CN116514763A - 一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用，属于有机小分子荧光探针技术领域。本发明提供的荧光探针如式(I)所示，是以Rhodol基团为母体，在底环上引入强吸电子基团F原子，利用底环4号位上氟原子的高活性引入苯基硒基团，利用硒原子的氧化还原电位设计合成的可以检测ClO‑/GSH氧化还原过程的探针。本发明的氧化还原型荧光探针，能够实现细胞外源ClO‑/GSH氧化还原过程的检测；并且对ClO‑/GSH具有特异性响应，高灵敏度及良好的光学稳定性；同时本发明提供的该探针的制备产率较高。

Description

一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用
技术领域
本发明属于分子荧光探针技术领域，具体涉及一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用。
背景技术
氧化还原的动态平衡对于有氧生命体维持各项正常的生命活动至关重要，有氧呼吸在为机体提供能量的同时会产生具有强氧化性的活性氧物种(ROS)。HClO作为活性氧家族的重要成员，在生物体免疫反应中发挥着重要的作用，其含量水平异常会引起许多免疫相关疾病，例如糖尿病，癌症等。活性氧化物种和还原性物质的氧化还原平衡能够维持调控细胞的正常生理活动，当细胞处于异常状态时，还原性物质不能够有效地消耗掉过量的ROS，致使氧化还原失衡，进一步导致细胞功能异常，最终引发各种疾病。检测氧化还原状态的化学荧光探针具有能与信号分子结合的识别基团以及发出荧光信号的基团，通过发出荧光的强度来反映氧化还原状态。因此实时监测细胞内ROS与还原性物质之间的动态平衡能够帮助我们理解和调控细胞内氧化还原状态。
近年来，荧光成像及荧光探针技术由于其高灵敏度、高时间和空间分辨率、实时原位和非侵入性检测的特点而被广泛用于生物活性物种检测开发中。目前有许多单一检测氧化性物种或者还原性物种的荧光探针，但是能够动态检测氧化还原过程的探针并不是很多。因此发展一种简单有效的荧光探针可以用于动态监测细胞内氧化还原过程具有重要的研究意义和实用价值。
发明内容
本发明的目的是解决细胞内活性氧ROS与还原性物质之间动态平衡的实时监测问题，提供一种用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用。
本发明的技术方案
为实现上述目的，本发明首先提供了一种用于监测氧化还原过程的荧光探针，该探针的化学名称为2-(6-(二乙基氨基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)-3,5,6-三氟-4-((3-苯基硒酰基)丙基氨基)苯甲酸，简称为Rhodol-Se，结构如式(Ι)所示：
该探针可以监测ClO-/GSH这一氧化还原对的氧化还原过程。
本发明同时提供了一种上述用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法，该方法所用原料易得、合成步骤简单及产率高，具体合成路线如下：
合成步骤如下：
S1、将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚在甲磺酸中反应得到Rhodol-F；
S2、将二苯基二硒醚和氢氧化钠置于有机溶剂中反应，再加入硼氢化钠NaBH4反应，在反应混合物中加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺继续反应最终得到产物Z1所示化合物；
S3、将化合物Z1和水合肼在有机溶剂中进行水解反应，得到产物Z2所示化合物；
S4、将步骤S1得到的Rhodol-F与Z2在有机溶剂中进行取代反应得到如式Ι所示的化合物Rhodol-Se。
作为部分实施方式，S1中，所述2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的摩尔比为1:1.1～1.5，优选为1：1.3；如果间苯二酚的添加比例较小，则反应时间会较长且容易生成副产物。如果间苯二酚的添加比例较大，则会增加反应成本。所述2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的总重量与甲磺酸溶剂的重量比为1:20～30。反应温度优选为60℃～95℃。
作为部分实施方式，S2中，所述二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠和N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的摩尔比为1：1.5～3：1～2.5：1.5～2，优选为1：2.5：2：2；所述二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠与N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的总重量和有机溶剂的重量比为1：9～15；所述有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。
作为部分实施方式，S3中，所述化合物Z1和水合肼的摩尔比为1：2～4.5，优选为1：4.1；化合物Z1和水合肼的总重量与乙醇溶剂的重量比为1：1.5～10；水解反应有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。
由于化合物中存在-NH2和-Se，二者均容易被氧化，因此温度不宜过高。
作为部分实施方式，S4取代反应中，所述Rhodol-F与Z2的摩尔比为1：1～1.5，优选为1：1.2；Rhodol-F和Z2的总重量与DMF溶剂的重量比为1：5～9，由于DMF的沸点较高，不易除去，因此不宜量多；反应温度优选为20℃～50℃，时间为18～30小时。
作为部分实施方式，S1-S4中均优先采用硅胶柱层析进行纯化。
本发明还提供了上述荧光探针在检测细胞氧化还原过程中的应用。
本发明的优点和有益效果：
本发明提供的荧光探针的产率较高，可以动态监测ClO-/GSH氧化还原过程，可以实现在细胞内源和外源ClO-/GSH的检测，对ClO-/GSH这一氧化还原对具有特异性响应，灵敏度较高，信噪比低，有良好的光学稳定性。本发明探针的最大吸收波长在530nm左右，最大发射波长为575nm(图2)，探针对ClO-/GSH的识别机制是分子内诱导电子转移(PET)，从而具有高灵敏度(检测限低于10-8M/L)。而且本发明的探针具有良好的生物膜透性和较低的细胞毒性，可以实现细胞中对ClO-/GSH氧化还原过程的检测(图3)。
附图说明
图1是探针在不同浓度ClO-中荧光发射光谱(横坐标为发射波长，纵坐标为荧光强度)。
图2是探针加入ClO-将探针氧化后对不同浓度抗氧化剂GSH荧光光谱(横坐标为发射波长，纵坐标为荧光强度)。
图3是探针Rhodol-Se对外源ClO-/GSH氧化还原过程的细胞成像应用。
具体实施方式
以下详细说明都是例示性的，旨在对申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。
需要注意的是，这里所用的术语仅是为了描述具体实施方法，而非意图限制根据本申请的示例实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也包括复数形式。此外，还应当理解的是，当在本说明中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。
下面将结合附图和实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明提供的用于监测氧化还原过程的荧光探针的结构特征是：以Rhodol为母体结构，在底环上引入强吸电子的卤素原子F原子，底环上4号位的F原子具有较高的反应活性，因此引入苯基硒基团设计合成了探针Rhodol-Se。
本发明还涉及探针的应用，该应用为在HeLa细胞中监测ClO-/GSH氧化还原过程；活的生物样品包括活细胞或者活组织，优选为活的HeLa细胞。
本发明所述的一种用于检测氧化还原过程的荧光探针的制备方法及应用中对氧化还原过程的检测机理是：Se原子具有氧化还原电位，容易被活性氧氧化，利用这一特点将其引入荧光团受体，通过PET机制控制荧光的“关-开”，Se上的供电子基团可以转移至荧光受体，发生PET过程，从而使荧光淬灭，当Se被氧化为Se＝O时，PET机制被阻碍，荧光开启。
为了更好的理解本发明的技术方案，以下通过具体的实施例作进一步详细叙述。
实施例1：用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备
S1、分别将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸(3g,7.8mmol)和间苯二酚(1.1g,10mmol)置于100mL的圆底烧瓶中，加入50mL甲磺酸，在90℃下搅拌24小时，反应停止，将反应液冷却至室温后倒入100毫升冰水中并采用NaHCO3将反应液的pH值调节至中性，用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并有机相用无水硫酸钠干燥后旋干，收集粗产物。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到3.10g粉红色固体Rhodol-F，产率85％。M.p.179-181℃。ESI:m/z[M+H]+＝460.1184；计算值：460.1094。1HNMR(CDCl3,400MHz,ppm):7.34(d,J＝12Hz,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(s,1H),7.13(d,J＝9.6Hz,1H),7.07(d,J＝8.8Hz,1H),6.99(s,1H),3.50(q,J＝6.8Hz,4H)1.38(t,J＝6.8Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm):δ185.71,164.45,159.69,157.42,149.51,147.91,145.22,144.41,141.32,135.46,134.38,128.51,128.32,116.54,113.43,105.67,95.34,92.76,47.11,12.78。
S2、中间体N-(3-苯基硒基)丙基)邻苯二甲酰亚胺Z1的合成及表征
将二苯基二硒醚(3.139g,10mmol)和氢氧化钠(1.0g,25mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL乙醇，将NaBH4(756mg,20mmol)缓慢加入到圆底烧瓶内，室温条件下，悬浮液在氩气氛围下搅拌一小时，不经任何处理直接进行下一步。在反应混合物中加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(5.34g,20mmol)，50℃下搅拌过夜，反应结束后将反应混合物倒入250mL冰水中，采用NaHCO3中和至中性，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到3.60g白色固体粉末Z1，产率为52％。M.p.98-100℃。ESI:m/z[M+O+2H]+＝364.0452；计算值：364.0268。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.96(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),7.55-7.46(m,4H),7.39(d,J＝7.6Hz,1H),7.28-7.22(m,3H),3.50(t,J＝6.4Hz,2H),3.00(t,J＝7.2Hz,2H),2.03-1.98(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):171.01,168.82,137.74,132.63,131.80,130.4,129.85,129.77,129.15,127.53,126.96,39.71,29.46,24.90。
S3、中间体3-苯基硒基-1-丙胺Z2的合成及表征
将化合物Z1(3.5g,10mmol)和水合肼(2mL,41mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇，在氩气氛围下反应过夜，反应结束后将反应混合物冷却至室温，析出白色固体，过滤，将滤液旋干收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到1.45g白色固体粉末Z2，产率为67％，M.p.110-112℃。ESI:m/z[M+H]+＝216.0300；计算值：216.0213。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.49(d,J＝7.2Hz,2H),7.29-7.22(m,3H),2.95(t,J＝7.2Hz,2H),2.86(t,J＝6.8Hz,2H),1.92-1.86(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):132.67,129.14,129.10,127.07,39.88,29.28,24.19。
S4、探针Rhodol-Se的合成及表征
将Rhodol-F(150mg,0.33mmol)和Z2(85mg,0.4mmol)置于50mL圆底烧瓶内，加入2mLDMF中，40℃下搅拌24h，反应结束后，倒入100mL冰水中，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，v/v，100/0-100/30)进行分离后，得到141mg粉红色固体粉末Rhodol-Se，产率为65.5％。M.p.193-195℃。ESI:m/z[M+H]+＝655.1360；计算值：655.1245。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm)7.50(s,2H),7.33-7.38(m,3H),7.27(s,2H),7.22(s,1H),7.04(t,J＝11.2Hz,2H),6.92(s,1H),3.69(d,J＝6.8Hz,4H),3.63(t,J＝6.2Hz,2H),2.98(t,J＝6.8Hz,2H),2.06-2.03(m,2H),1.39(t,J＝6.2Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm)168.68,159.82,159.42,158.66,158.22,157.80,157.38,157.15,156.81,132.60,131.52,130.41,129.48,129.13,127.11,118.68,118.54,115.84,113.01,110.71,102.77,96.42,77.30,77.07,76.75,54.03,53.81,53.58,53.35,53.13,46.53,30.80,24.35,12.38。
实施例2
S1、分别将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸(3g,7.8mmol)和间苯二酚(990mg,9mmol)置于100mL的圆底烧瓶中，加入50mL甲磺酸，在90℃下搅拌24小时，反应停止，将反应液冷却至室温后倒入100毫升冰水中并采用NaHCO3将反应液的pH值调节至中性，用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并有机相用无水硫酸钠干燥后旋干，收集粗产物。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到2.74g粉红色固体Rhodol-F，产率75％。M.p.179-181℃。ESI:m/z[M+H]+＝460.1184；计算值：460.1094。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm):7.34(d,J＝12Hz,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(s,1H),7.13(d,J＝9.6Hz,1H),7.07(d,J＝8.8Hz,1H),6.99(s,1H),3.50(q,J＝6.8Hz,4H)1.38(t,J＝6.8Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm):δ185.71,164.45,159.69,157.42,149.51,147.91,145.22,144.41,141.32,135.46,134.38,128.51,128.32,116.54,113.43,105.67,95.34,92.76,47.11,12.78。
S2、中间体N-(3-苯基硒基)丙基)邻苯二甲酰亚胺Z1的合成及表征
将二苯基二硒醚(3.139g,10mmol)和氢氧化钠(600mg,15mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL乙醇，将NaBH4(567mg,15mmol)缓慢加入到圆底烧瓶内，室温条件下，悬浮液在氩气氛围下搅拌一小时，不经任何处理直接进行下一步。在反应混合物中加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(4.00g,15mmol)，50℃下搅拌过夜，反应结束后将反应混合物倒入250mL冰水中，采用NaHCO3中和至中性，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到3.12g白色固体粉末Z1，产率为45％。M.p.98-100℃。ESI:m/z[M+O+2H]+＝364.0452；计算值：364.0268。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.96(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),7.55-7.46(m,4H),7.39(d,J＝7.6Hz,1H),7.28-7.22(m,3H),3.50(t,J＝6.4Hz,2H),3.00(t,J＝7.2Hz,2H),2.03-1.98(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):171.01,168.82,137.74,132.63,131.80,130.4,129.85,129.77,129.15,127.53,126.96,39.71,29.46,24.90。
S3、中间体3-苯基硒基-1-丙胺Z2的合成及表征
将化合物Z1(3.5g,10mmol)和水合肼(1.5mL,30mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇，在氩气氛围下反应过夜，反应结束后将反应混合物冷却至室温，析出白色固体，过滤，将滤液旋干收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到1.30g白色固体粉末Z2，产率为60％，M.p.110-112℃。ESI:m/z[M+H]+＝216.0300；计算值：216.0213。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.49(d,J＝7.2Hz,2H),7.29-7.22(m,3H),2.95(t,J＝7.2Hz,2H),2.86(t,J＝6.8Hz,2H),1.92-1.86(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):132.67,129.14,129.10,127.07,39.88,29.28,24.19。
S4、探针Rhodol-Se的合成及表征
将Rhodol-F(150mg,0.33mmol)和Z2(68mg,0.5mmol)置于50mL圆底烧瓶内，加入2mL DMF中，室温下搅拌24h，反应结束后，倒入100mL冰水中，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，v/v，100/0-100/30)进行分离后，得到129mg粉红色固体粉末Rhodol-Se，产率为60％。M.p.193-195℃。ESI:m/z[M+H]+＝655.1360；计算值：655.1245。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm)7.50(s,2H),7.33-7.38(m,3H),7.27(s,2H),7.22(s,1H),7.04(t,J＝11.2Hz,2H),6.92(s,1H),3.69(d,J＝6.8Hz,4H),3.63(t,J＝6.2Hz,2H),2.98(t,J＝6.8Hz,2H),2.06-2.03(m,2H),1.39(t,J＝6.2Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm)168.68,159.82,159.42,158.66,158.22,157.80,157.38,157.15,156.81,132.60,131.52,130.41,129.48,129.13,127.11,118.68,118.54,115.84,113.01,110.71,102.77,96.42,77.30,77.07,76.75,54.03,53.81,53.58,53.35,53.13,46.53,30.80,24.35,12.38。
实施例3
S1、分别将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸(3g,7.8mmol)和间苯二酚(1.21g,11mmol)置于100mL的圆底烧瓶中，加入50mL甲磺酸，在70℃下搅拌24小时，反应停止，将反应液冷却至室温后倒入100毫升冰水中并采用NaHCO3将反应液的pH值调节至中性，用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并有机相用无水硫酸钠干燥后旋干，收集粗产物。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到2.55g粉红色固体Rhodol-F，产率70％。M.p.179-181℃。ESI:m/z[M+H]+＝460.1184；计算值：460.1094。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm):7.34(d,J＝12Hz,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(s,1H),7.13(d,J＝9.6Hz,1H),7.07(d,J＝8.8Hz,1H),6.99(s,1H),3.50(q,J＝6.8Hz,4H)1.38(t,J＝6.8Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm):δ185.71,164.45,159.69,157.42,149.51,147.91,145.22,144.41,141.32,135.46,134.38,128.51,128.32,116.54,113.43,105.67,95.34,92.76,47.11,12.78。
S2、中间体N-(3-苯基硒基)丙基)邻苯二甲酰亚胺Z1的合成及表征
将二苯基二硒醚(3.139g,10mmol)和氢氧化钠(800mg,20mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL乙醇，将NaBH4(945mg,25mmol)缓慢加入到圆底烧瓶内，室温条件下，悬浮液在氩气氛围下搅拌一小时，不经任何处理直接进行下一步。在反应混合物中加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(4.81g,18mmol)，50℃下搅拌过夜，反应结束后将反应混合物倒入250mL冰水中，采用NaHCO3中和至中性，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到3.32g白色固体粉末Z1，产率为48％。M.p.98-100℃。ESI:m/z[M+O+2H]+＝364.0452；计算值：364.0268。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.96(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),7.55-7.46(m,4H),7.39(d,J＝7.6Hz,1H),7.28-7.22(m,3H),3.50(t,J＝6.4Hz,2H),3.00(t,J＝7.2Hz,2H),2.03-1.98(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):171.01,168.82,137.74,132.63,131.80,130.4,129.85,129.77,129.15,127.53,126.96,39.71,29.46,24.90。
S3、中间体3-苯基硒基-1-丙胺Z2的合成及表征
将化合物Z1(3.5g,10mmol)和水合肼(1.7mL,35mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇，在氩气氛围下反应过夜，反应结束后将反应混合物冷却至室温，析出白色固体，过滤，将滤液旋干收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到1.34g白色固体粉末Z2，产率为62％，M.p.110-112℃。ESI:m/z[M+H]+＝216.0300；计算值：216.0213。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.49(d,J＝7.2Hz,2H),7.29-7.22(m,3H),2.95(t,J＝7.2Hz,2H),2.86(t,J＝6.8Hz,2H),1.92-1.86(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):132.67,129.14,129.10,127.07,39.88,29.28,24.19。
S4、探针Rhodol-Se的合成及表征
将Rhodol-F(150mg,0.33mmol)和Z2(91mg,0.43mmol)置于50mL圆底烧瓶内，加入2mLDMF中，40℃下搅拌24h，反应结束后，倒入100mL冰水中，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，v/v，100/0-100/30)进行分离后，得到136mg粉红色固体粉末Rhodol-Se，产率为63％。M.p.193-195℃。ESI:m/z[M+H]+＝655.1360；计算值：655.1245。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm)7.50(s,2H),7.33-7.38(m,3H),7.27(s,2H),7.22(s,1H),7.04(t,J＝11.2Hz,2H),6.92(s,1H),3.69(d,J＝6.8Hz,4H),3.63(t,J＝6.2Hz,2H),2.98(t,J＝6.8Hz,2H),2.06-2.03(m,2H),1.39(t,J＝6.2Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm)168.68,159.82,159.42,158.66,158.22,157.80,157.38,157.15,156.81,132.60,131.52,130.41,129.48,129.13,127.11,118.68,118.54,115.84,113.01,110.71,102.77,96.42,77.30,77.07,76.75,54.03,53.81,53.58,53.35,53.13,46.53,30.80,24.35,12.38。
实施例4
S1、分别将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸(3g,7.8mmol)和间苯二酚(1.32g,12mmol)置于100mL的圆底烧瓶中，加入50mL甲磺酸，在80℃下搅拌24小时，反应停止，将反应液冷却至室温后倒入100毫升冰水中并采用NaHCO3将反应液的pH值调节至中性，用二氯甲烷萃取三次(100mL×3)，合并有机相用无水硫酸钠干燥后旋干，收集粗产物。粗产物用乙酸乙酯重结晶，得到2.92g粉红色固体Rhodol-F，产率80％。M.p.179-181℃。ESI:m/z[M+H]+＝460.1184；计算值：460.1094。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm):7.34(d,J＝12Hz,1H),7.28(d,J＝8.8Hz,1H),7.22(s,1H),7.13(d,J＝9.6Hz,1H),7.07(d,J＝8.8Hz,1H),6.99(s,1H),3.50(q,J＝6.8Hz,4H)1.38(t,J＝6.8Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm):δ185.71,164.45,159.69,157.42,149.51,147.91,145.22,144.41,141.32,135.46,134.38,128.51,128.32,116.54,113.43,105.67,95.34,92.76,47.11,12.78。
S2、中间体N-(3-苯基硒基)丙基)邻苯二甲酰亚胺Z1的合成及表征
将二苯基二硒醚(3.139g,10mmol)和氢氧化钠(720mg,18mmol)置于250mL圆底烧瓶中，加入100mL乙醇，将NaBH4(756mg,20mmol)缓慢加入到圆底烧瓶内，室温条件下，悬浮液在氩气氛围下搅拌一小时，不经任何处理直接进行下一步。在反应混合物中加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺(4.27g,16mmol)，50℃下搅拌过夜，反应结束后将反应混合物倒入250mL冰水中，采用NaHCO3中和至中性，用乙酸乙酯(100mL×3)萃取。合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到3.46g白色固体粉末Z1，产率为50％。M.p.98-100℃。ESI:m/z[M+O+2H]+＝364.0452；计算值：364.0268。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.96(dd,J＝7.6Hz,0.8Hz,1H),7.55-7.46(m,4H),7.39(d,J＝7.6Hz,1H),7.28-7.22(m,3H),3.50(t,J＝6.4Hz,2H),3.00(t,J＝7.2Hz,2H),2.03-1.98(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):171.01,168.82,137.74,132.63,131.80,130.4,129.85,129.77,129.15,127.53,126.96,39.71,29.46,24.90。
S3、中间体3-苯基硒基-1-丙胺Z2的合成及表征
将化合物Z1(3.5g,10mmol)和水合肼(0.98mL,20mmol)置于100mL圆底烧瓶中，加入10mL无水乙醇，在氩气氛围下反应过夜，反应结束后将反应混合物冷却至室温，析出白色固体，过滤，将滤液旋干收集粗产物，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：乙酸乙酯/乙醇，v/v，100/0-100/25)进行分离后，得到1.41g白色固体粉末Z2，产率为65％，M.p.110-112℃。ESI:m/z[M+H]+＝216.0300；计算值：216.0213。1H NMR(400MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):7.49(d,J＝7.2Hz,2H),7.29-7.22(m,3H),2.95(t,J＝7.2Hz,2H),2.86(t,J＝6.8Hz,2H),1.92-1.86(m,2H)；13C NMR(100MHz,CDCl3-CD3OD,5:1,v/v):132.67,129.14,129.10,127.07,39.88,29.28,24.19。
S4、探针Rhodol-Se的合成及表征
将Rhodol-F(150mg,0.33mmol)和Z2(98mg,0.46mmol)置于50mL圆底烧瓶内，加入2mLDMF中，30℃下搅拌24h，反应结束后，倒入100mL冰水中，用二氯甲烷(30mL×3)萃取，合并有机相用无水Na2SO4干燥后旋干，粗产物采用硅胶柱层析(展开剂：二氯甲烷/乙酸乙酯，v/v，100/0-100/30)进行分离后，得到133mg粉红色固体粉末Rhodol-Se，产率为62％。M.p.193-195℃。ESI:m/z[M+H]+＝655.1360；计算值：655.1245。1H NMR(CDCl3,400MHz,ppm)7.50(s,2H),7.33-7.38(m,3H),7.27(s,2H),7.22(s,1H),7.04(t,J＝11.2Hz,2H),6.92(s,1H),3.69(d,J＝6.8Hz,4H),3.63(t,J＝6.2Hz,2H),2.98(t,J＝6.8Hz,2H),2.06-2.03(m,2H),1.39(t,J＝6.2Hz,6H)；13C NMR(CDCl3,100MHz,ppm)168.68,159.82,159.42,158.66,158.22,157.80,157.38,157.15,156.81,132.60,131.52,130.41,129.48,129.13,127.11,118.68,118.54,115.84,113.01,110.71,102.77,96.42,77.30,77.07,76.75,54.03,53.81,53.58,53.35,53.13,46.53,30.80,24.35,12.38。
探针Rhodol-Se及加入不同浓度的ClO-的荧光光谱
将上述制得的Rhodol-Se在二甲基亚砜(DMSO)中制成5×10-3M的母体溶液待用；
取6μL 5×10-3mol/L的标准母体溶液于3mL检测体系中，配成浓度为10μM的主体溶液。向主体溶液中加入不同浓度的ClO-客体溶液，使得样品瓶内ClO-与探针Rhodol-Se的浓度比分别为：0.2、0.4、0.6、0.8、1、1.2、1.4、1.6、1.8、2、2.2、2.4、2.6、2.8、3、3.2、3.4、3.6、3.8、4、4.2、4.4、4.6、4.8、5、5.2、5.4、5.6、5.8、6，摇匀进行荧光测试(激发波长500nm，狭缝宽度5nm)。测得各体系中荧光强度。如图1所示，由图1可知，随着ClO-浓度的增加，荧光强度逐渐增强。
取6μL 5×10-3mol/L的标准母体溶液于3mL检测体系中，配成浓度为10μM的主体溶液。向主体溶液中加入3eq ClO-摇匀溶液，再向里面加入GSH使得样品瓶内GSH与探针Rhodol-Se的浓度比分别为：0.8、1.4、1.8、2.2、2.6、3、4、5，摇匀进行荧光测试(激发波长500nm，狭缝宽度5nm)。测得各体系中荧光强度，如图2所示，由图2可知，随着GSH浓度的增加，荧光强度逐渐降低。
探针Rhodol-Se对外源性ClO-/GSH的细胞成像图
将适当密度的HeLa细胞接种到6孔的培养皿中，在37℃含5％CO2的培养箱中培养；待细胞贴壁后，加入荧光探针Rhodol-Se(浓度为1μM)孵育半小时后进行荧光成像(激发波长488nm，收集波段520-620nm)，成像结果如图3所示。
由图3可知，图3中a1)活的Hela细胞先加入1mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理除去细胞里本身含有的生物硫醇物质，然后用探针Rhodol-Se(1μM)处理后，细胞在绿色通道中呈现微弱的荧光，图a2)为明场下细胞成像图。图a3)为a1)和a2)的叠加图。图b1)中，活的Hela细胞先用1mM的N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理，除去细胞里本身含有的生物硫醇物质，再用1μM Rhodol-Se和ClO-(2μM)共培养30分钟，细胞中的荧光信号明显增强，图b2)为明场下的细胞成像图，图b3)为b1)和b2)的叠加图。图c1)中，在图b1)的基础上再加入2μM GSH与细胞共培养30分钟，细胞中的绿色通道的荧光信号明显降低。图d)是再次加入ClO-，发现细胞内绿色通道荧光信号再次增强。

Claims (9)

1.一种用于监测氧化还原过程的荧光探针，该探针的化学名称为2-(6-(二乙基氨基-3-氧代-3H-氧杂蒽-9-基)-3,5,6-三氟-4-((3-苯基硒酰基)丙基氨基)苯甲酸，简称为Rhodol-Se，可以监测ClO-/GSH这一氧化还原对的氧化还原过程，其结构如下式(Ι)所示：
2.一种权利要求1所述的用于监测氧化还原过程的荧光探针的制备方法，其特征在于：具体制备路线如下：
a)
b)
C)
合成步骤如下：
S1、将2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚加入到装有甲磺酸的容器中反应，得到Rhodol-F；
S2、将二苯基二硒醚和氢氧化钠溶于有机溶剂中，将NaBH4缓慢加入到混合物中；再向反应混合物中加入N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺继续反应，得到Z1所示化合物；
S3、将化合物Z1和水合肼用有机溶剂溶解进行水解反应，得到Z2所示化合物；
S4、将Rhodol-F和Z2在有机溶剂中进行取代反应，得到目标产物Rhodol-Se。
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，步骤S1中所述的2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的摩尔比为：1：1.1～1.5，优选1：1.3。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤S1中所述的2-(4-(二乙氨基-2-羟基苯甲酰基)-四氟苯甲酸和间苯二酚的总重量与甲磺酸的重量比为1：20～30；反应温度为60℃～95℃。
5.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤S2中所述的二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠和N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的摩尔比为1：1.5～3：1～2.5：1.5～2，优选为1：2.5：2：2。
6.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤S2中所述的二苯基二硒醚、氢氧化钠、硼氢化钠与N-(3-溴丙基)邻苯二甲酰亚胺的总重量和有机溶剂的重量比为1：9～15；所述有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。
7.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤S3中所述的化合物Z1和水合肼的摩尔比为1：2～4.5，优选为1：4.1；化合物Z1和水合肼的总重量与有机溶剂的重量比为1：1.5～10。
8.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤S3中水解反应有机溶剂选择醇类有机溶剂，优选为乙醇；反应温度优选为25℃～50℃。
9.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于步骤S4中所述的化合物Rhodol-F与Z2的摩尔比为1：1～1.5，优选为1：1.2；S4中的取代反应温度为20～50℃，时间为18～30小时。
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