能够产生定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的突变株。
2.根据权利要求1所述的能够产生定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的突变株，其特征在于，所述筛选培养基中2,6-二氨基庚二酸的浓度为50mg/L，庆大霉素的浓度为50mg/L；所述筛选培养基中LB营养肉汤的配方如下：10g/L的胰蛋白胨、5g/L的酵母提取物、5g/L的氯化钠和15g/L的琼脂粉。
3.一种利用权利要求2所述的突变株制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，其特征在于，具体如下：
将所述突变株加至缺铁的M9基础培养基中进行恒温培养；待培养完毕后，将菌液进行第一次离心后得到含有特异性铁载体的第一上清液；将所述第一上清液通过0.22μm水系滤膜过滤后进行浓缩，待液体完全蒸发留下盐结晶后，加入醇类使特异性铁载体完全溶解后进行第二次离心，得到第二上清液；将第二上清液通过0.22μm有机系滤膜过滤，得到定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体。
4.根据权利要求3所述的制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，其特征在于，S3中所述的缺铁的M9基础培养基包括磷酸氢二钠6.78g/L、磷酸二氢钾3.0g/L、氯化钠0.5g/L、氯化铵1.0g/L、硫酸镁0.24g/L、葡萄糖4g/L、氯化钙0.011g/L、酪蛋白氨基酸3.0g/L。
5.根据权利要求3所述的制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，其特征在于，S3中所述的恒温培养条件如下：在温度为37℃的恒温气浴摇床中，以150r/min的振荡速率培养16～20h。
6.根据权利要求3所述的制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，其特征在于，S3中所述的第一次离心过程是在高速离心机中以5000rpm的速率离心5min；所述的第二次离心是在高速离心机中以12000rpm的速率离心15min；S3中所述的浓缩过程采用旋转蒸发仪。
7.根据权利要求3所述的制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，其特征在于，S3中所述的醇类为异丙醇或甲醇。
8.根据权利要求7所述的制备定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体的方法，其特征在于，所述醇类为异丙醇。
9.一种根据权利要求3～8任一所述方法制备的定向富集厌氧氨氧化菌Ca.Brocadia的铁载体。
10.一种权利要求9所述的铁载体的应用，其特征在于，将该铁载体添加至厌氧氨氧化生物反应器进行废水脱氮处理。
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