CN116490609A

CN116490609A - 质粒成瘾系统

Info

Publication number: CN116490609A
Application number: CN202180072354.5A
Authority: CN
Inventors: H·达曼卡尔; D·S·坎宁安; C·马卡迪诺; W·法默; S·麦卡沃伊; A·班纳吉; K·拉马钱德里亚
Original assignee: Greenlight Biosciences Inc
Current assignee: Greenlight Biosciences Inc
Priority date: 2020-08-24
Filing date: 2021-08-23
Publication date: 2023-07-25

Abstract

在一些实施方案中，本文提供了用于基于必需糖酵解基因的质粒成瘾系统的组合物和方法。在一些实施方案中，本文还提供了用于基于外膜流出蛋白的质粒成瘾系统的组合物和方法。

Description

质粒成瘾系统

相关申请

本申请根据35 USC§119(e)要求2020年8月24日提交的美国临时申请号63/069,620和2020年10月13日提交的美国临时申请号63/091,259的权利；其中每一个的内容通过引用整体并入本文。

发明背景

基于核酸和基于蛋白质的产品的重组生产通常发生在宿主微生物细胞(例如，大肠杆菌细胞)中。这些细胞通常经过工程化(例如，使用基于质粒的技术)以大量生产高质量的所需产物。为了确保大量的产品，编码所需产品的质粒必须保持在宿主微生物细胞内。质粒维持通常通过将抗生素抗性基因标志物掺入质粒中来实现。然而，如果被释放，抗生素抗性基因标志物的掺入可能对环境有害，因为它可能促进生物体或病原体中抗生素抗性的出现，例如，通过水平遗传转移(HGT)的过程，通过将编码抗生素抗性基因标志物的DNA吸收和同化到它们自己的染色体中。因此，由于抗生素的过度使用以及对包含抗生素和编码抗生素抗性标志物的DNA的生物制品的监管担忧，需要无抗生素的质粒维持方法。

发明内容

本文公开了新型无抗生素质粒成瘾系统，该系统采用关键糖酵解基因(例如，编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的原核基因，如来自大肠杆菌的gapA基因)作为选择标志物，用于在合适的宿主菌株中维持质粒。发明人发现，与已描述的其他质粒成瘾系统不同，基于关键糖酵解基因(例如，来自大肠杆菌的gapA基因)的质粒成瘾系统在成分确定的培养基(例如，如Korz et al.,1995,J.Biotechnol.39:59-65中描述的Korz液体培养基)和复合培养基(例如，Luria液体培养基)二者中实现无抗生素选择含质粒的微生物。基于其他代谢途径的质粒成瘾系统(例如，基于氨基酸代谢/营养缺陷型或阿拉伯糖代谢/营养缺陷型的系统)通常不期望在成分确定的培养基和复合培养基二者中实现含质粒的微生物的选择。相反，这些替代质粒成瘾系统有望仅仅在成分确定的培养基或通常仅在成分确定的基本培养基中实现有效选择。相反，本公开的发明人意识到基于糖酵解代谢途径(例如，基于gapA)的质粒成瘾系统将能够在复合培养基(如Luria液体培养基)以及成分确定的培养基中实现质粒选择。这一发现代表了重大进步，因为与成分确定的培养基或成分确定的基本培养基相比，复合培养基中用于克隆和其他质粒和/或菌株管理和制备目的的细胞增殖以及细胞库和最终生产细胞菌株的制备明显更容易。

因此，在一些方面，本文提供了微生物细胞，其缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达。在一些实施方案中，微生物细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码重组糖酵解酶的表达盒，并且其中微生物细胞可以在成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。在一些实施方案中，微生物细胞不能在没有核酸构建体的成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。

在一些方面，本文提供质粒成瘾系统，其包含(i)微生物细胞，其包含编码内源糖酵解酶的糖酵解基因的遗传修饰，其中遗传修饰降低或消除内源糖酵解酶的表达；(ii)包含编码重组糖酵解酶的表达盒的质粒；其中微生物细胞在不掺入质粒的情况下不能生长或繁殖。

在一些实施方案中，遗传修饰包括糖酵解基因或糖酵解基因的控制元件内的突变、插入或缺失，任选地，其中控制元件是启动子或核糖体结合位点。在一些实施方案中，重组糖酵解酶具有与内源糖酵解酶相同的酶活性。在一些实施方案中，如果将质粒掺入细胞中，则微生物细胞可以在成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。

在一些实施方案中，重组糖酵解酶具有与内源糖酵解基因相同的酶活性。在一些实施方案中，微生物细胞的染色体DNA包含降低糖酵解酶的表达的内源基因的遗传修饰或控制内源基因表达的元件，任选地，其中遗传修饰是突变、插入或缺失。在一些实施方案中，核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。在一些实施方案中，内源糖酵解基因编码己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，重组糖酵解酶是己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，内源糖酵解基因编码具有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的糖酵解酶，并且其中重组糖酵解酶具有GAPDH活性。在一些实施方案中，内源糖酵解基因编码甘油醛3-磷酸脱氢酶，并且其中重组糖酵解酶是甘油醛3-磷酸脱氢酶。在一些实施方案中，甘油醛3-磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。

在一些实施方案中，微生物细胞是原核或真核细胞，任选地，其中微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(Mycobacterium leprae，M.leprae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，M.smegmatis)、酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae，S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica，Y.lipolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris，P.pastoris)或里氏木霉(Trichoderma reesie，T.reesie)细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞，内源糖酵解基因是gapA，重组糖酵解酶是甘油醛3-磷酸脱氢酶。

在一些实施方案中，复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、具有分解代谢物抑制作用的超优液体培养基(SOC培养基)或其任何衍生物。在一些实施方案中，成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基，或其任何衍生物。

在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含含有复制起点及其控制元件的复制子。在一些实施方案中，复制子是细菌来源的。在一些实施方案中，复制子是ColE1复制子、pUC复制子或衍生自ColE1、pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子。在一些实施方案中，编码重组糖酵解酶的表达盒包含可操作地连接至重组糖酵解酶的编码序列的启动子。

在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含含有感兴趣的序列的表达盒，其中感兴趣的序列编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物。在一些实施方案中，RNA产物是信使RNA、siRNA、micro RNA、向导RNA、双链RNA的有义链或双链RNA的反义链。在一些实施方案中，核酸构建体包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA的有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码双链RNA的反义链的第二感兴趣的序列。在一些实施方案中，包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至感兴趣的序列的启动子。

在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。在一些实施方案中，编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含重组糖酵解酶编码序列上游的初始转录序列(ITS)。在一些实施方案中，ITS包含SEQ ID NO:24中列出的核酸序列。在一些实施方案中，ITS由SEQ ID NO:24中列出的核酸序列组成。

在一些实施方案中，编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含5’UTR，该5’UTR包含位于重组糖酵解酶编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和一个或多个位于重组糖酵解酶编码序列下游的终止子。重组糖酵解酶。在一些实施方案中，RBS包含在SEQ ID NO:25-35的任一个中列出的核酸序列。在一些实施方案中，RBS由SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列组成。在一些实施方案中，一个或多个终止子包含SEQ ID NO:36-49中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，一个或多个终止子由SEQ ID NO:36-49中任一个所示的核酸序列组成。

在一些实施方案中，包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。在一些实施方案中，微生物细胞不包含抗生素抗性基因。

在一些实施方案中，质粒进一步包含一个或多个多克隆位点(MCS)或独特的限制性核酸内切酶消化位点。在一些实施方案中，质粒不包含抗生素抗性基因。

在一些方面，本文提供包含表达盒的核酸构建体，该表达盒包含编码具有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的酶的基因和

(i)一个或多个多克隆位点，和/或

(ii)包含编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物的感兴趣的序列的表达盒。

在一些实施方案中，核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。在一些实施方案中，编码具有GAPDH活性的酶的基因是微生物gapA基因。在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。在一些实施方案中，核酸构建体包含第一感兴趣的序列和第二感兴趣的序列，任选地其中第一表达盒包含第一感兴趣的序列和第二表达盒包含第二感兴趣的序列。在一些实施方案中，第一感兴趣的序列编码双链RNA产物的有义链，并且第二感兴趣的序列编码双链RNA产物的反义链。

在一些实施方案中，任何一个表达盒进一步包含启动子和/或终止子。在一些实施方案中，启动子包含或由SEQ ID NO:1-23中任一个所列的核酸序列组成。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至初始转录序列(ITS)。在一些实施方案中，ITS包含SEQ ID NO:24中所示的核酸序列或由其组成。在一些实施方案中，启动子可操作地连接至核糖体结合位点(RBS)。在一些实施方案中，RBS包含或由SEQ ID NO:25-35中所示的核酸序列组成。

在一些方面，提供了一种方法，该方法包括在不存在抗生素的情况下在足以产生核酸构建体的条件下培养本文所述的微生物细胞。在一些实施方案中，该方法产生核酸构建体总量的至少50％或至少90％，如由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的。

在一些方面，提供了一种方法，该方法包括在不存在抗生素的情况下在足以产生RNA产物、肽产物或蛋白质产物的条件下培养本文所述的微生物细胞。在一些实施方案中，该方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的RNA产物、肽产物或蛋白质产物总量的至少50％或至少90％。

在一些方面，本文提供了一种方法，该方法包括向微生物细胞递送包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的载体，其中微生物细胞包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的经遗传修饰的基因，任选地，其中遗传修饰包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶或该基因的控制元件的基因内的突变、插入或缺失，任选地，其中控制元件是启动子或核糖体结合位点。

在一些实施方案中，该方法进一步包括在成分确定的培养基或复合培养基中培养微生物细胞。在一些实施方案中，复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、超优液体培养基(SOC培养基)或其任何衍生物。在一些实施方案中，成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基或其任何衍生物。

在一些方面，提供了一种试剂盒，其包含(i)如本文所述的核酸构建体；(ii)包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的经遗传修饰的基因的多个微生物细胞，任选地，其中遗传修饰包含突变、插入或缺失。

在一些方面，提供了一种试剂盒，其包含(i)包含编码重组糖酵解酶的表达盒的质粒；(ii)多个微生物细胞，其包含编码糖酵解酶的基因的遗传修饰，任选地，其中遗传修饰包含糖酵解基因或糖酵解基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步任选地，其中控制元件是启动子或核糖体结合位点。

在一些方面，提供的是包含多个如本文所述的微生物细胞的试剂盒。在一些实施方案中，多个微生物细胞在冷冻保护剂中被冻干或冷冻。

本文还公开了新的无抗生素质粒成瘾系统，该系统采用外膜流出基因(例如，来自大肠杆菌的tolC基因)作为用于在合适的宿主菌株中维持质粒的选择标志物。发明人发现，与已描述的一些其他质粒成瘾系统不同，基于外膜流出基因(例如来自大肠杆菌的tolC基因)的质粒成瘾系统能够在包含表面活性剂(例如，十二烷基硫酸钠(SDS)的培养基中无抗生素地选择含质粒微生物。基于其他代谢途径的质粒成瘾系统(例如，基于氨基酸代谢或营养缺陷型，或阿拉伯糖代谢或营养缺陷型的那些)通常不能预期能够在包含表面活性剂的培养基中实现含质粒的微生物的选择。发明人的这一发现代表了重大进步，因为用于克隆和其他质粒和/或菌株管理和制备目的的细胞增殖以及细胞库和最终生产细胞菌株的制备可以使用抗生素并在复合培养基或成分确定的培养基中进行。

在一些方面，本公开提供了微生物细胞，其缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达，其中该微生物细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码重组外膜流出蛋白的表达盒和编码感兴趣的序列的表达盒，并且其中当微生物细胞在存在阈值水平的表面活性剂的情况下生长时表达感兴趣的序列。

在一些方面，本公开提供了质粒成瘾系统，其包含(i)微生物细胞，其包含编码外膜流出蛋白的基因的遗传修饰，其中遗传修饰减少或消除内源外膜流出蛋白的表达；(ii)质粒，其包含编码重组外膜流出蛋白的表达盒；其中微生物细胞在含有阈值水平的表面活性剂而不掺入质粒的培养基中不能生长或繁殖。

在一些方面，本公开提供了核酸构建体，其包含表达盒，该表达盒包含编码具有tolC活性的蛋白质的基因和(i)一个或多个多克隆位点，和/或(ii)包含编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物的感兴趣的序列的表达盒。

在一些实施方案中，重组外膜流出蛋白具有与编码外膜流出蛋白的内源基因相同的酶活性。在一些实施方案中，微生物细胞的染色体DNA包含内源基因的遗传修饰或控制内源基因表达的元件，其降低外膜流出蛋白的表达。在一些实施方案中，遗传修饰是突变、插入或缺失。

在一些实施方案中，核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。

在一些实施方案中，内源基因编码tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。在一些实施方案中，外膜流出蛋白是tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。在一些实施方案中，内源基因编码具有tolC活性的蛋白质，并且其中重组外膜流出蛋白具有tolC活性。在一些实施方案中，内源基因编码tolC蛋白，并且其中重组外膜流出蛋白是重组tolC蛋白。在一些实施方案中，重组tolC蛋白包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

在一些实施方案中，微生物细胞是原核或真核细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、分枝杆菌结核病(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、毕赤酵母(P.pastoris)或里氏木霉(T.reesie)细胞。在一些实施方案中，微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)细胞，内源基因是tolC，重组外膜流出蛋白是重组tolC蛋白

在一些实施方案中，表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂浓度。在一些实施方案中，对照微生物细胞缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。在一些实施方案中，表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷，辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。

在一些实施方案中，核酸构建体进一步包含含有复制起点及其控制元件的复制子。在一些实施方案中，复制子是细菌来源的。在一些实施方案中，复制子是ColE1复制子、pUC复制子或衍生自ColE1、pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子。在一些实施方案中，编码重组外膜流出蛋白的表达盒包含可操作地连接至重组外膜流出蛋白的编码序列的启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。在一些实施方案中，编码重组外膜流出蛋白的表达盒进一步包含在重组外膜流出蛋白的编码序列上游的初始转录序列(ITS)。在一些实施方案中，ITS包含SEQ ID NO:24中列出的核酸序列。在一些实施方案中，ITS由SEQ ID NO:24中列出的核酸序列组成。

在一些实施方案中，编码重组外膜流出蛋白的表达盒进一步包含5’UTR，其包含位于重组外膜流出蛋白编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和位于该重组外膜流出蛋白下游的一个或多个终止子。在一些实施方案中，RBS包含在SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，RBS由SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列组成。

在一些实施方案中，一个或多个终止子包含SEQ ID NO:36-49中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，一个或多个终止子由SEQ ID NO:36-49中任一个所示的核酸序列组成。

在一些实施方案中，感兴趣的序列编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物。在一些实施方案中，RNA产物是信使RNA、siRNA、micro RNA、向导RNA、双链RNA的有义链或双链RNA的反义链。在一些实施方案中，核酸构建体包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA的有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码双链RNA的反义链的第二感兴趣的序列。

在一些实施方案中，包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至感兴趣的序列的启动子。在一些实施方案中，启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。在一些实施方案中，启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。在一些实施方案中，包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。在一些实施方案中，微生物细胞不包含抗生素抗性基因。

在一些实施方案中，如果将质粒掺入细胞中，则微生物细胞可以在含有表面活性剂的培养基中生长和繁殖。

在一些实施方案中，质粒包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码双链RNA反义链的第二感兴趣的序列。

在一些实施方案中，核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。在一些实施方案中，编码具有tolC活性的蛋白质的基因是微生物tolC基因。在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白质包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

在一些方面，本公开提供了一种方法，该方法包括在存在阈值水平的表面活性剂且不存在抗生素的情况下在足以产生核酸构建体的条件下培养如本文所述的微生物细胞。在一些实施方案中，该方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的核酸构建体的总量的至少50％。在一些实施方案中，该方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的核酸构建体的总量的至少90％。

在一些方面，本公开提供了一种方法，该方法包括在存在阈值水平的表面活性剂且不存在抗生素的情况下在足以产生RNA产物、肽产物或蛋白质产物的条件下培养如本文所述的微生物细胞。在一些实施方案中，该方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的RNA产物、肽产物或蛋白质产物的总量的至少50％。在一些实施方案中，该方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的RNA产物、肽产物或蛋白质产物的总量的至少90％。

在一些方面，本公开提供了一种方法，其包括：向微生物细胞递送包含编码tolC的基因和表达感兴趣的序列的基因的载体，其中微生物细胞包含遗传修饰的tolC基因，任选地，其中遗传修饰包含tolC基因或tolC基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步可选地，其中控制元件是启动子或核糖体结合位点。

在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(i)如本文所述的核酸构建体；(ii)包含遗传修饰的tolC基因的多个微生物细胞，任选地，其中遗传修饰包含突变、插入或缺失。

在一些方面，本公开提供了一种试剂盒，其包含：(i)包含编码外膜流出蛋白的表达盒的质粒；(ii)多个微生物细胞，其包含编码外膜流出蛋白的基因的遗传修饰，任选地，其中所述遗传修饰包含基因或基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步任选地，其中控制元件是启动子或核糖体结合位点。

在一些方面，本公开提供了包含多个如本文所述的任何微生物细胞的试剂盒。

在一些实施方案中，多个微生物细胞在冷冻保护剂中被冻干或冷冻。

附图简要说明

图1A-1B提供了使用抗生素选择策略(图1A)和基于糖酵解基因(gapA)的质粒成瘾策略(图1B)进行质粒选择的代表性示意图。

图2A-2B提供了表达质粒的代表性示意图，该表达质粒包含L-阿拉伯糖诱导型P_BAD启动子下游的感兴趣的序列和用于经由抗生素选择维持质粒的抗生素抗性标志物(bla)(图2A)或在合适的宿主中用于经由gapA成瘾选择策略维持质粒的gapA基因(图2B)。

图3A-3B提供了表达质粒的代表性示意图，其包含L-阿拉伯糖诱导型P_BAD启动子下游的T7 RNA聚合酶基因和用于经由抗生素选择维持质粒的抗生素抗性标志物(bla)(图3A)或在合适的宿主中用于经由gapA成瘾选择策略维持质粒的gapA基因(图3B)。

图4A-4C提供了用于产生双链RNA的模板质粒的代表性示意图，所述双链RNA包含来自两个独立表达盒的感兴趣的序列(SOI)，这两个表达盒都在T7启动子和初始转录序列(ITS)的转录控制下。图4A显示了含有bla基因的代表性质粒图谱，该bla基因能够经由氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性实现质粒选择。图4B显示了包含gapA基因的代表性质粒图谱，该gapA基因可以在合适的宿主中实现无抗生素的质粒选择。图4C显示了含有gapA的模板质粒并突出显示了含有合成启动子的gapA基因上游区域和含有用于驱动外源gapA标志物表达的核糖体结合位点(RBS)的5’非翻译区(UTR)。可以组合使用不同的启动子和RBS。

图5A-5C提供了显示gapA损失对大肠杆菌在不同培养基条件下生长的影响的图表。图5A显示缺乏内源gapA表达的大肠杆菌(GL18-134)不能在成分确定的基本培养基(Korz培养基)或复合培养基(Luria液体培养基(LB))中生长，所述培养基含有需要gapA基因经由糖酵解进行分解代谢的碳源，但是当补充了碳源(甘油和琥珀酸盐)以消除对gapA基因的需要时，它们能够在成分确定的培养基中生长。图5B显示添加用于gapA表达的外源质粒可以挽救缺乏内源gapA的大肠杆菌(GL18-135)在含有需要gapA基因和糖酵解的碳源的成分确定的基本培养基(Korz培养基)中的生长。图5C显示添加用于gapA表达的外源质粒可以挽救缺乏内源gapA的大肠杆菌(GL18-135)在含有需要gapA基因和糖酵解的碳源的复合培养基(LB)中的生长。

图6A-6C提供了证明使用gapA质粒成瘾策略在大肠杆菌细胞中有效生产重组蛋白的图表。图6A-6B显示缺乏内源gapA的大肠杆菌产生高水平的从包含外源gapA基因的质粒(GL18-135；unARMed)表达的重组蛋白。GL18-135细胞中的蛋白质表达与含有bla抗生素抗性标志物基因(GL17-195；ARMed)的大肠杆菌细胞中的蛋白质表达相当。图6C显示了GL18-135细胞和GL17-195细胞以相似的速率生长和表达重组蛋白的数据，如它们随时间推移的细胞干重和蛋白质表达水平(g/L)所示。

图7A-7C提供的图表显示使用氨苄青霉素/羧苄青霉素抗性选择系统(ARMed)或gapA质粒成瘾策略(unARMed)在大肠杆菌细胞中产生质粒DNA。图7A显示缺乏内源gapA的大肠杆菌细胞的质粒DNA产率，该细胞表达包含可变感兴趣的基因和外源gapA基因的质粒。图7B显示缺乏内源gapA的大肠杆菌细胞的生长曲线，该细胞表达包含可变感兴趣的基因和外源gapA基因的质粒。图7C显示了ARMed菌株和unARMed变体的质粒DNA产率。

图8提供了使用基于表达外膜流出蛋白(tolC)的基因的质粒成瘾策略的质粒选择的代表性示意图。

图9A-9B提供了表达质粒的代表性示意图，其包含L-阿拉伯糖诱导型P_BAD启动子下游的感兴趣的序列和用于经由抗生素选择维持质粒的抗生素抗性标志物(bla)(图9A)或用于在合适的宿主中经由tolC成瘾选择策略维持质粒的tolC基因(图9B)。

图10A-10C提供了用于产生双链RNA的模板质粒的代表性示意图，该双链RNA包含来自两个独立表达盒的感兴趣的序列(SOI)，这两个表达盒都在T7启动子和初始转录序列(ITS)的转录控制下。图10A显示了含有bla基因的代表性质粒图谱，该bla基因能够经由羧苄青霉素抗性实现质粒选择。图10B显示了包含tolC基因的代表性质粒图谱，该tolC基因使得能够在合适的宿主中实现无抗生素质粒选择。图10C显示了包含tolC的模板质粒并突出了包含合成启动子的tolC基因上游的区域和包含用于驱动外源tolC标志物表达的核糖体结合位点(RBS)的5’非翻译区(UTR)。可以组合使用不同的启动子和RBS。

图11提供了显示在存在低浓度SDS(0.005％；50mg/L)的情况下tolC损失对大肠杆菌生长的影响以及随后通过在重组质粒上引入tolC拯救ΔtolC表型的图。

图12提供了显示使用羧苄青霉素抗性选择系统(ARMed：GL18-020)或tolC质粒成瘾策略(UnARMed：GL18-196、GL18-197、GL18-198、GL18-199、GL18-200)在大肠杆菌细胞中产生编码兴趣dsRNA的质粒DNA的图。

发明详述

在一些方面，本公开提供了用于质粒成瘾系统(例如，利用糖酵解途径的酶的质粒成瘾系统和利用表达外膜流出蛋白的基因的质粒成瘾系统)的方法和组合物。在一些实施方案中，本文所述的质粒成瘾系统使质粒能够保留在微生物中，而不需要抗生素或编码抗生素抗性标志物的DNA序列。

本发明描述了涉及将编码关键微生物糖酵解酶的基因(例如，gapA)转移到质粒中的质粒成瘾系统，该质粒将维持在细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)中，这些细菌细胞已被工程化为已经减少或消除了表达该关键微生物糖酵解酶的基因的表达。此类配置需要细胞具有减少或消除的糖酵解酶的内源表达(例如，缺乏内源gapA基因的细胞(gapA缺陷型大肠杆菌))以维持质粒，以在产业上常用的复合和成分确定的基本培养基中保持存活。质粒的丢失会导致具有减少或消除糖酵解酶的内源表达的细胞(例如，gapA缺陷型大肠杆菌)停止生长并被几代后继续保留质粒的细胞稀释。

本发明进一步描述了质粒成瘾策略，该策略涉及将表达外膜流出蛋白(例如，tolC)的基因转移到要维持在已被工程化的细菌细胞(例如，大肠杆菌细胞)内的质粒上，该被工程化的细胞具有减少或消除的表达外膜流出蛋白的基因的表达。此类配置需要细胞具有减少或消除的外膜流出蛋白的内源表达(例如，缺乏内源tolC基因的细胞(tolC缺陷型大肠杆菌))以维持质粒，以在表面活性剂存在的情况下保持存活。质粒的丢失会导致具有减少或消除的外膜流出蛋白的内源表达的细胞(例如，tolC缺陷型大肠杆菌)停止生长并被几代后继续保留质粒的细胞稀释。

定义

尽管以下术语被认为是本领域的普通技术人员所熟知的，但给出以下定义是为了方便对当前公开的主题进行解释。

术语“成分确定的培养基”和“化学成分确定的培养基”是指通常使用化学纯的生化物质、无机盐和化学组分已知的成分制备的培养基。因此，成分确定的培养基的化学组分通常是准确已知的。

如本文所用，术语“成分确定的基本培养基”或“基本培养基”通常是指成分确定的微生物细胞培养基，其营养贫乏且由所述微生物细胞生长必须的最少必需成分组成。在一些实施方案中，最少必需成分由无机盐、简单碳源(例如单糖，如葡萄糖或甘油)、简单无机氮源(例如铵盐)和水组成。在一些实施方案中，成分确定的基本培养基内的碳源是糖酵解途径的组分。在一些实施方案中，基本培养基是Korz液体培养基，例如，如Korz等人，1995，J.Biotechnol.39:59-65中所述的培养基或衍生自该培养基的培养基。在一些实施方案中，基本培养基是M9基本培养基(例如，如Cold Spring Harbor Protocols中所述)或衍生自M9基本培养基。

如本文所用，术语“复合培养基”通常是指微生物细胞的培养基，其营养丰富并且包括至少一种粗制的、不纯的或复合的组合物(例如，具有多种组分的组合物，其化学成分结构和/或比例不明确(例如，酵母提取物、血液、牛肉提取物))。复合培养基可包含无机盐、一种或多种碳源、水和至少一种用作氨基酸和/或氮和/或碳源的复合组合物。在一些实施方案中，复合培养基内的碳源是糖酵解和/或糖异生途径的组分。在一些实施方案中，复合培养基是Luria液体培养基(LB)或衍生自LB的培养基、Terrifi液体培养基或衍生自TB的培养基或具有分解代谢物抑制的超优液体培养基(SOC培养基)或衍生自SOC的培养基。

如本文所用，术语“核酸”或“核酸分子”通常指脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。核酸可以是单链或双链的。核酸分子中的核苷酸单体可以是天然存在的核苷酸、修饰的核苷酸或其组合。在一些实施方案中，修饰的核苷酸包含糖部分和/或嘧啶或嘌呤碱基的修饰。

术语“转录”或“RNA转录”一般指RNA转录物由RNA聚合酶合成的过程，该RNA聚合酶能够使用核酸分子(DNA或RNA)作为模板在体内或体外聚合三磷酸核糖核苷。

术语“模板”或“转录模板”或“用于转录的模板”一般是指充当RNA聚合酶模板以经由转录过程产生RNA转录物的核酸序列(DNA或RNA)。该模板指定了由RNA聚合酶合成的RNA转录物的序列。RNA聚合酶通过沿着模板核酸分子的模板链移动并将与模板(DNA或RNA)链互补的核糖核苷酸三磷酸添加到生长中的RNA转录物来合成RNA转录物。模板可以是DNA或RNA。在一些实施方案中，模板是单链或双链的。在大多数生物体中，转录是通过RNA聚合酶以双链DNA分子(染色体DNA)为模板在细胞内合成mRNA来进行的。在一些实施方案中，体外转录利用合成的部分双链DNA模板由DNA依赖性的RNA聚合酶转录。在一些实施方案中，模板是线性分子。在一些实施方案中，模板是环形的。除了表达RNA转录物所必需的元素之外，模板还可以包含其他元素。此外，通过RNA依赖性RNA聚合酶从单链RNA进行的体内和/或体外转录也是可能的(例如在一些RNA病毒的情况下)。在一些实施方案中，术语“模板”或“转录模板”或“用于转录的模板”可以指双链DNA分子片段的特定核酸序列或包含待转录的核酸序列的整个DNA分子。

术语“感兴趣的序列”通常指RNA或DNA分子的一部分的特定核酸序列(例如，模板内存在的特定核酸序列)。在一些实施方案中，感兴趣的序列是指作为DNA模板或产物的一部分的核酸序列。因此，在一些实施方案中，感兴趣的序列是编码RNA产物的特定核酸序列的DNA模板片段。在一些实施方案中，感兴趣的序列是掺入RNA转录物或经由转录产生的RNA产物中的序列。在其他实施方案中，感兴趣的序列是DNA模板的片段，其编码兴趣蛋白(例如，编码酶的基因)。在一些实施方案中，感兴趣的序列可以是表达盒的一部分。在一些实施方案中，感兴趣的序列是RNA转录物或产物的一部分或全部的核酸序列。在一些实施方案中，感兴趣的序列是编码特定RNA转录物或肽或蛋白质产物的基因。在一些实施方案中，感兴趣的序列是掺入核酸构建体(例如，质粒或表达盒)以允许表达由该基因编码的所需RNA转录物和/或肽和/或蛋白质产物的基因。

术语“有义”和“反义”通常指双链DNA或RNA分子中的单条链。因此，本文所用的术语“有义链”可指双链DNA分子的编码链的核酸序列。在一些实施方案中，术语“有义链”是指在体内或体外产生的mRNA转录物的片段或全部的核酸序列。术语“有义链”也可以指双链RNA分子的一条链。此外，术语“反义链”可以指在给定生物体中转录产生mRNA的双链DNA的模板链的一部分或全部的核酸序列。或者，术语“反义链”可指与给定生物体细胞中产生的部分或全部mRNA转录物互补的RNA链的核酸序列。进一步，术语“反义链”可以指与双链RNA分子中的有义链互补的RNA链。

术语“表达盒”通常是指用作经由转录表达兴趣RNA转录物的模板的核酸序列，并且至少由可操作地连接到编码待表达的RNA分子的核酸序列的启动子组成。在一些实施方案中，表达盒是指充当用于表达RNA转录物或产物的模板的DNA序列。在一些实施方案中，表达盒进一步包含以下元件中的一种或多种：(1)初始转录序列(ITS)，其紧邻启动子下游，例如，以增强兴趣RNA转录物的转录，并且使得它是出现在每个转录物的5’端；(2)包含核糖体结合位点(RBS)的5’-非翻译区(5’UTR)，如果该转录物编码蛋白质，当将其掺入到所得RNA转录物中时，有助于翻译成蛋白质；(3)ITS的反向互补序列(ITS-RC)，(4)一个或多个限制性核酸内切酶位点；和/或(5)一个或多个转录终止子序列。因此，当RNA转录物是编码肽或蛋白质的mRNA转录物时，表达盒能允许RNA转录物作为兴趣产物(例如，siRNA、shRNA、sgRNA、mRNA、tRNA等)表达，或能经由表达的RNA转录物的翻译进一步允许肽或蛋白质产物的表达。

术语“构建体”、“核酸构建体”、“表达构建体”或“载体”通常是指DNA分子，其包括一个或多个用于经由RNA聚合酶的转录表达RNA转录物(例如mRNA、siRNA、dsRNA链等)的表达盒。在一些实施方案中，当RNA转录物是信使RNA(mRNA)时，表达盒最终编码兴趣蛋白。构建体可能包括对RNA转录物的表达不重要，但对于确保其自身在体内或体外的复制、维持、稳定性等必需的其他元素。例如，构建体可以是具有一个或多个表达盒的质粒，该质粒进一步包含用于其在合适宿主(例如，gapA缺陷型细菌细胞)中的复制和维持的复制起点和选择标志物(例如，gapA基因)。在一些实施方案中，已通过整合一个或多个表达盒进行生物体的染色体修饰以允许表达RNA转录物，该生物体的染色体可包含构建体。构建体的非限制性实例包括病毒载体(例如，腺相关病毒载体)、质粒、粘粒、质体系、噬菌体、人工染色体、具有整合表达盒的天然基因组或线性DNA分子。

术语“初始转录序列(ITS)”一般指包含DNA模板上转录序列的前几个核苷酸(例如，1-15个核苷酸)且紧邻启动子下游的核酸序列。

术语“ARMed”是指包含抗生素抗性标志物(ARM)基因(例如，编码赋予氨苄青霉素和羧苄青霉素抗性的β-内酰胺酶的bla基因)的生物体、细胞、染色体或核酸构建体(例如，质粒)。相反，术语“UnARMed”是指不包含抗生素抗性标志物基因或以其他方式具有或赋予抗生素抗性的生物体、细胞、染色体或核酸构建体(例如，质粒)。

术语“表面活性剂”是指降低液体表面张力的两亲性分子(即，具有疏水基团和亲水基团的分子)。在一些实施方案中，表面活性剂是洗涤剂、润湿剂、乳化剂或分散剂。在一些实施方案中，表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷，辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。在一些实施方案中，表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞(例如，外膜流出蛋白缺陷的微生物细胞)中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的最小表面活性剂浓度。在一些实施方案中，在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂的最小浓度是10、20、30、40或50mg/L的表面活性剂(例如，SDS)。

糖酵解基因

糖酵解途径也称糖酵解，是一种分解代谢途径，其构成了作为几乎所有活生物体内中心碳代谢的一部分的一组反应。糖酵解途径允许葡萄糖分解为丙酮酸盐，并且伴有ATP形式的能量释放。糖酵解基因编码实施作为糖酵解途径的一部分的反应的酶。在一些实施方案中，糖酵解基因编码编码选自下组的酶：己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、甘油醛3-磷酸脱氢酶、磷酸甘油酸激酶、磷酸甘油酸变位酶、烯醇酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶和丙酮酸激酶。

由大肠杆菌(E.coli)中gapA基因编码的甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)在糖酵解途径中催化甘油醛-3-磷酸盐偶联地氧化和磷酸化为1,3-二磷酸甘油酸盐。从大肠杆菌中去除将该基因有效去除了这种生成1,3-二磷酸甘油酸盐的化学反应，从而阻止了糖酵解中GAPDH上游的仅含碳源的成分确定的培养基或成分确定的基本培养基中的生长。gapA的缺失也阻止了主要由氨基酸和小肽组成的复杂培养基中的生长，因为糖原异生将不能通过gapA路障来同化碳。为促进gapA缺陷型大肠杆菌的生长，此类突变体需要在含有两种或多种碳源的培养基中生长，这些碳源可以被gapA障碍两侧上的中枢代谢所同化。此类培养基的一种表现是含有甘油和琥珀酸的培养基(例如sM63培养基)。为恢复gapA缺陷型大肠杆菌在含有单一碳源的确定培养基或复杂培养基中的生长，需要将编码具有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的酶的基因(例如，通过EC 1.2.1.12或1.2.1.13鉴定的反应)在质粒或其他DNA载体上引入细胞中(图1B)。

在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶可以来自大肠杆菌或其他生物体，并且具有通过下表1中列出的登录号给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶包括属于表1中描述的任何一种酶的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶包括与表1中所述任何一种酶具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

表1.示例性的GAPDH活性的生物来源

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在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶包括SEQ ID NO:50的氨基酸序列或由该序列组成。在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶包括与SEQ ID NO:50的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的氨基酸序列或由这样的序列组成。由大肠杆菌gapA基因(WP_000153502)编码的GAPDH酶–SEQ ID NO:50

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编码外膜外排蛋白的基因

外膜外排蛋白是使得能够输出革兰氏阴性细菌(例如大肠杆菌)中的生物分子的跨膜蛋白通道。在一些实施方案中，外膜外排蛋白是促进细菌(例如致病菌)对抗生素的抗性的关键蛋白质。在一些实施方案中，外膜外排蛋白是促进细菌存活性(例如，通过使毒素能够从细菌内部输出)的关键蛋白质。在一些实施方案中，外膜外排泵是选自下组的蛋白质：tolC(例如，来自大肠杆菌的tolC)、延长因子G(FusA，例如，来自假单胞菌(Pseudomonas)的FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB和bepC。

TolC是一种蛋白外排泵(例如，由大肠杆菌tolC基因编码的酶)。其充当通道以通过微生物细胞(例如大肠杆菌)的周质空间和外膜泵出(即，流出)多种有毒化合物，这些有毒化合物包括比如十二烷基硫酸钠(SDS)等表面活性剂分子。其在赋予针对广谱毒性外源化合物如抗生素、洗涤剂和有机溶剂等的抗性方面起重要作用。TolC作为三聚体蛋白发挥作用，其在转位酶AcrAB或MdtABC与毒性化合物结合后被募集以与此类转位酶形成瞬时复合物。这种与AcrAB或MdtABC的相互作用导致TolC结构的构型转变为开放状态，使得TolC能够将通过这些外排系统递送的毒性化合物泵送到细胞外。重点在于，tolC缺失使得微生物细胞不能在TolC负责泵送出细胞外的一些毒性化合物(例如，比如SDS等表面活性剂)的存在下生长。因此，本公开的发明人已发现，利用tolC的质粒成瘾系统是非常有效的。如果微生物细胞在比如SDS等表面活性剂存在下生长，则内源性tolC的缺失导致微生物细胞需要维持含有外源性tolC的质粒。在一些实施方案中，TolC外膜通道蛋白可来自大肠杆菌或其在其它生物中的同源物，其具有由下表2中列出的登录号给出的氨基酸序列。

表2.示例性的TolC活性的生物来源。

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在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白可以来自大肠杆菌或其他生物体，并且具有表2中列出的登录号所给出的氨基酸序列。在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白包括属于表2中描述的任何一种蛋白的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白包括与表2中描述的任何一种酶具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白包括SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白包括与SEQ ID NO:51的氨基酸序列具有至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％或至少97％序列同一性的氨基酸序列或由其组成。

由大肠杆菌tolC基因编码的TolC酶(ADD58252)(SEQ ID NO:51)

细胞和基因修饰

本公开的细胞(例如，细菌细胞如大肠杆菌等)可以进行修饰(例如，遗传修饰，例如，使用λ红色重组方法)以去除、失活或缺失其内源性基因中的一个或多个。在一些实施方案中，本公开的细胞被修饰为去除、失活或缺失一个或多个内源性糖酵解基因(例如编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的原核基因，比如大肠杆菌gapA基因等，或者表1中描述的任何蛋白质)，从而使细胞缺失内源性糖酵解基因或具有降低表达的内源性糖酵解基因。在一些实施方案中，本公开的细胞被修饰为去除、失活或缺失一个或多个编码外膜外排蛋白(例如编码外膜外排蛋白的原核基因，比如大肠杆菌tolC基因或表2中描述的恩和蛋白质)的内源性基因，以使得细胞缺失编码外膜外排蛋白的内源性基因或具有降低表达的编码外膜外排蛋白的内源性基因。在一些实施方案中，具有降低表达的内源性基因的细胞以野生型或未修饰细胞表达水平的约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或不足1％的水平来表达基因。在一些实施方案中，修饰细胞中内源性基因的表达比野生型或未修饰细胞中内源性基因的表达低至少10％、20％、30％、40％、50％、75％、100％、125％、150％、175％或200％。在一些实施方案中，细胞被修饰为内源性基因部分缺陷(例如，表达低水平的糖酵解基因)。在一些实施方案中，内源性基因部分缺陷的细胞以野生型或原初细胞表达水平的约25％、20％、15％、10％、5％、4％、3％、2％、1％或不足1％的表达水平来表达基因。在一些实施方案中，细胞被遗传修饰为内源性基因完全缺乏(例如，没有可检测水平的糖酵解基因)。已经进行修饰以使得一个或多个内源性基因(例如，一个或多个内源性糖酵解基因或外膜蛋白)已被去除、失活或缺失的细胞也可以称为缺失所述内源性基因(例如，缺失所述内源性糖酵解基因或基因并且编码外膜蛋白)。

在一些实施方案中，已经进行修饰以使得一个或多个内源性糖酵解基因已被删除、失活或缺失的细胞不能在成分确定的培养基或成分确定的基本培养基(例如Korz培养基)中存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得一个或多个内源性糖酵解基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得一个或多个内源性糖酵解基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在成分确定的培养基、成分确定的基本培养基(例如Korz培养基)和/或复杂培养基(例如Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。

在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的酶的内源性糖酵解基因已被去除、失活或缺失。在一些实施方案中，已对细胞进行修饰以使得其缺乏编码具有甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的酶的内源性糖酵解基因的表达或该基因的表达降低。在一些实施方案中，具有GAPDH活性的酶是大肠杆菌gapA基因或如表1所述的基因。

在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有GAPDH活性的酶的内源性糖酵解基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在成分确定的培养基或成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)中存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有GAPDH活性的酶的内源性糖酵解基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有GAPDH活性的酶的内源性糖酵解基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在成分确定的培养基、成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)或复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。

在一些实施方案中，已经进行修饰以使得一个或多个编码外膜外排蛋白的内源性基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在包含表面活性剂(例如，SDS)的培养基中存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得一个或多个编码外膜外排蛋白的内源性基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在包含毒素的培养基中存活、繁殖或生长。

在一些实施方案中，细胞已经进行修饰以使得编码具有tolC活性的蛋白质的内源性基因库已被去除、失活或缺失。在一些实施方案中，细胞已经进行修饰以使其缺乏编码具有tolC活性的蛋白质的表达或该基因的表达降低。在一些实施方案中，具有tolC活性的蛋白是大肠杆菌tolC蛋白或如表2所述的蛋白质。

在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有tolC活性的蛋白已被去除、失活或缺失的细胞不能在成分确定的培养基或成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有tolC活性的蛋白质的内源性基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。在一些实施方案中，已经进行修饰以使得编码具有tolC活性的蛋白质的内源性基因已被去除、失活或缺失的细胞不能在成分确定的培养基、成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)或复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。细胞可以使用技术人员已知的任何方法进行修饰。例如，细胞可以使用以下方法进行修饰：CRISPR/Cas9技术、细菌重组、噬菌体转导(例如细菌噬菌体P1转导)和/或染色体缺失。在一些实施方案中，细胞使用细菌重组进行修饰，这种重组是使用在细菌细胞中产生的噬菌体重组蛋白进行的。在一些实施方案中，重组是指来自不同生物体的DNA的互补核苷酸序列的人工结合。重组蛋白比如单链退火蛋白或整合酶等允许将序列有效地导入细菌基因组中或使序列从细菌基因组中缺失。在一些实施方案中，可以进行重组以使用非编码基因或不相关蛋白的编码序列来替代内源性糖酵解基因(例如编码甘油醛-3-磷酸脱氢酶的原核基因如大肠杆菌gapA基因等，或编码tolC的原核基因如大肠杆菌tolC基因等)。

在一些实施方案中，细胞是来自单细胞或多细胞微生物的微生物细胞。在一些实施方案中，细胞是细菌。在一些实施方案中，细胞是酵母细胞。在一些实施方案中，细胞是原核或真核细胞。在一些实施方案中，细胞是大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis，B.subtilis)、铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus(S.aureus)、肺炎链球菌(Streptococcus pneumoniae，S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(Mycobacteriumtuberculosis，M.tuberculosis)、麻风分歧杆菌(Mycobacterium leprae，M.leprae)、耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis，M.smegmatis)细胞。在一些实施方案中，细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae，S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Yarrowia lypolytica，Y.lypolytica)、毕赤酵母(Pichia pastoris，P.pastoris)或里氏木霉(Trichodermareesei，T.reesei)细胞。

在一些实施方案中，本公开提供了生长或培养细胞(例如，在成分确定的培养基或复杂培养基中)。生长或培养细胞描述了在任何生长培养基中维持细胞以促进细胞存活和增殖。在一些实施方案中，细胞在成分确定的基本培养基中生长，该培养基由所述微生物细胞生长的最低必需物质组成。在一些实施方案中，最低必需物质由无机盐、碳源、氮源和水组成。在一些实施方案中，基本培养基为Korz液体培养基，例如，如Korz等人，1995，J.Biotechnol.39:59-65所述。在一些实施方案中，基本培养基是改良的Korz液体培养基。在一些实施方案中，细胞在复杂培养基中生长，该培养基包括无机盐、碳源、水以及氨基酸源和氮源中的至少一种。在一些实施方案中，复杂培养基是Luria液体培养基(LB)。

可以将包含一个或多个外源性基因的外源性核酸构建体(例如，质粒)添加到如本文所述的修饰细胞中。在一些实施方案中，外源性基因是糖酵解基因(例如，编码具有GAPDH活性的酶的基因)。在一些实施方案中，外源性基因是编码外膜外排蛋白的基因(例如，编码具有tolC活性的蛋白质的基因)。外源性核酸构建体可以使用如下方法添加：电穿孔、显微注射、珠转染、氯化钙转化或技术人员抑制的任何转染方法。

将包含一个或多个外源性糖酵解基因(例如，编码具有GAPDH活性的酶的基因)添加到修饰细胞中允许细胞在成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)和/或复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。例如，将包含gapA基因的外源性核酸构建体添加至遗传修饰的gapA缺陷型大肠杆菌细胞(ΔgapA大肠杆菌细胞)允许细胞在成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)和复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中存活、繁殖或生长。

将包含一个或多个编码外膜外排蛋白的外源性基因(例如，编码具有tolC活性的蛋白质的基因)的外源性核酸构建体(例如，质粒)添加到修饰细胞中允许细胞在包含毒素(例如，表面活性剂，包括但不限于SDS)中的培养基中存活、繁殖或生长。例如，将包含tolC基因的外源性核酸构建体添加到遗传修饰的tolC缺陷型大肠杆菌细胞(ΔtolC大肠杆菌细胞)中允许细胞在包含表面活性剂(例如，SDS)的培养基中存活、繁殖或生长。

感兴趣的序列和编码产物

本文所述的核酸组合物如DNA质粒包含感兴趣的序列(SOI)，其中该SOI是任何编码RNA、肽和/或蛋白产物的序列。在一些实施方案中，SOI可操作地连接启动子，任选为包含起始转录序列(ITS)的启动子。启动子驱动其所调节的SOI的表达或驱动其转录。在一些实施方案中，感兴趣的序列是感兴趣的基因。

在一些实施方案中，RNA产物是双链RNA (dsRNA)的有义链。在一些实施方案中，RNA产物是dsRNA的反义链。在一些实施方案中，dsRNA的有义链与dsRNA的反义链互补。在一些实施方案中，RNA产物是单链RNA，例如，信使RNA。在一些实施方案中，RNA产物是shRNA、siRNA、反义寡核苷酸、gapmer或任何其他可想到的RNA产物。

在一些实施方案中，RNA产物如dsRNA靶向(例如，经由RNA干扰)感兴趣的基因组序列，该序列例如来自昆虫、植物、真菌、动物或病毒。在一些实施方案中，RNA产物如mRNA编码兴趣蛋白。

在一些实施方案中，编码RNA产物的SOI可以具有任何足以诱导生物活性的长度。非限制性例子可以包括长度为4-10、4-20、4-30、4-50、4-60、4-70、4-80、4-90、4-100、4-200、4-300、4-400、4-500、4-1000、4-2000、4-3000、4-4000、4-5000、4-6000、4-7000、4-8000、4-9000或4-10000个核苷酸的编码RNA产物的SOI。在一些实施方案中，编码RNA产物的SOI的长度为15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸。在一些实施方案中、编码RNA产物的SOI的长度为4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100、500、1000或更多个核苷酸。

如果两个核酸，例如dsRNA的有义链和反义链，彼此碱基配对或结合以通过沃森-克里克相互作用(也称为杂交)形成双链核酸分子，则它们是互补的。如本文所用，结合是指至少两个分子或同一分子的至少两个区域之间在生理条件下因例如静电相互作用、疏水相互作用、离子相互作用和/或氢键相互作用导致的缔合。在一些实施方案中，两个核酸是100％互补的。在一些实施方案中，两个核酸是至少75％、80％、85％、90％或95％互补的。

在一些实施方案中，双链RNA或dsRNA是完全双链分子，不含单链区域(例如，环或突出端)。在一些实施方案中，双链RNA或dsRNA是部分双链分子，包含双链区域和单链区域(例如环或突出端)。

在一些实施方案中，SOI编码允许在转录时合成肽或蛋白质产物(例如，酶、抗原或抗体)的mRNA。在一些实施方案中，SOI编码可以用做mRNA疫苗的mRNA。在一些实施方案中，蛋白质产物是激酶(例如CMP激酶、GMP激酶、UMP激酶、NDP激酶、多磷酸盐激酶)、磷酸酶、差向异构酶、磷酸葡萄糖异构酶(PGI)、磷酸葡萄糖变位酶(PGM)、α-葡聚糖磷酸化酶或淀粉异构酶。在一些实施方案中，蛋白质产物是聚合酶(例如T7 RNA聚合酶)。

在一些实施方案中，编码蛋白质的SOI可以具有足以能够大规模生产酶(例如，CMP激酶、GMP激酶、UMP激酶、NDP激酶、多磷酸盐激酶和T7RNA聚合酶)的任何长度。在一些实施方案中，编码蛋白质的SOI的长度为至少100、200、300 400、500、600、700、800、900、1000、1500、2000、2500、3000、3500、4000、4500、5000、5500、6000、6500、7000、7500、8000、8500、9000、9500或10,000个碱基对。

核酸结构

本文所述的核酸可以包含任何可得到的结构。在一些实施方案中，核酸是环状质粒。在一些实施方案中，环状核酸包含核酸内切酶识别位点，如果合适的核酸内切酶在该核酸内切酶识别位点切割核酸，则所述位点可以使环状核酸线性化。在一些实施方案中，核酸是包含感兴趣的序列(SOI)的DNA模板，其中该SOI编码RNA产物。在一些实施方案中，DNA模板或载体是质粒或DNA构建体。在一些实施方案中，DNA模板或载体是质粒、表达盒、粘粒、细菌人工染色体、价目人工染色体、细菌噬菌体、腺相关病毒载体(AAV载体)或病毒。

在一些实施方案中，核酸构建体(例如质粒构建体)包含复制子，其定义为允许在宿主微生物细胞中复制核酸构建体(例如质粒DNA)的最小单元或元件。在一些实施方案中，复制子包括核酸构建体(例如质粒DNA)的复制在该处启动的复制起点(ori)以及在宿主细胞中控制核酸构建体(例如质粒)的复制及其拷贝数的其他元件。在核酸构建体是质粒DNA构建体的实施方案中，通过宿主的DNA复制机制在ori处启动质粒DNA的复制。一些非限制性的复制子例子包括允许质粒在细菌宿主(例如大肠杆菌)中辅助的复制子，比如在ColE1质粒、pBR322质粒(pMB1复制起点)、pUC18和pUC19质粒(携带pUC复制子，pMB1复制子的衍生物)、R6K质粒、p15A质粒、pSC101质粒中发现的复制子等。不同的复制子在给定宿主中导致不同的拷贝数和质粒产率。例如，ColE1和pMB1起点通常允许在每个细胞中维持约15-20个质粒分子拷贝，而rop基因的缺失和pMB1起点中的两个点突变导致携带pUC复制子的质粒的拷贝数在温度诱导下扩增至每个细胞500-1000个拷贝，如在pUC18或pUC19衍生的质粒中发现的。另外，真核微生物细胞(例如酵母)中使用的质粒携带“自主复制序列(ARS)”作为复制子，在此处启动复制。在一些实施方案中，复制子最少由复制起点组成。

在一些实施方案中，核酸组合物如DNA质粒包括一个或多个启动子。启动子可以天然地与基因或序列相关，例如内源性启动子。在一些实施方案中，内源性启动子位于给定基因或序列的编码片段的上游。在一些实施方案中，编码核酸序列，例如SOI，可以在重组或异源性启动子的控制下定位，这些启动子是指在其天然环境中通常不与所编码的序列相关的启动子。此类启动子可以包括其他基因的启动子；从任何其他物种分离的启动子；以及“非天然存在”的合成启动子或增强子，比如，例如包含不同转录调节区的不同元件和/或通过本领域已知的遗传工程方法改变表达的突变的启动子或增强子等。非限制性的启动子例子包括：T7、T7Lac、SP6、P_BAD、P_trp、P_lac、P_tra、P_trc、lacUV5、T3、P_tet、LuxR、OmpR、Pho A、Hsp-70和Hsp-90衍生的启动子、P_cat、P_kan、P_bla、λpR和λpL。

在一些实施方案中，启动子是组成性激活启动子。在一些实施方案中，启动子是诱导型启动子(例如在化学或物理变化的诱导下驱动RNA转录物表达的启动子)。在一些实施方案中，启动子是化学诱导型启动子(例如比如通过添加阿拉伯糖诱导的P_BAD启动子等的启动子)。在一些实施方案中，启动子是温度诱导型启动子(例如，允许RNA转录物响应于温度变化而表达的启动子)。在一些实施方案中，启动子由生长期间营养物的限制来诱导(例如，响应于磷酸盐限制来驱动大肠杆菌中碱性磷酸酶基因phoA表达的启动子)。在一些实施方案中，启动子是天然地驱动所用基因表达的启动子(例如，所用的糖酵解基因或所用的外膜外排蛋白)。例如，在一些实施方案中，用于驱动质粒中gapA基因表达的启动子是天然gapA启动子，其被发现驱动这些基因在大肠杆菌染色体中的表达。作为另一个例子，在一些实施方案中，用于驱动tolC基因从质粒中表达的启动子是被发现驱动这些基因在大肠杆菌染色体中表达的天然tolC启动子。在一些实施方案中，启动子是P_bla启动子或P_BAD启动子。在一些实施方案中，启动子是T7启动子(例如，包含SEQ ID NO:22的T7启动子)。在一些实施方案中，启动子包含T7启动子序列，其前面是天然地存在于III类T7启动子上游的30bp上游序列，该序列驱动T7噬菌体基因组中和/>基因的表达(例如，包含SEQ ID NO:23的T7启动子)。在一些实施方案中，启动子是合成启动子。在一些实施方案中，合成启动子包含初始转录序列(ITS)，其包含GGGAGACCGGGAATT(SEQ ID NO:24)。在一些实施方案中，启动子包含表3中SEQ ID NO:1-23或52中任何一项的核苷酸序列。在一些实施方案中，启动子是指位于编码待表达的RNA转录物的SOI上游的dsDNA片段的非模板链的序列，转录起始位点通常紧接在该序列下游。在一些实施方案中，当启动子包含T7启动子(例如，包含SEQ IDNO:22或23的启动子)时，待表达的RNA转录物的5’端处的转录起始位点是用于有效转录的“G”。/>

表3.启动子序列

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核糖体结合位点(RBS)是mRNA分子的5’未翻译区(5’UTR)的片段，核糖体结合该位点以将其正确定位，从而在起始密码子处启动编码肽或蛋白质的SOI的翻译。RBS控制mRNA翻译开始的准确性和效率，并且根据其序列和结构调节蛋白质合成。有两个共有序列，Kozak和Shine-Dalgarno，已知它们分别促进真核生物和原核生物中的有效翻译。在真核细胞中，Kozak共有序列为5’-GCCACCAUGG-3’(SEQ ID NO:55)。在原核生物中，Shine-Dalgarno共有序列为5’-UAAGGAGG-3’，后面是起始密码子，最常见为AUG。RBS的活性可以受分隔RBS和起始子AUG的间隔序列的长度和核苷酸组成影响。在一些实施方案中，RBS是天然RBS，其被发现为在自然界生物体中表达的mRNA转录物的5’UTR的一部分。在一些实施方案中，RBS是合成设计的构建体，设计成从给定的mRNA转录物(例如，如Kosuri等人，2013，PNAS，110:14024-14029和Mutalik等人，2012，Nature Methods，10(4):354-360所述的RBS序列)实现期望的翻译起始速率和蛋白质生产。在一些实施方案中，本文定义的RBS还包含额外的5’UTR核苷酸。在一些实施方案中，核糖体结合位点包含SEQ ID NO:25-35或53中任何一项的核苷酸序列。

表4.核糖体结合位点序列(可能包含额外的5’UTR的核苷酸)

在一些实施方案中，核酸的组合物如DNA质粒含有转录终止子序列。编码转录终止子的序列通常紧接位于编码序列的下游。其由参与通过RNA聚合酶进行RNA转录物的特异性终止的DNA序列组成。终止子序列防止下游的核酸序列被上游的启动子转录激活。因此，在一些实施方案中，考虑了包含终止RNA转录物产生的终止子的DNA模板。最常用的终止子类型是正向终止子。当位于通常被转录的核酸序列下游时，正向转录终止子将导致转录中止。在一些实施方案中，提供了双向转录终止子，其通常导致转录在正向链和反向链二者上均终止。在一些实施方案中，提供了逆向转录终止子，其通常仅在反向链上终止转录。在原核系统中，终止子通常分为两类：(1)rho非依赖性终止子，和(2)rho依赖性终止子。Rho非依赖性终止子通常由回文序列组成，该回文序列形成富含G-C碱基对的茎环，随后是一串尿嘧啶碱基。

根据本公开使用的终止子包括本文所述或本领域普通技术人员已知的任何转录终止子。非限制性的终止子的例子包括基因的终止序列，比如，例如，牛生长激素终止子、大肠杆菌核糖体RNA T1T2终止子、rrnBT1和rrnBT2、人前甲状旁腺PTH终止子和病毒终止序列以及它们的衍生物，比如，例如，T0终止子、TE终止子、λT1、T7、TT7、T7U、TT3终止子和在细菌系统中发现和/或使用的其他终止子序列。在一些实施方案中，终止信号可以是不能转录或翻译的序列，比如得自序列截短的序列。

在一些实施方案中，终止子包含两个或更多个独立和/或不同的终止子序列或其组合。在一些实施方案中，终止子包含rrnBT1、rrnBT2、T7、TT7、T7U、TT3和/或PTH终止子序列。在一些实施方案中，终止子如表5所述。

表5.终止子序列

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在一些实施方案中，核酸的组合物如DNA质粒含有一个或多个多克隆位点(MCS)或独特的限制性内切酶消化位点。多克隆位点(MCS)或多接头区域是核酸构建体(例如DNA质粒)的片段，该片段含有多个独特的核酸内切酶限制性位点，该位点允许插入和连接一个或多个自身在其末端带有合适的限制性内切酶位点的所需的核酸序列(例如表达盒、基因或感兴趣的基因、启动子等)。通过合适的限制性内切酶进行的待插入序列和携带MCS的核酸构建体的消化产生了必要的粘性末端，这有利于受体核酸构建体的插入片段之间的相互作用。通过合适的连接酶进行的连接反过来允许必要的共价键形成以完成插入，从而形成完整的核酸分子。独立或作为MSC的部分存在于核酸构建体中的限制性内切酶位点可以允许在识别位点(例如，通过常规的II型限制性酶如EcoRI、BamHI等识别的位点)或在距离识别位点(例如通过IIS型限制性酶比如Esp3I或BspQI等识别的位点)确定的距离处进行切割。

包含必需糖酵解基因的核酸构建体

在一些实施方案中，用于本文所述质粒成瘾系统的核酸构建体包含复制子(例如，包括复制起点及其控制元件)和一个或多个表达盒，该表达盒用于糖酵解基因的重组表达，该糖酵解基因被认为对于宿主细胞细菌的存活和生长是必需的，该宿主细菌细胞缺乏由所述糖酵解基因编码的活性(例如，已经通过遗传修饰从宿主细胞中去除、失活或缺失)和/或不能从其自身染色体表达所述糖酵解基因。在一些实施方案中，核酸构建体的复制子是ColE1复制子或是来源于pUC18或pUC19复制子的复制子。在一些实施方案中，复制子是来源于pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子的复制子。

在一些实施方案中，表达盒包含合适的驱动糖酵解基因表达的启动子，其任选可操作地连接至初始转录序列(ITS)和/或包含合适的核糖体结合位点(RBS)的5’UTR。在一些实施方案中，表达盒包含一个或多个位于糖酵解基因下游的终止子。糖酵解基因由其表达盒的表达水平可以使用位于该基因上游的天然或合成启动子与天然或合成RBS的组合来进行调节。例如，在一些实施方案中，表达盒包含Pbla启动子(SEQ ID NO.20)或如表3所述的启动子，任选与表4所述的RBS结合。

在一些实施方案中，糖酵解基因是来自原核细胞的编码酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)基因(例如，大肠杆菌gapA基因)。在一些实施方案中，糖酵解基因是来自真核细胞的编码酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因。在一些实施方案中，糖酵解基因是编码具有GAPDH活性的酶的基因。在一些实施方案中，编码GAPDH的糖酵解基因如表1所述。

在一些实施方案中，能够表达糖酵解基因的核酸构建体还包含一个或多个多克隆位点以促进其他核酸构建体(例如针对特异性RNA转录物、肽或蛋白质产物的表达盒)的加入。

在一些实施方案中，核酸构建体还包含一个或多个用于重组表达RNA转录物的表达盒。RNA转录物可以是兴趣产物(例如mRNA或dsRNA)或编码一种或多种兴趣蛋白质产物(例如，用于体外或体内表达)。表达盒中每个感兴趣的序列的RNA转录物的表达可以由T7启动子、PBAD启动子或表3中描述的任何其他启动子驱动。

包含外膜外排蛋白的核酸构建体

在一些实施方案中，在本文所述的质粒成瘾系统中使用的核酸构建体包含复制子(例如，含有复制起点及其控制元件)和一个或多个用于重组表达外膜外排蛋白的表达盒。在一些实施方案中，核酸构建体的复制子是ColE1复制子或是来源于pUC18或pUC19复制子的复制子。在一些实施方案中，复制子是来源于pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子的复制子。

在一些实施方案中，表达盒包含合适的驱动编码外膜外排蛋白的基因的表达的启动子，其任选可操作地连接至初始转录序列(ITS)和/或包含合适的核糖体结合位点(RBS)的5’UTR。在一些实施方案中，表达盒包含一个或多个位于编码外膜外排蛋白下游的基因的终止子。编码外膜外排蛋白的基因由其表达盒的表达水平可以使用位于该基因上游的天然或合成启动子与天然或合成RBS的组合来进行调节。例如，在一些实施方案中，表达盒包含Pbla启动子(SEQ ID NO.20)或如表3所述的启动子，任选与表4所述的RBS结合。

在一些实施方案中，编码外膜外排蛋白的基因是来自原核细胞的编码tolC蛋白的基因(例如，大肠杆菌tolC基因)。在一些实施方案中，编码外膜外排蛋白的基因是来自真核细胞的编码tolC蛋白的基因。在一些实施方案中，编码外膜外排蛋白的基因是编码具有tolC活性的蛋白质的基因。在一些实施方案中，编码外膜外排蛋白的基因如表2中所述。

在一些实施方案中，能够表达编码外膜外排蛋白的基因的核酸构建体还包含一个或多个多克隆位点以促进其他核酸构建体(例如，用于特异性RNA转录物、肽或蛋白质产物的表达盒)的加入。

在一些实施方案中，核酸构建体还包含一个或多个用于重组表达RNA转录物的表达盒。RNA转录物可以是兴趣产物(例如，mRNA或dsRNA)或编码一种或多种兴趣蛋白质产物(例如，用于体外或体内表达)。表达盒中每个感兴趣的序列的RNA转录物的表达可以由T7启动子、PBAD启动子或表3中描述的任何其他启动子驱动。

质粒成瘾细胞

本公开的一些方面描述了缺乏细胞生长和存活所必需的必需糖酵解基因的微生物细胞(例如，具有突变或缺失或任何损害该基因所编码的酶的表达的修饰的细胞)。微生物细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中，细胞缺乏编码酶甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的基因。在一些实施方案中，微生物细胞是大肠杆菌细胞并且缺乏/受损的基因是gapA。在一些实施方案中，缺乏必需糖酵解基因的微生物细胞不能在成分确定的培养基和/或成分确定的基本培养基和/或复杂培养基中生长。

本公开的其他方面描述了缺乏细胞生长和存活所必需的编码外膜外排蛋白的基因的微生物细胞(例如，具有突变或缺失或任何损害该基因所编码的蛋白质的表达的修饰的细胞)。微生物细胞可以是原核或真核细胞。在一些实施方案中，细胞缺乏编码外膜外排蛋白(例如，tolC)的基因。在一些实施方案中，微生物细胞是大肠杆菌细胞并且缺乏/受损的基因是tolC。在一些实施方案中，缺乏编码外膜外排蛋白的基因的微生物细胞不能在含有阈值水平的表面活性剂的培养基中生长。

在一些实施方案中，微生物细胞还包含核酸构建体，该核酸构建体包含外源基因，该外源基因恢复细胞中缺乏/受损基因(例如，糖酵解基因或编码外膜外排蛋白的基因)的酶功能。在一些实施方案中，包含恢复细胞中缺乏/受损的糖酵解基因的酶功能的外源性基因的核酸构建体进一步恢复微生物细胞在成分确定的培养基和/或成分确定的基本培养基(例如，Korz培养基)和/或复杂培养基(例如，Luria液体培养基)中生长和存活的能力。在一些实施方案中，包含恢复细胞中缺乏/受损的编码外膜外排蛋白的基因的酶功能的外源性基因的核酸构建体进一步恢复微生物细胞在含有阈值水平的表面活性剂的培养基中生长和存活的能力。

方法

本发明的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生至少0.1％、0.25％、0.5％、0.6％、0.7％、0.8％、0.9％、1.0％、1.25％、1.5％、1.75％、2.0％、2.5％、3.0％、3.5％、4.0％、4.5％,5.0％、5.5％、6.0％、6.5％、7.5％、8.0％、8.5％、9.0％、9.5％、10.0％、12.5％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％g/g的干细胞重量(DCW)的质粒DNA。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)每升发酵体积能够产生至少0.1、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5或10克质粒DNA。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生由包含抗生素抗性标记基因的对照微生物细胞产生的总质粒DNA的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生包含抗生素抗性标记基因的对照微生物细胞所产生的质粒DNA多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％对质粒DNA。

本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)每升发酵体积每升发酵体积能够产生至少0.1、0.25、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.25、1.5、1.75、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、7.5或10，15，20，25，30，35，40，45或50克RNA产物(例如，双链RNA)。可选地，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生至少1％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％或50％g/g干细胞重量(DCW)的RNA产物(例如，双链RNA)。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生包含抗生素抗性标记基因的对照微生物细胞所产生的总RNA产物(例如，双链RNA)的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生比包含抗生素抗性标记基因的对照微生物细胞所产生的RNA产物(例如，双链RNA)多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或95％的RNA产物(例如，双链RNA)。

本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞gapA质粒或tolC质粒成瘾的细胞)每升发酵体积能够产生至少1、2.5、5、6、7、8、9、10、12.5、15、17.5、20、25、30、35、40、45、50、55或60克兴趣蛋白质产物。可选地，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生至少1％、2.5％、5％、7.5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％、60％g/g DCW的蛋白质产物。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生包含抗生素抗性标记基因的对照微生物细胞所产生的总蛋白质产物的至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％。在一些实施方案中，本公开的遗传工程化的微生物细胞(例如，对gapA表达质粒成瘾的细胞或tolC质粒成瘾的细胞)能够产生比包含抗生素抗性标记基因的对照微生物细胞所产生的蛋白质产物多至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的蛋白质产物。

试剂盒

本公开的一些方面提供了试剂盒。试剂盒可以包括，例如，本文所述的工程化核酸或构建体(例如，质粒)和多个缺乏内源性糖酵解基因(例如，内源性gapA)的微生物细胞。在一些实施方案中，多个微生物细胞是在冷冻保护剂中冻干或冷冻的。

本文所述的试剂盒可以包括一个或多个容纳组分的容器以及任选的使用说明。用于研究目的的试剂盒可以包含合适浓度或量的组分以供进行各种实验。本文所述的试剂盒中的任何一个还可以包含实施本文所述任何方法需要的组分。

在适用的情况下，试剂盒的每种组分可以以液体形式(例如溶液)或固体形式(例如干粉)提供。在某些情况下，一些组分可以被冻干、复液或加工(例如，加工成活性形式)，例如，通过添加合适的溶剂或其他物质(例如，水或某些有机溶剂)，这些溶剂或其他物质可以或可以不与试剂盒一起提供。

在一些实施方案中，试剂盒包括所提供组分的使用说明和/或宣传。说明可以限定说明书和/或促销的组成部分，并且通常涉及在本公开的包装上或与该包装相关的书面说明。说明还可以包括以任何使用户清楚认识到该说明与试剂盒相关的方式(例如，视听材料(例如，录像带、DVD等)、互联网和/或基于网络的通信等)提供的任何口头或电子说明书。

试剂盒可以包含在一个或多个容器中的本文所述的一个或多个组分。组分可以是无菌制备的，包装在注射器中并且冷藏运输。可选地，其可以被容纳在小药瓶或其他储藏容器中。第二容器可以具有无菌制备的其他组分。可选地，试剂盒可以包含预先混合的活性剂并且在小药瓶、试管或其他容器中运输。

取决于具体应用，试剂盒还可以包含其他组分，例如，容器、细胞培养基、盐、缓冲液、试剂、注射器、针头、一次性手套等。

其他实施方案

本公开进一步提供了与基于外膜流出蛋白的质粒成瘾系统相关的实施方案，其包含在以下编号段落中：

1.微生物细胞，其缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达，其中该微生物细胞包含核酸构建体，该核酸构建体包含编码重组外膜流出蛋白的表达盒和编码感兴趣的序列的表达盒，并且其中当微生物细胞在存在阈值水平的表面活性剂的情况下生长时表达感兴趣的序列。

2.根据权利要求1的微生物细胞，其中所述重组外膜流出蛋白具有与编码外膜流出蛋白的内源基因相同的酶活性。

3.权利要求1或2的微生物细胞，其中微生物细胞的染色体DNA包含内源基因的遗传修饰或控制内源基因表达的元件，其降低外膜流出蛋白的表达。

4.权利要求3的微生物细胞，其中所述遗传修饰是突变、插入或缺失。

5.权利要求1-4中任一项的微生物细胞，其中所述核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。

6.权利要求1-5中任一项的微生物细胞，其中所述内源基因编码tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

7.权利要求1-6中任一项的微生物细胞，其中所述外膜流出蛋白是tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

8.权利要求1-7中任一项的微生物细胞，其中所述内源基因编码具有tolC活性的蛋白质，并且其中所述重组外膜流出蛋白具有tolC活性。

9.权利要求1-8中任一项的微生物细胞，其中所述内源基因编码tolC蛋白，并且其中所述重组外膜流出蛋白是重组tolC蛋白。

10.9的微生物细胞，其中所述重组tolC蛋白包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

11.权利要求1-10中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是原核或真核细胞。

12.权利要求1-11中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。

13.权利要求1-12中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、毕赤酵母(P.pastoris)或里氏木霉(T.reesie)细胞。

1.权利要求1-13中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞，所述内源基因为tolC，所述重组外膜流出蛋白为重组tolC蛋白。

14.2.权利要求1-1中任一项的微生物细胞，其中所述表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂浓度。

14.3.权利要求14.2的微生物细胞，其中所述对照微生物细胞缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。

15.权利要求1-14.3中任一项的微生物细胞，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷，辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。

16.权利要求1-15中任一项的微生物细胞，其中所述核酸构建体进一步包含复制子，所述复制子包含复制起点及其控制元件。

17.权利要求16的微生物细胞，其中所述复制子是细菌来源的。

18.权利要求16的微生物细胞，其中所述复制子是ColE1复制子、pUC复制子或衍生自ColE1、pBR322、pUC、R6K、p15a或pSC101复制子。

19.权利要求1-18中任一项的微生物细胞，其中编码重组外膜流出蛋白的表达盒包含可操作地连接至重组外膜流出蛋白的编码序列的启动子。

20.权利要求19的微生物细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23或52中任一项所示的核酸序列。

21.权利要求19的微生物细胞，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列组成。

22.权利要求19的微生物细胞，其中编码重组外膜流出蛋白的表达盒进一步包含在重组外膜流出蛋白的编码序列上游的初始转录序列(ITS)。

23.权利要求22的微生物细胞，其中所述ITS包含SEQ ID NO:24中所示的核酸序列。

24.权利要求22所述的微生物细胞，其中所述ITS由SEQ ID NO:24中所示的核酸序列组成。

25.权利要求19-24中任一项的微生物细胞，其中编码重组外膜流出蛋白的表达盒进一步包含5’UTR，该5’UTR包含位于重组外膜流出蛋白的编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和一个或多个位于重组糖酵解酶编码序列下游的终止子。

26.权利要求25的微生物细胞，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25-35或53中任一项所示的核酸序列。

27.权利要求25的微生物细胞，其中所述RBS由SEQ ID NO:25-35或53中任一个所示的核酸序列组成。

28.权利要求25-27中任一项的微生物细胞，其中所述一个或多个终止子包含SEQID NO:36-49或54中任一项所示的核酸序列。

29.权利要求25-27中任一项的微生物细胞，其中所述一个或多个终止子由SEQ IDNO:36-49或54中任一个所示的核酸序列组成。

30.权利要求1-29中任一项的微生物细胞，其中所述感兴趣的序列编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物。

31.权利要求30的微生物细胞，其中所述RNA产物是信使RNA、siRNA、microRNA、向导RNA、双链RNA的有义链或双链RNA的反义链。

32.权利要求30或31的微生物细胞，其中所述核酸构建体包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA的有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码双链RNA的反义链的第二感兴趣的序列。

33.权利要求30-32中任一项的微生物细胞，其中包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至感兴趣的序列的启动子。

34.权利要求33的微生物细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23或52中任一项所示的核酸序列。

35.权利要求33的微生物细胞，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列组成。

36.权利要求30-35中任一项的微生物细胞，其中包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合序列位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。

37.权利要求1-36中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞不包含抗生素抗性基因。

38.质粒成瘾系统，其包含：

(i)微生物细胞，其包含对编码外膜流出蛋白的基因进行遗传修饰，其中所述遗传修饰降低或消除内源外膜流出蛋白的表达；和

(ii)质粒，其包含编码重组外膜流出蛋白的表达盒；

其中所述微生物细胞不能在含有阈值水平的表面活性剂而不掺入质粒的培养基中生长或繁殖。

39.权利要求38的质粒成瘾系统，其中所述遗传修饰包含在编码外膜流出蛋白的基因或所述基因的控制元件内的突变、插入或缺失，任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合地点。

40.权利要求38或39的质粒成瘾系统，其中重组外膜流出蛋白具有与内源外膜流出蛋白相同的活性。

41.权利要求38-40中任一项的质粒成瘾系统，其中如果将所述质粒掺入所述细胞中，则所述微生物细胞可以在含有表面活性剂的培养基中生长和繁殖。

42.权利要求38-41中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的基因编码tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

43.权利要求38-42中任一项的质粒成瘾系统，其中所述重组外膜流出蛋白是tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

44.权利要求38-43中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的基因编码具有tolC活性的外膜流出蛋白，并且其中所述重组外膜流出蛋白具有tolC活性。

45.权利要求38-44中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰基因编码tolC蛋白，并且其中所述重组外膜流出蛋白是tolC蛋白。

46.权利要求45的质粒成瘾系统，其中所述tolC蛋白包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

47.权利要求38-46中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是原核或真核细胞，任选地，其中所述微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。

48.权利要求38-46中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、毕赤酵母(P.pastoris)或里氏木霉(T.reesie)细胞。

49.权利要求38-48中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞为大肠杆菌(E.coli)细胞，所述失活基因为tolC，所述重组外膜流出蛋白为tolC蛋白。

50.权利要求38-49中任一项的质粒成瘾系统，其中表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂浓度。

51.权利要求50的质粒成瘾系统，其中所述对照微生物细胞缺乏对照微生物细胞缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。

51.权利要求38-50.1中任一项的质粒成瘾系统，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷，辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。

52.权利要求41-51中任一项的质粒成瘾系统，其中所述质粒包含复制子，所述复制子包含复制起点及其允许质粒在微生物细胞中复制的控制元件，任选地其中所述复制子是ColE1复制子，pUC复制子或衍生自ColE1、pUC、pBR322、R6K、p15a或pSC101复制子。

53.权利要求41-52中任一项的质粒成瘾系统，其中编码重组外膜流出蛋白的表达盒包含可操作地连接至重组外膜流出蛋白的编码序列的启动子。

54.权利要求53的质粒成瘾系统，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列。

55.权利要求53的质粒成瘾系统，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列组成。

56.权利要求53-55的质粒成瘾系统，其中编码重组外膜流出蛋白的表达盒进一步包含重组外膜流出蛋白编码序列上游的初始转录序列(ITS)。

57.权利要求56的质粒成瘾系统，其中所述ITS包含SEQ ID NO:24所示的核酸序列。

58.权利要求56的质粒成瘾系统，其中所述ITS由SEQ ID NO:24所示的核酸序列组成。

59.权利要求53-58中任一项的质粒成瘾系统，其中编码重组外膜流出蛋白的表达盒进一步包含5’UTR，该5’UTR包含位于重组体的编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和一个或多个位于重组糖酵解酶编码序列下游的终止子。

60.权利要求59的质粒成瘾系统，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25-35或53中任一项所示的核酸序列。

61.权利要求59的质粒成瘾系统，其中所述RBS由SEQ ID NO:25-35或53中任一个所示的核酸序列组成。

62.权利要求59-61中任一项的质粒成瘾系统，其中所述一个或多个终止子包含SEQ ID NO:36-49或54中任一项所示的核酸序列。

63.权利要求59-61中任一项的质粒成瘾系统，其中所述一个或多个终止子由SEQID NO:36-49或54中任一个所示的核酸序列组成。

64.权利要求59-63中任一项的质粒成瘾系统，其中所述质粒进一步包含含有感兴趣的序列的表达盒，其中所述感兴趣的序列编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物。

65.权利要求64的质粒成瘾系统，其中所述RNA产物是信使RNA、siRNA、microRNA、向导RNA、双链RNA的有义链或双链RNA的反义链。

66.权利要求64或65的质粒成瘾系统，其中所述质粒包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码双链RNA反义链的第二感兴趣的序列。

67.权利要求64-66中任一项的质粒成瘾系统，其中包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至感兴趣的序列的启动子。

68.权利要求67的质粒成瘾系统，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列。

69.权利要求67的质粒成瘾系统，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列组成。

70.权利要求64-69中任一项的质粒成瘾系统，其中包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。

71.权利要求38-63中任一项的质粒成瘾系统，其中所述质粒进一步包含一个或多个多克隆位点(MCS)或独特的限制性核酸内切酶消化位点。

72.权利要求38-71中任一项的质粒成瘾系统，其中所述质粒不包含抗生素抗性基因。

73.核酸构建体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码具有tolC活性的蛋白质的基因和

(i)一个或多个多克隆位点，和/或

(ii)表达盒，其包含编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物的感兴趣的序列。

74.权利要求73的核酸构建体，其中所述核酸构建体是质粒、载体、粘粒、细菌人工染色体、酵母人工染色体、噬菌体、病毒载体或任何其他。

75.权利要求73或74的核酸构建体，其中编码具有tolC活性的蛋白质的基因是微生物tolC基因。

76.权利要求73-75中任一项的核酸构建体，其中所述具有tolC活性的蛋白质包含SEQ ID NO:51的氨基酸序列。

77.权利要求73-76中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含第一感兴趣的序列和第二感兴趣的序列，任选地其中第一表达盒包含所述第一感兴趣的序列和第二表达盒包含所述第二感兴趣的序列。

78.权利要求77的核酸构建体，其中所述第一感兴趣的序列编码双链RNA产物的有义链，并且所述第二感兴趣的序列编码双链RNA产物的反义链。

79.权利要求73-78中任一项的核酸构建体，其中任何一个表达盒进一步包含启动子和/或终止子。

80.权利要求79的核酸构建体，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列。

81.权利要求79的核酸构建体，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23或52中任一个所示的核酸序列组成。

82.权利要求79-81中任一项的核酸构建体，其中所述启动子可操作地连接至初始转录序列(ITS)。

83.权利要求82的核酸构建体，其中所述ITS包含SEQ ID NO:24中所示的核酸序列。

84.权利要求82的核酸构建体，其中所述ITS由SEQ ID NO:24中所示的核酸序列组成。

85.权利要求79-81中任一项的核酸构建体，其中所述启动子可操作地连接至包含核糖体结合位点(RBS)的5’UTR。

86.权利要求85的核酸构建体，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25-35或53中所示的核酸序列。

87.权利要求85的核酸构建体，其中所述RBS由SEQ ID NO:25-35或53中所示的核酸序列组成。

88.包括在存在阈值水平的表面活性剂且不存在抗生素的情况下在足以产生核酸构建体的条件下培养权利要求1-37中任一项的微生物细胞的方法。

89.权利要求88的方法，其中所述方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的核酸构建体的总量的至少50％。

90.权利要求88的方法，其中所述方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的核酸构建体的总量的至少90％。

91.包括在存在阈值水平的表面活性剂且不存在抗生素的情况下在足以产生RNA产物、肽产物或蛋白质产物的条件下培养权利要求16-37中任一项的微生物细胞的方法。

92.权利要求91的方法，其中所述方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的RNA产物、肽产物或蛋白质产物的总量的至少50％。

93.权利要求91或92的方法，其中所述方法产生由包含抗生素抗性标志物基因的对照微生物细胞产生的RNA产物、肽产物或蛋白质产物的总量的至少90％。

94.方法，其包括：

向微生物细胞递送包含编码tolC的基因和表达感兴趣的序列的基因的载体，

其中所述微生物细胞包含遗传修饰的tolC基因，任选地，其中所述遗传修饰包含在tolC基因或tolC基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。

95.权利要求88-93中任一项的方法，其中所述表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂浓度。

96.权利要求95的方法，其中所述对照微生物细胞缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。

97.权利要求88-93、95或96中任一项的方法，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷，辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。

98.试剂盒，其包含：

(i)权利要求73-87中任一项的核酸构建体；和

(ii)包含遗传修饰的tolC基因的多个微生物细胞，任选地其中所述遗传修饰包含突变、插入或缺失。

99.试剂盒，其包含：

(i)核酸构建体，其包含编码外膜流出蛋白的表达盒；和

(ii)多个微生物细胞，其包含编码外膜流出蛋白的基因的遗传修饰，任选地，其中所述遗传修饰包含基因或该基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。

100.试剂盒，其包含多个权利要求1-37中任一项的微生物细胞。

101.权利要求98-100中任一项的试剂盒，其中所述多个微生物细胞在冷冻保护剂中被冻干或冷冻。

实施例

实施例1：采用基于gapA的选择来构建ARMed质粒或unARMed质粒

构建了一组利用基于gapA的成瘾性使质粒保留在细菌宿主中的质粒，以证明此类unARMed质粒可用于实现与利用传统抗生素抗性标记(ARMed质粒)进行选择的质粒相当的重组蛋白过表达水平。另外地，构建了第二组利用基于gapA的成瘾性使颗粒保留的质粒，以证明此类unARMed质粒可用于获得与利用大肠杆菌发酵的ARMed质粒获得的模板质粒DNA相当的模板质粒DNA产率。下文给出了这两组质粒的构建细节。另外地，构建ARMed质粒用于对照。

表6所述的ARMed表达质粒包含：a)用于表达在Pbla启动子(SEQ ID NO:20)以及包含bla_rbs RBS(SEQ ID NO:33)和位于bla基因下游的Tbla终止子(Tbla，SEQ ID No:49)的5’UTR的转录和翻译控制下作为氨苄青霉素抗性标记的bla基因(编码β-内酰胺酶)的表达盒，b)pBR322复制起点，和c)用于表达重组蛋白的表达盒，其包含P_BAD启动子(SEQ ID NO:21)和5’UTR，后者包含位于最多两个感兴趣的基因或感兴趣的序列的两个多克隆位点上游的araB_rbs RBS(SEQ ID NO:35)和位于这些多克隆位点下游的单个pET-T7终止子(SEQ ID NO:44)。示例性ARMed质粒模板如图2A所示。

基于gapA质粒成瘾系统的unARMed质粒包含：a)用于作为无抗生素标记的大肠杆菌gapA基因的表达盒，其包含Pbla启动子(SEQ ID NO:20)和5’UTR，该5’UTR包含驱动gapA基因表达的bla_rbs RBS(SEQ ID NO:33)和位于gapA基因下游的TgapA终止子(SEQ ID NO:48)，b)pBR322复制起点，c)表达重组酶的表达盒，其包含P_BAD启动子(SEQ ID NO:21)和5’UTR，该5’UTR包含位于最多两个感兴趣的基因或感兴趣的序列的两个多克隆位点上游的araB_rbs RBS(SEQ ID NO:35)和位于这些多克隆位点下游的三个pET-T7终止子(SEQ ID NO:44)。示例性unARMed质粒模板如图2B所示。

表6.表达重组蛋白质的ARMed和unARMed质粒。

含有质粒的表达盒自身可以是微生物发酵的所需产物，并且必须具有支持高拷贝数复制的复制起点以最大化质粒DNA(pDNA)产率。为证实使用gapA成瘾性作为质粒保留机制可以有效地产生此类高拷贝质粒，构建了含有pUC复制起点和能够合成dsRNA产物(GS1)的表达盒的若干质粒。

含有bla基因的ARMed模板质粒具有图4A所示质粒地图所示的结构，由两个转录盒组成，其中在每个盒中，待转录的感兴趣的序列的侧翼是5’端上的延长的T7启动子(SEQ IDNO:23)和ITS(SEQ ID NO:24)和3’端上的由PTH终止子(SEQ ID NO:47)和pET-T7终止子(SEQ ID NO:44)组成的Term18双终止子复合物(SEQ ID NO:37)。pUC复制起点位于有义盒的3’端和反义盒的5’端之间，并且由以下表达盒驱动bla基因的表达：该表达和包含Pbla启动子(SEQ ID NO:20)和5’UTR，该5’UTR包含位于bla基因上游的bla_rbs RBS(SEQ ID NO:33)及其下游的Tbla终止子。

UnARMed模板质粒具有如图4B所示的结构，类似于ARMed模板质粒，不同之处在于以大肠杆菌gapA基因代替bla基因。使用表7所述的各种启动子和RBS来改变gapA基因的表达水平。

表7.用于dsRNA生产的ARMed和unARMed模板质粒

实施例2：开发基于gapA的质粒成瘾系统

使用λred重组将内源性gapA基因从大肠杆菌细胞(GL17-086，BL21(DE3)衍生株，其中删除了内源性tolC基因)。内源gapA基因被替换为tolC基因标记，其可以通过在50mg/L十二烷基硫酸钠(SDS)存在下生长来选择。获得所需的ΔgapA::tolC替换的细胞通过PCR扩增和对应的基因组基因座测序来验证。

被验证含有ΔgapA::tolC染色体修饰的分离的单一大肠杆菌群落被保存为菌株GL18-134(表8)，并且表征其在含有葡萄糖作为唯一碳源的成分确定的基本培养基(Korz液体培养基)、Luria液体培养基(LB)培养基以及含有1g/L酪蛋白氨基酸、25mM和琥珀酸盐和12.5mM甘油的sM63成分确定的培养基(参见，Pardee等人，1959，J.Mol.Biol.1:165-178)中生长的能力。为进行比较，将作为GL18-134的gapA⁺副本的菌株GL17-086(亲代大肠杆菌菌株)也在Korz液体培养基和LB培养基中生长作为阳性对照(图5A-5B)。

表8.实施例2中所述的菌株

将GL18-134(ΔgapA，即，gapA缺陷型)和GL17-086(gapA⁺)菌株分别在sM63和Korz基本培养基中于37℃在250rpm摇动下生长过夜。第二天，将各自含有10mL LB或Korz或sM63培养基的三组摇瓶用100μL GL18-134或GL17-086过夜培养物接种，随后于37℃在250rpm摇动下温育。定期采样进行OD₆₀₀测量。

图5A-5B示出了GL18-134(ΔgapA)和GL17-086(gapA⁺)在Korz、LB或sM63培养基中的生长。GL18-134不能在Korz或LB(图5A)中生长，因为这些培养基含有分别需要糖酵解或糖原异生的碳源来合成细菌细胞保持存活所必需的所有基本构成要素。然而，在sM63中观察到生长，因为该培养基提供了在糖酵解途径中gapA的任一侧产生碳通量的碳源(甘油和琥珀酸)。相反，如揭示的，GL17-086(gapA⁺)能够在接种后4-6小时之后在Korz和LB中生长(图5B)至600nm下光学密度(OD₆₀₀)介于2.0-4.0之间。

将表达gapA的质粒导入ΔgapA大肠杆菌菌株(GL18-135)允许恢复生长(图5B-5C)。具体而言，用命名为pGLX010的pET衍生质粒转化ΔgapA大肠杆菌使得到的转化物(菌株GL18-135，实心圆)在LB和Korz培养基二者中均能生长，其中该pET衍生质粒携带大肠杆菌gapA基因，该基因的天然5’UTR(gapA_rbs，SEQ ID NO:34)和终止子(TgapA，SEQ ID NO:48)被克隆以允许表达受组成型bla启动子驱动的gapA的表达。另外地，GL18-135在用L-阿拉伯糖诱导时表达来自P_BAD启动子的重组蛋白(嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)CMP激酶)。GL17-277是一种携带bla表达质粒pGLA680的GL17-086转化物，其作为对照生长以供在50mg/L羧苄青霉素存在下在Korz和LB培养基二者中进行比较。

如表9所示，菌株GL17-277和GL18-135倍增时间的比较表明，使用gapA成瘾性维持质粒导致生长动力学类似于使用bla抗性标记和羧苄青霉素进行质粒维持的生长动力学。GL18-134是没有质粒的gapA缺陷型菌株，仅能在sM63成分确定的培养基中生长，其倍增时间比菌株在具有gapA质粒拯救(GL18-135)的Korz基本培养基中生长时长几乎80％，因此验证了用gapA表达质粒补充ΔgapA表型的有效性。

表9.gapA成瘾质粒菌株和使用抗生素(羧苄青霉素)抗性进行质粒选择的菌株在于37℃和250rpm摇动下温育的摇瓶培养物中的生长参数。

*ND，未确定

实施例3：使用基于gapA的质粒成瘾系统在流加培养发酵中生产重组蛋白

如实施例2中开发的GL18-135(ΔgapA；gapA质粒成瘾)和GL17-277(gapA⁺，羧苄青霉素抗性)菌株用于研究重组蛋白表达。具体而言，GL18-135和GL17-277用于在发酵中分别从基于gapA的选择质粒和基于氨苄青霉素抗性的选择质粒表达嗜热栖热菌(Thermusthermophilus)CMP激酶(CmpK)。发酵的种子培养包括两次预培养。在第一预培养阶段，将在培养瓶中的25mL Luria液体培养基(LB)培养基用0.625mL(2.5％v/v接种物)的冷冻细胞(光学密度(OD₆₀₀)约为1的冷冻储料)接种并且在旋转摇床中在37℃和300rpm下温育。在细胞达到2的OD₆₀₀之后，将2.5mL的这种培养物(2.5％v/v接种物)转移到第二培养阶段烧瓶中，其中含有97.5mL成分确定的培养基(Korz培养基)，含有25g/L葡萄糖作为碳源。将第二预培养烧瓶在旋转摇床中在37℃和300rpm下温育。当细胞达到3的OD₆₀₀时，将80mL的这种培养物转移到2.4L标称容量(NV)的生物反应器中，其中含有720mL成分确定的培养基(10％v/v接种物)，含有25g/L葡萄糖作为碳源。将羧苄青霉素添加到所有菌株GL17-277的培养物中，在发酵培养基中的浓度为50mg/L，以维持生长期间的抗生素选择压力。在葡萄糖作为单独碳源存在下的生长用作ΔgapA GL18-135菌株中携带质粒的细胞的选择。

发酵过程由分批阶段和随后的流加发酵阶段组成。这两个阶段均控制在以下条件：pH 7.05，空气流的每体积培养基的空气体积(VVM)为1，溶解氧等于或高于30％，温度为37℃。仅用30％(v/v)氢氧化铵作为碱控制pH，不进行酸控制。使用搅拌并且在需要时补氧来维持溶解氧≥30％。在分批阶段结束时，在连续基础上开始葡萄糖进料，以线性模式逐渐增加进料速率。一旦培养物的OD₆₀₀达到75，以恒定速率供应L-阿拉伯糖直到发酵结束，以表达CMP激酶。在含有盐(比如磷酸盐和硫酸盐等)、微量金属(比如镁、铁、钙、猛和锌等)和维生素(比如硫胺素等)的成分确定的培养基(Korz培养基)中进行发酵。

如图6A-6C所示，GL18-135菌株(ΔgapA，嗜含gapA的质粒pGLX010)产生的CMP激酶的水平与GL17-277菌株(gapA⁺，羧苄青霉素抗性)所产生的酶的水平相当。例如，GL18-135菌株产生了约20g/L的CMP激酶和约70g/L的干细胞重量(DCW)。定期收集样品以测量光密度和酶表达。通过使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳从总表达蛋白中分离酶并用His标签凝胶内染色剂选择性染色以定量测定His标记的酶的表达。使用ImageJ软件定量比较样品和在相同凝胶上运行的纯化酶标准品之间的酶染色带强度。

实施例4：使用基于gapA的质粒成瘾系统以分批发酵在摇瓶中生产重组蛋白质

类似地，使用实施例3所述的用于表达CMP激酶的gapA成瘾策略来维持质粒工程化以在表达其他重组蛋白质，比如ΔgapA菌株中的GMP激酶、NDP激酶、PP激酶、UMP激酶和T7RNA聚合酶等。如图6B所示，ΔgapA菌株在摇瓶中产生的重组蛋白质的水平与携带具有羧苄青霉素抗性标记的质粒并且在用50mg/L羧苄青霉素补充的培养基中生长的gapA⁺菌株中产生的重组蛋白质水平相当。用于此研究的ARMed和unARMed菌株如表10所述。

表10.实施例3-4中所述的菌株

实施例5：使用基于gapA的质粒成瘾系统生产质粒DNA

经由发酵以高产率和高滴度生产作为所需产物的质粒DNA需要高拷贝质粒在微生物宿主中的稳定维持和繁殖。使用gapA成瘾质粒系统在大肠杆菌中维持具有pUC复制起点的高拷贝质粒与使用采用bla抗生素抗性标记来维持质粒的类似的高拷贝pUC质粒的维持相当。pUC复制起点允许质粒拷贝数的温度诱导型扩增。

测试了不同组合的不同启动子以评估它们驱动gapA标记在基于gapA成瘾性的质粒中表达的能力，从而获得与携带从组成型P_bla启动子和bla基因的天然RBS(ARMed对照质粒)表达的质粒相当或者更好的质粒产率(图7C)。GL18-140(具有内源性gapA并且endA和recA基因被删除的大肠杆菌菌株)用作用于转化携带gapA标记的质粒的背景菌株。GL17-294(内源性endA和recA基因被删除的gapA⁺菌株)用作用于转化具有bla抗性标记的质粒DNA的背景菌株。除gapA或bla标记之外，本实施例中的每个质粒还携带两个表达盒，这些表达盒将分别允许表达dsRNA产物的有义链和反义链。

对于每个菌株，根据在摇瓶(摇瓶实验)中或2L流加发酵(流加发酵实验)中生长之后收获的生物质来测量质粒产率(克pDNA/克生物质)和/或滴度(g/LpDNA)。对于摇瓶实验，每个菌株的接种物最初在25mL Luria液体培养基(LB)培养基中在培养瓶中生长，其已经接种了0.625mL(2.5％v/v接种物)冷冻细胞(光学密度(OD₆₀₀)约为1的冷冻储料)并且在旋转摇床中在30℃和300rpm下温育。在第一预培养阶段的细胞达到OD₆₀₀为2之后，将2.5mL(2.5％v/v接种物)的这些细胞转移到实验阶段摇瓶中，其中含有97.5mL成分确定的培养基(Korz培养基)。将实验阶段的摇瓶在在旋转摇床中在升高温度(介于37℃和45℃之间)和300rpm下温育9h，以便能够增加pDNA复制。羧苄青霉素(培养基中的最终浓度为50mg/L)用于维持ARMed菌株(GL18-020)的选择压力，同时在成分确定的培养基中的生长用作unARMed菌株的自然显式选择。在实验结束时，从每个摇瓶收获细胞培养物液体培养基，并且最初稀释到2OD(0.84g DCW/L)。然后，使用QIAprep Spin mini prep Kit high yield方案进行pDNA提取和纯化。使用Quant-iT^TM PicoGreen^TM试剂盒量化pDNA浓度。

对于流加实验，发酵过程由最初的分批阶段和随后的流加发酵阶段组成。将两个阶段均控制在pH 7.05，溶解氧等于或高于30％，并且温度为30℃，直到诱导。pH用30％(v/v)氢氧化铵控制，使用搅拌并且在需要时补样来维持溶解氧。在分批阶段结束时，在连续基础上开始葡萄糖进料，以线性模式逐渐增加进料速率。该发酵采用基于温度的诱导系统以便在培养物的OD₆₀₀达到60之后触发质粒DNA模板的拷贝数增加。在此诱导期期间，升高温度(介于37℃和45℃之间)以进行拷贝数扩增。在含有盐(比如磷酸盐和硫酸盐等)、微量金属(比如镁、铁、钙、猛和锌等)和维生素(比如硫胺素等)的成分确定的培养基(Korz培养基)中进行发酵。

对于流加发酵，相对于ARMed GL18-020菌株作为对照，从携带具有驱动gapA表达的不同启动子-RBS组合的质粒的菌株产生的质粒DNA的滴度(g/L)或产率(g-pDNA/g-DCW生物质)，在图7A-7C和表11中提供。

表11.质粒DNA滴度

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实施例6：采用基于tolC的选择来构建ARMed质粒或unARMed质粒

构建了一组利用基于tolC的成瘾性使质粒保留在细菌宿主中的质粒，以证明这种unARMed质粒可用于实现与利用传统抗生素抗性标记(ARMed质粒)进行选择的质粒相当的重组蛋白过表达水平。另外地，构建了第二组利用基于tolC的成瘾性使颗粒保留的质粒，以证明此类unARMed质粒可用于获得与利用大肠杆菌发酵的ARMed质粒获得的模板质粒DNA相当的模板质粒DNA产率。下文给出了这两组质粒的构建细节。另外地，构建ARMed质粒用作对照。

表12中所述的ARMed表达质粒包含：a)在Pbla启动子(SEQ ID NO:20)和5’UTR的转录和翻译控制下用于表达作为羧苄青霉素抗性标记的bla基因(编码β-内酰胺酶)的表达盒，该5’UTR分别包含bla_rbs RBS(SEQ ID NO:33)和位于bla基因下游的Tbla终止子(Tbla，SEQ ID NO:49),b)pBR 322复制起点，和c)用于表达重组蛋白的表达盒，其包含P_BAD启动子(SEQ ID NO:21)和5’UTR，该5’UTR包含位于最多两个感兴趣的基因或感兴趣的序列的两个多克隆位点上游的araB_rbs RBS(SEQ ID NO:35)和位于这些多克隆位点的下游的单个pET-T7终止子(SEQ ID NO:44)。示例性ARMed质粒模板如图9A所示。

基于tolC质粒成瘾系统的unARMed质粒包含：a)用于作为无抗生素标记的大肠杆菌tolC基因的表达盒，其包含天然tolC启动子(P_tolC，SEQ ID NO:24)和5’UTR，该5’UTR包含驱动tolC基因表达的tolC RBS(SEQ ID NO:34)和位于tolC基因下游的TtolC终止子(SEQID NO:48)，b)pBR322复制起点，c)表达重组酶的表达盒，其包含P_BAD启动子(SEQ ID NO:21)和5’UTR，该5’UTR包含位于最多两个感兴趣的基因或感兴趣的序列的两个多克隆位点上游的araB_rbs RBS(SEQ ID NO:35)和位于这些多克隆位点下游的单个pET-T7终止子(SEQ IDNO:44)。示例性unARMed质粒模板如图9B所示。

表12.表达重组蛋白质的ARMed和unARMed质粒。

含有质粒的表达盒自身可以是微生物发酵的所需产物，并且必须具有支持高拷贝数复制的复制起点以最大化质粒DNA(pDNA)产率。为验证可以使用tolC成瘾性作为质粒保留机制来有效地产生此类高拷贝质粒，构建了含有pUC复制起点和能够合成dsRNA产物(GS1)的转录盒的若干质粒。

含有bla基因的ARMed模板质粒具有图10A所示质粒地图所示的结构10A，由两个转录盒组成，其中在每个转录盒中，待转录的感兴趣的序列的侧翼是5’端上的延长的T7启动子(SEQ ID NO:23)和ITS(SEQ ID NO:24)以及3’端上的由PTH(SEQ ID NO:47)和pET-T7(SEQ ID NO:44)终止子组成的Term 18双终止子复合物(SEQ ID NO:37)。pUC复制起点位于有义盒的3’端和反义盒的5’端之间，并且由以下表达盒驱动bla基因的表达：该表达和包含Pbla启动子(SEQ ID NO:20)和5’UTR，该5’UTR包含位于bla基因上游的bla_rbs RBS(SEQ IDNO:33)及其下游的Tbla终止子。

UnARMed模板质粒具有如图10B所示的结构，类似于ARMed模板质粒，不同之处在于用大肠杆菌tolC基因代替bla基因。使用表13中所述的各种启动子和RBS来改变tolC基因的表达水平。

表13.用于dsRNA生产的ARMed和unARMed模板质粒

实施例7：开发基于tolC的质粒成瘾系统

使用λred重组从大肠杆菌细胞(33B03，其内源性tolC基因已被删除的BL21(DE3)衍生菌株)的染色体中去除内源性tolC基因。将内源性tolC基因替换为可以通过在十二烷基硫酸钠(SDS)存在下生长来选择的tolC基因标记，以制备菌株GL18-172。通过PCR扩增和对应的基因组基因座测序来验证获得所需ΔtolC::tolC替换的细胞。

被验证含有ΔtolC::tolC染色体修饰的分离的单一大肠杆菌群落被保存为菌株GL18-172(表14)，并且表征其在含有50mg/mL SDS的Luria液体培养基(LB)培养基中生长的能力。为进行比较，也在包含0或50mg/mL SDS的LB培养基中生长表14中所述的菌株(图11)。

表14.实施例7中所述的菌株

33B03(ΔtolC，即，tolC缺陷型)、GL17-086(内源性tolC⁺)、GL17-277(用bla⁺质粒补充的内源性tolC⁺，ARMed，即，羧苄青霉素抗性)和GL18-172(用tolC⁺质粒补充的ΔtolC，unARMed)菌株单独在LB培养基中于37℃在250rpm摇动下生长过夜。

第二天，将含有10mL LB培养基的六个摇瓶如下接种：(1)100μL Gl17-086的过夜培养物(无SDS)；(2)100μL GL17-086的过夜培养物，存在50mg/LSDS；(3)100μL的GL17-277的过夜培养物，存在羧苄青霉素(无SDS)；(4)100μL 33B03的过夜培养物(无SDS)；(5)100μL33B03的过夜培养物，存在50mg/L SDS；和(6)100μL GL18-172的过夜培养物，存在50mg/LSDS。随后将摇瓶于37℃在250rpm摇动下温育。定期采样进行OD₆₀₀测量。

图11表明，六种摇瓶培养物中的每一个均生长超过6.5小时的时间。GL17-086(内源性tolC⁺)在(1)，即，不存在SDS；和(2)，即，存在50mg/L SDS两种情况下均生长。GL17-277在(3)，即，存在羧苄青霉素且无SDS的情况下茁壮生长。菌株33B03(ΔtolC)在(4)，即，不存在SDS的情况下生长。菌株33B03(ΔtolC)不能在(5)，即，存在50mg/L SDS的情况下生长，证明去除内源性tolC会显著降低大肠杆菌在50mg/L SDS存在下生长的能力。然而，将包含外源性tolC的质粒导入ΔtolC菌株(UnARMed GL18-172)能够挽救大肠杆菌在(6)，即，存在50mg/L SDS的情况下的生长。

这些数据证明，携带tolC的质粒能成功地挽救tolC缺陷型细菌细胞在包含表面活性剂如SDS等的培养基中的生长。

实施例8：使用基于tolC的质粒成瘾系统生产质粒DNA

经由发酵以高产率和高滴度生产作为所需产物的质粒DNA需要高拷贝质粒在微生物宿主中的稳定维持和繁殖。使用tolC质粒成瘾系统在大肠杆菌中维持具有pUC复制起点的高拷贝质粒提供了与使用采用bla抗生素抗性标记来维持质粒的类似的高拷贝pUC质粒相当的产率。pUC复制起点允许质粒拷贝数的温度诱导型扩增。

测试了不同组合的不同启动子以评估它们驱动tolC基因在基于tolC成瘾性的质粒中表达的能力，从而获得与携带从组成型P_bla启动子和bla基因的天然RBS(ARMed对照质粒)表达的质粒相当的质粒产率。具有内源性tolC并且endA和recA基因被删除的大肠杆菌菌株用作用于转化携带tolC标记的质粒的背景菌株。除tolC或bla标记之外，本实施例中的每个质粒还携带两个表达盒，这些表达盒将分别允许表达dsRNA产物(GS1)的有义链和反义链。

对于每个菌株，根据在摇瓶(摇瓶实验)中或2L流加发酵(流加发酵实验)中生长之后收获的生物质来测量质粒产率(克pDNA/克生物质)和/或滴度(g/LpDNA)。对于摇瓶实验，每个菌株的接种物最初在25mL Luria液体培养基(LB)培养基中在培养瓶中生长，其已经接种了0.625mL(2.5％v/v接种物)冷冻细胞(光学密度(OD₆₀₀)约为1的冷冻储料)并且在旋转摇床中在30℃和300rpm下温育。在第一预培养阶段的细胞达到OD₆₀₀为2之后，将2.5mL(2.5％v/v接种物)的这些细胞转移到实验阶段摇瓶中，其中含有97.5mL成分确定的培养，该培养基含有25g/L甘油作为碳源。将实验阶段的摇瓶在在旋转摇床中在升高温度(介于37℃和45℃之间)和300rpm下温育9h，以便能够增加pDNA复制。羧苄青霉素(培养基中的最终浓度为50mg/L)用于维持ARMed菌株(GL18-020)的选择压力，同时在成分确定的培养基中添加用作unARMed菌株选择的50mg/L十二烷基硫酸钠(SDS)。在实验结束时，从每个摇瓶收获细胞培养物液体培养基，并且最初稀释到2OD(0.84g DCW/L)。然后，使用QIAprep Spinmini prep Kit high yield方案进行pDNA提取和纯化。使用Quant-iT^TPicoGreen^TM试剂盒量化pDNA浓度。

tolC质粒成瘾UnARMed菌株产生的质粒DNA的产率在图12和表15中提供。

表15.质粒DNA滴度(克/升)。

本文公开的所有参考文献、专利和专利申请都通过引用的方式结合到本文中，在某些情况下，它们可以包含整个文献。

除非明确表示相反，否则本文所用的不定冠词“一个/一种(a/an)在说明书中和在权利要求书中均应理解为表示“至少一个/一种”。

除非明确表示相反，否则还应理解，在本文要求保护的任何包含一个以上步骤或行为的方法中，该方法的步骤或行为不必限制于所阐述的方法的步骤或行为的顺序。

在权利要求以及上面的说明书中，所有过渡短语，例如“包括/包含(comprising)”、“包含、含有(including)”、“携带(carrying)”、“具有(having)”、“包含/含有(containing)”、“涉及(involving)”、“保持(holding)”、“由……组成(consisitingof)”等，都应理解为开放式的，即，意味着包括但不限于。仅有过渡短语“由……组成(consisting of)”和“基本由……组成(consisting essentially of)”应分别为封闭式或半封闭式的，如同美国专利局专利审查程序手册(the United States Patent OfficeManual of Patent Examining Procedures)第2111.03节中阐述的那样。

术语“约”和“基本上”在数值前面表示所述数值±10％。

当提供数值范围时，该范围上下限之间的每个值都被在本文中具体设想和描述。

序列表

<110> 绿光生物科技股份有限公司

<120> 质粒成瘾系统

<130> G0830.70038WO00

<140> 尚未分配

<141> 于此一同

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<150> US 63/069,620

<151> 2020-08-24

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<170> PatentIn version 3.5

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<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 33

gataaatgct tcaatcatga ttgaaaaagg aagagt 36

<210> 34

<211> 36

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 34

aaccttttat tcactaacaa atagctggtg gaatat 36

<210> 35

<211> 45

<212> DNA

<213> 大肠杆菌

<400> 35

acccgttttt ttggcttttg tgtaactgta agaaggagat atcat 45

<210> 36

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 36

aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt g 41

<210> 37

<211> 106

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 37

catctgtttt cttgcaagat cagctgagca ataactagca taaccccttg gggcctctaa 60

acgggtcttg aggggttttt tgctgaaagg aggaactata tccgga 106

<210> 38

<211> 295

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 38

cctagcataa ccccgcgggg cctcttcggg ggtctcgcgg ggttttttgc tgaaagaagc 60

ttcaaataaa acgaaaggct cagtcgaaag actgggcctt tcgttttatc tgttgtttgt 120

cgctgcggcc gcactcgagc accaccacca ccaccactga gatccggctg ctaacaaagc 180

ccgaaaggaa gctgagttgg ctgctgccac cgctgagcaa taactagcat aaccccttgg 240

ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt gctgaaagga ggaactatat ccgga 295

<210> 39

<211> 297

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 39

cctagcataa accccttggg ttccctcttt aggagtctga ggggtttttt gctgaaagaa 60

gcttcaaata aaacgaaagg ctcagtcgaa agactgggcc tttcgtttta tctgttgttt 120

gtcgctgcgg ccgcactcga gcaccaccac caccaccatt gagatccggc tgctaacaaa 180

gcccgaaagg aagctgagtt ggctgctgcc accgctgagc aataactagc ataacccctt 240

ggggcctcta aacgggtctt gaggggtttt ttgctgaaag gaggaactat atccgga 297

<210> 40

<211> 185

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 40

aagcttgctt aagcagaagg ccatcctgac ggatggcctt tttgcgtttc tacctagcat 60

aaccccttgg ggcctctaaa cgggtcttga ggggtttttt ggccatctgt tttcttgcaa 120

gatcagctga gcaataacta gcataacccc ttggggcctc taaacgggtc ttgaggggtt 180

ttttg 185

<210> 41

<211> 69

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 41

tcaaataaaa cgaaaggctc agtcgaaaga ctgggccttt cgttttatct gttgtttgtc 60

gctgcggcc 69

<210> 42

<211> 45

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 42

ttaagcagaa ggccatcctg acggatggcc tttttgcgtt tctac 45

<210> 43

<211> 48

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 43

ctagcataac cccttggggc ctctaaacgg gtcttgaggg gttttttg 48

<210> 44

<211> 84

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 44

gctgagcaat aactagcata accccttggg gcctctaaac gggtcttgag gggttttttg 60

ctgaaaggag gaactatatc cgga 84

<210> 45

<211> 61

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 45

cctagcataa ccccgcgggg cctcttcggg ggtctcgcgg ggttttttgc tgaaagaagc 60

t 61

<210> 46

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 46

cctagcataa accccttggg ttccctcttt aggagtctga ggggtttttt gctgaaagaa 60

gct 63

<210> 47

<211> 10

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 47

catctgtttt 10

<210> 48

<211> 50

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 48

tgtgatctaa aaagagcgac ttcggtcgct ctttttttta cctgataaaa 50

<210> 49

<211> 99

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 49

ctgtcagacc aagtttactc atatatactt tagattgatt taaaacttca tttttaattt 60

aaaaggatct aggtgaagat cctttttgat aatctcatg 99

<210> 50

<211> 331

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 50

Met Thr Ile Lys Val Gly Ile Asn Gly Phe Gly Arg Ile Gly Arg Ile

1 5 10 15

Val Phe Arg Ala Ala Gln Lys Arg Ser Asp Ile Glu Ile Val Ala Ile

20 25 30

Asn Asp Leu Leu Asp Ala Asp Tyr Met Ala Tyr Met Leu Lys Tyr Asp

35 40 45

Ser Thr His Gly Arg Phe Asp Gly Thr Val Glu Val Lys Asp Gly His

50 55 60

Leu Ile Val Asn Gly Lys Lys Ile Arg Val Thr Ala Glu Arg Asp Pro

65 70 75 80

Ala Asn Leu Lys Trp Asp Glu Val Gly Val Asp Val Val Ala Glu Ala

85 90 95

Thr Gly Leu Phe Leu Thr Asp Glu Thr Ala Arg Lys His Ile Thr Ala

100 105 110

Gly Ala Lys Lys Val Val Met Thr Gly Pro Ser Lys Asp Asn Thr Pro

115 120 125

Met Phe Val Lys Gly Ala Asn Phe Asp Lys Tyr Ala Gly Gln Asp Ile

130 135 140

Val Ser Asn Ala Ser Cys Thr Thr Asn Cys Leu Ala Pro Leu Ala Lys

145 150 155 160

Val Ile Asn Asp Asn Phe Gly Ile Ile Glu Gly Leu Met Thr Thr Val

165 170 175

His Ala Thr Thr Ala Thr Gln Lys Thr Val Asp Gly Pro Ser His Lys

180 185 190

Asp Trp Arg Gly Gly Arg Gly Ala Ser Gln Asn Ile Ile Pro Ser Ser

195 200 205

Thr Gly Ala Ala Lys Ala Val Gly Lys Val Leu Pro Glu Leu Asn Gly

210 215 220

Lys Leu Thr Gly Met Ala Phe Arg Val Pro Thr Pro Asn Val Ser Val

225 230 235 240

Val Asp Leu Thr Val Arg Leu Glu Lys Ala Ala Thr Tyr Glu Gln Ile

245 250 255

Lys Ala Ala Val Lys Ala Ala Ala Glu Gly Glu Met Lys Gly Val Leu

260 265 270

Gly Tyr Thr Glu Asp Asp Val Val Ser Thr Asp Phe Asn Gly Glu Val

275 280 285

Cys Thr Ser Val Phe Asp Ala Lys Ala Gly Ile Ala Leu Asn Asp Asn

290 295 300

Phe Val Lys Leu Val Ser Trp Tyr Asp Asn Glu Thr Gly Tyr Ser Asn

305 310 315 320

Lys Val Leu Asp Leu Ile Ala His Ile Ser Lys

325 330

<210> 51

<211> 506

<212> PRT

<213> 大肠杆菌

<400> 51

Met Ile Ala Leu Asn Thr Ala Ser Pro Gln Gly Met Gln Met Lys Lys

1 5 10 15

Leu Leu Pro Ile Leu Ile Gly Leu Ser Leu Ser Gly Phe Ser Ser Leu

20 25 30

Ser Gln Ala Glu Asn Leu Met Gln Val Tyr Gln Gln Ala Arg Leu Ser

35 40 45

Asn Pro Glu Leu Arg Lys Ser Ala Ala Asp Arg Asp Ala Ala Phe Glu

50 55 60

Lys Ile Asn Glu Ala Arg Ser Pro Leu Leu Pro Gln Leu Gly Leu Gly

65 70 75 80

Ala Asp Tyr Thr Tyr Ser Asn Gly Tyr Arg Asp Ala Asn Gly Ile Asn

85 90 95

Ser Asn Ala Thr Ser Ala Ser Leu Gln Leu Thr Gln Ser Ile Phe Asp

100 105 110

Met Ser Lys Trp Arg Ala Leu Thr Leu Gln Glu Lys Ala Ala Gly Ile

115 120 125

Gln Asp Val Thr Tyr Gln Thr Asp Gln Gln Thr Leu Ile Leu Asn Thr

130 135 140

Ala Thr Ala Tyr Phe Asn Val Leu Asn Ala Ile Asp Val Leu Ser Tyr

145 150 155 160

Thr Gln Ala Gln Lys Glu Ala Ile Tyr Arg Gln Leu Asp Gln Thr Thr

165 170 175

Gln Arg Phe Asn Val Gly Leu Val Ala Ile Thr Asp Val Gln Asn Ala

180 185 190

Arg Ala Gln Tyr Asp Thr Val Leu Ala Asn Glu Val Thr Ala Arg Asn

195 200 205

Asn Leu Asp Asn Ala Val Glu Gln Leu Arg Gln Ile Thr Gly Asn Tyr

210 215 220

Tyr Pro Glu Leu Ala Ala Leu Asn Val Glu Asn Phe Lys Thr Asp Lys

225 230 235 240

Pro Gln Pro Val Asn Ala Leu Leu Lys Glu Ala Glu Lys Arg Asn Leu

245 250 255

Ser Leu Leu Gln Ala Arg Leu Ser Gln Asp Leu Ala Arg Glu Gln Ile

260 265 270

Arg Gln Ala Gln Asp Gly His Leu Pro Thr Leu Asp Leu Thr Ala Ser

275 280 285

Thr Gly Ile Ser Asp Thr Ser Tyr Ser Gly Ser Lys Thr Arg Gly Ala

290 295 300

Ala Gly Thr Gln Tyr Asp Asp Ser Asn Met Gly Gln Asn Lys Val Gly

305 310 315 320

Leu Ser Phe Ser Leu Pro Ile Tyr Gln Gly Gly Met Val Asn Ser Gln

325 330 335

Val Lys Gln Ala Gln Tyr Asn Phe Val Gly Ala Ser Glu Gln Leu Glu

340 345 350

Ser Ala His Arg Ser Val Val Gln Thr Val Arg Ser Ser Phe Asn Asn

355 360 365

Ile Asn Ala Ser Ile Ser Ser Ile Asn Ala Tyr Lys Gln Ala Val Val

370 375 380

Ser Ala Gln Ser Ser Leu Asp Ala Met Glu Ala Gly Tyr Ser Val Gly

385 390 395 400

Thr Arg Thr Ile Val Asp Val Leu Asp Ala Thr Thr Thr Leu Tyr Asn

405 410 415

Ala Lys Gln Glu Leu Ala Asn Ala Arg Tyr Asn Tyr Leu Ile Asn Gln

420 425 430

Leu Asn Ile Lys Ser Ala Leu Gly Thr Leu Asn Glu Gln Asp Leu Leu

435 440 445

Ala Leu Asn Asn Ala Leu Ser Lys Pro Val Ser Thr Asn Pro Glu Asn

450 455 460

Val Ala Pro Gln Thr Pro Glu Gln Asn Ala Ile Ala Asp Gly Tyr Ala

465 470 475 480

Pro Asp Ser Pro Ala Pro Val Val Gln Gln Thr Ser Ala Arg Thr Thr

485 490 495

Thr Ser Asn Gly His Asn Pro Phe Arg Asn

500 505

<210> 52

<211> 60

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 52

ggcacgtaac gccaaccttt tgcggtagcg gcttctgcta gaatccgcaa taattttaca 60

<210> 53

<211> 35

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 53

gtttgatcgc gctaaatact gcttcaccac aagga 35

<210> 54

<211> 110

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 54

ctagaggcat caaataaaac gaaaggctca gtcgaaagac tgggcctttc gttttatctg 60

ttgtttgtcg gtgaacgctc tcctgagtag gacaaatccg ccgccctaga 110

<210> 55

<211> 10

<212> RNA

<213> 未知

<220>

<223> 真核

<400> 55

gccaccaugg 10

<210> 56

<211> 97

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 56

cctatttgtt tatttttcta aatacattca aatatgtatc cgctcatgag acaataaccc 60

tgataaatgc ttcaatcatg attgaaaaag gaagagt 97

<210> 57

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 57

tttacagcta gctcagtcct agggactgtg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 58

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 58

ctgatggcta gctcagtcct agggattatg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 59

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 59

tttatggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 60

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 60

ttgacagcta gctcagtcct agggattgtg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 61

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 61

tttatagcta gctcagccct tggtacaatg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 62

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 62

tttacggcta gctcagtcct aggtacaatg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 63

<211> 71

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 63

ctgacagcta gctcagtcct aggtataatg ctagcaacct tttattcact aacaaatagc 60

tggtggaata t 71

<210> 64

<211> 59

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成

<400> 64

tttacggcta gctcagccct aggtattatg ctagcatgga tcacacagga aaggcccat 59

Claims

1.微生物细胞，其缺乏编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达或具有降低的编码糖酵解酶的内源糖酵解基因的表达，其中所述微生物细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码重组糖酵解酶的表达盒，并且其中所述微生物细胞可以在成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。

2.权利要求1的微生物细胞，其中所述微生物细胞在没有所述核酸构建体的情况下不能在所述成分确定的培养基和/或所述复合培养基中生长。

3.权利要求1或2的微生物细胞，其中所述重组糖酵解酶具有与所述内源糖酵解基因相同的酶活性。

4.权利要求1-3中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞的染色体DNA包含降低所述糖酵解酶表达的对所述内源基因或控制所述内源基因表达的元件的遗传修饰，任选地其中所述遗传修饰是突变、插入或缺失。

6.权利要求1-5中任一项的微生物细胞，其中所述内源糖酵解基因编码己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶。

7.权利要求1-6中任一项的微生物细胞，其中所述重组糖酵解酶是己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶。

8.权利要求1-7中任一项的微生物细胞，其中所述内源糖酵解基因编码具有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的糖酵解酶，并且其中所述重组糖酵解酶具有GAPDH活性。

9.权利要求1-8中任一项的微生物细胞，其中所述内源糖酵解基因编码甘油醛3-磷酸脱氢酶，并且其中所述重组糖酵解酶是甘油醛3-磷酸脱氢酶。

10.权利要求9的微生物细胞，其中所述甘油醛3-磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。

11.权利要求1-10中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是原核或真核细胞，任选地，其中所述微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞。

12.权利要求1-11中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是大肠杆菌(E.coli)、枯草芽孢杆菌(B.subtilis)、铜绿假单胞菌(P.aeruginosa)、金黄色葡萄球菌(S.aureus)、肺炎链球菌(S.pneumoniae)、结核分枝杆菌(M.tuberculosis)、麻风分枝杆菌(M.leprae)、耻垢分枝杆菌(M.smegmatis)、酿酒酵母(S.cerevisiae)、解脂耶氏酵母(Y.lipolytica)、毕赤酵母(P.pastoris)或里氏木霉(T.reesie)细胞。

13.权利要求1-12中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是大肠杆菌细胞，所述内源糖酵解基因是gapA，并且所述重组糖酵解酶是甘油醛3-磷酸脱氢酶。

14.权利要求1-13中任一项的微生物细胞，其中所述复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、具有分解代谢物抑制的超优液体培养基(SOC培养基)或其任何衍生物。

15.权利要求1-14中任一项的微生物细胞，其中所述成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基或其任何衍生物。

19.权利要求1-18中任一项的微生物细胞，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒包含可操作地连接至所述重组糖酵解酶的编码序列的启动子。

20.权利要求19的微生物细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。

21.权利要求19的微生物细胞，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。

22.权利要求19的微生物细胞，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含在所述重组糖酵解酶的编码序列上游的初始转录序列(ITS)。

24.权利要求22的微生物细胞，其中所述ITS由SEQ ID NO:24中所示的核酸序列组成。

25.权利要求19-24中任一项的微生物细胞，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含5’UTR，所述5’UTR包含位于所述重组糖酵解酶的编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和所述重组糖酵解酶的编码序列下游的一个或多个终止子。

26.权利要求25的微生物细胞，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列。

27.权利要求25的微生物细胞，其中所述RBS由SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列组成。

28.权利要求25-27中任一项的微生物细胞，其中所述一个或多个终止子包含SEQ IDNO:36-49中任一个所示的核酸序列。

29.权利要求25-27中任一项的微生物细胞，其中所述一个或多个终止子由SEQ ID NO:36-49中任一个所示的核酸序列组成。

30.权利要求1-29中任一项的微生物细胞，其中所述核酸构建体进一步包含含有感兴趣的序列的表达盒，其中所述感兴趣的序列编码RNA产物、肽产物或蛋白质产物。

32.权利要求30或31的微生物细胞，其中所述核酸构建体包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA的有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码所述双链RNA的反义链的第二感兴趣的序列。

33.权利要求30-32中任一项的微生物细胞，其中所述包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至所述感兴趣的序列的启动子。

34.权利要求33的微生物细胞，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。

35.权利要求33的微生物细胞，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。

36.权利要求30-35中任一项的微生物细胞，其中所述包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。

38.质粒成瘾系统，其包含：

(i)微生物细胞，其包含编码内源糖酵解酶的糖酵解基因的遗传修饰，其中所述遗传修饰降低或消除所述内源糖酵解酶的表达；和

(ii)质粒，其包含编码重组糖酵解酶的表达盒；

其中所述微生物细胞在不掺入所述质粒的情况下不能生长或繁殖。

39.权利要求38的质粒成瘾系统，其中所述遗传修饰包含所述糖酵解基因或所述糖酵解基因的控制元件内的突变、插入或缺失，任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。

40.权利要求38或39的质粒成瘾系统，其中所述重组糖酵解酶具有与所述内源糖酵解酶相同的酶活性。

41.权利要求38-40中任一项的质粒成瘾系统，其中如果将所述质粒掺入所述细胞中，则所述微生物细胞可以在成分确定的培养基和/或复合培养基中生长。

42.权利要求38-41中任一项的质粒成瘾系统，其中所述修饰的糖酵解基因编码己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶。

43.权利要求38-42中任一项的质粒成瘾系统，其中所述重组糖酵解酶是己糖激酶、葡萄糖磷酸异构酶、磷酸果糖激酶、醛缩酶、磷酸丙糖异构酶、磷酸甘油酸激酶、烯醇酶、丙酮酸激酶、磷酸烯醇丙酮酸羧化酶、丙酮酸羧化酶或甘油醛3-磷酸脱氢酶。

44.权利要求38-43中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的糖酵解基因编码具有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的糖酵解酶，并且其中所述重组糖酵解酶具有GAPDH活性。

45.权利要求38-44中任一项的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的糖酵解基因编码甘油醛3-磷酸脱氢酶，并且其中所述重组糖酵解酶是甘油醛3-磷酸脱氢酶。

46.权利要求45的质粒成瘾系统，其中所述甘油醛3-磷酸脱氢酶包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。

48.权利要求38-46中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、毕赤酵母或里氏木霉细胞。

49.权利要求38-48中任一项的质粒成瘾系统，其中所述微生物细胞是大肠杆菌细胞，失活的糖酵解基因是gapA，并且所述重组糖酵解酶是甘油醛3-磷酸脱氢酶。

50.权利要求41-49中任一项的质粒成瘾系统，其中所述复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、具有分解代谢物抑制的超优液体培养基(SOC培养基)或其任何衍生物。

51.权利要求41-50中任一项的质粒成瘾系统，其中所述成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基或其任何衍生物。

52.权利要求41-51中任一项的质粒成瘾系统，其中所述质粒包含复制子，所述复制子包含复制起点及其允许所述质粒在所述微生物细胞中复制的控制元件，任选地其中所述复制子是ColE1复制子，pUC复制子或衍生自ColE1、pUC、pBR322、R6K、p15a或pSC101复制子。

53.权利要求41-52中任一项的质粒成瘾系统，其中所述编码重组糖酵解酶的表达盒包含可操作地连接至所述重组糖酵解酶的编码序列的启动子。

54.权利要求53的质粒成瘾系统，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。

55.权利要求53的质粒成瘾系统，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。

56.权利要求53-55的质粒成瘾系统，其中编码所述重组糖酵解酶的表达盒进一步包含所述重组糖酵解酶的编码序列上游的初始转录序列(ITS)。

59.权利要求53-58中任一项的质粒成瘾系统，其中编码重组糖酵解酶的表达盒进一步包含5’UTR，所述5’UTR包含位于所述重组糖酵解酶的编码序列上游的核糖体结合位点(RBS)和所述重组糖酵解酶的编码序列下游的一个或多个终止子。

60.权利要求59的质粒成瘾系统，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列。

61.权利要求59的质粒成瘾系统，其中所述RBS由SEQ ID NO:25-35中任一个所示的核酸序列组成。

62.权利要求59-61中任一项的质粒成瘾系统，其中所述一个或多个终止子包含SEQ IDNO:36-49中任一项所示的核酸序列。

63.权利要求59-61中任一项的质粒成瘾系统，其中所述一个或多个终止子由SEQ IDNO:36-49中任一个所示的核酸序列组成。

66.权利要求64或65的质粒成瘾系统，其中所述质粒包含两个包含感兴趣的序列的表达盒，其中第一表达盒包含编码双链RNA的有义链的第一感兴趣的序列，并且其中第二表达盒包含编码双链RNA的反义链的第二感兴趣的序列。

67.权利要求64-66中任一项的质粒成瘾系统，其中所述包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含可操作地连接至所述感兴趣的序列的启动子。

68.权利要求67的质粒成瘾系统，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。

69.权利要求67的质粒成瘾系统，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。

70.权利要求64-69中任一项的质粒成瘾系统，其中所述包含感兴趣的序列的表达盒进一步包含选自由以下组成的组的一个或多个序列元件：启动子、初始转录序列、核糖体结合位点、限制性核酸内切酶位点和终止子。

73.核酸构建体，其包含表达盒，所述表达盒包含编码具有甘油醛3-磷酸脱氢酶(GAPDH)活性的酶的基因，和

(i)一个或多个多克隆位点，和/或

75.权利要求73或74的核酸构建体，其中所述编码具有GAPDH活性的酶的基因是微生物gapA基因。

76.权利要求73-75中任一项的核酸构建体，其中所述具有GAPDH活性的酶包含SEQ IDNO:50的氨基酸序列。

77.权利要求73-76中任一项的核酸构建体，其中所述核酸构建体包含第一感兴趣的序列和第二感兴趣的序列，任选地其中第一表达盒包含所述第一感兴趣的序列且第二表达盒包含所述第二感兴趣的序列。

79.权利要求73-78中任一项的核酸构建体，其中所述表达盒的任何一个进一步包含启动子和/或终止子。

80.权利要求79的核酸构建体，其中所述启动子包含SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列。

81.权利要求79的核酸构建体，其中所述启动子由SEQ ID NO:1-23中任一个所示的核酸序列组成。

86.权利要求85的核酸构建体，其中所述RBS包含SEQ ID NO:25-35中所示的核酸序列。

87.权利要求85的核酸构建体，其中所述RBS由SEQ ID NO:25-35中所示的核酸序列组成。

88.方法，其包括在不存在抗生素的情况下在足以产生核酸构建体的条件下培养权利要求1-37中任一项的微生物细胞。

91.方法，其包括在不存在抗生素的情况下在足以产生RNA产物、肽产物或蛋白质产物的条件下培养权利要求16-37中任一项的微生物细胞。

94.方法，其包括：

向微生物细胞递送包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因的载体，

其中所述微生物细胞包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的经遗传修饰的基因，任选地其中所述遗传修饰包含在编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的基因或所述基因的控制元件内的突变、插入或缺失，任选地其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。

95.权利要求94的方法，其进一步包括在成分确定的培养基或复合培养基中培养微生物细胞。

96.权利要求95的方法，其中所述复合培养基是Luria液体培养基(LB)、Terrific液体培养基、具有分解代谢物抑制的超优液体培养基(SOC培养基)或其任何衍生物。

97.权利要求95的方法，其中所述成分确定的培养基是Korz液体培养基、M9基本培养基或其任何衍生物。

98.试剂盒，其包含：

(i)权利要求73-87中任一项的核酸构建体；和

(ii)多个微生物细胞，所述微生物细胞包含编码甘油醛3-磷酸脱氢酶的经遗传修饰的基因，任选地，其中所述遗传修饰包含突变、插入或缺失。

99.试剂盒，其包含：

(i)包含编码重组糖酵解酶的表达盒的质粒；和

(ii)多个微生物细胞，所述微生物细胞包含编码糖酵解酶的基因的遗传修饰，任选地，其中所述遗传修饰包含所述糖酵解基因或所述糖酵解基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。

102.微生物细胞，其缺乏编码外膜流出蛋白的内源基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达，其中所述微生物细胞包含核酸构建体，所述核酸构建体包含编码重组外膜流出蛋白的表达盒和编码感兴趣的序列的表达盒，并且其中当所述微生物细胞在存在阈值水平的表面活性剂的情况下生长时表达所述感兴趣的序列

103.权利要求102的微生物细胞，其中所述重组外膜流出蛋白具有与所述编码外膜流出蛋白的内源基因相同的酶活性。

104.权利要求102或103的微生物细胞，其中所述微生物细胞的染色体DNA包含降低所述外膜流出蛋白表达的对所述内源基因或控制所述内源基因表达的元件的遗传修饰。

105.权利要求102-104中任一项的微生物细胞，其中所述内源基因编码tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

106.权利要求102-105中任一项的微生物细胞，其中所述外膜流出蛋白是tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

107.权利要求102-106中任一项的微生物细胞，其中所述内源基因编码tolC蛋白，并且其中所述重组外膜流出蛋白是重组tolC蛋白。

108.权利要求107的微生物细胞，其中所述重组tolC蛋白包含SEQ ID NO:50的氨基酸序列。

109.权利要求102-108中任一项的微生物细胞，其中所述微生物细胞是细菌细胞或酵母细胞，任选地，其中所述微生物细胞是大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌、肺炎链球菌、结核分枝杆菌、麻风分枝杆菌、耻垢分枝杆菌、酿酒酵母、解脂耶氏酵母、毕赤酵母或里氏木霉细胞。

110.权利要求102-109中任一项的微生物细胞，其中所述表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂的浓度，任选地其中所述对照微生物细胞缺乏编码外膜流出蛋白的内源基因的表达或具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。

111.权利要求102-110中任一项的微生物细胞，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷，辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。

112.质粒成瘾系统，其包含：

(i)微生物细胞，其包含编码外膜流出蛋白的基因的遗传修饰，其中所述遗传修饰降低或消除所述内源外膜流出蛋白的表达；和

(ii)质粒，其包含编码重组外膜流出蛋白的表达盒；

其中所述微生物细胞在不掺入所述质粒的情况下不能在含有阈值水平的表面活性剂的培养基中生长或繁殖。

113.权利要求112的质粒成瘾系统，其中如果将所述质粒掺入所述细胞中，则所述微生物细胞可以在含有表面活性剂的培养基中生长和繁殖。

114.权利要求112或113的质粒成瘾系统，其中所述经修饰的基因编码tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

115.权利要求112-114中任一项的质粒成瘾系统，其中所述重组外膜流出蛋白是tolC、FusA、mexA、mexB、oprM、PpF1、SepA、SepB、SepC、SmeC、OpmE、OpmD、OpmB或bepC蛋白。

116.权利要求112-115中任一项的质粒成瘾系统，其中所述表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂的浓度，任选地其中所述对照微生物细胞缺乏编码外膜流出蛋白的内源基因的表达或者具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。

117.权利要求112-116中任一项的质粒成瘾系统，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷、辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。

118.方法，其包括在存在阈值水平的表面活性剂且不存在抗生素的情况下在足以产生核酸构建体的条件下培养权利要求102-111中任一项的微生物细胞。

119.方法，其包括：

其中所述微生物细胞包含经遗传修饰的tolC基因，任选地，其中所述遗传修饰包含在tolC基因或tolC基因的控制元件内的突变、插入或缺失，进一步任选地，其中所述控制元件是启动子或核糖体结合位点。

120.权利要求119的方法，其中所述表面活性剂的阈值水平是在对照微生物细胞中停止细胞生长和/或促进细胞死亡的表面活性剂的浓度，任选地其中所述对照微生物细胞缺乏编码外膜流出蛋白的内源基因的表达或者具有降低的编码外膜流出蛋白的内源基因的表达并且不包含含有编码重组外膜流出蛋白的表达盒的核酸构建体。

121.权利要求119或120的方法，其中所述表面活性剂是十二烷基硫酸钠(SDS)、十六烷基三甲基溴化铵、Triton X-100、3[(3-胆固醇丙氨基)二甲基胺]-1-丙磺酸盐(CHAPS)、壬基苯氧基聚乙氧基乙醇(NP-40)、辛基硫葡糖苷、辛基葡糖苷或十二烷基麦芽糖苷。