CN116500278A - 标志物在制备诊断或辅助诊断缺血性脑卒中产品中的应用 - Google Patents

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CN116500278A CN202310494423.2A CN202310494423A CN116500278A CN 116500278 A CN116500278 A CN 116500278A CN 202310494423 A CN202310494423 A CN 202310494423A CN 116500278 A CN116500278 A CN 116500278A
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Abstract

本发明公开了标志物在制备诊断或辅助诊断缺血性脑卒中产品中的应用，所述标志物为CLDN7和/或PPM1B，经临床样本验证发现，所述标志物对缺血性脑卒中具有较高的诊断效能，可作为诊断鉴别缺血性脑卒中的生物标志物，且具有准确性高、特异性好、灵敏度高等优点，为本领域关于缺血性脑卒中的早期诊断提供了全新的思路和策略，具有良好的临床应用价值。

Description

标志物在制备诊断或辅助诊断缺血性脑卒中产品中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体地，本发明涉及标志物在制备诊断或辅助诊断缺血性脑卒中产品中的应用，更具体地，所述标志物为CLDN7和/或PPM1B。
背景技术
缺血性脑卒中(Ischemic stroke，IS)是指由于脑的供血动脉(颈动脉和椎动脉)狭窄或闭塞、脑供血不足导致的脑组织坏死的总称。缺血性脑卒中是由于局部脑缺血及永久性脑梗死(如DWI检查呈阳性)引发的突发神经功能缺损。临床研究表明，多种因素均可诱发缺血性脑卒中，其常见原因(按发病率排列)包括大动脉的动脉粥样硬化性闭塞、脑栓塞(栓塞性梗死)、小的深部穿支动脉的非栓塞性梗塞(腔隙性脑梗)、和由远端动脉狭窄及脑血流下降导致的分水岭区域梗死(血流动力学卒中)。缺血性脑卒中的诊断主要靠临床诊断，CT或MRI能帮助排除出血，明确诊断，同时能判断其病变的范围。对于某些患者，急性期溶栓治疗可能会有帮助。根据病因不同，颈动脉内膜切除术或支架植入、抗血小板治疗或华法林等可帮助降低再次脑卒中的发生率。
由于血管危险因素的负担日益加重以及突出的人口老龄化问题，导致神经血管疾病的发生越来越普遍。其中，缺血性脑卒中占到所有卒中比例的87％，因其发病率高、复发率高、死亡率高、致残率高，是世界公认严重威胁人类健康的重大疾病。超早期或早期(发病6小时内)、个体化治疗对于急性脑卒中患者的预后至关重要。目前存在以下几个问题：(1)缺血性脑卒中是通过临床评估和神经影像学诊断的，需要的时间较长；(2)许多短暂性缺血发作的患者在到达医院时已经无症状，无法进行准确的神经功能评估；(3)即使患者在卒中时的基本特征相似，预后也可能存在较大差异。这些因素都会延误对患者的诊断和针对性的治疗，导致错过最佳的治疗时间。虽然血液生物标志物已经在其它血管疾病的诊断中使用了很多年，但是尚未见有关于卒中的血液生物标志物应用于临床，而目前报道的生物标志物的准确性远远低于临床实践的要求。
因此，开发快速、便捷的缺血性脑卒中患者血液生物标志物诊断指标对于缺血性脑卒中的早期诊断及后续治疗具有重要的临床意义。
发明内容
有鉴于此，为了弥补现有技术中存在的不足，本发明的目的在于提供能够用于诊断或辅助诊断缺血性脑卒中的标志物，所述标志物为CLDN7和/或PPM1B。
为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：
本发明的第一方面提供了检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂在制备诊断或辅助诊断缺血性脑卒中产品中的应用。
进一步，所述试剂包括采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、色谱技术、质谱技术检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂。
进一步，所述试剂包括检测样本中CLDN7和/或PPM1B mRNA表达水平的试剂、检测样本中CLDN7和/或PPM1B编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂。
进一步，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B mRNA表达水平的试剂包括特异性识别CLDN7和/或PPM1B的探针、特异性扩增CLDN7和/或PPM1B的引物。
进一步，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合CLDN7和/或PPM1B的抗体、抗体片段、亲和性蛋白。
进一步，所述特异性扩增CLDN7的引物的序列如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6所示；
所述特异性扩增PPM1B的引物的序列如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示。
进一步，所述样本为血液样本。
进一步，所述测序技术包括(但不限于)：一代测序、二代测序、三代测序，其中，一代测序也称Sanger测序，是利用DNA聚合酶合成反应的测序技术，一代测序是基于Sanger方法的测序技术；二代测序基于大规模平行测序技术(Massive parallel analysis，MPS)，它能同时完成测序模板互补链的合成和序列数据的获取；三代测序则基于单分子测序和大规模平行测序技术。
进一步，所述核酸杂交技术是指互补的核苷酸序列(DNA与DNA、DNA与RNA、RNA与RNA等)通过Watson-Crick碱基配对形成非共价键，从而形成稳定的同源或异源双链分子的过程，又称为核酸杂交。
进一步，所述核酸扩增技术是指一大类技术方法的总称，目前核酸扩增技术包括常规PCR、实时荧光PCR、等温核酸扩增技术等，可将极微量的靶DNA特异地扩增上百万倍，从而大大提高对DNA分子的分析和检测能力，能检测单分子DNA或对每10万个细胞中仅含1个靶DNA分子的样品。
进一步，所述蛋白免疫技术是指包括放射免疫测定、直接、间接或对比酶联免疫吸附测定、酶免疫测定、荧光免疫测定、蛋白质印迹法、免疫沉淀法、基于任何颗粒的免疫测定(例如：使用金颗粒、银颗粒或乳胶颗粒、磁性颗粒或量子点)对目标物进行检测的一类方法的统称，可在微量滴定板或条的形式中实施蛋白免疫法。
进一步，所述色谱技术是指分离和分析复杂混合物中各个组分的方法，利用不同物质在由固定相和流动相构成的体系中具有不同的分配系数，当两相作相对运动时，这些物质随流动相一起运动，并在两相间进行反复多次的分配，从而使各物质达到分离。
进一步，所述质谱技术是指利用电场和磁场将运动的离子(带电荷的原子、分子或分子碎片、同位素离子、碎片离子、重排离子、多电荷离子、亚稳离子、负离子和离子-分子相互作用产生的离子)按它们的质荷比分离后进行检测的方法。测出离子准确质量即可确定离子的化合物组成。
本发明的第二方面提供了一种用于诊断或辅助诊断缺血性脑卒中的产品。
进一步，所述产品包含检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂。
在一些实施方案中，所述产品包括芯片、试剂盒、试纸、高通量测序平台。
在一些实施方案中，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂包括检测样本中CLDN7和/或PPM1B mRNA表达水平的试剂、检测样本中CLDN7和/或PPM1B编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂。
在一些实施方案中，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B mRNA表达水平的试剂包括特异性识别CLDN7和/或PPM1B的探针、特异性扩增CLDN7和/或PPM1B的引物，在一些优选的实施方案中，所述特异性扩增CLDN7的引物的序列如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6所示，所述特异性扩增PPM1B的引物的序列如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示。
在一些实施方案中，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合CLDN7和/或PPM1B的抗体、抗体片段、亲和性蛋白。
进一步，所述芯片的制备可采用本领域技术人员已知的生物芯片的常规制备方法，包括(但不限于)：采用修饰玻片或硅片的固相载体，探针的5’端含有氨基修饰的聚dT串，将寡核苷酸探针配制成溶液，然后采用点样仪将其点在修饰玻片或硅片上，排列成预定的序列或阵列，然后通过放置过夜来固定，就可得到本发明所述的芯片。
进一步，所述试剂盒还包括使用说明书或标签、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，还包括一个或多个用于容纳试剂盒中所含组合物的容器。组合物可呈液体形式或可冻干。用于组合物的合适容器包括例如瓶子、小瓶、注射器和试管。容器可由多种材料形成，包括玻璃或塑料。所述说明书或标签详细记载了如何使用所述试剂盒进行样本的检测以及所述试剂盒用于诊断或辅助诊断缺血性脑卒中。
进一步，所述试剂盒还可包括适于实用(如针对不同的检测方法)的多种不同的试剂，并不限于目前本发明中所列举的试剂，只要是基于CLDN7和/或PPM1B的检测来诊断或辅助诊断缺血性脑卒中的试剂均包含在本发明的保护范围内。
进一步，所述试剂盒包括qPCR试剂盒、免疫印迹检测试剂盒、免疫层析检测试剂盒、流式细胞分析试剂盒、免疫组化检测试剂盒、ELISA试剂盒、电化学发光检测试剂盒。
本发明中所述的产品中包括的引物可以通过化学合成来制备，通过使用本领域技术人员熟知的方法参考已知信息来适当地设计，并通过化学合成来制备，并不局限于本发明所述的如SEQ ID NO:5-SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示引物。本发明中所述的产品中的抗体，可以使用任何结构、尺寸、免疫球蛋白类别、起源等的抗体或其片段，只要它结合靶蛋白质即可。本发明的产品中包括的抗体或其片段可以是单克隆的或多克隆的。抗体片段指保留抗体对抗原的结合活性的抗体一部分或含有抗体一部分的肽。抗体片段可以包括F(ab′)2、Fab′、Fab、单链Fv(scFv)、二硫化物键合的Fv(dsFv)或其聚合物、二聚化V区(双抗体)、或含有CDR的肽。抗体可以通过本领域技术人员公知的方法来获得。例如，制备保留整个或部分靶蛋白质的多肽或整合编码它们的多核苷酸的哺乳动物细胞表达载体作为抗原。使用抗原免疫动物后，从经过免疫的动物获得免疫细胞并融合癌细胞以获得杂交瘤。然后从杂交瘤培养物收集抗体。最后可以通过使用被用作抗原的标志物蛋白或其部分对获得的抗体实施抗原特异性纯化来获得针对标志物蛋白的单克隆抗体。
本发明的第三方面提供了一种筛选治疗缺血性脑卒中的候选药物的方法。
进一步，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达CLDN7和/或PPM1B的体系接触；
(2)检测所述体系中CLDN7和/或PPM1B的表达水平；
(3)选择可降低CLDN7表达水平和/或升高PPM1B表达水平的物质为治疗缺血性脑卒中的候选药物。
在一些实施方案中，所述体系包括(但不限于)：细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。
本发明的第四方面提供了一种用于诊断或辅助诊断缺血性脑卒中的诊断系统。
进一步，所述诊断系统包括：
(1)缺血性脑卒中评估装置：包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有缺血性脑卒中；
(2)彼此通信连接的信息通信终端装置：用于提供关于来自受试者的样本中CLDN7和/或PPM1B的表达水平的数据；
所述缺血性脑卒中评估装置的控制单元包括如下四个单元：
1)数据接收单元：用于接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的数据；
2)判别值计算单元：其基于对由所述数据接收单元接收的所述样本中CLDN7和/或PPM1B的表达水平以及存储在所述存储单元中作为解释变量的CLDN7和/或PPM1B的表达水平的判别来计算判别值；
3)判别值基准评价单元：其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者缺血性脑卒中的发生风险情况进行评价；
4)评估结果发送单元：其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
进一步，所述样本为受试者来源的血液样本。
本发明中所述的生物标志物CLDN7(claudin 7)在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Gene ID为1366，具体位置为17p13.1。
本发明中所述的生物标志物PPM1B(protein phosphatase,Mg2+/Mn2+dependent1B)在NCBI(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)中的Gene ID为5495，具体位置为2p21。
相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果：
本发明首次发现CLDN7和/或PPM1B与缺血性脑卒中密切相关，可作为诊断鉴别缺血性脑卒中的生物标志物，且具有准确性高、特异性好、灵敏度高等优点，为本领域关于缺血性脑卒中的早期诊断提供了全新的思路和策略，具有良好的临床应用价值。
附图说明
图1为在筛选集中鉴定出的差异表达基因的结果图；
图2为在筛选集中，CLDN7在缺血性脑卒中患者和正常对照者之间的差异表达结果图；
图3为在筛选集中，PPM1B在缺血性脑卒中患者和正常对照者之间的差异表达结果图；
图4为在筛选集中，CLDN7用于诊断缺血性脑卒中的ROC曲线结果图，其中，纵坐标是灵敏度，横坐标是特异性；
图5为在筛选集中，PPM1B用于诊断缺血性脑卒中的ROC曲线结果图，其中，纵坐标是灵敏度，横坐标是特异性；
图6为在筛选集中，CLDN7+PPM1B用于诊断缺血性脑卒中的ROC曲线结果图，其中，纵坐标是灵敏度，横坐标是特异性；
图7为内参GAPDH基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图，其中，A图：GAPDH基因实时扩增曲线图，B图：产物溶解曲线图；
图8为内参ACTB基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图，其中，A图：ACTB基因实时扩增曲线图，B图：产物溶解曲线图；
图9为CLDN7基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图，其中，A图：CLDN7基因实时扩增曲线图，B图：产物溶解曲线图；
图10为PPM1B基因实时扩增曲线图及产物溶解曲线图，其中，A图：PPM1B基因实时扩增曲线图，B图：产物溶解曲线图；
图11为在验证集中，CLDN7在缺血性脑卒中患者和正常对照者之间的差异表达结果图；
图12为在验证集中，PPM1B在缺血性脑卒中患者和正常对照者之间的差异表达结果图；
图13为在验证集中，CLDN7用于诊断缺血性脑卒中的ROC曲线结果图，其中，纵坐标是灵敏度，横坐标是特异性；
图14为在验证集中，PPM1B用于诊断缺血性脑卒中的ROC曲线结果图，其中，纵坐标是灵敏度，横坐标是特异性；
图15为在验证集中，CLDN7+PPM1B用于诊断缺血性脑卒中的ROC曲线结果图，其中，纵坐标是灵敏度，横坐标是特异性。
具体实施方式
除非另有定义，本发明上下文中的所使用的所有的技术和科学术语具有本领域普通技术人员所理解的相同含义。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例，不是旨在于限制本发明，此外，对部分术语解释如下。
本文中使用的术语“表达水平”，是指特定的生物标志物序列从其基因组基因座被转录的程度，即生物标志物在一个或多个被分析血液中的浓度。在本发明的具体实施例中，所述特定的生物标志物为CLDN7和/或PPM1B。
本文中使用的术语“生物标志物”，是指具有特异性生物学特性、生物化学特征或者其他方面特性的分子指示物，其可用于确定存在或不存在某种特定疾病或状况和/或某种特定疾病或状况的严重程度。在本发明的具体实施例中，所述某种特定疾病或状况指缺血性脑卒中。在本发明中，所使用的术语“生物标志物”特指化合物，优选为基因，与来自具有第二表型(例如没有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品相比，它在来自具有第一表型(例如患有疾病)的受试者或一组受试者的生物样品中差异地存在(即增加或减少)。该术语通常是指一种基因的存在/浓度/含量或两种或更种基因的存在/浓度/含量，在本发明的具体实施例中，所述生物标志物为CLDN7和/或PPM1B；
生物标志物可以在任何水平上差异地存在，但是一般以如下的水平存在，所述水平增加了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少100％、至少110％、至少120％、至少130％、至少140％、至少150％、或更多；或一般以如下的水平存在，所述水平减少了至少5％、至少10％、至少15％、至少20％、至少25％、至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、或100％(即不存在)，优选地，所述生物标志物以具有统计显著性(P＜0.05)。
本文中使用的术语“样本”，是指获得自或衍生自受试者(例如感兴趣的个体)的组合物，其包含有待根据例如物理，生化，化学和/或生理特点来表征和/或鉴定的细胞和/或其它分子实体。例如，样本是指来源于感兴趣的受试者的任何样本，预计或已知其包含待表征的细胞和/或分子实体。样本包括但不限于，组织样本，原代或培养的细胞或细胞系、细胞上清、细胞裂解物、血小板、血清、血浆、玻璃体液、淋巴液、滑液、滤泡液、精液、羊水、乳液、全血、血液衍生的细胞、尿液、脑脊髓液、唾液、痰液、泪液、汗液、粘液、肿瘤裂解物、组织培养液、组织提取物、匀浆化的组织、肿瘤组织、细胞提取物、及其组合。作为优选的实施方式，所述样本选自血液、血清、血浆，作为另一优选的实施方式，所述样本选自组织。在本发明的具体实施方案中，所述样本优选为受试者来源的血液样本。
本文中使用的术语“受试者”，是指任何动物，还指人类和非人类的动物。非人类的动物包括所有脊椎动物，例如，哺乳动物，如非人灵长类动物(特别是高等灵长类动物)、绵羊、狗、啮齿类动物(如小鼠或大鼠)、豚鼠、山羊、猪、猫、兔、牛、和任何家畜或宠物；以及非哺乳动物，如鸡，两栖类，爬行动物等。在优选的实施方式中，所述受试者为人。
本文中使用的术语“治疗”，是指涉及人类或动物(例如，被兽医所应用)的治疗，其中可达到某些预期的治疗效果，例如，抑制病症的发展(包括降低发展速度、使发展停止)、改善病症和治愈病症。还包括作为预防措施(例如预防)的治疗。对还没有发展为病症但有发展为该病症危险的患者的用途，也包括在术语“治疗”中。
本文中使用的术语“差异表达”，是指生物标志物在靶样本中的表达水平与在对照样本中相比是改变的，所述对照样本可以是健康人的样本，其可以是上调(即在靶样本中生物标志物的浓度增加)或下调(即在靶样本中生物标志物的浓度降低或消失)。在本发明的具体实施例中，所述生物标志物为CLDN7和/或PPM1B。
本文中使用的术语“引物”，是指可以在扩增方法(如聚合酶链式反应(PCR))中使用来基于对应于目的基因(例如，CLDN7和/或PPM1B的序列或其一部分)的多核苷酸序列扩增核苷酸序列的寡核苷酸。通常，用于扩增多核苷酸序列的至少一条PCR引物对于该多核苷酸序列是序列特异性的。引物的确切长度取决于多种因素，包括温度、引物来源和所用的方法。例如，对于诊断应用，根据靶序列的复杂性，寡核苷酸引物通常含有至少10、或15、或20、或25或更多个核苷酸，但是其可以含有更少核苷酸或更多核苷酸。确定引物合适长度中涉及的因素是本领域技术人员熟知的。
本文中使用的术语“探针”，是指能够选择性结合特定预期目标生物分子的任何分子。在一些实施方案中，本文中，术语“探针”是指可间接地或直接地、共价地或非共价地结合至本文公开的任何底物和/或反应产物和/或蛋白酶的任何分子或与其相关，并且其相关或结合可使用本文公开的方法检测。在一些实施方案中，探针是荧光探针、抗体或基于吸光度的探针。如果是基于吸光度的探针，发色团pNA(对硝基苯胺)可用作检测和/或定量本文公开的靶核酸序列的探针。在一些实施方案中，探针可以是包含荧光分子或底物的核酸序列，该荧光分子或底物在暴露于酶时变为发荧光的，并且该核酸序列与一种核酸序列的片段互补。
本文中使用的术语“抗体”，是指针对抗原位点的特异性免疫球蛋白，本发明中的抗体是指与本发明中所述的生物标志物多肽和/或蛋白特异性结合的抗体，可以根据本领域中的常规方法来制造抗体，抗体的形式包括多克隆抗体或单克隆抗体、抗体片段(例如：Fab、Fab'、F(ab')2和Fv片段)、单链Fv(scFv)抗体、多特异性抗体(例如：双特异性抗体)、单特异性抗体、单价抗体、嵌合抗体、人源化抗体、人抗体、包含抗体的抗原结合位点的融合蛋白，以及包含抗原结合位点的任何其他修饰的免疫球蛋白分子，只要该抗体表现出所需的生物结合活性即可。
本文中使用的术语“多肽”，是指由氨基酸以肽键连接组成的化合物，包括多肽的全长或氨基酸片段，所述基因编码的多肽的表达水平，可以根据样本中总蛋白的量或管家基因所编码的多肽的量来标准化。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。
实施例1缺血性脑卒中诊断相关的生物标志物的筛选
1、筛选方法
1.1筛选集来源及预处理的方法
本实施例中用于筛选与缺血性脑卒诊断相关的生物标志物的筛选集来自于GeneExpression Omnibus(GEO)数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)，从GEO数据库下载了GSE146882数据集的芯片数据及临床信息作为本研究的筛选集，所述筛选集中的样本量为缺血性脑卒中：对照组＝10：10。所述样本均来自于所述受试者的血液样本。
利用fastp软件双端序列自动检测模式对raw data进行接头处理；采用最低N碱基数量阈值为5，reads最低长度阈值为15，碱基质量阈值Q15，低质量碱基百分比阈值为40％，以4个碱基为单位滑动窗口过滤，窗口平均质量阈值Q20的条件对数据进行修剪和质控；分析使用软件默认参数，输出高质量的测序数据进行后续分析；分析得到的clean data使用ICGC软件比对到人类参考基因组，参考基因组版本为GRCh38.d1.vd1，使用RMA方法对来自于GEO数据库的数据进行标准化处理，由平台注释文件GPL23178对基因进行注释，合并去重取平均值。
1.2缺血性脑卒中相关的差异表达基因分析
使用R软件中的“limma”包(版本为3.36.5)进行差异表达基因的分析，比较在缺血性脑卒中的血液样本与对照组的血液样本中表达差异的基因，从而获得在缺血性脑卒中组和对照组之间差异表达的基因(DEGs)，其中，DEGs的筛选标准为adj.P.Val<0.05、|log2FC|>1，并使用火山图进行可视化。
2、筛选结果
在筛选集中，差异表达基因的分析结果见图1，结果显示，与对照组相比，在缺血性脑卒中组中共鉴定出9985个差异表达基因，其中，有4377个上调的差异表达基因，5581个下调的差异表达基因，并将上下调基因中差异性最高的前25个基因以热图的形式展示。
在筛选集中，本发明涉及的血液生物标志物CLDN7、PPM1B在缺血性脑卒中中的表达均呈现显著性的差异表达(见图2和图3)，其中，CLDN7在缺血性脑卒中中表达显著上调，PPM1B在缺血性脑卒中中表达显著下调。
实施例2初步验证经筛选得到的诊断标志物对缺血性脑卒中的诊断效能1、验证分析方法
采用R包“pROC”绘制受试者工作曲线(ROC)，分析经实施例1筛选得到的在缺血性脑卒中组和对照组之间呈现显著性的差异表达的生物标志物CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B在筛选集中的AUC值、灵敏度、特异性，判断其对缺血性脑卒中的诊断效能。
其中，在评估分析单个生物标志物CLDN7、PPM1B对缺血性脑卒中的诊断效能时，使用基因的表达量(Log2表达量)进行评估分析，选择最大的Youden指数所对应的点作为其cutoff值，即最佳划分阈值通过Youden指数最大的一点来确定；在评估分析联合的生物标志物CLDN7+PPM1B对缺血性脑卒中的诊断效能时，首先对CLDN7+PPM1B进行Logistics回归分析，在Logistics回归分析中，自变量为CLDN7+PPM1B，因变量为缺血性脑卒中的患病情况，通过拟合出的回归曲线可以计算出每个个体患缺血性脑卒中与否的概率，确定不同的概率划分阈值即可得到预测结果。最佳概率划分阈值通过Youden指数最大的一点来确定，根据确定的概率划分阈值，可以分别计算得出CLDN7+PPM1B检测在筛选集中的AUC值、灵敏度、特异性等。对得到的CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B对应的AUC值、灵敏度、特异性进行分析，以判断其诊断效能。
2、验证分析结果
CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B在筛选集中对应的诊断效能结果分别见图4、图5、图6和下表1，结果显示，在筛选集中，CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B均显示出对缺血性脑卒中较高的诊断效能。
表1CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B对应的诊断效能
实施例3采用临床收集的样本对经筛选得到的诊断标志物的表达情况进行进一步的验证
1、研究对象
本研究于山东第一医科大学第二附属医院收集了27例缺血性脑卒中患者的血液样本和14个正常对照者的血液样本，采集的血液样本用于后续分析研究。所述缺血性脑卒中患者的纳入和排除标准如下：
纳入标准：
①均经《中国急性缺血性脑卒中诊治指南》确诊为缺血性脑卒中者；
②患者及其家属知晓研究并配合签署知情同意书者；
③山东第一医科大学第二附属医院医学伦理委员会支持此研究且获得批准；
④患者在进行检测前未接受治疗；
⑤所有研究者均接受彩超、CT、MRI等检查；
⑥患者发病至入院时间≤3d。
排除标准：
①既往有心脑血管疾病病史；
②合并有严重的肝肾疾病、恶性血液疾病或者肿瘤患者；
③存在语言交流、认知、意识、情感、精神障碍，依从性差，无法配合完成者。
所述正常对照组是指于山东第一医科大学第二附属医院进行常规体检的人群，与缺血性脑卒中患者组的年龄、性别、BMI比较差异均无统计学意义，无任何脑血管疾病。
所述41例受试者的临床信息见下表2。
表2参与本研究的受试者的基本临床信息
2、实验主要试剂
本研究所使用到的主要试剂见下表3。
表3使用试剂清单
3、实验主要仪器
本研究所使用到的主要实验仪器见下表4。
表4使用仪器清单
仪器名称 仪器型号 厂家
离心机 Centrifuge 5424R Eppendorf
NanoVue Plus 28956057 BIOCHROM LTD
荧光定量PCR仪 Gene-9660 BIOER
4、Real Time PCR检测
4.1引物设计
Real Time PCR检测目的基因CLDN7、PPM1B的引物序列见下表5，所述引物由博迈德公司合成。
表5引物序列
4.2实验方法
4.2.1提取样本总RNA
①每0.25mL液体样本(血液样本)加入0.75mL裂解液RLS，用加样枪吹打液体样品几次以帮助裂解样品中细胞。每5-10×106个细胞至少加入0.75mL裂解液RLS。裂解液RLS和液体样品的终体积比总是3：1。
②在EP管中加入0.75mL裂解液RLS，再加入0.25mL血液样本，用力连续震摇30s，混匀，在15-30℃的条件下孵育10min以使核蛋白体完全分解。
③每0.75mL裂解液RLS加0.2mL氯仿，剧烈震荡15s，并在室温下放置5min。
④于4℃12000rpm条件下离心10min，样品会分成三层：下层有机相，中间层和上层无色的水相，RNA存在于上层水相中。水相层的容量大约为所加RLS体积的70％，把水相转移到新管中，进行下一步的操作。
⑤加入1倍体积70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)。得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中(吸附柱套在收集管内)。
⑥12000rpm离心45s，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管。
⑦加入0.5mL去蛋白液RE，12000rpm离心45s，弃掉废液。
⑧加入0.5mL漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液。
⑨加入0.5mL漂洗液RW，12000rpm离心45s，弃掉废液。
⑩将吸附柱RA放回孔收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
取出吸附柱RA，放入一个RNase free离心管中，根据预期RNA产量在吸附膜的中间部位加30-50μL RNase free water(事先在65-70℃水浴中加热效果更好)，室温放置2min，12000rpm离心1min。如果需要较多RNA，可将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，离心1min，或者另外加入再加30μL RNase free water，离心1min，合并两次洗脱液。
4.2.2逆转录合成mRNA cDNA
采用FastKing cDNA第一链合成试剂盒(货号：KR116)进行mRNA反转录，首先去除基因组DNA反应，在试管中加入5×gDNA Buffer 2.0μL，TotalRNA 1μg，加Rnase FreeddH2O使总体积至10μL，水浴锅中42℃加热3min，再将10×King RT Buffer 2.0μL，FastKing RT Enzyme Mix 1.0μL，FQ-RT Primer Mix2.0μL，RNase Free ddH2O 5.0μL，混合后加入上述试管中一起混合共20μL，水浴锅中42℃加热15min，95℃加热3min，合成的cDNA需要长期保存时，于-20℃或更低温度的条件下保存。
4.2.3RealTime PCR
4.2.3.1mRNA荧光定量检测
4.2.3.1.1仪器及分析方法
使用Gene-9660型荧光定量PCR仪，采用2-△△CT法进行数据的相对定量分析。
4.2.3.1.2操作过程
①反应体系
使用SuperReal PreMix Plus(SYBR Green)(货号：FP205)进行扩增，实验操作按产品说明书进行。RealTime反应体系见下表6。
表6反应体系
试剂 使用量
2×SuperReal PreMix Plus 10μL
上游引物(10μM) 0.6μL
下游引物(10μM) 0.6μL
50×ROX Reference Dye△ 2μL
DNA模板 2μL
灭菌蒸馏水 4.8μL
②扩增程序
扩增程序如下：95℃15min，(95℃10sec，55℃30sec，72℃32sec)×40个循环，95℃15sec，60℃60sec，95℃15sec)。
③引物筛选
将各样本cDNA混合后，以此为模板进行10倍梯度稀释，稀释后样品各取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增，同时在60-95℃进行溶解曲线分析，根据扩增效率高和溶解曲线单峰原则进行引物筛选。
④样品RealTime PCR检测
将各样品cDNA 3-10倍稀释后取2μL作模板，分别用目的基因引物和内参基因引物进行扩增(见下表7)。同时在60-95℃进行溶解曲线分析。
表7样品RealTime PCR检测设计
模板 样品cDNA 样品cDNA
重复检测孔道数 3 3
引物 目的基因引物 内参基因引物
5、数据统计
将运行程序下机所导出的原始结果ct值按照上样顺序进行整理，得到各个样本每个基因的三个复孔原始ct值，在excel中分别求出目的基因与内参基因三个复孔ct值的平均值，分别计算缺血性脑卒中组和对照组中目的基因相对于内参基因的表达，采用GraphPad软件进行统计分析，两者之间的差异采用t检验。
6、各样本相对定量分析
根据RealTime PCR原始检测结果，按照2-△△ct相对定量计算公式，计算出各样本的目的基因相对定量结果，即缺血性脑卒中组各个样本相对于对照组样本，目的基因mRNA转录水平的差异。所述计算公式如下：
7、实验结果
7.1RNA浓度检测结果及1.5％琼脂糖RNA电泳检测结果
RNA浓度检测结果及1.5％琼脂糖RNA电泳检测结果见下表8。
表8RNA浓度及纯度结果
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7.2各样本RealTime PCR检测结果及分析
各样本实时扩增曲线图和样本扩增产物溶解曲线图如图7-图10所示。
本研究采用收集得到的实际临床样本对CLDN7和PPM1B的表达水平进行了进一步的验证，统计结果如图11、图12所示，结果显示，与对照组相比，缺血性脑卒中组样本中CLDN7的表达水平显著上调，PPM1B的表达水平显著下调。
实施例4采用临床收集的样本对经筛选得到的诊断标志物的诊断效能进行进一步的验证
1、实验方法
采用如前所述的验证方法，分析生物标志物CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B在验证集(实施例3中收集得到的实际临床样本组成的验证集)中的AUC值、灵敏度、特异性，判断其对缺血性脑卒中的诊断效能。
2、验证分析结果
CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B在验证集中对应的诊断效能结果分别见图13、图14、图15和下表9，结果显示，在验证集中，CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B均显示出对缺血性脑卒中较高的诊断效能，可见经临床上收集得到的实际临床样本验证，CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B同样具有较高的诊断效能，能够作为缺血性脑卒中的诊断标志物。
表9CLDN7、PPM1B、CLDN7+PPM1B对应的诊断效能
上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

Claims (10)

1.检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂在制备诊断或辅助诊断缺血性脑卒中产品中的应用。
2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述试剂包括采用测序技术、核酸杂交技术、核酸扩增技术、蛋白免疫技术、色谱技术、质谱技术检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂。
3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述试剂包括检测样本中CLDN7和/或PPM1B mRNA表达水平的试剂、检测样本中CLDN7和/或PPM1B编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂。
4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B mRNA表达水平的试剂包括特异性识别CLDN7和/或PPM1B的探针、特异性扩增CLDN7和/或PPM1B的引物。
5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述检测样本中CLDN7和/或PPM1B编码的蛋白和/或多肽表达水平的试剂包括特异性结合CLDN7和/或PPM1B的抗体、抗体片段、亲和性蛋白。
6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述特异性扩增CLDN7的引物的序列如SEQID NO:5-SEQ ID NO:6所示；
所述特异性扩增PPM1B的引物的序列如SEQ ID NO:7-SEQ ID NO:8所示。
7.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述样本为血液样本。
8.一种用于诊断或辅助诊断缺血性脑卒中的产品，其特征在于，所述产品包含检测样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的试剂。
9.一种筛选治疗缺血性脑卒中的候选药物的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：
(1)将待测物质与含有或表达CLDN7和/或PPM1B的体系接触；
(2)检测所述体系中CLDN7和/或PPM1B的表达水平；
(3)选择可降低CLDN7表达水平和/或升高PPM1B表达水平的物质为治疗缺血性脑卒中的候选药物。
10.一种用于诊断或辅助诊断缺血性脑卒中的诊断系统，其特征在于，所述诊断系统包括：
(1)缺血性脑卒中评估装置：包括控制单元和存储单元，用于评估受试者是否患有缺血性脑卒中；
(2)彼此通信连接的信息通信终端装置：用于提供关于来自受试者的样本中CLDN7和/或PPM1B的表达水平的数据；
所述缺血性脑卒中评估装置的控制单元包括如下四个单元：
1)数据接收单元：用于接收从所述信息通信终端设备传输的关于所述样本中CLDN7和/或PPM1B表达水平的数据；
2)判别值计算单元：其基于对由所述数据接收单元接收的所述样本中CLDN7和/或PPM1B的表达水平以及存储在所述存储单元中作为解释变量的CLDN7和/或PPM1B的表达水平的判别来计算判别值；
3)判别值基准评价单元：其基于由所述判别值计算单元计算的判别值，对所述受试者缺血性脑卒中的发生风险情况进行评价；
4)评估结果发送单元：其将由所述判别值基准评估单元获得的所述受试者的评估结果发送到所述信息通信终端装置。
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