CN116515669A - 一种施氏假单胞菌及其应用施氏假单胞菌的微生物调水菌剂、使用方法 - Google Patents
一种施氏假单胞菌及其应用施氏假单胞菌的微生物调水菌剂、使用方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株种施氏假单胞菌及其发酵工艺，所述施氏假单胞菌保藏号为CCTCC NO：M20221711。所述发酵培养基为：麸皮0.5％、玉米浆干粉0.5％、牛肉膏0.5％、氯化钠1％、磷酸二氢钠0.25％、硫酸镁0.075％、消泡剂0.05％、初始pH值7.0。发酵条件为：温度35℃、转速200r/min、罐压0.05Mpa、通气量0.8vvm，发酵时间28‑36h。本发明还公开一种应用上述施氏假单胞菌的微生物调水菌剂，还包括解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌。微生态制剂调节水质的关键在于菌株的选择和微生物含量。微生物能否在池塘中定植以及池塘中微生物活菌的浓度，是评价一个微生态制剂好坏的重要指标。本发明提供了一种施氏假单胞菌及其微生态制剂，具有较好的降解氨氮和亚盐的功能，能在自然界较好的定植，本发明将施氏假单胞菌、解淀粉芽孢杆菌和植物乳杆菌发酵液按照一定比例复配后可以得到一种降解氨氮、亚盐的微生物调水菌剂，可以降低水产养殖水域氨氮、亚盐含量。
Description
技术领域
本发明属于微生物领域，具体地说，涉及一种施氏假单胞菌及发酵工艺，以及其应用施氏假单胞菌的微生物调水菌剂、使用方法。
背景技术
水产养殖中良好的水质是养好水产的关键因素，影响水质的主要因素有溶解氧、氨氮及亚硝酸盐浓度、硫化氢、pH值、饲料残饵与水产动物代谢物等。当养殖水体受到污染时，大量的有机物带入养殖水体中，其氧化分解时会消耗水中大量的氧气，造成养殖水体缺氧。如果长期缺氧，水中氨氮、亚硝酸盐、硫化氢等得不到氧化分解，毒性增大，水产动物生长减慢；严重缺氧，就会造成浮头，甚至死亡。因此，调好水质的关键的消除水产养殖中的污染源对养殖的不利影响。解决水问题的处理技术主要分为传统调水技术和生物调水技术。传统调水技术主要包括物理调节法和化学调节法，主要技术有换水、机械增氧、加入化学增氧剂、pH调节剂等，传统调水方法特点是见效快，使用方便，不足之处是时效短，成本高，不能解决根本问题。生物调水技术手段主要是培藻、培菌等，通过定向培植藻类提高水中溶解氧；通过培菌增加水体中的微生物种类和数量。微生物是水体物质循环的推动者。水体中有机质、有毒有害物质、残饵与动植物残体大部分都是微生物参与分解和转化的。由于高密度养殖造成的营养物质和代谢物质严重失衡；滥用化学药品导致养殖环境中的微生物严重失衡；有益微生物的繁殖及数量不稳定导致水体失衡，这三大因素造成很多循环出现断链，需要周期性补充养殖水体有益微生物：如沼泽红假单胞菌、芽孢杆菌、嗜酸乳杆菌、粪链球菌、硝化细菌等复合微生态制剂。保持菌相平衡，是养殖环境修复的关键。
微生态制剂调节水质的关键在于菌株的选择和微生物含量。微生物能否在池塘中定植以及池塘中微生物活菌的浓度，是评价一个微生态制剂好坏的重要指标。本发明提供了一种施氏假单胞菌及其微生态制剂，本发明的施氏假单胞菌是本实验室从猪粪污水处理厂集污池中筛选而得，具有较好的降解氨氮和亚盐的功能，能在自然界较好的定植，本发明旨在提供一种能在池塘中较好定植的微生态菌剂，发挥调节水质的作用。
发明内容
本发明提供了提供一种施氏假单胞菌及其应用施氏假单胞菌的微生物调水菌剂、使用方法，为了降低生产成本，本发明还提供了一种施氏假单胞菌的发酵工艺，并且提供了一种含施氏假单胞菌的微生态制剂及其应用，以实现对水产养殖水域氨氮、亚盐的降解。
本发明提供了一株种施氏假单胞菌，所述施氏假单胞菌于2022年11月02日保藏至中国典型培养物保藏中心，并获得保藏编号为CCTCC NO：M 20221711，分类命名为施氏假单胞菌TRS-15(Pseudomonas stutzeri TRS-15)。
本发明还公开一种应用上述施氏假单胞菌的微生物调水菌剂，还包括解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌。
进一步地，所述微生物调水菌剂具体由施氏假单胞菌的发酵液、解淀粉芽孢杆菌的发酵液、植物乳杆菌的发酵液按照体积比(1-3)：(2-4)：(4-6)混合而成。
进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌为保藏号ACCC 19745的解淀粉芽孢杆菌。
进一步地，所述植物乳杆菌为保藏号ACCC 61967的解淀粉芽孢杆菌。
进一步地，所述施氏假单胞菌的发酵液制备方法如下：
取施氏假单胞菌于发酵培养基中，在温度35℃、转速200r/min、罐压0.05Mpa、通气量0.8vvm，培养时间28h-36h，接种量2-4％；
所述施氏假单胞菌的发酵培养基包括：麸皮0.5％、玉米浆干粉0.5％、牛肉膏0.5％、氯化钠1％、磷酸二氢钠0.25％、硫酸镁0.075％、消泡剂0.05％，所述发酵培养基初始pH值为7.0。
更进一步地，所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液制备方法如下：
S201.种子液制备，取纯化的解淀粉芽孢杆菌，斜面接种至灭菌LB液体培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、200r/min；
S202.液体发酵，向发酵罐中加入发酵液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；控制装液体积为发酵罐的60％-70％，将培养好的种子液按体积比2％-3％的接种量接入发酵罐，在罐压0.05Mpa、通气量0.7vvm、转速225r/min、温度37℃的条件下培养36h，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；
所述解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基组分为：大麦粉2.0％、硫酸铵1.25％、大豆浓缩蛋白1.25％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.15％、碳酸钙0.7％。
更进一步地，所述植物乳杆菌的发酵液制备方法如下：
S301.种子液制备，取纯化的植物乳杆菌，斜面接种至灭菌MRS肉汤培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、100r/min；
S302.液体发酵，发酵罐中加入LB液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.01Mpa、通气量0L/min、转速125r/min、温度37℃的条件下培养24h，得到植物乳杆菌的发酵液。
本发明还公开一种上述微生物调水菌剂的使用方法，所述微生物调水菌剂：糖：水按(1-5):(1-5):(50-200)的重量比混合，并密封活化24-36h后使用。
进一步地，所述糖可选为砂糖、红糖、麦芽糖、果葡糖浆中至少一种，所述密封活化24-36h后使用具体包括：在塘口密封活化24-36h后，浇洒至水塘，用量按照1000-2000立方米水体使用微生物调水菌剂(0.5-5L)。
更进一步地，在水深为2米时，每1亩水面使用微生物调水菌剂1L。
本发明相对于现有技术，施氏假单胞菌经过液体发酵后活菌含量可达1.43×1010cfu/mL，解淀粉芽孢杆菌发酵后活菌含量可达2.52×1010cfu/mL、植物乳杆菌发酵后活菌含量可达6.35×109cfu/mL。本发明提供的微生物调水菌剂活菌含量高，所选取的菌株具有较强的定植能力，功能互补且对弧菌有抑制作用，施氏假单胞菌具有反硝化作用，解淀粉芽孢杆菌具有利用铵盐作用，植物乳杆菌具有抑菌降低水体pH作用。
附图说明
图1为本发明实施例施氏假单胞菌菌落形态。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本发明方案，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分的实施例，而不是全部的实施例。
本发明中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，是指质量百分比；但溶液的百分比，除另有规定外，是指100mL溶液中含有溶质的克数。
为了实现本发明目的，本发明在猪粪集污池筛选获得一株施氏假单胞菌，其菌落形态图见图1。本发明菌株经16S rDNA测序获得基因序列(见下表)，通过在NCBI进行序列比对，本发明菌株与施氏假单胞菌Pseudomonas stutzeri strain NCTC10475相似性最高，相似度99.93％，结合其生理生化特性初步确定本发明菌株为施氏假单胞菌。筛选获得的施氏假单胞菌于2022年11月02日保藏至中国典型培养物保藏中心，保藏地址：中国武汉武汉大学，并获得保藏编号为CCTCC NO：M 20221711，分类命名为施氏假单胞菌TRS-15(Pseudomonas stutzeri TRS-15)。
实施例1施氏假单胞菌发酵液的生产
包括以下步骤：
1、斜面种子的制备
将施氏假单胞菌在营养琼脂试管斜面上活化。
2、一级液体种子液的制备
将活化后的施氏假单胞菌挑2-3环菌种接种至LB培养基中(1000ml三角瓶，装液量为400ml，121℃高压灭菌15min)，于37℃，200r/min的条件下发酵16h，发酵过程中控制pH值7.0，即得一级液体种子液。
3、液体发酵
液体发酵培养基：麸皮0.5％、玉米浆干粉0.5％、牛肉膏0.5％、氯化钠1％、磷酸二氢钠0.25％、硫酸镁0.075％、消泡剂0.05％、初始pH值7.0。
将一级液体种子液按3％(v/v)的接种量接种至灭菌LB培养基(加入0.05％有机硅消泡剂)中，发酵条件：温度35℃、转速200r/min、罐压0.05Mpa、通气量0.8vvm，培养时间28h-36h，得施氏假单胞菌发酵液。
实施例2微生物调水菌剂的制备
微生物调水菌剂是采用由施氏假单胞菌发酵液、解淀粉芽孢杆菌发酵液、植物乳杆菌发酵液复配而成，所述微生物由保藏编号为CCTCC NO：M 20221711的施氏假单胞菌、植物乳杆菌ACCC 61967、解淀粉芽孢杆菌ACCC 19745组成。包括以下步骤：
S1：微生物液体发酵
(1)施氏假单胞菌发酵：步骤同实施例1
(2)解淀粉芽孢杆菌发酵：a.种子液制备，取纯化的解淀粉芽孢杆菌斜面接种至灭菌LB培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、200r/min。b.液体发酵，培养基：大麦粉2.0％、硫酸铵1.25％、大豆浓缩蛋白1.25％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.15％、碳酸钙0.7％。发酵罐中加入液体培养基和0.05％有机硅消泡剂灭菌，控制装液体积为发酵罐的60％-70％。种子液按体积比3％的接种量接入发酵罐培养36h即可，发酵条件为：罐压0.05Mpa、通气量0.7vvm、转速225r/min、温度37℃。
(3)植物乳杆菌发酵：a.种子液制备，取纯化的植物乳杆菌斜面接种至灭菌MRS肉汤培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、100r/min。b.液体发酵，发酵罐中加入LB液体培养基和0.05％有机硅消泡剂灭菌，将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐培养24h即可，发酵条件：罐压0.01Mpa、通气量0L/min、转速125r/min、温度37℃。
S2：微生物调水菌剂制备
将S1中发酵液按照体积比2:3:5的比例在发酵储罐中混合均匀即得。
实验例3
1、实验设计
对照组：市售调水菌剂；
实验组：实施例2菌剂。
试验在湖北监利湘大水产基地进行。试验分单口池塘面积为3亩，养殖品种为加州鲈。菌剂扩培方法一致。菌剂的用量为：试验分单口池塘水深为2米，按照每1亩水面使用微生物调水菌剂1L的标准进行菌剂添加。具体添加方法为，将菌剂：红糖：水按1:1:100的重量比混合，并于塘口密封活化24-36h后，浇洒至水塘。
2、实验方法
菌剂泼洒选择晴朗天气，泼洒前开增氧泵1h左右，在上午9点钟左右泼洒，泼洒后继续开增氧泵2～4h。每天用取一次水样检测指标，取样时间为上午11点钟，每次用水样采集器在池塘四周及中间采集样品，采自水面下0.5m处，采集的5个样品混合均匀后检测指标。pH、温度、DO值用仪器直接从池塘中测量，其他指标均采样后用仪器测量。溶氧仪(衡欣AZ86031)、pH计(希玛PH818)、多参数水质分析仪(CV-1562)
3、实验结果
表1菌剂对池塘水质的影响
由表1可知，实验组和对照组，初始pH、水温、DO值、氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐含量非常相近，实验组塘口含量略高于对照组。COD值实验组塘口低于对照组塘口。三天后，实验组的氨氮下降69.67％、亚硝酸盐下降71.70％、COD值下降26.42％，pH略有降低。对照组氨氮有所上升，上升了6.81％；亚硝酸盐下降55.56％、COD值下降1.68％，pH略有升高。综上所述，本发明实施例3的实验组通过采用实施例2菌剂，可有效降低COD值、氨氮、亚硝酸盐，对水体水质的有效调节，进而使水体可符合水产养殖标准。
最后应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对其限制，尽管参照上述实施例对本发明进行了详细的说明，所属领域的普通技术人员应当理解，技术人员阅读本申请说明书后依然可以对本发明的具体实施方式进行修改或者等同替换，但这些修改或变更均未脱离本发明申请待批权利要求保护范围之内。
Claims (10)
1.一种施氏假单胞菌，其特征在于，所述施氏假单胞菌保藏号为CCTCC NO：M20221711。
2.一种应用权利要求1所述施氏假单胞菌的微生物调水菌剂，其特征在于，所述微生物调水菌剂还包括解淀粉芽孢杆菌、植物乳杆菌。
3.根据权利要求2所述微生物调水菌剂，其特征在于，所述微生物调水菌剂具体由施氏假单胞菌的发酵液、解淀粉芽孢杆菌的发酵液、植物乳杆菌的发酵液按照体积比(1-3)：(2-4)：(4-6)混合而成。
4.根据权利要求2或3所述微生物调水菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌为保藏号ACCC 19745的解淀粉芽孢杆菌。
5.根据权利要求2或3所述微生物调水菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌为保藏号ACCC61967的解淀粉芽孢杆菌。
6.根据权利要求2所述微生物调水菌剂，其特征在于，所述施氏假单胞菌的发酵液制备方法如下：
取施氏假单胞菌于发酵培养基中，在温度35℃、转速200r/min、罐压0.05Mpa、通气量0.8vvm，培养时间28h-36h，接种量2-4％；
所述施氏假单胞菌的发酵培养基包括：麸皮0.5％、玉米浆干粉0.5％、牛肉膏0.5％、氯化钠1％、磷酸二氢钠0.25％、硫酸镁0.075％、消泡剂0.05％，所述发酵培养基初始pH值为7.0。
7.根据权利要求3所述微生物调水菌剂，其特征在于，所述解淀粉芽孢杆菌的发酵液制备方法如下：
S201.种子液制备，取纯化的解淀粉芽孢杆菌，斜面接种至灭菌LB液体培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、200r/min；
S202.液体发酵，向发酵罐中加入发酵液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；控制装液体积为发酵罐的60％-70％，将培养好的种子液按体积比2％-3％的接种量接入发酵罐，在罐压0.05Mpa、通气量0.7vvm、转速225r/min、温度37℃的条件下培养36h，得到解淀粉芽孢杆菌发酵液；
所述解淀粉芽孢杆菌的发酵培养基组分为：大麦粉2.0％、硫酸铵1.25％、大豆浓缩蛋白1.25％、氯化钠0.1％、硫酸镁0.15％、碳酸钙0.7％。
8.根据权利要求4所述微生物调水菌剂，其特征在于，所述植物乳杆菌的发酵液制备方法如下：
S301.种子液制备，取纯化的植物乳杆菌，斜面接种至灭菌MRS肉汤培养基中置于摇床培养16h，培养条件37℃、100r/min；
S302.液体发酵，发酵罐中加入LB液体培养基，加入其重量0.05％的有机硅消泡剂，并灭菌；将培养好的种子液按体积比1％的接种量接入发酵罐，在罐压0.01Mpa、通气量0L/min、转速125r/min、温度37℃的条件下培养24h，得到植物乳杆菌的发酵液。
9.一种权利要求3-8任意一项所述微生物调水菌剂的使用方法，其特征在于，所述微生物调水菌剂：糖：水按(1-5):(1-5):(50-200)的重量比混合，并密封活化24-36h后使用。
10.根据权利要求9所述微生物调水菌剂的使用方法，其特征在于，所述糖可选为砂糖、红糖、麦芽糖、果葡糖浆中至少一种，所述密封活化24-36h后使用具体包括：在塘口密封活化24-36h后，浇洒至水塘，用量按照1000-2000立方米水体使用微生物调水菌剂(0.5-5L)。
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