CN116497004A - 一种来源于牛瘤胃的高活性纤维素酶及其基因 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶及编码基因，属于基因工程领域，该高活性纤维素酶Umcel‑1的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，该高活性纤维素酶编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。本发明从大额牛瘤胃中获得Umcel‑1基因，能表达出纤维素酶活性，且对竹粉、稻草及苜蓿有降解作用，这对更深入地了解大额牛瘤胃中纤维素酶基因编码的纤维素酶能高效降解竹子等高粗纤维饲料以及为后续运用分子生物学等手段将多个高效纤维素酶基因开发成新型的纤维素复合酶资源提供了一定的理论基础和现实意义。

Description

一种来源于牛瘤胃的高活性纤维素酶及其基因

技术领域

本发明属于基因工程领域，具体的说，涉及一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因及其编码的酶。

背景技术

大额牛为我国云南半野生半家养的珍稀动物，外型与印度野牛最为相似，都拥有相同的染色体数(2n＝58)，而普通牛和瘤牛染色体数目为(2n＝60)。大额牛生存条件极其恶劣，主食富含粗纤维的当地竹子，但仍能保持较好的生长速度，很明显，大额牛瘤胃内分解粗纤维的微生物的数量和活性优于其他牛种。研究发现竹子粗纤维含量远高于稻草和苜蓿等高粗纤维饲料，然而大额牛瘤胃内总活细菌和纤维降解菌以及对竹子、稻草和苜蓿等高粗纤维饲料的干物质体外消化率显著高于同一生境的黄牛，这一现象提示大额牛瘤胃具有高效降解竹子等高粗纤维饲料的微生物以及纤维素酶或基因。因此，大额牛无疑是发掘高效粗纤维降解酶的珍贵种质资源。

利用已构建的宏基因组文库，筛选高效降解纤维素酶基因以及对纤维素酶基因异源表达，同时检验异源表达的纤维素酶对竹粉、稻草及苜蓿的降解情况，研究结果有望发掘大额牛瘤胃纤维素高效降解的纤维素酶资源，这对反刍动物纤维饲料高效转化利用具有重要意义，若能将开发的纤维素酶资源运用于生活实践中来，将自然界中不易降解的纤维性物质转化成可利用的能源，还解决能源短缺的危机。

发明内容

本发明提供了一种来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因及其编码的酶，为后续纤维素复合酶的构建、高效表达及利用，继而开发成新型的纤维素酶资源等提供坚实的理论基础。

为实现上述目的，本发明是通过如下技术方案实现的：

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶Umcel-1，其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶Umcel-1在降解高粗纤维物质中的应用，其酶最适温度范围在35℃～55℃，酶最适pH范围在5.0～8.5。

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因，编码上述的高活性纤维素酶Umcel-1。

所述的来源于大额牛瘤胃的高活性纤维素酶基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述高活性纤维素酶基因的重组表达载体。

包含上述高活性纤维素酶基因的重组表达载体Umcel-1/pET30a(+)。

包含上述高活性纤维素酶基因的重组表达菌株。

本发明的有益效果：

本发明从构建的大额牛瘤胃细菌Fosmid文库中，筛选得到一个全长为999bp，编码332个氨基酸的纤维素酶基因Umcel-1。Umcel-1/pET30a(+)重组蛋白在E.coli BL21中能表达出纤维素酶活性，对竹粉、稻草及苜蓿有降解作用。Umcel-1酶反应的最适温度是50℃，最适pH为6.0；温度在20℃～50℃，pH在5.0～7.0时酶活较稳定。从大额牛瘤胃中获得的Umcel-1基因能表达出纤维素酶活性，这对更深入地了解大额牛瘤胃中纤维素酶基因高效降解竹子等粗纤维饲料以及为后续运用分子改造等手段将高效纤维素酶基因开发成新型的酶资源提供了一定的理论基础和现实意义。

附图说明

图1是Umcel-1蛋白信号肽分析结果。

图2是Umcel-1蛋白跨膜区的预测结果。

图3是Umcel-1蛋白的疏水性分析结果。

图4是Umcel-1蛋白的组件结构。

图5是Umcel-1/pET30a(+)的CMC底物平板纤维素酶活性检测。

图6是Umcel-1酶对竹粉的降解平板纤维素酶活性检测。

图7是Umcel-1酶对稻草的降解平板纤维素酶活性检测。

图8是Umcel-1酶对苜蓿的降解平板纤维素酶活性检测。

图9是Umcel-1基因酶切电泳图；其中，M：1kb ladderDNAMarker；Umcel-1：Umcel-1酶切产物。

图10是Umcel-1纯化蛋白在37℃、15℃、0.2mM IPTG、1.0mM IPTG不同条件下的SDS-PAGE电泳图；其中：

图11是Umcel-1纯化蛋白SDS-PAGE电泳图；其中，M：蛋白Maker；Umcel-1：Umcel-1。

图12是Umcel-1纯化蛋白WB电泳图。

图13是蛋白质浓度标准曲线。

图14是葡萄糖浓度标准曲线。

图15是Umcel-1酶反应最适底物浓度。

图16是Umcel-1酶反应最适温度。

图17是Umcel-1酶反应最适PH。

图18是Umcel-1酶反应的热稳定性。

图19是Umcel-1酶反应的酸碱稳定性。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，下面将对本发明的优选实施例进行详细的说明，以方便技术人员理解。

【实施例1】纤维素酶基因的定位与分析

1、Fosmid文库中纤维素酶编码基因筛选

从前期已构建的大额牛瘤胃Fosmid文库中挑选纤维降解酶基因：对序列reads组装，得到contigs序列，根据contig实际的拼接结果，进行基因预测，对基因预测结果与公共数据库的CAZy等数据库进行Blastx比对，对分类同时属于GH5和GH9的基因进行生物信息学分析，从中挑选出一个纤维素酶基因Umcel-1。

2.Umcel-1序列分析

测序得到一个全长为999bp的基因Umcel-1，编码332个氨基酸；预测Umcel-1编码的蛋白质等电点(pI)为5.01，理论分子量(MW)为82751.80Da，Umcel-1蛋白无信号肽(见图1)，无跨膜区(见图2)，疏水性正常(见图3)。Umcel-1蛋白组件结构(见图4)。其编码的氨基酸序列显示第109～303个氨基酸是糖苷水解酶家族5功能域。Umcel-1的蛋白分子量为36.8kDa。

【实施例2】纤维素酶Umcel-1基因原核质粒的构建方案

基因表达使用N端his标签融合表达，His标签分子量小，不改变蛋白质的生物结构和溶解性，有利于蛋白的表达。

首先，在基因Umcel-1的5’端加入His标签(MHHHHHHSSG)。然后，筛选载体序列里存在而基因序列里不存在的酶切位点，防止基因或载体因酶切断开。在基因Umcel-1序列3’端补充终止子TAA，选取连接基因Umcel-1的酶切位点为HindIII(AAGCTT)和XhoI(CTCGAG)，HindIII(AAGCTT)置于His标签的5’端，XhoI(CTCGAG)置于基因Umcel-1碱基序列的3’端。

使用全基因化学合成法合成质粒Umcel-1，合成时连接表达载体pGEX-6P-1。钓取基因Umcel-1并亚克隆至共表达载体pET30a(+)上。

【实施例3】纤维素酶Umcel-1基因原核表达

一、方法

1.刚果红染色法验证酶活

将菌液接种到含2％CMC-Na底物的LB固体培养基平板上(含0.1％V Kana(卡拉霉素)，37℃过夜培养16小时，次日用刚果红染色法确定是否有纤维素酶活性。

将菌液接种到含0.5％竹粉、稻草和苜蓿底物的LB固体培养基平板上(含0.1％VKana，竹粉、稻草和苜蓿均粉碎至250目)，37℃过夜培养16小时，次日用刚果红染色法确定是否能降解竹粉、稻草和苜蓿，从而验证Umcel-1基因表达的酶是否有纤维素酶活性。

2.酶切验证Umcel-1基因

对pET30a(+)—Umcel-1进行NdeI-SacI酶切。使用限制性内切酶NdeI和SacI对pET30a(+)—Umcel-1进行酶切反应，然后进行电泳实验。

3.Umcel-1/pET30a(+)重组蛋白的表达纯化检测

转化：将重组质粒转入BL21(DE3)大肠杆菌感受态细胞，42℃热激后涂布在含有30μg/ml卡那霉素的平板上，37℃培养；

活化：挑取单克隆菌落到含有30μg/ml卡那霉素的液体培养基中37℃培养；

诱导：当OD值达到0.6时，添加诱导剂IPTG，继续培养，分别于15℃条件下培养过夜，37℃条件下培养4h，未添加诱导剂的为阴性对照；

收集菌体：4000rpm离心10min，弃上清，收集菌体；

表达检测：在收集到的菌体中加入缓冲液A悬浮，使用超声破碎仪使其充分溶解。离心收集上清和沉淀，沉淀使用缓冲液B进行溶解，分别对上清和沉淀蛋白进行制样，准备上胶检测。再表达：在LB液体培养基中(含0.1％V Kana)，当OD值达到0.6时，添加1.0mmol诱导剂IPTG在37℃培养一夜后大量表达，离心收集细胞体。

再表达：在含30μg/ml卡那霉素的培养基中培养菌液，当OD值达到0.6时，添加1.0mM诱导剂IPTG，37℃条件下培养过夜进行大量表达，离心收集细胞菌体。

收集粗蛋白：细胞菌体用缓冲液C溶解、超声破碎，离心收集上清粗蛋白；

平衡：取5ml Ni-NTA，用5倍柱床体积的Binding buffer清洗平衡柱子；

上柱：将粗蛋白与平衡后的柱填料孵育1h，收集流出；

平衡：用Binding buffer清洗平衡柱子；

洗杂：用Washingbuffer洗柱子，并收集流出；

洗脱：用Elutionbuffer洗脱，收集流出；

纯化检测：对粗蛋白、流出组分分别处理，制样，准备SDS-PAGE检测。

收集处理：将纯化后的组分5透析到蛋白保存缓冲液PBS,300mM NaCl,10％Glycerol,pH 7.4中，透析结束后用PEG20000浓缩，0.45μm滤膜过滤后分装1ml/tube，-80℃保存。

SDS-PAGE检测:蛋白质样品制备，采用12％分离凝胶和5％浓缩凝胶，电泳实验，分子量检测。

Western-blot验证：处理并制备蛋白质样品。使用5％浓缩胶和12％分离胶。第一种抗体标记为鼠抗his标签，第二种标记为羊抗鼠。

表2主要缓冲液

二、结果与分析

1.刚果红染色法验证酶活

通过刚果红平板染色可见基因Umcel-1能成功的表达出纤维素酶活性(见图5)且能降解竹粉、稻草和苜蓿，竹粉、稻草和苜蓿被分解后，周围出现的水解区域，颜色变浅(见图6、图7和图8)。

2.Umcel-1/pET30a(+)酶切电泳结果

两条酶切条带清晰可见，两个酶切位点分别位于约1000bp处和约5500bp处，两条带分别是基因Umcel-1和载体pET30a(+)(见图9)。

3.Umcel-1/pET30a(+)重组蛋白的表达纯化检测

在不同温度和诱导剂浓度水平下，1-13各有一条深蓝色电泳条带，13条电泳条带在同一水平线上(图10)，估计Umcel-1融合蛋白表达量约为36.8KDa。

pET30a(+)—Umcel-1重组质粒蛋白SDS-PAGE(见图11)和Western-blot(见图12)分析结果发现分别只有一条蛋白电泳条带，基因Umcel-1蛋白纯化后表达量约为36KDa，与融合蛋白的计算分子量(36.8kDa)一致。

【实施例4】酶学特性研究

1.Umcel-1表达蛋白浓度的测定

采用Bradford法测蛋白浓度，PurifiedBSA(10mg/mL)为标准蛋白母液。以标准蛋白浓度(ug/mL)为横坐标和对应的光吸收值OD₅₉₅为纵坐标绘制标准蛋白曲线(图13)。相关系数为0.9987。

取纯化的Umcel-1酶液，稀释50倍，采用标准蛋白测定方法，测定稀释50倍的纯化的Umcel-1酶液，在酶标仪上测定OD₅₉₅吸光值，再根据标准蛋白曲线和蛋白浓度计算公式计算纯化的Umcel-1酶液的浓度(蛋白含量)。计算结果为纯化的Umcel-1酶液浓度为0.5mg/mL。

2.葡萄糖浓度标准曲线的绘制

以葡萄糖浓度(mg/mL)为横坐标和对应的光吸收值OD₅₄₀为纵坐标绘制葡萄糖浓度标准曲线(图14)。相关系数为0.9936。

3.Umcel-1酶反应最适底物浓度

如图在CMC-Na浓度(0.5％～4.5％)测定Umcel-1酶酶活，浓度为3.0％时的相对酶活值最大，假定为100％，通过计算不同CMC-Na浓度下的相对酶活做曲线结果(图15)。从图中可知，CMC-Na浓度在1.5％～4.5％之间时Umcel-1酶的相对酶活在70％以上，0.5％时相对酶活最低，但仍还有相对最高酶活的41％。

4.Umcel-1酶反应的最适温度

如图16，测定温度在25℃～65℃条件时Umcel-1表达蛋白的酶活，结果与最适温度测定的Umcel-1酶活比较(假定最适温度条件下的酶活性为100％)，计算以上不同温度条件下的相对酶活性。结果表明Umcel-1酶活在50℃时最大，反应温度在35℃～55℃之间时Umcel-1酶的相对酶活在60％以上，温度在65℃时酶活性较低，但仍还有相对最高酶活的31％。

5.Umcel-1酶反应的最适PH

在50℃的水浴条件下分别测定Umcel-1蛋白在pH＝3.0～9.0时的酶活，假定最适pH条件下的酶活性为100％，分析不同pH条件下的相对酶活(图17)。由图可知，Umcel-1在pH6.0时酶活性最强，pH在5.0～8.5时的相对酶活高于60％，pH在4.5以下时的相对酶活在50％以下。因此，Umcel-1酶反应适宜的pH范围在5.0～8.0之间。

6.Umcel-1酶的热稳定性

以事先置于4℃保存的Umcel-1酶液为最大酶活100％，分别计算各温度下的相对酶活。如图18，纯化酶在20℃～50℃条件下1h，Umcel-1保持80％以上的相对酶活，说明Umcel-1酶在小于50℃的温度范围内较稳定；但当温度达到60℃时，酶十分不稳定，相对酶活下降至15％；而置于70℃条件下的酶，相对酶活下降94％，基本失活。此结果说明Umcel-1酶在小于50℃的范围内还比较稳定。当高于50℃，酶就变得不稳定。

7.Umcel-1酶的酸碱稳定性

以事先置于4℃保存的Umcel-1酶液的活力为最大酶活100％，分别计算各pH值下的相对酶活。由图19可知，Umcel-1酶在pH＝5.0～7.0时残留活力在70％以上，在pH＝5.0～9.0时残留活力在50％以上，pH＝3.0时仅剩29％的相对酶活。因此说明，纤维素酶Umcel-1酶在pH5.0～7.0之间较稳定。

最后说明的是，以上优选实施例仅用于说明本发明的技术方案而非限制，尽管通过上述优选实施例已经对本发明进行了详细的描述，但本领域技术人员应当理解，可以在形式上和细节上对其作出各种各样的改变，而不偏离本发明权利要求书所限定的范围。

Claims (7)

1.一种来源于大额牛瘤胃的纤维素酶Umcel-1，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ IDNO.1所示。

2.如权利要求1所述的一种来源于大额牛瘤胃的纤维素酶Umcel-1在降解高粗纤维物质中的应用，其特征在于：其酶最适温度范围在35℃~55℃，酶最适pH范围在5.0~8.5。

3.一种来源于大额牛瘤胃的纤维素酶基因，其特征在于：编码权利要求1所述的纤维素酶Umcel-1。

4.如权利要求3所述的一种来源于大额牛瘤胃的纤维素酶基因，其特征在于：其核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

5.包含权利要求3或4所述高活性纤维素酶基因的重组表达载体。

6.包含权利要求3或4所述高活性纤维素酶基因的重组表达载体Umcel-1/pET30a(+)。

7.包含权利要求3或4所述高活性纤维素酶基因的重组表达菌株。