CN116497026A - 家蚕马氏管特异表达启动子及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了家蚕马氏管特异表达启动子及其应用，该启动子能够驱动目的基因在马氏管特异表达，为研究和利用家蚕马氏管特异基因，特别是马氏管特异高量表达的转运排泄相关基因提供了有力的工具；同时也能在家蚕马氏管特异表达外源基因，具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及家蚕马氏管特异表达启动子，还涉及家蚕马氏管特异表达启动子的应用。
背景技术
家蚕是一种具有重要价值的经济昆虫，作为鳞翅目的模式生物，家蚕在理论研究和生产应用方面都具有重要作用。马氏管是家蚕重要的渗透调节器官，同时还具有重要的代谢排泄、免疫和解毒功能。此外，越来越多的证据还表明马氏管是研究人类肾脏疾病非常有前途的模型，一些肾脏疾病在昆虫和人类身上表现出相似的表型。因此，马氏管作为昆虫中具有意想不到的广泛功能的关键组织而享有极大的声誉。然而，目前对家蚕马氏管的研究比较少，主要原因是可以利用的研究手段有限。随着家蚕基因组框架图、精细图及遗传变异图谱的相继完成，家蚕转基因技术也逐步完善，有关家蚕马氏管的研究逐渐增多，但仍需要更多的其他研究工具的配合来提高家蚕马氏管的代谢排泄和解毒能力，甚至是对人类肾脏疾病发病机制提供相关见解，这也成为了后基因组时代研究人员追求的目标，事关蚕业发展。要想研究和利用家蚕马氏管有关基因进行前述研究就需要有一个家蚕马氏管特异的启动子，但目前没有家蚕马氏管特异表达启动子的相关报道。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的之一在于提供一种家蚕马氏管特异表达启动子；本发明的目的之二在于提供含有所述家蚕马氏管特异表达启动子的表达载体；本发明的目的之三在于提供含有所述家蚕马氏管特异表达启动子的表达盒；本发明的目的之四在于提供含有所述家蚕马氏管特异表达启动子的转化载体；本发明的目的之五在于提供含有启动子、或所述表达载体、或所述表达盒、或所述转化载体的宿主细胞；本发明的目的之六在于提供所述家蚕马氏管特异表达启动子在驱动目标基因在家蚕马氏管特异表达中的应用。
为达到上述目的，本发明提供如下技术方案：
1、家蚕马氏管特异表达启动子，所述家蚕马氏管特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2、含有所述家蚕马氏管特异表达启动子的表达载体。
3、含有所述家蚕马氏管特异表达启动子的表达盒。
4、含有所述家蚕马氏管特异表达启动子的转化载体。
5、含有所述启动子、或所述表达载体、或所述表达盒、或所述转化载体的宿主细胞。
本发明优选的，所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
6、所述家蚕马氏管特异表达启动子在驱动目标基因在家蚕马氏管特异表达中的应用。
本发明的有益效果在于：本发明公开了马氏管特异表达的启动子，该启动子能够驱动目的基因在马氏管特异表达，为研究和利用家蚕马氏管特异基因，特别是马氏管特异高量表达的转运排泄相关基因提供了有力的工具；同时也能在家蚕马氏管特异表达外源基因，具有良好的应用前景。
附图说明
为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明：
图1为Bm0004175基因的组织表达特征，其中A为荧光定量结果图，B为半定量结果图(He:头；Ep:表皮；Mg:中肠；Fb:脂肪体；Mt:马氏管；Sg:丝腺；Te:精巢；Ov:卵巢；Hem:血淋巴；Tr:气管)；
图2为转基因家蚕卵和成虫的显微镜下照片，其中A和C为明场下卵和成虫的照片，B和D为Red激发光下的照片。
图3为转基因家蚕和阴性对照家蚕中EGFP基因的蛋白印迹检测结果图(1：阴性对照家蚕马氏管组织；2：阴性对照家蚕除马氏管外剩余所有组织；3：转基因家蚕马氏管组织；4：转基因家蚕除马氏管外剩余所有组织)。
转基因家蚕是指经显微注射pBac[Bm0004175-EGFP-SV40，3×P3-DsRed af]成功的家蚕，阴性对照家蚕是指未经任何处理的家蚕。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1、Bm0004175基因组织表达情况的RT-PCR和荧光定量检测
在家蚕基因组数据库(https://silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)中下载Bm0004175基因的CDS序列，利用软件Primer Premier 5.0设计特异检测引物。用大造5龄3天各组织cDNA模板进行RT-PCR检测，PCR扩增条件为：95℃预变性5分钟，95℃变性30秒、55℃退火40秒、72℃延伸20秒，共26个循环，最后72℃延伸5分钟。PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果如图1中B所示。发现BGIBMGA014258基因在家蚕马氏管特异表达。用同样的引物进行荧光定量检测，扩增程序为：95℃预变性30秒，95℃变性3秒，60℃退火延伸30秒，循环40次，后使用2-ΔΔCt计算目的基因相对表达，结果如图1中A所示。结果进一步确定该基因在马氏管特异高量表达。检测引物BGIBMGA014258-F:5’-AGATACCAATTCAGCGATGGAT-3’(SEQ ID NO.4)，BGIBMGA014258-R:5’-CAATACAGCAACACCTATGCTC-3’(SEQ ID NO.5)。
实施例2、克隆家蚕Bm0004175基因启动子
提取家蚕大造基因组DNA，根据现有的家蚕基因组数据库信息(https://silkdb.bioinfotoolkits.net/main/species-info/-1)，设计家蚕Bm0004175基因启动子上、下游引物。其中上游扩增引物加了PmeI的酶切位点，下游扩增引物加了NheI的酶切位点。引物序列为Bm0004175-pro-F：5’-agctttgtttaaactccatggaacgtagctctgaggct-3’(SEQID NO.1)；Bm0004175-pro-R：5’-ctagctagctgttagcttttgaaaat-3’(SEQ ID NO.2)。以家蚕基因组为模板，以SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2为引物进行PCR扩增，扩增条件为98℃预变性5分钟；98℃变性10秒，55℃退火8秒，72℃延伸20秒，共30个循环，最后72℃继续延伸5分钟。扩增产物经回收后与pMD19-simple载体连接，转化Trans1-T1感受态细胞，获得阳性克隆后送测序确认，最终获得家蚕Bm0004175基因启动子，其核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
实施例3、构建pBac[EGFP-SV40,3×P3-DsRed af]中间载体
根据pBac[3×P3-EGFP afm]载体(公开号为102296071A的中国专利)中绿色荧光蛋白基因EGFP及终止信号SV40序列，设计特异扩增含EGFP和SV40片段的引物，其中上游扩增引物加了pBac[3×P3-DsRed af]载体(公开号为102296071A的中国专利)AscI酶切位点上游22bp的重叠序列，此外还加了PmeI和NheI的酶切位点，下游扩增引物加了AscI酶切位点下游22bp的重叠序列。引物序列为EGFP-F：5’-taaagcttatcgatacgcgtacagctttgtttaaacctagctagcatggtgagcaagggcgaggagc-3’(SEQ ID NO.6)；SV40-R：5’-agatccgagatcggccggcctacgagatcggccggcctag-3’(SEQ ID NO.7)；然后以pBac[3×P3-EGFP afm]载体为模板，以SEQ ID NO.6和SEQ ID NO.7为引物进行PCR扩增，扩增条件为：98℃预变性5分钟；98℃变性10秒，55℃退火8秒，72℃延伸20秒，共30个循环，最后72℃继续延伸5分钟，回收扩增产物，获得EGFPSV40片段。
将pBac[3×P3-DsRed af]载体用限制性内切酶AscI于37℃条件下酶切4小时，回收pBac[3×P3-DsRed af]载体骨架，后用碱性磷酸酶于50℃处理并纯化，获得去磷酸化的pBac[3×P3-DsRed af]载体骨架。将EGFPSV40片段和pBac[3×P3-DsRed af]骨架混合，利用同源重组酶在50℃条件下定向重组15分钟，重组产物转化Trans1-T1感受态细胞，获得阳性克隆后送测序确认，最终获得含EGFPSV40片段的重组载体，命名为pBac[EGFP-SV40,3×P3-DsRed af]中间载体。
实施例4、构建含家蚕Bm0004175基因启动子的重组表达载体
用限制性内切酶PmeI和NheI于37℃分别酶切含有Bm0004175基因启动子的pMD19-simple载体和pBac[EGFP-SV40,3×P3-DsRed af]中间载体4个小时，回收Bm0004175基因启动子片段和pBac[EGFP-SV40,3×P3-DsRed af]骨架。将Bm0004175基因启动子片段片段与pBac[EGFP-SV40,3×P3-DsRed af]骨架混合后在T4 DNA连接酶的作用下进行连接反应，反应条件为16℃过夜连接，连接完成后转化Trans1-T1感受态细胞，阳性克隆经测序确认获得含家蚕Bm0004175基因启动子的重组表达载体，命名为pBac[Bm0004175-EGFP-SV40，3×P3-DsRed af]重组表达载体。
实施例5、转基因显微注射和阳性个体的筛选
将多化性家蚕正常桑叶饲养至化蛹化蛾后，将雌雄蚕蛾交配4小时，拆对后黑暗环境中产卵。将此蚕卵在干净的载玻片上整齐排列，用Eppendorf显微注射系统将重组表达载体pBac[Bm0004175-EGFP-SV40，3×P3-DsRed af]和辅助质料pHA3PIG一起注射进300粒蚕卵中，用无毒胶水封口以后置于25℃、相对湿度80％的环境中催青孵化，获得50头G0代蚁蚕，将成功饲养至化蛹化蛾的蚕，交配产卵，获得10个蛾圈，经荧光显微镜筛选获得2个阳性蛾圈中有10头阳性个体。将阳性个体饲养至化蛹化蛾，进一步荧光显微镜观察。结果如附图2所示，获得的转基因个体眼睛有红色荧光出现，确认获得转基因家蚕。
实施例5、转基因家蚕的分子检测
桑叶饲养转基因家蚕至5龄中期，分别取转基因家蚕和阴性对照家蚕的马氏管组织及除马氏管外剩余所有组织样品，各2个共4个样品，提取4个样品的总蛋白，SDS-PAGE蛋白凝胶电泳后检测EGFP的表达，结果如图3所示，转基因家蚕的马氏管组织样品中检测到EGFP的表达，而在阴性对照家蚕的马氏管组织、转基因家蚕和阴性对照家蚕的除马氏管外剩余所有组织样品中都未检测到EGFP的表达，说明Bm0004175基因启动子确实是家蚕马氏管特异表达启动子，可驱动目标基因在家蚕马氏管特异表达。
以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。
Claims (7)
1.家蚕马氏管特异表达启动子，其特征在于：所述家蚕马氏管特异表达启动子的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
2.含有权利要求1所述家蚕马氏管特异表达启动子的表达载体。
3.含有权利要求1所述家蚕马氏管特异表达启动子的表达盒。
4.含有权利要求1所述家蚕马氏管特异表达启动子的转化载体。
5.含有权利要求1所述启动子、或权利要求2所述表达载体、或权利要求3所述表达盒、或权利要求4所述转化载体的宿主细胞。
6.根据权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞为真核细胞或原核细胞。
7.权利要求1所述家蚕马氏管特异表达启动子在驱动目标基因在家蚕马氏管特异表达中的应用。
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2023
- 2023-04-13 CN CN202310393167.8A patent/CN116497026A/zh active Pending
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