CN116514769A - 4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物、制备方法、药物组合物和应用 - Google Patents

4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物、制备方法、药物组合物和应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一类4‑羟基嘧啶‑5‑甲酰腙衍生物衍生物、制备方法、药物组合物和应用。该化合物结构如式I，该类衍生物包含其药学上可接受的盐。该类衍生物对脯氨酰羟化酶具有高效的抑制作用，从而增强促红细胞生成素(erythropoietin，EPO)的生成和分泌，用于治疗或预防与PHD2介导的疾病如慢性肾性贫血等疾病。所制备药物在分子水平、细胞水平和动物水平均可以发挥药效，应用广泛，并且该类化合物合成方法简便，易操作。

Description

4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物、制备方法、药物组合物和应用
技术领域
本发明涉及一类4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物、制备方法、药物组合物和应用，尤其涉及一类可有效抑制脯氨酰羟化酶的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物、制备方法、药物组合物和应用。
背景技术
肾性贫血是慢性肾脏病(chronic kidney disease,CKD)患者最常见的并发症之一，严重影响患者的生活质量，也是导致心血管发生率及死亡率增高的重要因素。肾脏是人体产生分泌促红细胞生成素(erythropoietin,EPO)的主要器官，CKD患者由于肾功能衰退或损伤进而导致EPO分泌严重不足，直接造成造血(形成红细胞)能力受损，引发贫血症状。近年来肾性贫血治疗常用药物为注射用重组人EPO(rhEPO),rhEPO在疗效和安全性方面具有局限性：1)免疫原性问题；2)不可控高血压副作用；3)注射给药方式降低了治疗依从性；4)需要与铁剂联合用药。鉴于此，人们一直在寻找能够代替生物药rhEPO的更为安全、有效、便捷的治疗方法。
随着对EPO生物学研究的深入，科学家们发现内源性EPO主要受缺氧诱导因子(hypoxia inducible factor,HIF)的调控，HIF是人类对氧气的适应性调节、诱导低氧应激反应相关基因表达最重要的转录因子。HIF通常由对氧气敏感的α亚基和稳定的β亚基两部分组成。低氧气情况下，胞质中的HIF-α进入细胞核与HIF-β结合形成异源二聚体HIF-α/β后，从而启动相关靶基因表达，比如EPO、VEGF、糖酵解相关基因等。常氧气情况下，HIF-α的氧依赖降解结构域中特定的脯氨酸残基可以被脯氨酰羟化酶(prolyl hydrolase domain,PHD)羟基化，羟基化的HIF-α可迅速被VHL(Von Hippel-Lindau)蛋白精准识别，招募形成E3连接酶复合体，继而被泛素化降解。另外，PHD主要包括PHD1、PHD2、PHD3三个亚型。其中，PHD2亚型在调控HIF-α和EPO中占据主导因素。基于此，可以通过抑制PHD2来达到稳定HIF-α，促进内源性EPO以及铁吸收蛋白等表达，从而提高血液中血红蛋白和红细胞的形成，达到治疗肾性贫血的目的。
鉴于针对肾性贫血等多种疾病的潜在治疗用途，PHD2抑制剂的药物研发近年来取得一定的研究进展，珐博进的Roxadustat、Akebia的Vadadustat、拜尔的Molidustat、葛兰素史克的Daprodustat、信立泰的Enarodustat已先后获批上市，并在治疗慢性肾性贫血方面表现出较好了疗效。
现有已上市的PHD2药物虽然在治疗慢性肾性贫血方面表现出了不错的潜力，但是同时具有一些不可控的心血管风险和其他不可忽视的副作用，如血栓、癫痫、以及严重/致命的感染等。基于此，本项目开发4-羟基嘧啶-5-甲酰腙类PHD2小分子抑制剂，提高活性，提高药效，未来有望在降低药物剂量的情况下，维持药效，有效克服上述心血管风险等副作用。
发明内容
发明目的：针对现有化合物存在的临床使用剂量过大、副作用大等问题，本发明旨在提供一类酶水平活性较优、疗效显著的PHD2小分子抑制剂4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物、制备方法、药物组合物和应用。
技术方案：作为本发明涉及的第一方面，本发明的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物具有式(I)的结构，所述衍生物包含其药学上可接受的盐：
其中：
A选自五元或六元不饱和杂环；
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C2-C4炔基或芳基，其中，芳基被一个或多个R3取代；
R2选自氢、卤素或甲基；
R3为选自卤素、羟基、氨基、羧基、苯基、苄基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基甲磺酰基、C1-C4烷基或OC1-C4烷基。
优选，所述结构中：
A选自
优选，所述结构中：
R1为苯基。
更具体地，上述4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物选自以下任一化合物：
所述药学上可接受的盐为所述4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物与酸或碱形成的盐，所述酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸，所述碱为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱，胆碱、二乙醇胺或吗啉。
作为本发明涉及的第二方面，上述4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物的制备方法为：
化合物(II)与化合物(III)，经酰化、缩合反应得到化合物(I)；
具体地，化合物(II)与水合肼反应生成化合物(III)，其中反应溶剂为甲醇或乙醇，反应温度优选为80℃，反应时间6-12小时；化合物(III)和化合物(IV)在对甲氧基苯胺催化的条件得到化合物(I)，其中反应溶剂为二甲基亚砜和水，反应温度优选为37℃，反应时间12-24小时。
其中，A、R1、R2的定义如前所述；
将相应的酸或碱与以上方法制备的化合物(I)成盐，即得上述衍生物的药学上可接受的盐。
作为本发明涉及的第三方面，本发明的药物组合物包含上述4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物以及药学上可接受的载体。
上述4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物可以添加药学上可接受的载体制成常见的药用制剂，如片剂、胶囊、糖浆、悬浮剂或注射剂，制剂可以加入香料、甜味剂、液体/固体填料、稀释剂等常用药用辅料。
作为本发明涉及的第四方面，上述4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物及其药物组合物可制备为脯氨酰羟化酶抑制剂药物，用于治疗和/或预防因红细胞生成素下降或不足所引起的贫血症或缺血性疾病；其中，贫血症是由肾炎、肾损伤、类风湿性关节炎、风湿热、炎症性肠道疾病或肿瘤化疗引起的贫血症；缺血性疾病是缺血性脑卒中或心肌缺血相关疾病。
有益效果：与现有技术相比，本发明具有如下显著优点：
(1)该类衍生物和药物组合物可有效抑制脯氨酰羟化酶，IC50值均达到纳摩尔浓度水平，最优低于50nM；
(2)该类衍生物和药物组合物应用广泛，可制备为治疗和/或预防慢性疾病性相关的贫血、缺血性疾病药物；所述药物在分子水平、细胞水平和动物水平均可以发挥药效；
(3)化合物制备方法简便、易操作。
附图说明
图1为化合物I-25和阳性药FG-4592在10mg/kg、20mg/kg、50mg/kg剂量下，连续给药3天，取小鼠血液，小鼠血浆EPO水平；
图2为化合物I-25和阳性药FG-4592在5mg/kg、10mg/kg、20mg/kg剂量下，连续给药3天，取小鼠血液，小鼠全血网织红细胞比率(％RBC)。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案作进一步说明。
实施例1
4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-羧酸(0.434g，2.0mmol)，水合肼(0.151g，3.0mmol)溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.432g，收率：93.5％，Rf:0.23(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.201.4-203.5゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(s,1H),8.69(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),8.18(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.92(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.27(td,J＝7.4,1.5Hz,1H).EI-MS m/z:218[M+H]+。
I-1的制备
4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.462g，2.0mmol)，3,4,5-三羟基苯甲醛(0.338g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌10.0小时，将反应液倒入10mL H2O，析出大量固体。通过硅胶柱色谱(洗脱液：在乙酸乙酯中10-80％甲醇)纯化产物，得到目标产物白色固体(E)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)-N′-(3,4,5-三羟基亚苄基)嘧啶-5-碳酰肼0.600g；收率：81.7％，Rf：0.16(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.18(s,1H),12.46(s,1H),9.15(s,2H),8.84(d,J＝3.7Hz,1H),8.67(s,2H),8.42(d,J＝7.9Hz,1H),8.11-8.15(m,2H),7.76–7.73(m,1H),6.75(s,2H).EI-MS m/z:368[M+H]+。
实施例2
I-2的制备
制备方法同实施例1，用3,4-二羟基苯甲醛(0.276g，2.0mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-(3,4-二羟基亚苄基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.632g，两步收率：84.2％，Rf：0.19(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.294.7-295.2゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.24(d,J＝14.9Hz,1H),12.51(s,1H),9.43(s,1H),9.29(s,1H),8.84(d,J＝4.3Hz,1H),8.67(s,1H),8.42(d,J＝7.8Hz,1H),8.24(s,1H),8.13(t,J＝7.2Hz,1H),7.78–7.69(m,1H),7.30–7.26(m,1H),7.02(d,J＝8.2Hz,2H),6.79(d,J＝8.1Hz,1H).EI-MS m/z:352[M+H]+。
实施例3
I-3的制备
制备方法同实施例1，用2,3-二羟基苯甲醛(0.276g，2.0mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-(2,3-二羟基亚苄基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.643g，两步收率：85.6％，Rf：0.16(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.>300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.41(s,1H),12.73(s,1H),11.07(s,1H),9.24(s,1H),8.84(d,J＝4.3Hz,1H),8.69(s,1H),8.67(s,1H),8.43(d,J＝7.9Hz,1H),8.14–8.10(m,1H),7.75(dd,J＝6.9,4.8Hz,1H),6.99(dd,J＝8.9,1.2Hz,1H),6.87(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),6.76(t,J＝7.8Hz,1H).EI-MS m/z:352[M+H]+。
实施例4
I-4的制备
制备方法同实施例1，用3-(甲磺酰基)苯甲醛(0.368g，2.0mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-4-羟基-N′-(3-(甲基磺酰基)苯亚甲基)-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.658g，两步收率：77.5％，Rf：0.12(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.285.8-286.9゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.21(s,1H),9.88(s,1H),8.79(s,1H),8.68(s,1H),8.34(s,2H),7.99–7.88(m,1H),7.66(s,1H),7.51–7.38(m,3H),7.27(d,J＝7.7Hz,1H),3.03(s,3H).EI-MS m/z:398[M+H]+。
实施例5
4-羟基-6-甲基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-6-甲基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-羧酸(0.462g，2.0mmol)，水合肼(0.151g，3.0mmol)溶于乙醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-6-甲基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.451g，收率：92.0％，Rf:0.25(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.205.8-207.2゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.35(t,J＝5.2Hz,1H),8.69(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.17(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.92(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.27(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),4.35(d,J＝5.1Hz,2H),2.64(s,3H).EI-MS m/z:246[M+H]+。
I-5的制备
4-羟基-6-甲基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.490g，2.0mmol)，3-甲氧基苯甲醛(0.299g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌10.0小时，将反应液倒入10mL H2O，析出大量固体。得黄色固体(E)-4-羟基-N′-(3-甲氧基苄叉)-6-甲基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.638g,收率：87.9％，Rf：0.15(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.289.7-291.4゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.70(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.30(s,1H),8.18(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.35(dt,J＝7.4,1.6Hz,1H),7.31–7.23(m,3H),6.92(dt,J＝7.3,1.5Hz,1H),3.83(s,3H),2.63(s,3H).EI-MS m/z:364[M+H]+。
实施例6
4-氯-6-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-氯-6-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-羧酸(0.753g，3.0mmol)，水合肼(0.202g，4.0mmol)溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-氯-6-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.743g，收率：93.5％，Rf:0.23(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.209.1-211.5゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.30(t,J＝5.2Hz,1H),8.70(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.17(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.26(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),4.37(d,J＝5.3Hz,2H).EI-MS m/z:266[M+H]+。
I-6的制备
4-氯-6-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.530g，2.0mmol)，3-三氟甲基苯甲醛(0.360g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌10.0小时，将反应液倒入10mL H2O，析出大量固体。得白色固体(E)-4-氯-6-羟基-2-(吡啶-2-基)-N′-(3-(三氟甲基)亚苄基)嘧啶-5-碳酰肼0.686g，收率：81.5％，Rf：0.14(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.291.3-293.6゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ8.72(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),8.28(s,1H),8.16(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.76(t,J＝1.5Hz,1H),7.66(dt,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.53(dt,J＝7.4,1.6Hz,1H),7.44(t,J＝7.5Hz,1H),7.26(td,J＝7.5,1.6Hz,1H).EI-MS m/z:422[M+H]+。
实施例7
I-7的制备
制备方法同实施例1，用3-三氟甲氧基苯甲醛(0.418g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)-N′-(3-(三氟甲氧基)苄叉)嘧啶-5-碳酰肼0.672g，两步收率：77.9％，Rf：0.15(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.275.1-277.8゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.71(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),8.36(s,1H),8.13(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.4,1.6Hz,1H),7.47(t,J＝1.4Hz,1H),7.41–7.36(m,1H),7.34(d,J＝7.4Hz,1H),7.26(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.17(dt,J＝7.3,1.7Hz,1H).EI-MS m/z:404[M+H]+。
实施例8
I-8的制备
制备方法同实施例1，用3-腈基苯甲醛(0.288g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-(3-氰基苯亚甲基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.656g，两步收率：89.1％，Rf：0.16(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.277.8-281.2゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.71(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.33(s,1H),8.15(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.96–7.89(m,2H),7.76(dt,J＝7.6,1.6Hz,1H),7.68(dt,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.54(t,J＝7.5Hz,1H),7.26(td,J＝7.5,1.5Hz,1H).EI-MS m/z:345[M+H]+。
实施例9
I-9的制备
制备方法同实施例1，用3-腈基苯甲醛(0.266g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-(3-氨基苯亚甲基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.633g,两步收率：88.6％，Rf：0.10(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.71(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),8.17(s,1H),8.13(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.4,1.6Hz,1H),7.31–7.20(m,3H),6.84(t,J＝1.6Hz,1H),6.63(dt,J＝7.3,1.7Hz,1H),4.88(d,J＝5.5Hz,1H),4.77(d,J＝5.5Hz,1H).EI-MS m/z:335[M+H]+。
实施例10
I-10的制备
制备方法同实施例1，用[1,1′-联苯]-3-甲醛(0.400g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-([1,1′-联苯]-3-基亚甲基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.702g,两步收率：83.1％，Rf：0.12(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.71(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.23(s,1H),8.17(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.92(td,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.78(d,J＝1.5Hz,1H),7.65–7.50(m,5H),7.48–7.41(m,2H),7.38–7.31(m,1H),7.26(td,J＝7.5,1.7Hz,1H).EI-MS m/z:396[M+H]+。
实施例11
I-11的制备
制备方法同实施例1，用2,5-二羟基苯甲醛(0.303g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-(2,5-二羟基亚苄基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.662g,两步收率：87.9％，Rf：0.13(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.37(s,1H),12.61(s,1H),11.33(s,1H),10.02(s,1H),8.84(d,J＝4.3Hz,1H),8.67(s,1H),8.56(s,1H),8.42(d,J＝7.8Hz,1H),8.15–8.08(m,1H),7.74(dd,J＝7.0,4.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.4Hz,1H),6.38(dd,J＝8.4,2.0Hz,1H),6.32(d,J＝1.9Hz,1H).EI-MS m/z:352[M+H]+。
实施例12
I-12的制备
制备方法同实施例1，用2,3,4-三羟基苯甲醛(0.338g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-4羟基-2-(吡啶-2-基)-N′-(2,3,4-三羟基亚苄基)嘧啶-5-碳酰肼0.638g,两步收率：81.1％，Rf：0.12(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.67(s,1H),11.37(s,1H),9.51(s,1H),8.84(d,J＝4.1Hz,1H),8.68(s,1H),8.54(s,1H),8.50(s,1H),8.42(d,J＝7.7Hz,1H),8.15–8.08(m,1H),7.74(dd,J＝7.6,4.3Hz,1H),6.82(d,J＝8.5Hz,1H),6.41(d,J＝8.4Hz,1H).EI-MS m/z:368[M+H]+。
实施例13
I-13的制备
制备方法同实施例1，用苯甲醛(0.233g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得黄色固体(E)-N′-亚苄基-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.621g,两步收率：90.9％，Rf：0.16(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.264.2-266.5゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.71(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.19–8.12(m,2H),7.92(td,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.71–7.65(m,2H),7.47–7.35(m,3H),7.27(td,J＝7.5,1.6Hz,1H).EI-MS m/z:320[M+H]+。
实施例14
4-羟基-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-5-羧酸(0.618g，3.0mmol)，水合肼(0.204g，4.0mmol)溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼0.612g；收率：92.7％，Rf:0.28(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.225.1-227.6゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.79(s,1H),9.33(t,J＝5.2Hz,1H),7.65(d,J＝7.5Hz,2H),6.61(t,J＝7.5Hz,1H),4.30(d,J＝5.3Hz,2H).EI-MS m/z:221[M+H]+。
I-14的制备
4-羟基-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.440g，2.0mmol),2,3-二羟基苯甲醛(0.303g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌12.0小时，将反应液倒入10mL H2O,析出大量固体。得褐色固体(E)-N′-(2,3-二羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(1H-吡唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼0.615g,收率：90.4％，Rf：0.12(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.01(d,J＝13.4Hz,2H),8.88(s,1H),8.47(s,1H),7.66(ddd,J＝7.5,4.4,1.5Hz,2H),7.09(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),6.83(t,J＝7.4Hz,1H),6.75(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),6.64(t,J＝7.5Hz,1H).EI-MS m/z:341[M+H]+。
实施例15
4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-羧酸(0.654g，3.0mmol)，水合肼(0.204g，4.0mmol)溶于乙醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-碳酰肼0.667g；收率：95.9％，Rf:0.29(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.278.8-280.3゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.76(s,1H),9.32(t,J＝5.2Hz,1H),8.53(dd,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.83(t,J＝7.5Hz,1H),7.73(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),4.31(d,J＝5.3Hz,2H).EI-MS m/z:233[M+H]+。
I-15的制备
4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.464g，2.0mmol),2,3-二羟基苯甲醛(0.303g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌12.0小时，将反应液倒入10mL H2O,析出大量固体。得白色固体(E)-N′-(2,3-二羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-碳酰肼0.671g,收率：95.3％，Rf：0.12(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.12(s,1H),12.82(s,1H),11.08(s,1H),9.50(d,J＝4.8Hz,1H),9.22(s,1H),8.72(s,1H),8.67(s,1H),8.55(d,J＝8.5Hz,1H),8.01(dd,J＝8.4,5.1Hz,1H),6.99(d,J＝7.8Hz,1H),6.87(d,J＝7.7Hz,1H),6.76(t,J＝7.8Hz,1H).EI-MS m/z:353[M+H]+。
实施例16
4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-碳酰肼的制备
4-羟基-[2,2'-联嘧啶]-5-羧酸(0.654g，3.0mmol)，水合肼(0.204g，4.0mmol)溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-碳酰肼0.680g；收率：97.7％，Rf:0.30(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.279.2-281.6゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.75(s,1H),9.32(t,J＝5.2Hz,1H),9.00(d,J＝7.5Hz,2H),7.42(t,J＝7.5Hz,1H),4.31(d,J＝5.3Hz,2H).EI-MS m/z:233[M+H]+。
I-16的制备
4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-碳酰肼(0.464g，2.0mmol)替,2,3-二羟基苯甲醛(0.303g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌12.0小时，将反应液倒入10mL H2O,析出大量固体。得白色固体(E)-N′-(2,3-二羟基亚苄基)-4-羟基-[2,2'-联嘧啶]-5-碳酰肼0.618g,收率：87.8％，Rf：0.12(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.67(s,1H),11.30(s,1H),9.15(s,1H),9.06–8.95(m,2H),8.73(s,1H),8.60(s,1H),7.71–7.63(m,1H),6.96(d,J＝7.7Hz,1H),6.85(d,J＝7.6Hz,1H),6.78–6.69(m,1H).EI-MS m/z:353[M+H]+。
实施例17
4-羟基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-5-羧酸(0.621g，3.0mmol)，水合肼(0.204g，4.0mmol)溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-碳酰肼0.653g；收率：98.5％，Rf:0.26(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.219.3-221.8゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.43(s,1H),8.95(s,1H),8.15(s,1H).EI-MS m/z:222[M+H]+。
I-17的制备
4-羟基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.442g，2.0mmol),2,3-二羟基苯甲醛(0.303g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌12.0小时，将反应液倒入10mL H2O,析出大量固体。得褐色固体(E)-N′-(2,3-二羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(1H-1,2,4-三唑-1-基)嘧啶-5-碳酰肼0.602g,收率：88.3％，Rf：0.10(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.09(s,1H),11.45(s,1H),9.24(s,1H),9.10(s,1H),8.67(s,1H),8.54(s,1H),8.17(s,1H),6.95(d,J＝7.2Hz,1H),6.83(d,J＝7.0Hz,1H),6.74(t,J＝7.7Hz,1H).EI-MS m/z:342[M+H]+。
实施例18
I-18的制备
制备方法同实施例15，用2-甲酰基苯甲酸(0.330g，2.2mmol)替换2,3-二羟基苯甲醛，得白色固体(E)-2-((2-(4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-羰基)肼基)甲基)苯甲酸0.580g,两步收率：76.3％，Rf：0.09(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.20(s,1H),9.45(d,J＝4.0Hz,1H),9.07(s,1H),8.74(s,1H),8.49(d,J＝8.2Hz,1H),8.04(d,J＝7.7Hz,1H),7.95(dt,J＝11.1,6.1Hz,2H),7.64(t,J＝7.6Hz,1H),7.54(t,J＝7.4Hz,1H).EI-MS m/z:365[M+H]+。
实施例19
I-19的制备
制备方法同实施例1，用4-甲酰基苯甲酸(0.330g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-4-((2-(4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-羰基)亚肼基)甲基)苯甲酸0.637g,两步收率：81.9％，Rf：0.09(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.94(s,1H),8.83(d,J＝3.9Hz,1H),8.70(s,1H),8.55(s,1H),8.42(d,J＝7.6Hz,1H),8.15–8.08(m,1H),8.02(d,J＝8.2Hz,2H),7.88(d,J＝8.3Hz,2H),7.73(dd,J＝6.8,4.3Hz,1H).EI-MS m/z:364[M+H]+。
实施例20
I-20的制备
制备方法同实施例16，用4-甲酰基苯甲酸(0.330g，2.2mmol)替换2,3-二羟基苯甲醛，得白色固体(E)-4-((2-(4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-羰基)亚肼基)甲基)苯甲酸0.661g,两步收率：88.7％，Rf：0.09(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.70(s,1H),13.15(s,1H),12.75(s,1H),9.13(d,J＝4.8Hz,2H),8.74(s,1H),8.56(s,1H),8.03(d,J＝8.1Hz,2H),7.88(d,J＝8.1Hz,2H),7.82(t,J＝4.8Hz,1H).EI-MS m/z:365[M+H]+。
实施例21
I-21的制备
制备方法同实施例15，用5-甲酰基-2-羟基苯甲酸(0.365g，2.2mmol)替换2,3-二羟基苯甲醛，得白色固体(E)-2-羟基-5-((2-(4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-羰基)肼基)甲基)苯甲酸0.672g,两步收率：84.8％，Rf：0.08(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.95(s,1H),12.54(s,1H),9.52(d,J＝3.8Hz,1H),8.56(d,J＝8.4Hz,1H),8.39(s,1H),8.18(s,1H),8.03(dd,J＝8.5,5.1Hz,1H),7.81(d,J＝7.6Hz,1H),6.94(d,J＝8.4Hz,1H).EI-MS m/z:381[M+H]+。
实施例22
I-22的制备
制备方法同实施例1，用5-甲酰基-2-羟基苯甲酸(0.365g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-2-羟基-5-((2-(4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-羰基)肼基)甲基)苯甲酸0.689g,两步收率：85.0％，Rf：0.08(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.49(s,1H),12.82(s,1H),8.84(d,J＝4.3Hz,1H),8.42(d,J＝7.0Hz,2H),8.21(d,J＝1.8Hz,1H),8.16–8.09(m,1H),7.91(dd,J＝8.7,1.9Hz,1H),7.75(dd,J＝7.0,5.1Hz,1H),7.06(d,J＝8.6Hz,1H).EI-MS m/z:380[M+H]+。
实施例23
I-23的制备
制备方法同实施例15，用3-氯-2-羟基苯甲醛(0.341g，2.2mmol)替换2,3-二羟基苯甲醛，得白色固体(E)-N′-(3-氯-2-羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-碳酰肼0.658g,两步收率：85.3％，Rf：0.11(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ12.93(s,1H),12.25(s,1H),9.51(d,J＝3.9Hz,1H),8.80(s,1H),8.73(s,1H),8.55(d,J＝7.9Hz,1H),8.02(dd,J＝8.6,5.0Hz,1H),7.53–7.50(m,1H),7.50–7.47(m,1H),6.99(t,J＝7.9Hz,1H).EI-MS m/z:371[M+H]+。
实施例24
I-24的制备
制备方法同实施例1，用3-氯-2-羟基苯甲醛(0.341g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-N′-(3-氯-2-羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.612g,收率：77.5％，Rf：0.11(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.51(s,1H),12.91(s,1H),12.26(s,1H),8.85(d,J＝4.7Hz,1H),8.79(s,1H),8.71(s,1H),8.43(d,J＝7.5Hz,1H),8.18–8.08(m,1H),7.79–7.70(m,1H),7.50(t,J＝7.3Hz,2H),6.99(t,J＝8.0Hz,1H).EI-MS m/z:370[M+H]+。
实施例25
I-25的制备
制备方法同实施例15，用2-氯-3-羟基苯甲醛(0.341g，2.2mmol)替换2,3-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-N′-(2-氯-3-羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(哒嗪-3-基)嘧啶-5-碳酰肼0.639g,两步收率：82.9％，Rf：0.11(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ14.26(s,1H),10.43(s,1H),9.31(dd,J＝4.9,1.5Hz,1H),8.80(s,1H),8.62(s,1H),8.41(d,J＝7.4Hz,1H),7.82(dd,J＝8.5,5.0Hz,1H),7.48(dd,J＝7.8,1.3Hz,1H),7.23(t,J＝7.9Hz,1H),7.04(dd,J＝8.0,1.4Hz,1H).EI-MS m/z:371[M+H]+。
实施例26
I-26的制备
制备方法同实施例1，用2-氯-3-羟基苯甲醛(0.341g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-N′-(2-氯-3-羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.633g,两步收率：80.1％，Rf：0.15(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1HNMR(400MHz,DMSO-d6)δ13.58(s,1H),10.41(s,1H),8.75(d,J＝4.3Hz,1H),8.73(s,1H),8.66(s,1H),8.37(d,J＝7.7Hz,1H),8.03(t,J＝7.1Hz,1H),7.64–7.57(m,1H),7.47(d,J＝7.0Hz,1H),7.23(t,J＝7.9Hz,1H),7.07–7.00(m,1H).EI-MS m/z:370[M+H]+。
实施例27
4-羟基-2-(吡嗪-2-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-2-(吡嗪-2-基)嘧啶-5-羧酸(0.654g，3.0mmol)，水合肼(0.204g，4.0mmol),溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-碳酰肼0.637g；收率：91.5％，Rf:0.32(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.245.6-247.8゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.58(s,1H),9.38(s,1H),8.89(d,J＝7.5Hz,1H),8.72(d,J＝7.5Hz,1H).EI-MS m/z:233[M+H]+。
I-27的制备
4-羟基-2-(吡嗪-2-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.464g，2.0mmol),2-氯-3-羟基苯甲醛(0.341g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌12.0小时，将反应液倒入10mL H2O,析出大量固体。得白色固体(E)-N′-(2-氯-3-羟基苯亚甲基)-4-羟基-2-(吡嗪-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.607g,收率：82.2％，Rf：0.14(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.＞300゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.70(dd,J＝7.5,1.4Hz,1H),8.49(s,1H),8.15(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.82(s,1H),7.45(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H),7.26(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.18(t,J＝7.5Hz,1H),6.81(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H).EI-MS m/z:370[M+H]+。
实施例28
4-羟基-2-(噻唑-4-基)嘧啶-5-碳酰肼的制备
4-羟基-2-(噻唑-4-基)嘧啶-5-羧酸(0.669g，3.0mmol)，水合肼(0.204g，4.0mmol),溶于甲醇(10mL)中，80゜C回流，冷却至室温，析出大量固体，抽滤，得目标中间体白色固体4-羟基-[2,2′-联嘧啶]-5-碳酰肼0.651g；收率：91.6％，Rf:0.37(甲醇：乙酸乙酯＝1：1),m.p.262.6-263.9゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.50(s,1H),8.92(d,J＝2.9Hz,1H),7.95(d,J＝2.9Hz,1H)..EI-MS m/z:238[M+H]+。
I-28的制备
4-羟基-2-(噻唑-4-基)嘧啶-5-碳酰肼(0.474g，2.0mmol),噻吩-3-甲醛(0.244g，2.2mmol)，4-甲氧基苯胺(0.123g，0.1mmol)溶于DMSO(1mL)和H2O(1mL)中，室温搅拌12.0小时，将反应液倒入10mL H2O,析出大量固体。得白色固体(E)-4-羟基-2-(噻唑-4-基)-N′-(噻吩-3-基亚甲基)嘧啶-5-碳酰肼0.625g，收率：94.4％，Rf：0.18(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.252.3-254.0゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.70(s,1H),8.92(d,J＝2.9Hz,1H),8.31(s,1H),7.95(d,J＝2.9Hz,1H),7.62(dd,J＝2.8,1.4Hz,1H),7.50(dd,J＝7.5,2.7Hz,1H),7.27(dd,J＝7.5,1.6Hz,1H).EI-MS m/z:332[M+H]+。
实施例29
I-29的制备
制备方法同实施例1，用环丙醛(0.155g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-N′-(环丙基亚甲基)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)嘧啶-5-碳酰肼0.519g，两步收率：85.7％，Rf：0.24(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.225.1-227.0゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.74(dd,J＝7.6,1.5Hz,1H),8.14(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.46(d,J＝7.1Hz,1H),7.27(td,J＝7.5,1.5Hz,1H),2.38(h,J＝7.0Hz,1H),1.58–1.46(m,2H),1.24–1.11(m,2H).EI-MS m/z:284[M+H]+。
实施例30
I-30的制备
制备方法同实施例1，用四氢-2H-吡喃-4-甲醛(0.250g，2.2mmol)替换3,4,5-三羟基苯甲醛，得白色固体(E)-4-羟基-2-(吡啶-2-基)-N′-((四氢-2H-吡喃-4-基)亚甲基)嘧啶-5-碳酰肼0.509g，两步收率：72.7％，Rf：0.21(甲醇：乙酸乙酯＝1：1)，m.p.234.7-237.0゜C，该化合物的1H NMR(400MHz,DMSO-d6)δ9.54(s,1H),8.71(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),8.13(dd,J＝7.5,1.5Hz,1H),7.92(td,J＝7.4,1.5Hz,1H),7.27(td,J＝7.4,1.6Hz,1H),7.06(d,J＝7.0Hz,1H),3.83–3.68(m,4H),2.58(h,J＝7.0Hz,1H),2.02(qd,J＝7.0,2.7Hz,4H).EI-MS m/z:328[M+H]+。
实施例31：化合物的生物学实验
1、半数抑制浓度(IC50)检测
本发明将脯氨酰羟化酶蛋白与异硫氰酸荧光素(FITC)标记的荧光分子(CN109293673A)，不同浓度的化合物溶液共同孵育，考察化合物与蛋白竞争性结合的能力。化合物能够占据关键辅因子2-0G的位点，导致荧光分子无法与蛋白结合，未结合脯氨酰羟化酶的荧光分子在溶液中旋转速度快，荧光偏振值低。依据这一特点，本发明通过测定化合物的荧光偏振值间接反映其脯氨酰羟化酶抑制活性。化合物三倍稀释成12个浓度梯度，取20μL加入384孔板(型号Corning#3575)，再依次加入等体积的PHD2蛋白和荧光分子，使终浓度分别为20nM和5nM，摇床孵育1h，采用Tecan SPARK多功能酶标仪检测，激发波长485nm，发射波长535nm，测试结果用Graphpad Prism 8分析。代表性化合物的测试结果见表1。测试中采用的空白对照为20μL荧光分子+40μL缓冲液，阴性对照为20μL荧光分子+20μL PHD2蛋白+20μL缓冲液，阳性对照为上市药物FG-4592(Roxadustat)。缓冲液配方为10mM Hepes,150mMNaCl,0.05％Tween-20,pH 7.40。
计算公式：％抑制率＝100*(1-(实测值-空白)/(阴性值-空白))，得出具体浓度所对应的抑制率。将所得数据导入Graphpad prism 8.0分析拟合得IC50值。
2、EPO基因检测
EPO为体内HIF升高后的标志物(J.Med.Chem.2012,55(7):2945-2959)，当PHD2活性受到抑制后，体内HIF含量升高，其会进入细胞核诱导下游相关基因表达，使体内EPO等蛋白表达含量升高，通过检测EPO的表达来验证化合物在细胞水平是否具有抑制PHD2活性，提高HIF的能力。
本试验采用人肝癌细胞Hep3B细胞，孵育给药10h后，按照RNA提取试剂盒操作，提取RNA。根据Prime ScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行反转录。在qPCR反应板中依次加入7μL DEPC水，0.5μL Sense Primer,0.5μLAntisense Primer,2μL cDNA,10μL SYBR Premix Ex TaqII，在Thermo Step One&StepOne Plus Real-Time PCR Systems完成扩增及定量过程。以HPRT作为内参基因，使用ΔΔCT方法分析EPO相对表达水平。
引物序列：
HPRT-forward 5′-GACCAGTCAACAGGGGACAT-3′,
reverse 5′-AACACTTCGTGGGGTCCTTTTC-3′,
EPO-forward 5′-GAGCCCAGAAGGAAGCCATC-3′,
reverse 5′-CGGAAAGTGTCAGCAGTGATTG-3′。
FG-4592(Roxadustat)是First in class PHD2抑制剂，目前已经相继在中国，日本，智利，韩国和欧洲获批上市，本发明中FG-4592作为阳性对照化合物。FG-4592的结构为：
表1本发明中部分化合物的脯氨酰羟化酶抑制活性及其相关生物学活性
化合物编号 PHD2 IC50(nM) 是否能够提高细胞内EPO表达
I-1 89.3±7.5 是
I-2 320.4±10.2 是
I-3 78.6±5.6 是
I-4 167.0±10.4 是
I-5 192.6±3.2 是
I-6 392.1±9.2 是
I-7 311.0±8.6 是
I-8 258.5±7.4 是
I-9 81.8±2.2 是
I-10 326.7±9.5 是
I-11 297.2±8.7 是
I-12 214.1±6.7 是
I-13 254.5±5.5 是
I-14 162.7±7.2 是
I-15 286.5±9.7 是
I-16 125.5±3.5 是
I-17 405.1±9.8 是
I-18 91.5±3.7 是
I-19 97.0±1.9 是
I-20 70.5±1.8 是
I-21 120.9±1.9 是
I-22 156.1±2.5 是
I-23 331.6±8.3 是
I-24 350.8±8.6 是
I-25 40.2±1.8 是
I-26 45.7±2.1 是
I-27 231.5±6.4 是
I-28 311.5±7.8 是
I-29 961.8±15.7 是
I-30 871.1±12.5 是
FG-4592 120.6±16.3 是
由表1可见，本发明的化合物具有较强的PHD2抑制活性，8个化合物PHD2抑制活性优于阳性药FG-4592，IC50在10～100nM。
对表1部分化合物进行了动物水平的EPO试验，方法参照(J.Med.Chem.2018,61(12):5332-5349)。由图1可见，本发明的化合物在动物水平可以明显提升血浆EPO。
对表1部分化合物进行了动物水平的的网织红细胞试验，方法参照(J.Med.Chem.2018,61(12):5332-5349)。由图1可见，本发明的化合物在动物水平可以明显提升全血网织红细胞比率(％RBC)。
本发明的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物无论在分子水平、细胞水平以及动物水平都具有良好的生物学活性。本发明的化合物可以在动物水平提升血液中红细胞生成素(EPO)和网织红细胞比率(％RBC)，可用于治疗或预防慢性疾病性相关的贫血、缺血性疾病。

Claims (10)

1.一种4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物，其特征在于，具有式(I)的结构，所述衍生物包含其药学上可接受的盐：
其中：
A选自五元或六元不饱和杂环；
R1选自C1-C6烷基、C3-C6环烷基、C2-C4炔基或芳基，其中，芳基被一个或多个R3取代；
R2选自氢、卤素或甲基；
R3为选自卤素、羟基、氨基、羧基、苯基、苄基、氰基、三氟甲基、三氟甲氧基、氨基甲磺酰基、C1-C4烷基或OC1-C4烷基。
2.根据权利要求1所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物，其特征在于，所述结构中：
A选自
3.根据权利要求1所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物，其特征在于，所述结构中：
R1为苯基。
4.根据权利要求1所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物，其特征在于，选自以下任一化合物：
5.根据权利要求1～4任一所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物，其特征在于，所述药学上可接受的盐为所述衍生物与酸或碱形成的盐，所述酸为盐酸、氢溴酸、硫酸、磷酸、甲磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、萘磺酸、柠檬酸、苹果酸、酒石酸、乳酸、丙酮酸、乙酸、马来酸、琥珀酸、富马酸、水杨酸、苯基乙酸或杏仁酸；所述碱为含有碱性金属阳离子、碱土金属阳离子或铵阳离子盐的无机碱，胆碱、二乙醇胺或吗啉。
6.一种权利要求1～5任一所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物的制备方法，其特征在于，所述制备方法为：
化合物II与化合物III，经酰化、缩合反应得到化合物I；
其中，A、R1、R2的定义如权利要求1～4任一所述；
将相应的酸或碱与以上方法制备的化合物(I)成盐，即得所述衍生物的药学上可接受的盐。
7.一种药物组合物，其特征在于，包含权利要求1～5任一所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物以及药学上可接受的载体。
8.一种权利要求1～5任一所述的4-羟基嘧啶-5-甲酰腙衍生物或者权利要求7所述的药物组合物在制备脯氨酰羟化酶抑制剂药物中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物用于治疗和/或预防因红细胞生成素下降或不足所引起的贫血症或缺血性疾病。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述贫血症是由肾炎、肾损伤、类风湿性关节炎、风湿热、炎症性肠道疾病或肿瘤化疗引起的贫血症；所述缺血性疾病是缺血性脑卒中或心肌缺血相关疾病。
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