CN112300969A - 氨氧化细菌培养基及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及氨氧化细菌培养基及其制备方法，每一升所述氨氧化细菌培养基中按重量份计包括以下组分：硫酸铵3.3g/L、磷酸二氢钾5.88g/L、硫酸镁0.0879g/L、氯化钙0.0201g/L、硫酸亚铁0.00152g/L、硫酸铜0.851×10‑4g/L、磷酸二氢钠0.4667g/L、氢氧化钠2.67g/L，以及，碳酸氢钠1.8～2.2g/L。相比传统氨氧化细菌培养基改进了无机碳源的种类，碳酸氢钠代替碳酸钠可为氨氧化细菌提供更丰富的碳源和更强的缓冲环境。本发明所提供的氨氧化细菌培养基能够促进氨氧化细菌自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程进行，有利于氨氧化细菌的稳定生长和繁殖。

Description

氨氧化细菌培养基及其制备方法
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及氨氧化细菌培养基及其制备方法。
背景技术
氨氮是水体中最主要的污染物之一，偏碱环境下，氨氮会对水生生物造成毒性；氨氮被氧化为硝态氮和亚硝酸盐会引起水华。随着工农业生产的发展，氨氮的污染日益加重，成为污水处理领域亟待解决的问题之一，也是国家重点监测的环境指标之一。氨氧化细菌依靠氨氧化作用去除氨氮，先由氨单加氧酶将氨氮转化为羟胺，再通过羟胺还原酶还原为亚硝态氮。随后，亚硝态氮可以由亚硝酸盐氧化细菌转化为硝酸盐，再由反硝化细菌逐步还原为氮气，从水体中释放，从而达到彻底脱氮的效果。也可以通过短程反硝化或厌氧氨氧化的方式直接脱氮。因此，氨氧化细菌的代谢是生物脱氮的关键步骤。
研究者早在1895年就发现了氨氧化现象，从上世纪中叶开始，关于氨氧化细菌的生理生化特性及其应用研究也从未间断。然而氨氧化细菌菌剂目前并没有大规模工业应用，其原因在于：它是一种化能自养细菌，生长缓慢，对温度、pH值、溶解氧、重金属等因素敏感。在污水处理系统中，这类菌难以形成优势菌群且容易受环境因素冲击，削弱系统的氨氮去除能力，是难培养微生物的模式菌株，进行纯化单菌操作极为困难。
氨氧化细菌氨氧化过程的产物是亚硝酸根和氢离子，培养基中的氢离子积累会导致pH下降，且氢离子与亚硝酸根二者结合会形成游离亚硝酸。在批次培养时，培养基中氨氧化细菌生长最终会受到低pH和高浓度游离亚硝酸的影响而停止生长。因此在氨氧化细菌的培养过程中，对培养基的要求越来越高。培养基的营养成为对菌种生长、繁殖和转化氨氮的速率有重要的影响。它既要求氨氧化细菌转接后能迅速生长，又要使氨氧化细菌较多地利用培养基中的营养，最终获得大量的氨氧化细菌。一个适当的培养基配方，对氨氧化细菌的生长有着极大的影响。
目前氨氧化细菌的培养基组成基本都是参照美国菌种保藏中心提供的欧洲亚硝化单胞菌培养基配方(https://www.atcc.org/Products/All/19718.aspx，ATCC medium:2265)。该配方以浓度为0.4g/L碳酸钠作为无机碳源，培养基中碳酸钠初始碱度为0.378g/L(以碳酸钙计)。由于碳酸的第1步电离要比第2步电离强得多，故碳酸钠水解程度及提高pH能力大于同样可以做无机碳源的碳酸氢钠。该配方中碳酸钠为培养基提供碳源时也提高了培养基的碱度和pH，为使培养基中初始pH处于适宜氨氧化细菌生长范围内，碳酸钠投加量不宜过大。氨氧化细菌氧化1g氨氮时会消耗7.14g碱度以平衡氨氧化过程产生的H+。由于该培养基中碳酸钠的添加量受初始pH限制不宜过高故培养基中的碱度有限。随着氨氧化细菌生长过程中碱度被消耗，pH将很快下降至抑制氨氧化菌生长的范围，因此氨氧化细菌营养利用率低且氨氧化细菌的生长较为缓慢。
因此，如何从培养基中的无机碳源种类角度出发，开发一种能够使氨氧化细菌菌体稳定、快速生长而更大程度地利用所提供的营养的培养基，对于氨氧化菌的培养及应用具有重要的价值。
发明内容
本发明人等基于现有技术中存在的问题，经过深入研究后发现，通过采用本发明的氨氧化细菌培养基，能够获得快速、稳定培养氨氧化细菌并且具有较长生长期的预料不到的效果，从而完成了本发明。
具体地，本发明包括下述的技术方案：
一方面，本发明提供了一种氨氧化细菌培养基，每一升所述氨氧化细菌培养基中按重量份计包括以下组分：
硫酸铵3.3g/L、磷酸二氢钾5.88g/L、硫酸镁0.0879g/L、氯化钙0.0201g/L、硫酸亚铁0.00152g/L、硫酸铜0.851×10-4g/L、磷酸二氢钠0.4667g/L、氢氧化钠2.67g/L,
以及，碳酸氢钠1.8～2.2g/L。
本发明的氨氧化细菌培养基中，通过使用碳酸氢钠作为碳源的同时，还能提供碱度。相比碳酸钠，碳酸氢钠的碱度较小，在保证培养基中初始pH适宜氨氧化菌生长的前提下，投加量比碳酸钠更多。由于碳酸氢钠既能结合初始培养基中的OH-也能结合氨氧化菌氨氧化产生的H+，因此选用碳酸氢钠作为碳源时，既能提供较为丰富的碳源又能提供缓冲能力更强的环境，有利于氨氧化细菌生长和培养基中氮源的利用；进一步，通过在培养基中添加硫酸铵，为氨氧化细菌生长提供了丰富的氮源；通过添加磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁和硫酸铜，促进氨氧化细菌自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程进行；通过添加磷酸二氢钾、磷酸二氢钠和氢氧化钠，与碳酸氢钠一起组成缓冲体系，维持培养基中的酸碱平衡。通过采用本发明的氨氧化细菌培养基，能够获得优良的、适用性广泛的氨氧化细菌培养基。
本发明的氨氧化细菌培养基尤其对于培养欧洲亚硝化单胞菌(氨氧化细菌典型模式菌种)具有较好的效果，能够使菌体生长稳定，最终细菌浓度高，培养基中的氮源利用程度更高。
另一方面，本发明还提供前述的本发明的氨氧化细菌培养基的制备方法，其包括以下步骤：
(1)每1L水加入硫酸铵4.125g、磷酸二氢钾0.5167g、硫酸镁0.0251g、氯化钙0.0019g，然后加入2.28mg硫酸亚铁和1.07mg硫酸铜，混合搅拌均匀；
(2)将磷酸二氢钾、磷酸二氢钠及超纯水按8.2：0.7：300的比例混合搅拌均匀；
(3)向前述步骤(2)中得到的混合溶液中加入浓度为10N的氢氧化钠，直至溶液pH为8；
(4)将前述步骤(1)得到的溶液和前述步骤(3)得到的溶液按体积比4:1的比例混合均匀后进行灭菌；
(5)将浓度为66.67g/L的碳酸氢钠溶液经除菌后，加入到前述步骤(4)得到的混合物中，使碳酸氢钠最终浓度为2g/L，混匀后得到所述氨氧化细菌培养基。
本发明的氨氧化细菌培养基的制备方法中，优选地，前述步骤(4)中的灭菌为高温高压灭菌，灭菌时间优选为15～30min，灭菌温度优选为121～122℃。
本发明的氨氧化细菌培养基的制备方法中，优选地，前述步骤(5)中的前述除菌的方法为滤膜过滤除菌，前述除菌中使用的滤膜优选为0.22um或0.45um的聚醚砜滤膜。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明提供的氨氧化细菌培养基，碳酸氢钠作为碳源，既能提供较为丰富的碳源又能提供缓冲能力更强的环境，有利于氨氧化细菌生长和培养基中氮源的利用；通过使用磷酸二氢钾、硫酸镁、氯化钙、硫酸亚铁、硫酸铜配合，能够促进氨氧化细菌自身对于营养物质的吸收以及相关代谢过程的进行，有利于刺激氨氧化细菌的稳定生长和繁殖；同时硫酸铵为氨氧化细菌生长提供了丰富的氮源，保证了氨氧化细菌足够的能量摄取；磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、氢氧化钠与碳酸氢钠一起组成缓冲体系，为氨氧化细菌生长提供了稳定的酸碱度。因此，本发明的氨氧化细菌培养基能够促进氨氧化细菌的良好生长，具有良好的应用前景。
本发明的氨氧化细菌培养基的制备方法中，除培养基成分中的碳酸氢钠由于在高温高压下会分解为碳酸钠因而采用过滤灭菌之外，培养基中其余成分均可采用高温高压灭菌。相对于美国菌种保藏中心提供的欧洲亚硝化单胞菌培养基配方中要求的整体过滤灭菌，本发明的氨氧化细菌培养基的制备方法更易操作，氨氧化细菌不易被污染。
附图说明
图1示出实施例1和对比例1中OD 600nm变化情况。
图2示出实施例1和对比例1中亚硝氮浓度变化情况。
图3示出实施例1和对比例1中pH变化情况。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：
制备按总体积计包括以下组分的氨氧化细菌培养基：碳酸氢钠2g/L，硫酸铵3.3g/L，磷酸二氢钾5.88g/L，硫酸镁0.0879g/L，氯化钙0.0201g/L,硫酸亚铁0.00152g，硫酸铜0.0851mg/L，磷酸二氢钠0.4667g/L，氢氧化钠2.67g/L。
制备方法：
(1)将(1)每1L水加入硫酸铵4.125g、磷酸二氢钾0.5167g、硫酸镁0.0251g、氯化钙0.0019g，另取2.28mg硫酸亚铁和1.07mg硫酸铜加入上述溶液中，混合搅拌均匀；
(2)将磷酸二氢钾、磷酸二氢钠、超纯水按8.2：0.7：300的比例混合搅拌均匀；
(3)将步骤(2)中混合溶液加入浓度为10N氢氧化钠至溶液pH为8；
(4)将步骤(1)和步骤(3)中溶液按4:1比例混合均匀后灭菌；
(5)将浓度为66.67g/L的碳酸氢钠溶液经除菌后，加入到步骤(4)得到的混合物中，使碳酸氢钠终浓度为2g/L，混匀后得到所述氨氧化细菌培养基。
对比例1：
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例不包括碳酸氢钠，而是将0.6g无水碳酸钠加入到步骤(4)得到的混合物中，其余均与实施例相同，混匀后得到对比例1的氨氧化细菌培养基。
将实施例1和对比例1分别转接入等量欧洲亚硝化单胞菌(Nitrosomonaseuropaea,
Figure BDA0002790653910000051
19718TM)进行培养，将该菌置于30℃，180r/min的摇床中遮光培养，每隔12h取样一次，记录菌种生长情况，测定菌液的OD 600nm值、培养基中亚硝氮浓度和培养基中的pH，具体结果分别如说明书附图1～3所示。
实施例1中碳酸氢钠提供的碱度为2.383g/L(以碳酸钙计)，而对比例1中碳酸钠的碱度为0.378g/L(以碳酸钙计)，前者约为后者6.3倍。通过实施例1与对比例1的对比可知，本发明的培养基中碳酸钠换成碳酸氢钠后，虽然初始pH相差不大，但欧洲亚硝化单胞菌的生长具有明显差别。说明本发明所提供的培养基相比传统添加碳酸钠的氨氧化细菌培养基能够促进欧洲亚硝化单胞菌的生长，使其氨氧化作用明显；且在本发明所提供的培养基中细菌整体生长期长，氮源利用率高，最终可获得的菌量大。本发明提供的氨氧化细菌培养基对氨氧化细菌模式菌株——欧洲亚硝化单胞菌培养效果较为突出。
实施例2：
实施例2中培养基配方和配制方法与实施例1相同。
取0.1mL的OD值为2浓缩自实施例1欧洲亚硝化单胞菌，经2.4KV/1mm的电转后转移至500mL新鲜的实施例1中培养基。经过48h的30℃，180r/min培养，实施例1中氨氮消耗量为350mg/L，OD600nm值为0.05。
对比例2：
对比例2中培养基配方和配制方法与对比例1相同。
取0.1mL的OD值为2浓缩自对比例1中对数生长期的欧洲亚硝化单胞菌，经2.4KV/1mm电转后转移至500mL新鲜对比例1中培养基。经过48h的30℃，180r/min培养，对比例中氨氮消耗量为150mg/L，OD 600nm值为0.02左右。
通过实施例2与对比例2的对比可知，当培养基中碳酸钠换成碳酸氢钠后，欧洲亚硝化单胞菌经电转后复苏效果较为突出。针对氨氧化细菌的克隆技术的难点在于氨氧化细菌生长缓慢，采用实施例1、2中的培养基则可实现氨氧化细菌电转后快速复苏，有利于氨氧化细菌的后续克隆技术操作。
对比例3：
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在步骤(5)将浓度为66.67g/L的碳酸氢钠溶液经除菌后，加入到步骤(4)得到的混合物中，使碳酸氢钠终浓度为4g/L，混匀后得到对比例3，其余均与实施例1。
对比例4：
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在步骤(5)将浓度为66.67g/L的碳酸氢钠溶液经除菌后，加入到步骤(4)得到的混合物中，使碳酸氢钠终浓度为6g/L，混匀后得到对比例3，其余均与实施例1。
对比例5：
本对比例与实施例1的区别在于，本对比例在步骤(5)将浓度为66.67g/L的碳酸氢钠溶液经除菌后，加入到步骤(4)得到的混合物中，使碳酸氢钠终浓度为8g/L，混匀后得到对比例3，其余均与实施例1。
将实施例1与对比例3、4、5分别分别转接入等量欧洲亚硝化单胞菌进行培养，将该菌置于30℃，180r/min的摇床中遮光培养，记录菌种生长情况。结果证明，只有实施例1中欧洲亚硝化单胞菌的菌量有明显增长，对比例3、4、5中欧洲亚硝化单胞菌均无生长现象。综上，本发明提供的氨氧化细菌培养基中的碳酸氢钠含量适宜欧洲亚硝化单胞菌生长。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的微生物培养基及其制备方法与应用，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见得的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

Claims (4)

1.一种氨氧化细菌培养基，其特征在于，每一升所述氨氧化细菌培养基中按质量浓度计包括以下组分：
硫酸铵3.3g/L、磷酸二氢钾5.88g/L、硫酸镁0.0879g/L、氯化钙0.0201g/L、硫酸亚铁0.00152g/L、硫酸铜0.851×10-4g/L、磷酸二氢钠0.4667g/L、氢氧化钠2.67g/L,
以及，碳酸氢钠1.8～2.2g/L。
2.权利要求1所述的氨氧化细菌培养基的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
(1)每1L水加入硫酸铵4.125g、磷酸二氢钾0.5167g、硫酸镁0.0251g、氯化钙0.0019g，然后加入2.28mg硫酸亚铁和1.07mg硫酸铜，混合搅拌均匀；
(2)将磷酸二氢钾、磷酸二氢钠及超纯水按8.2：0.7：300的比例混合搅拌均匀；
(3)向所述步骤(2)中得到的混合溶液中加入浓度为10N的氢氧化钠，直至溶液pH为7.8～8.2；
(4)将所述步骤(1)得到的溶液和所述步骤(3)得到的溶液按体积比4:1的比例混合均匀后进行灭菌；
(5)将浓度为66.67g/L的碳酸氢钠溶液经除菌后，加入到所述步骤(4)得到的混合物中，使碳酸氢钠最终浓度为1.8～2.2g/L，混匀后得到所述氨氧化细菌培养基。
3.根据权利要求2中所述的制备方法，其中，
所述步骤(4)中所述灭菌为高温高压灭菌，灭菌时间为15～30min，灭菌温度为121～122℃。
4.根据权利要求2或3所述的制备方法，其中，
所述步骤(5)中的所述除菌的方法为滤膜过滤除菌，所述除菌中使用的滤膜为0.22um或0.45um的聚醚砜滤膜。
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