CN113213644B - 通过培养硝化联合菌群对高浓度氨氮废水进行处理的方法 - Google Patents

通过培养硝化联合菌群对高浓度氨氮废水进行处理的方法 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种通过培养硝化联合菌群对高浓度氨氮废水进行处理的方法。本发明方法包括：氨氧化菌群的活化，氨氧化菌群菌液的培养，亚硝酸盐氧化菌群的筛选，硝化联合菌群的培养，硝化联合菌群对高浓度氨氮废水的处理。硝化联合菌群在短期内（4d）的氨氮去除效率和速率相比于氨氧化菌群分别提升了41.28%和99.17%，最终的亚硝态氮的去除率提升100%。本发明提出的氨氧化菌群和亚硝酸盐氧化菌群联合培养体系，发挥各类细菌之间的协调作用，在低碳氮比下能更快完成对高浓度氨氮的降解，并使该体系具有强的亚硝酸盐氧化活性，最终处理效果高于单一的氨氧化菌群，为生物法处理富营养化水体或高浓度氨氮废水提供技术支持。

Description

通过培养硝化联合菌群对高浓度氨氮废水进行处理的方法
技术领域
本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种硝化联合菌群的培养及其对高浓度氨氮废水处理的方法。
背景技术
氨氮污染作为破坏生态系统的重要因素之一，引起了全球性的关注。目前，随着城市化进程的快速发展，铵态氮（NH4 +-N）可能会通过化粪池或人为垃圾等渠道迅速进入自然水体。同时，未达标的工业废水、养殖废水的排放及垃圾填埋场不当地填埋方式等，都会导致河流、湖泊，甚至地下水中NH4 +-N的增加。研究表明，水体中的NH4 +-N是产生富营养化污染的原因之一，高浓度NH4 +-N的排放也会提高水体中的分子氨（NH3）水平，阻碍氧气在鱼鳃内的传递，导致鱼体行动变得迟缓甚至死亡。水体中存在的NH4 +-N，在氨氧化菌（ammonia-oxidizing bacteria，AOB）的作用下将被氧化成亚硝酸盐（NO2 --N），而长期摄入NO2 --N超标的饮用水则会诱发胃癌和肝癌等。而水中的NO2 --N还会进一步被亚硝酸盐氧化菌（nitrite-oxidizing bacteria，NOB）氧化成NO3 --N。饮用含有高浓度NO3 --N的水同样会致病，如蓝婴综合症。这是一种高铁血红蛋白疾病，其症状表现为皮肤颜色异常、易怒或嗜睡等。由此可知，水体中各种形式的氮都会对水生生物和人体产生负面影响，氮的去除也成为了各国学者长期探讨和研究的课题。
硝化过程（Nitrification）作为水处理中微生物脱氮的第一步，也是决定后续反硝化（Denitrification）脱氮的关键一步。研究发现，污水处理厂中的硝化细菌大多为自养型，它们生长缓慢，受环境变化影响较大，对高有机负荷的抵抗能力不强，同时也无法耐受较高浓度的氨氮和亚硝态氮。而相比于自养型硝化菌，异养型硝化菌具有以下优点：（1）生长速率快，生物量大；（2）具有高硝化能力的同时，还能快速完成对有机物的降解；（3）对极端环境的适应能力强。
此外，许多研究表明，相较于单个菌株，联合菌群在污染物的去除、抗负荷、生境定殖等方面更有优势。菌群可以大大缩短物种间对代谢物、信号分子、遗传物质和防御化合物进行交换的时间与空间，可实现对底物利用的最大化。因此，分离和培养一个具有高硝化功能的联合菌群，并考察它的除氮特征和机制，能够为菌群的生物强化处理应用提供基础。
发明内容
本发明的目的在于通过培养一个具有高硝化活性的联合菌群，对高浓度氨氮废水进行处理的方法，为富营养化水体治理提供新的方案。
本发明提供的通过培养硝化联合菌群，对高浓度氨氮废水进行处理的方法，具体步骤如下：
（1）氨氧化菌群的活化：将氨氧化菌群-甘油混合物从冰箱中取出，溶解后无菌接种于含有氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养7～10d，即得到活化的氨氧化菌群；
这里，冰箱温度一般为－80 ～－70℃，氨氧化菌群-甘油混合物从冰箱中取出后，需待其完全融化；恒温摇床中培养条件优选为温度28～32℃，转速140～160 rpm；
（2）氨氧化菌群菌液的培养：将步骤（1）中活化后的菌种转接至新鲜的氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养（培养条件同上）；7～10d后测定培养基内NH4 +-N含量，计算NH4 +-N去除率，并转接至新的氨氧化菌富集培养基中；如此重复转接、培养2~4次，每次均在7-10d后测定培养基内NH4 +-N含量，并计算NH4 +-N去除率，直到NH4 +-N去除率达到稳定；
（3）亚硝酸盐氧化菌群的筛选：富集样品等量10～15 g，接入0.8%的生理盐水中，加入磁子，置于磁力搅拌器上充分搅拌1～2 h，制成样品悬液；取悬液无菌接入新鲜的亚硝酸盐氧化菌富集培养基中，置于28～32℃、140～160 rpm恒温振荡培养；富集7 ～10d后，转接至新的培养基中；重复转接、富集5～7次后，测定溶液中NO2 --N、NO3 --N的含量；计算NO2 --N去除效率，取去除率最高的菌群，用于下一步实验；
（4）硝化联合菌群的培养：取步骤（2）中的氨氧化菌群培养液和步骤（3）中亚硝酸盐氧化菌群培养液，在无菌条件下等量接入含有氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养，温度和转速同样设定为28～32℃，140～160 rpm；富集7～10d后转接至新鲜的氨氧化菌富集培养基内；重复转接并富集5~7次，测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，计算NH4 +-N和NO2 --N去除效果，取去除效果最高的菌群，用于下一步实验。
（5）硝化联合菌群对高氨氮废水的处理：取10～15ml联合菌群培养液于离心管内，经9000～12000rpm、3-5℃（优选4℃）下高速冷冻离心8～15 min，弃掉上清液，将联合菌群沉淀溶于含有人工合成高浓度氨氮废水的三角烧瓶中，定时取样测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化。
处理结束后，NH4 +-N去除率与单一的氨氧化菌群相比提升了39.87-43.61%，且最终的NO2 --N积累量下降了99.68-100%。
本发明中，亚硝酸盐氧化菌群筛选中的富集样品来源于市售菌剂，筛选出的亚硝酸盐氧化菌群经微生物多样性分析得出，存在有大量异养型微生物。
本发明中，氨氧化菌富集培养基配方为：无水丁二酸钠1.0g，氯化铵1.0g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，碳酸钙 2.0g, 去离子水1L。用1mol·L-1的盐酸溶液调节pH至6，在121℃高压蒸汽灭菌30min。待其冷却至室温后，加入经过滤除菌后且浓度为75g·L-1的碳酸氢钠溶液调节pH至8，最后再加入高温高压灭菌后的微量元素0.5ml/100ml。
本发明中，亚硝酸盐氧化菌富集培养基配方为：无水丁二酸钠1.0g，亚硝酸钠0.25g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，碳酸钙 2.0g, 去离子水1L。用1mol·L-1的盐酸溶液调节pH至5.5，在121℃高压蒸汽灭菌30min。待其冷却至室温后，加入经过滤除菌后且浓度为75g·L-1的碳酸氢钠溶液调节pH至8-8.5，最后再加入高温高压灭菌后的微量元素0.5ml/100ml。
本发明中，高氨氮废水（人工合成）成为分为：无水丁二酸钠1.0g，氯化铵1.0g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，无水氯化钙0.075g, 去离子水1L。用1mol·L-1的盐酸溶液调节pH至6，在121℃高压蒸汽灭菌30min。待其冷却至室温后，加入经过滤除菌后且浓度为75g·L-1的碳酸氢钠溶液调节pH至8，最后再加入高温高压灭菌后的微量元素0.5ml/100ml。
本发明中，微量元素组成为：二水合钼酸钠0.01g，四水合氯化锰0.02g，六水合氯化钴0.0002g，七水合硫酸亚铁0.77g，五水硫酸铜0.002g，七水合硫酸锌0.01g， EDTA二钠1.03g，去离子水1 L。
本发明提出的氨氧化菌群和亚硝酸盐氧化菌群的联合培养体系，大大提高了各类细菌之间的协作。如氨氧化菌在氨氧化过程中产生的亚硝态氮，可以被亚硝酸盐氧化菌进一步去除，而亚硝酸盐氧化菌群中一些具有潜在氨氧化能力的微生物又能参与对高氨氮废水的快速降解。此外，在高氨氮废水处理过程中，联合菌群的氮代谢相关基因的表达与氨氧化菌群相比也得到显著上调。因此，氨氧化菌群与亚硝酸盐氧化菌群的联合培养不仅能实现对底物利用的最大化，同时还能激发各类微生物的氮转化潜能。
本发明的优点在于：将氨氧化菌群和亚硝酸盐氧化菌群联合培养后得到的硝化联合菌群，可发挥各类细菌之间的协调作用，在低碳氮比下能更快完成对高浓度氨氮的降解，不仅具有比单一氨氧化菌群更好的氨氮去除效果，同时还具备高效的亚硝酸盐氧化活性；使最终处理效果高于单一的氨氧化菌群，可为生物法处理富营养化水体或高浓度氨氮废水提供技术支持。
附图说明
图1为单一氨氧化菌群与本发明得到的硝化联合菌群在处理高浓度氨氮废水过程中的硝化特性。
图2为单一氨氧化菌群与本发明得到的硝化联合菌群分别处理高浓度氨氮废水12d后菌群的氮代谢基因表达差异。
具体实施方式
下面通过具体实施例，进一步介绍本发明。
实施例1
（1）将氨氧化菌群从-80℃冰箱中取出，待其完全融化后无菌接种于含有100ml氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养，温度30℃，转速150rpm，培养至8d后，即得到活化的氨氧化菌群。
（2）将步骤（1）中活化后的菌种以10%（v/v）转接至90ml新鲜的氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度30℃，转速150rpm，8d后测定培养基内NH4 +-N含量，计算NH4 +-N去除率，经3次转接直至NH4 +-N去除率稳定，备用于联合培养实验。
（3）将富集样品等量（12.0 g）分成3份，分别接入100 mL0.8%的生理盐水中，加入磁子，置于磁力搅拌器上充分搅拌1h，制成样品悬液。取悬液10mL无菌接入90mL新鲜的亚硝酸盐氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度30℃，转速150rpm。8d后，以10%（v/v）转接至新的培养基中。重复前述步骤6次后，测定溶液中NO2 --N、NO3 --N的含量。计算NO2 --N去除效率，取去除率最高的菌群，备用于联合培养实验。
（4）取步骤（2）中的氨氧化菌群培养液和步骤（3）中亚硝酸盐氧化菌群培养液各按5%（v/v）无菌接入含有90ml氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，分别设置三组平行，置于恒温摇床中培养，温度30℃，转速150rpm。8d后，再按10%（v/v）的接种量进行转接。重复前述步骤6次后，测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，计算NH4 +-N和NO2 --N去除效果，取去除效果最高的菌群，用于高氨氮废水处理实验。
（5）取12ml联合菌群培养液于离心管内，经10000rpm、4℃下高速冷冻离心10 min，弃掉上清液，将联合菌群沉淀溶于含有150ml人工合成高浓度氨氮废水的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养12d，温度30℃，转速150rpm。每2d取样测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，并在培养结束时取样做宏基因组测序，共设置三组平行。
（6）结果
结果表明（图1），经联合培养后得到的硝化联合菌群在4d内对NH4 +-N的去除效率与单一的氨氧化菌群相比提高了41.28%。此外，经硝化联合菌群处理10d后的高浓度氨氮废水，其NO2 --N积累量与单一的氨氧化菌群相比下降了99.98%。氮代谢相关基因表达差异（图2）得出，硝化联合菌群的amoABC（氨单加氧酶）、hao（羟胺氧化酶）和nxrAB（亚硝酸氧化还原酶）这三种与硝化过程相关的功能基因，它们的相对丰度与氨氧化菌群相比分别上调了590.57%、96.00%和19.27%；与反硝化相关的narGHI、napAB（硝酸还原酶）、nirK（亚硝酸还原酶）、norBC（一氧化氮还原酶）和nosZ（一氧化二氮还原酶）基因，它们的相对丰度与单一的氨氧化菌群相比分别上调了9.86%、19.15%、46.15%、27.16%和108.57%，这也说明了硝化联合菌群可能具有比单一的氨氧化菌群更强的反硝化能力。此外，nasA（同化硝酸还原酶）基因的相对丰度上调了193.94%；而与氨氧化菌群相比出现下调的基因有nirS（亚硝酸还原酶/羟胺还原酶）和nirBD（异化亚硝酸还原酶）。
实施例2
（1）将氨氧化菌群从-75℃冰箱中取出，待其完全融化后无菌接种于含有100ml氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养，温度28℃，转速160rpm，培养至10d后，即得到活化的氨氧化菌群。
（2）将步骤（1）中活化后的菌种以10%（v/v）转接至90ml新鲜的氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度28℃，转速160rpm，10d后测定培养基内NH4 +-N含量，计算NH4 +-N去除率，经多次转接直至NH4 +-N去除率稳定，备用于联合培养实验。
（3）将富集样品等量（15.0 g）分成3份，分别接入100 mL0.8%的生理盐水中，加入磁子，置于磁力搅拌器上充分搅拌2h，制成样品悬液。取悬液10mL无菌接入90mL新鲜的亚硝酸盐氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度28℃，转速160rpm。10d后，以10%（v/v）转接至新的培养基中。重复前述步骤7次后，测定溶液中NO2 --N、NO3 --N的含量。计算NO2 --N去除效率，取去除率最高的菌群，备用于联合培养实验。
（4）取步骤（2）中的氨氧化菌群培养液和步骤（3）中亚硝酸盐氧化菌群培养液各按5%（v/v）无菌接入含有90ml氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，分别设置三组平行，置于恒温摇床中培养，温度28℃，转速160rpm。10d后，再按10%（v/v）的接种量进行转接。重复前述步骤7次后，测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，计算NH4 +-N和NO2 --N去除效果，取去除效果最高的菌群，用于高氨氮废水处理实验。
（5）取15ml联合菌群培养液于离心管内，经9000rpm、5℃下高速冷冻离心15 min，弃掉上清液，将联合菌群沉淀溶于含有150ml人工合成高浓度氨氮废水的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养12d，温度28℃，转速160rpm。每2d取样测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，并在培养结束时取样做宏基因组测序，共设置三组平行。
（6）结果
其结果与实施例1相似，经联合培养后得到的硝化联合菌群在4d内对NH4 +-N的去除效率与氨氧化菌群相比提高了39.87%。此外，经硝化联合菌群处理10d后的高浓度氨氮废水，其NO2 --N积累量与单一的氨氧化菌群相比下降了99.68%。氮代谢相关基因表达的变化趋势也与实施例1相似，硝化联合菌群的amoABC（氨单加氧酶）、hao（羟胺氧化酶）和nxrAB（亚硝酸氧化还原酶）基因表达的相对丰度与单一的氨氧化菌群相比分别上调了530.57%、88.25%和10.09%；narGHI、napAB（硝酸还原酶）、nirK（亚硝酸还原酶）、norBC（一氧化氮还原酶）和nosZ（一氧化二氮还原酶）基因表达的相对丰度分别上调了10.33%、21.86%、42.45%、34.88%和92.67%；nasA（同化硝酸还原酶）基因的相对丰度上调了218.01%；而nirS（亚硝酸还原酶/羟胺还原酶）和nirBD（异化亚硝酸还原酶）基因的表达同样出现下调。
实施例3
（1）将氨氧化菌群从-70℃冰箱中取出，待其完全融化后无菌接种于含有100ml氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养，温度32℃，转速160rpm，培养至7d后，即得到活化的氨氧化菌群。
（2）将步骤（1）中活化后的菌种以10%（v/v）转接至90ml新鲜的氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度32℃，转速140rpm，10d后测定培养基内NH4 +-N含量，计算NH4 +-N去除率，经多次转接直至NH4 +-N去除率稳定，备用于联合培养实验。
（3）将富集样品等量（10.0 g）分成3份，分别接入100 mL0.8%的生理盐水中，加入磁子，置于磁力搅拌器上充分搅拌1h，制成样品悬液。取悬液10mL无菌接入90mL新鲜的亚硝酸盐氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度32℃，转速140rpm。7d后，以10%（v/v）转接至新的培养基中。重复前述步骤5次后，测定溶液中NO2 --N、NO3 --N的含量。计算NO2 --N去除效率，取去除率最高的菌群，备用于联合培养实验。
（4）取步骤（2）中的氨氧化菌群培养液和步骤（3）中亚硝酸盐氧化菌群培养液各按5%（v/v）无菌接入含有90ml氨氧化菌富集培养基的三角烧瓶中，分别设置三组平行，置于恒温摇床中培养，温度32℃，转速140rpm。7d后，再按10%（v/v）的接种量进行转接。重复前述步骤5次后，测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，计算NH4 +-N和NO2 --N去除效果，取去除效果最高的菌群，用于高氨氮废水处理实验。
（5）取10ml联合菌群培养液于离心管内，经12000rpm、3℃下高速冷冻离心8 min，弃掉上清液，将联合菌群沉淀溶于含有150ml人工合成高浓度氨氮废水的三角烧瓶中，置于恒温摇床中培养12d，温度32℃，转速140rpm。每2d取样测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，并在培养结束时取样做宏基因组测序，共设置三组平行。
（6）结果
其结果与实施例1相似，经联合培养后得到的硝化联合菌群在4d内对NH4 +-N的去除效率与氨氧化菌群相比提高了43.61%。此外，经硝化联合菌群处理10d后的高浓度氨氮废水，其NO2 --N积累量与单一的氨氧化菌群相比下降了100%。氮代谢相关基因表达的变化趋势也与实施例1相似，硝化联合菌群的amoABC（氨单加氧酶）、hao（羟胺氧化酶）和nxrAB（亚硝酸氧化还原酶）基因表达的相对丰度与单一的氨氧化菌群相比分别上调了612.11%、105.60%和25.33%；narGHI、napAB（硝酸还原酶）、nirK（亚硝酸还原酶）、norBC（一氧化氮还原酶）和nosZ（一氧化二氮还原酶）基因表达的相对丰度分别上调了7.25%、18.06%、52.33%、20、86%和100.23%；nasA（同化硝酸还原酶）基因的相对丰度上调了180.79%；而nirS（亚硝酸还原酶/羟胺还原酶）和nirBD（异化亚硝酸还原酶）基因的表达同样出现下调。

Claims (6)

1.一种通过培养硝化联合菌群对高浓度氨氮废水进行处理的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）氨氧化菌群的活化：将氨氧化菌群-甘油混合物从冰箱中取出，溶解后无菌接种于含有氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养7～10d，即得到活化的氨氧化菌群；
（2）氨氧化菌群菌液的培养：将步骤（1）中活化后的菌种转接至新鲜的氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养7～10d，然后测定培养基内NH4 +-N含量，计算NH4 +-N去除率，并转接至新的氨氧化菌富集培养基中；重复转接、培养2~4次，每次均在7-10d后测定培养基内NH4 +-N含量，并计算NH4 +-N去除率，直到NH4 +-N去除率达到稳定；
（3）亚硝酸盐氧化菌群的筛选：把富集样品10～15 g，接入0.8%的生理盐水中，加入磁子，置于磁力搅拌器上充分搅拌1～2 h，制成样品悬液；取悬液无菌接入新鲜的亚硝酸盐氧化菌富集培养基中，置于28～32℃、140～160 rpm恒温振荡培养；富集7 ～10d后，转接至新的培养基中；重复转接、富集5～7次后，测定溶液中NO2 --N、NO3 --N的含量；计算NO2 --N去除效率，取去除率最高的菌群；
（4）硝化联合菌群的培养：取步骤（2）中的氨氧化菌群培养液和步骤（3）中亚硝酸盐氧化菌群培养液，在无菌条件下等量接入含有氨氧化菌富集培养基中，置于恒温摇床中培养，温度和转速同样设定为28～32℃，140～160 rpm；富集7～10d后转接至新鲜的氨氧化菌富集培养基内；重复转接并富集5~7次，测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化，计算NH4 +-N和NO2 --N去除效果，取去除效果最高的菌群；
（5）硝化联合菌群对高氨氮废水的处理：取10～15ml联合菌群培养液于离心管内，经9000～12000rpm、3-5℃下高速冷冻离心8～15 min，弃掉上清液，将联合菌群沉淀溶于含有高浓度氨氮废水的三角烧瓶中，定时取样测溶液中NH4 +-N、NO2 --N和NO3 --N含量的变化。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中所述恒温摇床中培养，为温度28～32℃，转速140～160 rpm。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（1）中，氨氧化菌富集培养基配方为：无水丁二酸钠1.0g，氯化铵1.0g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，碳酸钙 2.0g, 去离子水1L；用1mol·L-1的盐酸溶液调节pH至6，在121℃高压蒸汽灭菌30min；待其冷却至室温后，加入经过滤除菌后且浓度为75g·L-1的碳酸氢钠溶液调节pH至8，最后再加入高温高压灭菌后的微量元素0.5ml/100ml。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（2）中，亚硝酸盐氧化菌富集培养基配方为：无水丁二酸钠1.0g，亚硝酸钠0.25g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，碳酸钙2.0g, 去离子水1L；用1mol·L-1的盐酸溶液调节pH至5.5，在121℃高压蒸汽灭菌30min；待其冷却至室温后，加入经过滤除菌后且浓度为75g·L-1的碳酸氢钠溶液调节pH至8-8.5，最后再加入高温高压灭菌后的微量元素0.5ml/100ml。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤（5）中高氨氮废水成分为：无水丁二酸钠1.0g，氯化铵1.0g，磷酸二氢钾0.2g，无水硫酸镁0.1g，无水氯化钙0.075g, 去离子水1L；用1mol·L-1的盐酸溶液调节pH至6，在121℃高压蒸汽灭菌30min；待其冷却至室温后，加入经过滤除菌后且浓度为75g·L-1的碳酸氢钠溶液调节pH至8，最后再加入高温高压灭菌后的微量元素0.5ml/100ml。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述微量元素成分为：二水合钼酸钠0.01g，四水合氯化锰0.02g，六水合氯化钴0.0002g，七水合硫酸亚铁0.77g，五水硫酸铜0.002g，七水合硫酸锌0.01g， EDTA二钠1.03g，去离子水1 L。
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