CN114981290A - Hmo生产 - Google Patents

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CN114981290A CN202180010201.8A CN202180010201A CN114981290A CN 114981290 A CN114981290 A CN 114981290A CN 202180010201 A CN202180010201 A CN 202180010201A CN 114981290 A CN114981290 A CN 114981290A
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Abstract

本发明概念涉及能够生产寡糖，优选HMO的遗传修饰细胞，其包含编码MFS超家族的推定转运蛋白(putative transporter protein)的重组核酸；以及使用所述细胞生产寡糖(一种或多种)，优选HMO的方法。

Description

HMO生产
技术领域
本发明涉及在宿主细胞中重组产生生物分子的领域。更具体地，本发明涉及使用表达主要促进因子超家族(MFS)蛋白的遗传修饰细胞重组产生人乳寡糖(HMO)的方法。
背景技术
人乳寡糖(HMO)是人乳中第三大固体成分，对酶水解具有高度抗性。因此，很大一部分HMO基本上未被消化和吸收，这使得它们能够通过结肠。在结肠中，HMO可通过选择性刺激特定糖分解细菌的生长而作为塑造肠道生态系统的底物。这种选择性被视为对婴儿和成人均有益，因为双歧杆菌的菌株被视为对肠道健康具有积极作用(Chichlowski M.等人，(2012)J.Pediatr.Gastroenterol.Nutr.5:251-258；Elison E.等人，(2016)BritJ.Nutr,116:1356-1368)。
除了它们的益生元属性外，HMO还具有附加的积极作用，这扩展了它们的应用领域(Kunz C.等人，(2014)食品寡糖：产生、分析和生物活性(Food Oligosaccharides:Production,Analysis and Bioactivity)，第1版，第5-20页，编辑：Moreno J.和Luz SanzM.，约翰·威利父子出版公司(John Wiley&Sons,Ltd))。
HMO明显的健康益处使其被批准用于食品，诸如婴儿配方食品，以及消费健康产品。HMO的生物技术生产是有价值的成本效益高的大规模HMO制造方式。它依赖于构建的基因工程细菌，以表达合成所需寡糖所需的糖基转移酶，并且利用细菌固有的核苷酸糖库作为HMO前体。HMO生物技术生产的最新发展使得克服细菌表达系统的某些固有限制成为可能。例如，可对生产HMO的细菌细胞进行遗传修饰，以增加细菌中有限的细胞内核苷酸糖库(WO2012112777)，以提高HMO生产中涉及的酶的活性(WO2016040531)，或促进合成的HMO分泌到细胞外培养基中(WO2010142305、WO2017042382)。另外，重组细胞中目的基因的表达可通过使用特定启动子或其它基因表达调控剂来调控，例如最近在WO2019123324中所描述的。
WO2010142305和WO2017042382中所描述的方法的优点在于，它允许通过高水平的重组基因表达，例如使用WO2012112777、WO201604531或WO2019123324的方法，减少对产生细胞造成的代谢负担。这种方法在重组HMO生产细胞工程中引起了越来越多的关注，例如最近描述了若干种新的糖转运蛋白基因，这些基因编码可促进重组产生的2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)(人乳中含量最丰富的HMO)外排的蛋白和发酵过程(WO2018077892、US201900323053、US201900323052)。然而，目前还没有一种算法能够在多个蛋白登录号(例如UniProt)中预测具有转运功能的众多细菌蛋白中精确定位能够外排不同重组产生的HMO结构的正确转运蛋白，因为定义糖转运体底物特异性的结构/因子仍未被充分研究并且仍然是高度不可预测的。
发明内容
鉴定对不同重组产生的HMO具有特异性的新的有效糖外排转运蛋白和开发表达所述蛋白的重组细胞有利于大规模工业HMO制造。
本发明提供了能够生产人乳寡糖(HMO)的重组细胞，其中所述细胞表达编码推定的MFS(主要促进因子超家族)转运蛋白的异源基因，该蛋白源于Rosenbergiella nectarea细菌。更具体地，本发明涉及为生产寡糖，特别是HMO而优化的遗传修饰细胞，其包含编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列相似性的蛋白的重组核酸。本文中鉴定为SEQID NO:1的氨基酸序列是与具有GenBank登录ID WP_092672081.1(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/proteinlWP_092672081.1)的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的MFS转运蛋白在本文中被标识为可互换的“Nec蛋白”或“Nec转运体”或“Nec”；编码Nec蛋白的核酸序列在本文中被标识为“编码Nec的核酸/DNA”或“nec基因”或“nec”。
本发明表明，使用表达Nec蛋白的生产HMO的重组细胞导致与HMO的发酵和纯化相关的HMO制造过程的非常明显的改进。本文所公开的用于HMO生产的重组细胞和方法提供了总生产的HMO的较高产率、较低的副产物形成或副产物与产物的比率、较低的每次发酵的生物量形成以及在发酵液的下游加工期间促进HMO的回收。
令人惊讶的是，发现编码Nec的DNA序列在不同HMO生产细胞中的表达与某些特定HMO在细胞外培养基和生产细胞内部的其它HMO中的积累以及HMO总产量的增加有关。令人惊讶的是，发现所生产的HMO的外排增加是由三或四个单糖单元组成的HMO的特征，即HMO是三糖和四糖，例如2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、3-唾液酸乳糖(3’-SL)、6-唾液酸乳糖(6’-SL)、乳-N-三糖2(LNT-2)、乳-N-新四糖(LNnT)和乳-N-四糖(LNT)，但不适用于较大的寡糖结构，如积累在生产细胞内部的五糖和六糖。令人惊讶的是，还发现在表达nec的对应HMO生产细胞中，主要HMO，例如2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、乳-N-三糖(LNT II)和乳-N-四糖(LNT)的总产量也增加，而在这些细胞中，副产物，例如二岩藻糖基乳糖(DFL)、乳-N-岩藻五糖(LNFP V)或对乳-新六糖-I(pLNH-I)的产量对应地经常减少，并且所述副产物寡糖典型地积聚在生产细胞内。另外，非常出乎意料的是，Nec蛋白在HMO生产细胞中的表达导致发酵期间生物量的形成减少，并且导致更健康的细胞培养物，这反映在发酵结束时死亡细胞数量的减少，这使得制造过程更有效，因为每个生物量单位产生更多的产物。
因此，本发明的第一方面涉及能够生产一种或多种HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1(图6)的蛋白或其功能性同源物的重组核酸，功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性。
本发明的第二方面涉及包含编码MFS转运蛋白的核酸序列的核酸构建体，其中编码该蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％，诸如至少80％，诸如至少85％，诸如至少95％，诸如至少99％的序列同一性，还涉及包含该核酸构建体的遗传修饰细胞，其为大肠杆菌(Escherichia coli)。
在一方面，核酸构建体包含编码MFS转运蛋白的核酸序列(一种或多种)，其中该核酸序列与SEQ ID NO:2至少70％相同。
本发明的第三方面涉及生产一种或多种寡糖的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供能够生产HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物的重组核酸，功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性；
(ii)在合适的细胞培养基中培养根据(i)的细胞，以表达所述重组核酸；
(iii)收获步骤(ii)中生产的一种或多种HMO。
本发明还涉及包含编码主要促进因子超家族(MFS)蛋白的异源核酸序列的遗传修饰细胞或核酸构建体在生产一种或多种人乳寡糖(HMO)中的用途，所述核酸序列与序列SEQID NO:2具有至少70％的序列同一性。
如上所述，在培养能够生产一种或多种HMO的遗传修饰细胞期间，这些细胞包含编码Nec转运蛋白的核酸，令人惊讶的是发现，对应的一种或多种HMO以高产率产生，同时副产物和生物量的形成减少。这有助于在下游过程期间回收HMO，例如整体回收和净化过程可包含较少的步骤，并且可缩短整体净化时间。
提高产物产率和促进产物回收的这些效果使得本发明优于现有技术的公开内容。
本发明的其它方面和有利特征将在下面通过非限制性的实施方案详细描述和说明。
附图说明
图1显示了具有和没有过表达SEQ ID NO:1的MFS转运蛋白的经修饰大肠杆菌的2’-FL的相对产量(图1A)、2’-FL在细胞内外的相对分布(图1B)、DFL与2’-FL的相对比率(图1C)以及相对光密度(图1D)。
图2显示了在具有和没有过表达SEQ ID NO:1的MFS转运蛋白的经修饰大肠杆菌中3-FL在细胞内外的相对分布。
图3显示了菌株MP4002和MP4039在总样品、上清液和沉淀样品中的相对LNT2浓度百分比(％)。尽管这两种菌株均表现出糖基转移酶基因IgtA的最佳表达，但只有MP4039表达异源转运体基因nec。
图4显示了菌株MP4473和MP4537在总样品、上清液和沉淀样品中的相对LNT和副产物浓度百分比(％)。尽管这两种菌株均表现出糖基转移酶基因IgtA和galTK的最佳表达，但只有MP4537表达异源转运体基因nec。
图5显示了菌株MP2789和MP4597在总样品中相对LNFP-I、2’-FL、LNT和HMO总和浓度的百分比(％)。尽管这两种菌株均表现出糖基转移酶基因IgtA、galTK和futC的最佳表达，但只有MP4597表达异源转运体基因nec。
图6显示了Nec蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)。
具体实施方式
在下文中，将进一步详细描述本发明的实施方案。除非另有明确说明，否则特征的每个具体变化可应用于本发明的其它实施方案。
一般而言，除非明确定义或另有说明，否则本文中使用的所有术语应根据其在技术领域中的普通含义进行解释，并且适用于本发明的所有方面和实施方案。除非另有明确说明，否则对“一/一个/该(a/an/the)[细胞、序列、基因、转运体、步骤等]的引用应公开解释为指所述细胞、序列、基因、转运蛋白、步骤等的至少一个实例。除非明确说明，否则本文所公开的任何方法的步骤不必按照所公开的确切顺序执行。
本发明总体上涉及用于高效生产寡糖的遗传修饰细胞以及所述遗传修饰细胞在生产寡糖的方法中的用途。具体而言，本发明涉及能够合成寡糖，优选异源寡糖，特别是人乳寡糖(HMO)的遗传修饰细胞。因此，本发明的细胞经修饰以表达细胞合成一种或多种HMO所必需的一组重组核酸(其使细胞能够合成一种或多种HMO)，诸如编码具有下述糖基转移酶活性的一种或多种酶的基因。本发明的寡糖生产重组细胞进一步经修饰以包含异源重组核酸序列，优选地，编码推定的MFS(主要促进因子超家族)转运蛋白的DNA序列，该蛋白源自Rosenbergiella nectarea细菌。更具体地，本发明涉及为生产一种或多种特定寡糖，特别是一种或多种特定HMO而优化的遗传修饰细胞，其包含编码与SEQ ID NO:1的氨基酸序列具有至少80％序列相似性，优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％序列相似性的蛋白的重组核酸(图6)。本文中标识为SEQ ID NO:1的氨基酸序列是与具有GenBank登录ID:WP_092672081.1的氨基酸序列具有100％同一性的氨基酸序列。
因此，本发明的第一方面涉及能够生产一种或多种HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物的重组核酸，功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性。在本上下文中，术语“功能性同源物”意指与SEQ ID NO:1具有80％-99.9％同一性的氨基酸序列的蛋白，并且具有有益于实现本发明的至少一种有益效果的功能，例如增加宿主细胞的总HMO产量，促进所生产的HMO(一种或多种)的回收，HMO生产效率和/或HMO生产细胞的活力。
具有SEQ ID NO:1氨基酸序列的MFS转运蛋白在本文中可互换地标识为可互换的“Nec蛋白”或“Nec转运体”或“Nec”；编码Nec蛋白的核酸序列在本文中被标识为“编码Nec的核酸/DNA”或“nec基因”或“nec”。
术语“主要促进因子超家族(MFS)”意指次级活性转运体类的一个大且异常多样的家族，其负责转运一系列不同的底物，包括糖、药物、疏水分子、肽、有机离子等。糖转运蛋白的特异性高度不可预测，并且对例如寡糖具有特异性的新型转运蛋白的鉴定需要无负担的实验室实验(更多详细信息请参阅Reddy V.S.等人的综述，(2012)，FEBS J.279(11):2022-2035)。术语“MFS转运体”在本上下文中意指促进寡糖(优选HMO)转运穿过细胞膜的蛋白，优选将由宿主细胞合成的HMO/寡糖从细胞胞质溶胶转运至细胞介质，优选包含三个或四个糖单元(例如2’-FL、3-FL、LNT-2、LNT、LNnT、3’-SL或6’-SL)的HMO/寡糖。附加地，或另选地，MFS转运体也可促进不被视为HMO或根据本发明的寡糖的分子的外排，诸如乳糖、葡萄糖、细胞代谢物或毒素。
在两种或多种核酸或氨基酸序列的上下文中，术语“[特定]的序列同一性％”意指当在比较窗或指定的核酸或氨基酸序列上进行最大对应性比较和比对时，两种或多种序列在给定的百分比中具有共同的核苷酸或氨基酸残基(即序列具有至少90％的(％)同一性)。核酸或氨基酸序列的同一性百分比可使用具有默认参数的BLAST 2.0序列比较算法，或者通过人工比对和目视检查来测量(参见例如http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。该定义也适用于测试序列的互补序列和具有缺失和/或添加的序列，以及具有取代的序列。适用于确定百分比同一性、序列相似性和比对的算法示例是BLAST 2.2.20+算法，其描述于Altschul等人的《核酸研究(Nucl.Acids Res.)》25,3389(1997)中。BLAST 2.2.20+用于确定本发明核酸和蛋白的序列同一性百分比。用于进行BLAST分析的软件可通过国家生物技术信息中心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)公开获得。序列比对算法的示例是CLUSTALOmega(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/)、EMBOSS Needle(http://www.ebi.ac.uk/Tools/psa/emboss_needle/)、MAFFT(http://mafft.cbrc.jp/alignment/server/)或MUSCLE(http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/muscle/)。
在本发明的上下文中，术语“寡糖”意指含有多个单糖单元的糖聚合物。在一些实施方案中，优选寡糖是由三个或四个单糖单元组成的糖聚合物，即三糖或四糖。本发明的优选寡糖为人乳寡糖(HMO)。
本文中的术语“人乳寡糖”或“HMO”意指人乳中发现的复杂碳水化合物(参见Urashima等人：乳寡糖(Milk Oligosaccharides.)，诺瓦生物医学图书，2011年；Chen，碳水化合物化学和生物化学进展，72,113(2015))。HMO具有在还原端包含乳糖单元的核心结构，该还原端可由一个或多个β-N-乙酰基-乳糖胺基和/或一个或多个β-乳-N-生物基单元延长，并且该核心结构可由α-L-呋喃核糖基和/或α-N-乙酰基神经氨酰(唾液酰基)部分取代。在这方面，非酸性(或中性)HMO不含唾液酸残基，而酸性HMO在其结构中具有至少一个唾液酸残基。非酸性(或中性)HMO可为岩藻糖基化或非岩藻糖基化的。此类中性非岩藻糖基化HMO的示例包括乳-N-三糖2(LNT-2)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-新六糖(LNnH)、对-乳-N-新六糖(pLNnH)、对-乳-N-六糖(pLNH)和乳-N-六糖(LNH)。中性岩藻糖基化HMO的示例包括2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-二岩藻六糖I(LNDFH-I)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-二岩藻六糖III(LNDFH-III)、岩藻糖基-乳-N-六糖II(FLNH-II)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、乳-N-二岩藻六糖II(LNDFH-II)、岩藻糖基-乳-N-六糖I(FLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-六糖I(FpLNH-I)、岩藻糖基-对-乳-N-新六糖II(F-pLNnHII)和岩藻糖基-乳-N-新六糖(FLNnH)。酸性HMO的示例包括3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、3-岩藻糖基-3’-唾液酸乳糖(FSL)、3’-O-唾液酸乳-N-四糖a(LST a)、岩藻糖基-LST a(FLST a)、6’-O-唾液酸乳-N-四糖b(LST b)、岩藻糖基-LST b(FLST b)、6’-O-唾液酸乳-N-新四糖(LST c)、岩藻糖基-LST c(FLST c)、3’-O-唾液酸乳-N-新四糖(LSTd)、岩藻糖基-LST d(FLST d)、唾液酸-乳-N-六糖(SLNH)、唾液酸-乳-N-新六糖I(SLNH-I)、唾液酸-乳-N-新六糖II(SLNH-II)和二唾液酸-乳-N-四糖(DSLNT)。在本发明的上下文中，乳糖不被视为HMO物种。
在本发明的一些实施方案中，三HMO和四HMO可为优选的，例如三糖2’-FL、3-FL、LNT-2、3’-SL、6’-SL和四糖DFL、LNT、LNnT、FSL。
为了能够合成一种或多种HMO，本发明的重组细胞包含至少一种编码具有糖基转移酶活性的功能酶的重组核酸。半乳糖基转移酶基因可(通过染色体整合)整合到宿主细胞的基因组中，或者另选地，它可包含在质粒DNA中并表达为质粒携带的。如果生产HMO需要两种或多种糖基转移酶，例如LNT或LNnT，则编码具有糖基转移酶活性的不同酶的两种或多种重组核酸可整合在基因组中和/或从质粒中表达，例如用于生产LNT的β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶(编码第一糖基转移酶的第一重组核酸)与β-1,3-半乳糖基转移酶(编码第二糖基转移酶的第二重组核酸)组合，其中第一和第二重组核酸可彼此独立地进行染色体整合或整合在质粒上。在一个优选实施方案中，第一和第二重组核酸均稳定整合到生产细胞的染色体中；在另一实施方案中，第一和第二糖基转移酶中的至少一种是质粒携带的。具有糖基转移酶活性的蛋白/酶(糖基转移酶)可在不同实施方案中选自具有以下项的活性的酶：α-1,2-岩藻糖基转移酶、α-1,3-岩藻糖基转移酶、α-1,3/4-岩藻糖基转移酶、α-1,4-岩藻糖基转移酶、α-2,3-唾液酸转移酶、α-2,6-唾液酸转移酶、β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、β-1,6-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶、β-1,3-半乳糖基转移酶和β-1,4-半乳糖基转移酶。例如，2’-FL的生产需要经修饰细胞表达活性α-1,2-岩藻糖基转移酶；为了生产3-FL，经修饰细胞需要表达活性α-1,3-岩藻糖基转移酶；为了生产LNT，经修饰细胞需要表达至少两种糖基转移酶，一种β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶和一种β-1,3-半乳糖基转移酶；为了生产6’-SL，经修饰细胞必须表达活性α-2,6-唾液酸转移酶和CMP-唾液酸合成途径；为了生产3’-SL，经修饰细胞必须表达活性α-2,3-唾液酸转移酶和CMP-唾液酸合成途径。可由生产细胞包含的重组基因编码的具有糖基转移酶活性的蛋白的一些非限制性实施方案可选自表1的非限制性示例。
表1
Figure BDA0003757461170000091
Figure BDA0003757461170000101
Figure BDA0003757461170000111
本发明的一方面是提供一种核酸构建体，其包含编码能够进行糖转运的蛋白的异源核酸序列(一种或多种)，该蛋白是如SEQ ID NO:1所示的主要促进子超家族(MFS)蛋白，或其功能性同源物，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，其中编码MFS蛋白的核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的序列同一性。
术语“异源核酸序列”、“重组基因/核酸/DNA编码”或“编码核酸序列”意指人工核酸序列(即，使用标准实验室方法在体外制备核酸序列)，其包含一组连续、非重叠的三联体(密码子)，当置于适当的控制序列(即启动子)的控制下时，它被转录成mRNA并翻译成多肽。编码序列的边界一般由位于由mRNA 5’端开放阅读框上游的核糖体结合位点、转录起始密码子(AUG、GUG或UUG)和翻译终止密码子(UAA、UGA或UAG)确定。编码序列可包括但不限于基因组DNA、cDNA、合成和重组核酸序列。术语“核酸”包括RNA、DNA和cDNA分子。应理解，由于遗传密码的简并性，可产生编码给定蛋白的大量核苷酸序列。术语核酸可与术语“多核苷酸”互换使用。“寡核苷酸”是一种短链核酸分子。“引物”是一种寡核苷酸，无论是天然存在的如在纯化的限制性消化物中还是合成产生的，当置于诱导与核酸链互补的引物延伸产物合成的条件下(即在核苷酸和诱导剂如DNA聚合酶的存在下和在合适的温度和pH下)时，其能够作为合成的起点。为了扩增的最大效率，引物优选是单链的，但也可为双链的。如果引物是双链的，则在用于制备延伸产物之前，首先对其进行处理以分离其链。优选地，引物是脱氧核糖核酸。引物必须足够长，以便在存在诱导剂的情况下引发延伸产物的合成。引物的确切长度取决于许多因素，包括温度、引物来源和方法的使用。
本发明的重组核酸序列可为编码DNA序列，例如基因，或非编码DNA序列，例如调控DNA，例如启动子序列。本发明的一方面涉及提供一种重组细胞，其包含编码产生一种或多种HMO所需酶的重组DNA序列和编码Nec转运体的DNA序列。因此，在一个实施方案中，本发明涉及一种核酸构建体，其包含编码核酸序列，即目的基因(例如糖基转移酶基因或nec基因)的重组DNA序列，以及非编码DNA序列，例如启动子DNA序列，例如衍生自lac操纵子或glp操纵子的启动子的重组启动子序列，或衍生自另一基因组启动子DNA序列的启动子序列，或合成启动子序列，其中编码序列和启动子序列可操作地连接。术语“可操作连接”是指两种或多种核酸(例如DNA)之间的功能性关系部分。典型地，它是指转录调控序列与转录序列之间的功能性关系。例如，如果启动子序列在合适的宿主细胞或其它表达系统中刺激或调控编码序列的转录，则该启动子序列与编码序列可操作地连接。与转录序列可操作连接的启动子转录调控序列与转录序列物理上相邻，即它们是顺式作用的。
在一个实施方案中，本发明的核酸构建体可为载体DNA的一部分，在另一个实施方案中，构建体是整合在宿主细胞基因组中的表达盒/盒。照着术语“核酸结构”意指人工构建的核酸片段，特别是DNA片段，其旨在“移植”到靶细胞，例如细菌细胞中，以修饰基因组基因的表达或表达可包括在构建体中的基因/编码DNA序列。在本发明的上下文中，核酸构建体包含含有两个或多个重组DNA序列的重组DNA序列：基本上，非编码DNA序列包含启动子DNA序列和编码目的基因的编码DNA序列，该目的基因例如Nec蛋白、糖基转移酶或用于在宿主细胞中产生HMO的另一基因。优选地，该构建体进一步包含调控构建体编码DNA的转录或翻译的非编码DNA序列，例如促进核糖体结合到转录物的DNA序列，稳定转录物的前导DNA序列。
包含在构建体(表达盒)中的目的重组核酸整合到细菌基因组中可以通过常规方法实现，例如通过使用含有与染色体上特定位点同源的侧翼序列的线性盒，如针对attTn7-位点所述(Waddell C.S.和Craig N.L.，基因和发展(Genes Dev.)(1988)2月；2(2):137-49.)；核酸序列的基因组整合方法，其中重组由噬菌体λ的红色重组酶功能或Rac原噬菌体的RecE/RecT重组酶功能介导(Murphy，细菌学杂志(JBacteriol.)1998)；180(8):2063-7；张等人，自然遗传学(Nature Genetics)(1998)s(1998)20:123-1 28Muyrers等人，EMBO报道(EMBO Rep.)(2000)1(3):239-243)；基于Red/ET重组的方法(Wenzel等人，化学生物学(Chem Biol.)(2005),12(3):349-56；Vetcher等人，应用环境微生物学(Appl EnvironMicrobiol.)(2005)；71(4):1829-35)；或阳性克隆，即携带表达盒的克隆，可例如通过标记基因或基因功能的丧失或获得来选择。
根据本发明，包含目的基因的表达盒的单个拷贝足以确保所需HMO的产生并实现所需效果。因此，在一些优选实施方案中，本发明涉及重组HMO生产细胞，其包含整合在细胞基因组DNA中的目的基因的一个、两个或三个拷贝。在一些实施方案中，基因的单拷贝是优选的。
在一个优选实施方案中，本发明核酸构建体的重组编码核酸序列相对于启动子是异源的，这意指在起源物种基因组中的等效天然编码序列中在另一启动子序列(即，不是构建体的启动子序列)的控制下转录。然而，就宿主细胞而言，编码DNA可为异源的(即源自另一生物物种或属)，例如编码在大肠杆菌宿主细胞中表达的Nec蛋白的DNA序列，或者是同源的(即源自宿主细胞)，例如结肠酸操纵子的基因、wca基因。
术语，“调控元件”或“启动子”或“启动子区域”或“启动子元件”是在转录启动期间被DNA依赖性RNA聚合酶标识和结合的核酸序列。启动子以及其它转录和翻译调控核酸序列(也称为“控制序列”)是表达给定基因或基因组(操纵子)所必需的。一般而言，转录和翻译调控序列包括但不限于启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。“转录起始位点”意指第一个被转录的核苷酸，被指定为+1。起始位点下游的核苷酸编号为+2、+3、+4等，而5’相反(上游)的核苷酸编号为-1、-2、-3等。构建体的启动子DNA序列可源自所选物种基因组的任何基因的启动子区域，优选大肠杆菌基因组DNA的启动子区域。因此，任何能够结合到RNA聚合酶并启动转录的启动子DNA序列均适合实施本发明。原则上，任何启动子DNA序列均可用于控制构建体的目的重组基因的转录，不同或相同的启动子序列可用于驱动整合在宿主细胞基因组或表达载体DNA中的不同目的基因的转录。为了使包括在构建体中的重组基因得到最佳表达，该构建体可包含进一步的调控序列，例如前导DNA序列，例如衍生自大肠杆菌glp基因的5’-非翻译区(5’UTR)的DNA序列，一种用于核糖体结合的序列。WO2019123324(通过引用并入本文)中描述了后面序列的示例，并且在本文的非限制性工作示例中有所说明。
在一些优选实施方案中，用于调控包括在本发明构建体中的重组基因的表达的调控元件是glpFKX操纵子启动子，PglpF，在其它优选实施方案中，启动子是lac操纵子启动子Plac。
在另一方面，用于调控包括在本发明构建体中的重组基因的表达的调控元件是mgIBAC；半乳糖/甲基半乳糖苷转运体启动子PmglB或其变体，诸如但不限于SEQ ID NO:15的PmglB_70UTR或SEQ ID NO:16的PmglB_70UTR_SD4。
在另一方面，用于调控包括在本发明构建体中的重组基因的表达的调控元件是gatYZABCD；塔格糖-1,6-bisP醛缩酶启动子PgatY或其变体，诸如但不限于SEQ ID NO:17的PgatY_U70UTR。
存在于本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体中的优选调控元件选自：PgatY_70UTR、PglpF、PglpF_SD1、PglpF_SD10、PglpF_SD2、PglpF_SD3、PglpF_SD4、PglpF_SD5、PglpF_SD6、PglpF_SD7、PglpF_SD8、PglpF_SD9、Plac_16UTR、Plac、PmglB_70UTR和PmglB_70UTR_SD4。
存在于本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体中的特别优选调控元件选自PglpF和Plac。
然而，任何能够转录和/或调控一种或多种重组核酸转录水平的启动子均适用于实施本发明，所述重组核酸编码一种或多种蛋白(或一种或多种调控核酸)，所述蛋白对于在宿主细胞中实现一种或多种HMO生物合成产生的最佳水平是必需的或有益的，所述蛋白例如涉及HMO或HMO前体的跨膜转运、HMO产生副产物的降解、基因表达调控蛋白等的蛋白，并且允许实现根据本发明的期望效果。
优选地，本发明的构建体包含与HMO生物合成产物相关的基因、启动子DNA序列和在宿主细胞中表达的其它调控序列，诸如核糖体结合位点序列(例如Shine-Dalgarno序列)，使得能够以至少0.03g/OD(光密度)的水平生产1升包含宿主细胞悬浮液的发酵培养基中的HMO，例如约0.05g/l/OD至约0.1g/l/OD的水平。就本发明而言，后一水平的HMO生产被视为“足够”，并且能够产生该水平的所需HMO的宿主细胞被视为“合适的宿主细胞”，即该细胞可以被进一步修饰以表达HMO转运蛋白，例如Nec，以实现本文所描述的至少一种有利于HMO产生的效果。
本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体包含核酸序列，诸如编码推定MFS(主要促进因子超家族)转运蛋白的异源基因。
本发明中特别感兴趣的MFS转运蛋白是Nec蛋白。因此，本发明的核酸构建体包含与基因nec，SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的核酸序列。
包含在遗传修饰细胞或核酸构建体中的核酸序列编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性。
SEQ ID NO:1的蛋白的功能性同源物可通过诱变获得。与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的功能性相比，功能性同源物应具有至少50％，诸如60％、70％、80％、90％或100％的剩余功能性。与SEQ ID NO:1的氨基酸序列的功能性相比，功能性同源物可具有更高的功能性。SEQ ID NO:1的功能性同源物应能够提高根据本发明的遗传修饰细胞的HMO产量。
遗传修饰细胞(宿主细胞或重组细胞)可为例如细菌或酵母细胞。在一个优选实施方案中，遗传修饰细菌细胞。关于细菌宿主细胞，原则上没有限制；它们可为真细菌(革兰氏阳性或革兰氏阴性)或古细菌，只要它们允许插入目的基因的基因操作，并且可在制造规模上培养。优选地，宿主细胞具有允许培养至高细胞密度的属性。适于重组工业产生根据本发明的HMO(一种或多种)的细菌宿主细胞的非限制性示例可为草生欧文氏菌(Erwiniaherbicola)(成团泛氏菌(Pantoea agglomerans))、弗劳地枸橼酸杆菌(Citrobacterfreundii)、柠檬泛菌(Pantoea citrea)、胡萝卜软腐果胶杆菌(Pectobacteriumcarotovorum)或野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。也可使用芽孢杆菌属的细菌，包括枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、嗜热芽孢杆菌(Bacillus thermophilus)、侧孢芽孢杆菌(Bacillus laterosporus)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、丝状芽孢杆菌(Bacillus mycoides)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilus)、迟缓芽孢杆菌(Bacilluslentus)、蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)和环状芽孢杆菌(Bacillus circulans)。类似地，可使用本发明的方法修饰乳杆菌属和乳球菌属的细菌，包括但不限于嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)、唾液乳杆菌(Lactobacillus salivarius)、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)、瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)、德氏乳杆菌(Lactobacillus delbrueckii)、鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)、卷曲乳杆菌(Lactobacillus crispatus)、加氏乳杆菌(Lactobacillus gasseri)、干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)、罗伊氏乳杆菌(Lactobacillus reuteri)、詹氏乳杆菌(Lactobacillus jensenii)和乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)。嗜热链球菌(Streptococcus thermophiles)和费氏固有杆菌(Proprionibacterium freudenreichii)也是本文所述发明的合适细菌种类。作为本发明的一部分，还包括来自肠球菌属(例如屎肠球菌和嗜热肠球菌)、双歧杆菌属(例如长双歧杆菌、婴儿双歧杆菌和双歧杆菌)、孢子乳杆菌属、微单孢菌属、微球菌属、红球菌属和假单胞菌属(例如荧光假单胞菌和铜绿假单胞菌)的菌株。在乳糖存在下培养包含本文所述特征的细菌，并且从细菌本身或细菌培养上清液中提取由细胞产生的寡糖，诸如HMO。在一个优选实施方案中，本发明的遗传修饰细胞是大肠杆菌细胞。
在另一优选实施方案中，宿主细胞是酵母细胞，例如酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)、分裂酵母(Schizosaccharomyces pombe)、巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)、乳酸克鲁维酵母(Kluveromyces lactis)、马克斯克鲁维酵母(Kluveromycesmarxianus)等。
本发明的重组细胞生产的HMO可使用本领域可用的适当程序(例如，如WO2015188834、WO2017182965或WO2017152918中所述)进行纯化。
本发明的遗传修饰细胞可使用本领域的标准方法提供，例如Sambrook等人，Wilson&Walker,Maniatise等人和Ausubel等人在手册中所述的方法。
适用于HMO生产的宿主，例如大肠杆菌，可包含内源性β-半乳糖苷酶基因或外源性β-半乳糖苷酶基因，例如大肠杆菌包含内源性lacZ基因(例如GenBank登录号V00296(GI:41901))。出于本发明的目的，对生产HMO的宿主细胞进行遗传操作，使其包含任何β-半乳糖苷酶基因或包含失活的基因。该基因可通过从细菌基因组中完全或部分缺失对应的核酸序列而失活，或者该基因序列以其转录的方式发生突变，或者如果被转录，则转录物不被翻译，或者如果翻译为蛋白(即β-半乳糖苷酶)，则该蛋白不具有对应的酶活性。通过这种方式，HMO的生产菌积累了更多的细胞内乳糖库，这有利于HMO的生产。
在一些实施方案中，工程细胞(例如细菌)包含缺陷唾液酸分解代谢途径。“唾液酸分解代谢途径”意指经常地由酶控制和催化的导致唾液酸降解的一系列反应。本文所描述的示例性唾液酸分解代谢途径为大肠杆菌途径。在该途径中，唾液酸(Neu5Ac；N-乙酰神经氨酸)由NanA(N-乙酰神经氨酸裂解酶)和NanK(N-乙酰甘露糖胺激酶)和NanE(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差向异构酶)降解，这些酶均由nanATEK-yhcH操纵子编码，并且由NanR抑制(http://ecocyc.org/ECOLI)。通过在内源性nanA(N-乙酰神经氨酸裂解酶)(例如GenBank登录号D00067.1(GL216588))和/或nanK(N-乙酰甘露糖胺激酶)基因(例如GenBank登录号(氨基酸)BAE77265.1(GL85676015))和/或nanE(N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸差异构酶，GI：947745，通过引用并入本文)中引入突变，在大肠杆菌宿主中呈现缺陷唾液酸分解代谢途径。任选地，nanT(N-乙酰神经氨酸转运体)基因也失活或突变。唾液酸代谢的其它中间产物包括：(ManNAc-6-P)N-乙酰甘露糖胺-6-磷酸；(GlcNAc-6-P)N-乙酰氨基葡萄糖-6-磷酸；(GlcN-6-P)氨基葡萄糖-6-磷酸和(Fruc-6-P)果糖-6-磷酸。在一些优选实施方案中，nanA发生突变。在其它优选实施方案中，nanA和nanK发生突变，而nanE保持功能性。在另一优选实施方案中，nanA和nanE发生突变，而nanK未发生突变、失活或缺失。突变是编码nanA、nanK、nanE和/或nanT的基因产物的核酸序列中的一种或多种变化。例如，核酸序列中的突变可为1、2、至多5、至多10、至多25、至多50或至多100个变化。例如，nanA、nanK、nanE和/或nanT基因通过null突变而突变。本文所描述的null突变包含氨基酸替换、添加、缺失或插入，其要么导致酶功能丧失(即活性降低或无活性)要么导致酶丧失(即无基因产物)。“缺失”意指完全或部分缺失编码区，从而不产生(功能性)基因产物。失活是指编码序列已被改变，使得所得基因产物在功能上无活性，或者编码的基因产物的活性低于天然、天然存在的、内源性基因产物的100％，例如90％、80％、70％、60％、50％、40％、30％或20％。“未突变的”基因或蛋白与天然、天然发生或内源性编码序列没有1、2、至多5、至多10、至多20、至多50、至多100、至多200或至多500个或更多密码子的不同，或与对应的编码氨基酸序列的不同。
此外，该细菌(例如大肠杆菌)还包含唾液酸合成能力。例如，该细菌通过提供外源性UDP-GIcNAc 2-差异构酶(例如空肠弯曲杆菌(Campylobacter jejuni)的neuC(GenBankAAK91727.1)或等效物(例如GenBank CAR04561.1)、Neu5Ac合酶(例如空肠弯曲杆菌的neuB(GenBank AAK91726.1)或等效物(例如黄杆菌利姆诺西氏(Flavobacteriumlimnosediminis)唾液酸合酶，GenBank WP_023580510.1)和/或CMP-Neu5Ac合成酶(例如空肠弯曲杆菌的neuA(GenBank AAK91728.1)或等效物(例如巴西弧菌(Vibriobrasiliensis)CMP-唾液酸合成酶，GenBank WP_006881452.1)而具有唾液酸合成能力。
在工程菌中生产含中性N-乙酰氨基葡萄糖的HMO在本领域也是已知的(参见例如Gebus C等人(2012)碳水化合物研究(Carbohydrate Research)363 83-90)。
用于生产含N-乙酰氨基葡萄糖的HMO，诸如乳-N-三糖(LNT-2)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-新四糖(LNnT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP-I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP-II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP-III)、乳-N-岩藻五糖V(LNFP-V)、乳-N-二岩藻六糖I(LDFH-I)、乳-N-二岩藻六糖II(LDFH-II)和乳-N-新二岩藻六糖II(LNDFH-III)，如上文所述，该细菌包含功能性lacY和功能失调的lacZ基因，并且经工程处理以包含外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因或其功能性变体或片段。这种外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因可从多种来源中的任何一种获得，例如从脑膜炎奈瑟菌(N.meningitides)(Genbank蛋白登录号AAF42258.1)或淋病奈瑟菌(N.gonorrhoeae)(Genbank蛋白登录号ACF31229.1)中描述的IgtA基因。任选地，附加的外源性糖基转移酶基因可在包含外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的细菌中共表达。例如，β-1,4-半乳糖基转移酶基因与UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰氨基葡萄糖基转移酶基因共表达。这种外源性β-1,4-半乳糖基转移酶基因可从多种来源中的任何一种获得，例如描述于脑膜炎奈瑟菌的IgtB基因(Genbank蛋白登录号AAF42257.1)或描述于幽门螺杆菌(H.pylori)的HP0826/galT基因(Genbank蛋白登录号NP_207619.1)。任选地，在包含外源性UDP-GlcNAc:Galα/β-Rβ-3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因的细菌中共表达的附加外源性糖基转移酶基因是P-I,3-半乳糖基转移酶基因，例如描述自大肠杆菌055:H7的wbgO基因(Genbank蛋白登录号WP_000582563.1)或描述自幽门螺杆菌的jhp0563基因(Genbank蛋白登录号AEZ55696.1)，或描述自无乳链球菌lb O/2型(Streptococcus agalactiae type lbO/2)的cpslBJ基因(Genbank蛋白登录号AB050723)。上述任何酶的功能变体和片段也涵盖在本发明中。
N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因和/或半乳糖基转移酶基因也可操作地连接到Pglp，并且从对应的基因组整合盒表达。在一个实施方案中，基因组整合的基因是编码半乳糖基转移酶的基因，例如编码来自幽门螺杆菌的GaIT酶的HP0826基因(Genbank蛋白登录号NP_207619.1)；在另一个实施方案中，基因组整合的基因是编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶的基因，例如来自脑膜炎奈瑟菌的IgtA基因(Genbank蛋白登录号AAF42258.1)。在这些实施方案中，第二个基因，即编码β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶或半乳糖基转移酶的基因，相应地，可从基因组整合盒或质粒载体盒表达。第二个基因任选地在glp启动子的控制下或在适用于表达系统的任何其它启动子(例如Plac)的控制下表达。
除非另有说明，否则本文中使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。Singleton等人(1994)微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)，第二版，约翰·威利父子出版社(纽约)为本领域技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。尽管在本发明的实践或测试中可使用类似于或等同于本文所述的任何方法和材料，但描述了优选方法和材料。本申请中所需的大多数命名法和一般实验室程序可在Sambrook等人的分子克隆：实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)，第1-3卷，冷泉港实验室，冷泉港，纽约(2012)；Wilson K.和Walker J.，生物化学和分子生物学原理与技术(Principles andTechniques of Biochemistry and Molecular Biology)(2010)，剑桥大学出版社；或Manatise等人，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室(2012)；或者在Ausubel等人的分子生物学当前方案(Current protocols in molecular biology)，John Wiley和Sohns(2010)中找到。这些手册在下文中分别称为“Sambrook等人”、“Wilson&Walker”、“Maniatise等人”、“Ausubel等人”。
本发明的第二方面涉及一种生产一种或多种HMO的方法，该方法包括以下步骤：
(i)提供能够生产HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物的重组核酸，功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％的同一性，优选至少85％的同一性，更优选至少90％的同一性；
(ii)在合适的细胞培养基中培养根据(i)的细胞，以允许HMO生产和DNA序列的表达，从而生产具有SEQ ID NO:1的氨基酸序列的蛋白，或其功能性同源物，其氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性；
(iii)收获步骤(ii)中生产的一种或多种HMO。
根据本发明，术语“培养(culturing)”(或“培养(cultivating)”或“培养(cultivation)”，也称为“发酵”)涉及根据业内已知方法在受控生物反应器中繁殖细菌表达细胞。
为了生产一种或多种HMO，根据本领域已知的程序，在合适的碳源(例如葡萄糖、甘油、乳糖等)存在下培养本文所描述的HMO生产菌，并且从培养基和培养过程期间形成的微生物生物量中收获生产的HMO。此后，根据本领域已知的程序(例如WO2015188834、WO2017182965或WO2017152918中所述)纯化HMO，并且纯化的HMO用作营养食品、药物或任何其它目的，例如用于研究。HMO的制造典型地通过大量培养来完成。本发明含义中的术语“制造”和“制造规模”定义了最小体积为5L培养液的发酵。经常地，“制造规模”工艺的定义是能够处理大量含有所需HMO或HMO的制剂，并且生产一定量的目的蛋白，例如在治疗化合物或组合物的情况下，满足临床试验以及市场供应的需求。除了大体积之外，与简单的实验室规模方法如摇瓶培养相反，制造规模方法的特征在于使用生物反应器(发酵罐)的技术系统，该系统配备有用于搅拌、通气、营养补料、监测和控制工艺参数(pH、温度、溶解氧张力、背压等)的装置。在很大程度上，表达系统在实验室规模方法中的行为，例如摇瓶、台式生物反应器或本公开实施例中描述的深井形式，确实允许预测该系统在生物反应器的复杂环境中的行为。
关于发酵过程中使用的合适细胞培养基，没有限制。培养基可为半定义的，即含有复杂培养基化合物(例如酵母提取物、大豆蛋白胨、酪氨酸氨基酸等)，也可为化学定义的，不含任何复杂化合物。
术语“一种或多种HMO”意指HMO生产细胞可产生单个HMO结构(第一HMO)或多个HMO结构(第二、第三HMO等)。在一些实施方案中，可优选产生单个HMO的宿主细胞，在其它优选实施方案中，可优选产生多个HMO结构的宿主细胞。产生单个HMO结构的宿主细胞的非限制性示例为2’-FL、3-FL、3’-SL、6’-SL或LNT-2生产细胞。能够产生多种HMO结构的宿主细胞的非限制性示例可为DFL、FSL、LNT、LNnT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP IV、LNFP V、pLNnH、pLNH2生产细胞。
本发明上下文中的术语“收获”涉及在发酵结束后收集产生的HMO(一种或多种)。在不同实施方案中，其可包括收集生物量(即宿主细胞)和培养基中包括的HMO(一种或多种)，即在从生物质中分离发酵液之前/不分离发酵液。在其它实施方案中，可从生物质和发酵液中分别收集所产生的HMO，即在从培养基(即发酵液)分离生物质之后。可使用本领域技术人员熟知的任何方法，诸如任何合适类型的离心或过滤，从培养基中分离细胞。从培养基中分离细胞可在收获发酵液后立即进行，或者在适当条件下储存发酵液后的稍后阶段进行。从剩余生物质(或总发酵)中回收产生的HMO，包括从生物质(生产细胞)中提取HMO。它可通过本领域任何合适的方法来完成，例如通过超声处理、煮沸、均质化、使用溶菌酶的酶促裂解或冷冻和研磨。
发酵回收后，HMO(一种或多种)可用于进一步加工和纯化。
发酵生产的HMO可使用WO2016095924、WO2015188834、WO2017152918、WO2017182965、US20190119314(全部通过引用并入)中所描述的适当程序来纯化。
在本发明的一些实施方案中，宿主细胞可产生多个HMO，其中一个HMO是“产物”HMO，而一些/所有其它HMO是“副产物”HMO。典型地，副产物HMO是主要HMO前体或主要HMO进一步改性的产物。在一些实施方案中，可能需要大量生产产物HMO和少量副产物HMO。本文所描述的用于HMO生产的细胞和方法允许控制生产具有定义的HMO分布的HMO产物，例如，在一个实施方案中，生产的HMO混合物，其中产物HMO是与混合物的其它HMO(即副产物HMO)相比的主要HMO，即产物HMO的产量高于其它副产物HMO；在其它实施方案中，生产相同HMO混合物的细胞可经调控以生产比产物HMO更多的一种或多种副产物HMO。例如，在2’-FL的产生期间，产生了产物HMO，通常是大量的DFL，即副产物HMO。使用本发明的遗传修饰细胞，2’-FL产物中的DFL水平可显著降低。
有利的是，本发明提供了降低的副产物与产物的比率和增加的产物的总产率(和/或HMO总量)。这种相对于产物形成而言较少的副产物形成促进了产物产量的提高，并且提高生产和产物回收过程的效率，提供优质的HMO制造程序。
在不同的优选实施方案中，可选择生产2’-FL、3-FL、3’-SL、6’-SL、LNT-2、DFL、FSL、LNT、DFL、FSL、LNT、LNnT、LNFP I、LNFP II、LNFP III、LNFP IV、LNFP V、pLNnH、pLNH2中之一/两者作为产物或副产物HMO的不同宿主细胞。在一个优选实施方案中，产物为3-FL，而副产物为DFL。在另一优选实施方案中，产物为2’-FL，而副产物为DFL。在另一优选实施方案中，产物为LNT-2，而副产物为LNT和LNFP I。
本发明还涉及根据本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体在生产一种或多种寡糖，优选一种或多种人乳寡糖(一种或多种)中的用途。在一个实施方案中，根据本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体用于生产选自2’-FL、3-FL、DLF、LNT、LNT-II、LNnT、LNFP-1、pLNnH和pLNH-II的特定HMO。在优选实施方案中，根据本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体用于生产选自2’-FL、3-FL、DLF、LNT、LNT-II、LNnT、pLNnH和pLNH-II的特定HMO。
在特别优选的实施方案中，根据本发明的遗传修饰细胞或核酸构建体用于生产选自2’-FL、3-FL、LNT、LNT-II、LNnT和pLNH-II的特定HMO。
下面通过非限制性实施例和实施方案进一步说明本发明。
实施例
材料和方法
除非另有说明，分子生物学领域中已知的标准技术、载体、控制序列元件和其它表达系统元件用于核酸操纵、转化和表达。此类标准技术、载体和元件可在以下内容中找到：Ausubel等人(编辑)，分子生物学当前方案(1995)(John Wiley&amp；Sons)；Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，分子克隆(Molecular Cloning)(1989)(纽约冷泉港实验室出版社)；Berger和Kimmel，酶学方法(Methods in Enzymology)152：分子克隆技术指南(Guide to Molecular Cloning Techniques)(1987)(学术出版社)；Bukhari等人(编辑)，DNA插入元件、质粒和上位体(DNA Insertion Elements,Plasmids and Episomes)(1977年)(纽约冷泉港实验室出版社)；Miller，J.H.分子遗传学实验(Experiments inmolecular genetics)(1972)(纽约冷泉港实验室出版社)。
菌株
所用的细菌菌株MDO由大肠杆菌K12 DH1构建。大肠杆菌K12DH1基因型为：F-、λ-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44。表2描述了本实施例中使用的菌株。
表2
Figure BDA0003757461170000241
培养基
Luria肉汤(LB)培养基使用LB肉汤粉，Millers(Fisher Scientific)制作的，并且LB琼脂平板使用LB琼脂粉，Millers(Fisher Scientific)制作的。添加适当的氨苄青霉素(100μg/mL)或任何适当的抗生素)和/或氯霉素(20μg/mL)。
基本最低培养基的组成如下：NaOH(1g/L)、KOH(2.5g/L)、KH2PO4(7g/L)、NH4H2PO4(7g/L)、柠檬酸(0.5g/L)、微量矿物质溶液(5mL/L)。微量矿物质储备液包含：ZnSO4*7H2O0.82g/L、柠檬酸20g/L、MnSO4*H2O 0.98g/L、FeSO4*7H2O 3.925g/L、CuSO4*5H2O 0.2g/L。用5N NaOH将基本最低培养基的pH值调整为7.0并高压灭菌。在接种之前，向基本最低培养基提供1mM MgSO4、4μg/mL硫胺素、0.5％的给定碳源(甘油(Carbosynth))，并且在适当时添加异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)(0.2mM)。硫胺素、抗生素和IPTG通过过滤灭菌。甘油的所有百分比浓度表示为v/v，葡萄糖的所有百分比浓度表示为w/v。
含有2-脱氧-半乳糖的M9平板的组成如下：15g/L琼脂(Fisher Scientific)、2.26g/L5×M9最小盐(Sigma-Aldrich)、2mM MgSO4、4μg/mL硫胺素、0.2％甘油和0.2％2-脱氧-D-半乳糖(Carbosynth)。
MacConkey指示板的组成如下：40g/L MacConkey琼脂基(BD-DifcoTM)以及最终浓度为1％的碳源。
培养
除非另有说明，否则大肠杆菌菌株在37℃下在含有0.2％葡萄糖的Luria Bertani(LB)培养基中搅拌繁殖。琼脂平板在37℃下温育过夜。
化学感受态细胞与转化
将大肠杆菌在37℃下从LB平板接种到含有0.2％葡萄糖的5mL LB中，摇动直至OD600～0.4。通过在13.000g下离心25秒获得2mL培养物。去除上清液，并且将细胞沉淀重新悬浮在600μL冷TB溶液中(10mM管道、15mM CaCl2、250mM KCl)。将细胞在冰上培养20分钟，随后在13.000g下沉淀15秒。去除上清液，将细胞沉淀重新悬浮在100μL冷TB溶液中。使用100μL感受态细胞和1至10ng质粒DNA进行质粒转化。细胞和DNA在冰上培养20分钟，然后在42℃下热震45秒。在冰上温育2分钟后，加入400μL SOC(20g/L胰蛋白胨、5g/L酵母抽提物、0.5g/L NaCl、0.186g/L KCl、10mM MgCl2、10mM MgSO4和20mM葡萄糖)，细胞培养物在37℃下振荡培养1小时，然后铺在选择性平板上。
在供应商(ThermoFisher Scientific)推荐的条件下，将质粒转化为TOP10化学感受态细胞。
DNA技术
使用QIAprep Spin-Miniprep试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中分离质粒DNA。使用QIAmp DNA迷你试剂盒(Qiagen)从大肠杆菌中分离染色体DNA。使用QIAquick PCR纯化试剂盒(Qiagen)纯化PCR产物。按照供应商的建议使用DreamTaq PCR主混合物(Thermofisher)、Phusion U热启动PCR主混合物(Thermofisher)、USEREnzyme(新英格兰生物实验室)。引物由德国Eurofins Genomics公司提供。PCR片段和质粒通过Eurofins基因组学进行测序。菌群PCR使用DreamTaq PCR Master Mix在T100TM热循环仪(Bio-Rad)中进行。
表3：用于扩增质粒主链、启动子元件和nec的寡聚物
Figure BDA0003757461170000261
表4：HMO生产细胞中表达的异源蛋白
Figure BDA0003757461170000271
表5：用于表达nec的合成DNA元件
Figure BDA0003757461170000272
Figure BDA0003757461170000281
质粒的构建
合成了含有两个I-Scel内切酶位点的质粒主链，这两个位点被适于同源重组到大肠杆菌基因组中的两个DNA片段和T1转录终止子序列分开。例如，在一个质粒主链中合成了半乳糖操纵子(galK中同源重组所需)和T1转录终止序列(pUC57::gal)(GeneScript)。gal操纵子中用于同源重组的DNA序列包括序列大肠杆菌K-12MG155完整基因组GenBank:ID:CP014225.1中的碱基对3.628.621-3.628.720和3.627.572-3.627.671。通过同源重组的插入将导致galK和galK-表型的949个碱基对缺失。以类似的方式，可合成基于pUC57(GeneScript)或含有两个I-Scel核酸内切酶位点的任何其它合适载体的主链，所述位点被适于同源重组到大肠杆菌基因组中的两个DNA片段和T1转录终止子序列分开。分子生物学领域中众所周知的标准技术用于设计引物和扩增大肠杆菌K-12DH1染色体DNA的特定DNA序列。例如，可在以下内容中找到此类标准技术、载体和元件：Ausubel等人(编辑)，分子生物学当前协议(1995)(John Wiley&amp；Sons)；Sambrook，Fritsch和Maniatis(编辑)，分子克隆(1989)(纽约冷泉港实验室出版社)；Berger和Kimmel，酶学方法，152：分子克隆技术指南(1987)(学术出版社)；Bukhari等人(编辑)。
从大肠杆菌DH1获得的染色体DNA用于使用寡聚体O261和O262扩增包含启动子PglpF的300bp DNA片段，以及使用寡聚体O68和IO113扩增含有Plac的195bp DNA片段(表3)。
用GeneScript合成了一个1.185bp的DNA片段，其中含有源自Rosenbergiellanectarea的nec基因的密码子优化版本(表5)。使用寡核苷酸O741和O742通过PCR扩增nec基因。
纯化所有PCR片段(质粒主链、包含启动子的元件和nec基因)，组装质粒主链、启动子元件(PglpF或Plac)和含有nec的DNA片段。通过标准用户克隆法克隆质粒。可使用任何标准的DNA克隆技术在任何适当的质粒中进行克隆。将质粒转化到TOP10细胞中，并且在含有100μg/mL氨苄青霉素(或任何合适的抗生素)和0.2％葡萄糖的LB板上进行选择。纯化构建的质粒，并且通过DNA测序(MWG Eurofins Genomics)验证启动子序列和nec基因的5’端。通过这种方式，构建了含有与nec基因相关的任何启动子的基因盒。
表6：用于菌株构建的辅助质粒和供体质粒的示例
质粒 相关基因型 标记基因
pACBSR Para-I-Scel-λRed,p15A ori,cam* cam
pUC57 pMB1,bla bla
pUC57::gal pUC57::galTK’/T1-galKM’ bla
菌株的构建
使用的细菌菌株MDO是由大肠杆菌K-12DH1构建的。大肠杆菌K-12DH1基因型为：F-、λ-、gyrA96、recA1、relA1、endA1、thi-1、hsdR17、supE44。除了大肠杆菌K-12DH1基因型外，MDO还有以下修饰：lacZ：缺失1.5kbp；lacA：缺失0.5kbp；nanKETA：缺失3.3kbp；melA：缺失0.9kbp；wcaJ：缺失0.5kbp；mdoH：缺失0.5kbp，以及在gmd基因上游插入Plac启动子。
插入含有连接到nec基因和T1转录终止序列的启动子的表达盒基本上是通过基因吞噬来完成的，如Herring等人(Herring，C.D.，Glasner，J.D.和Blattner,F.R.(2003).基因(Gene)(311).153-163)所述。简而言之，将供体质粒和辅助质粒共转化到MDO中，并且在含有0.2％葡萄糖、氨苄青霉素(100μg/mL)或卡那霉素(50mg/mL)和氯霉素(20μg/mL)的LB板上进行选择。将单个菌群接种在1mL含有氯霉素(20μg/mL)的和10μL的20％L-阿拉伯糖的LB中，并且在37℃下振荡培养7至8小时。为了整合大肠杆菌细胞的galK位点，然后将其接种在M9-DOG平板上，并且在37℃下温育48小时。在含有0.2％葡萄糖的LB平板上重新划线在MM-DOG平板上形成的单个菌群，并且在37℃下培养24小时。在MacConkey半乳糖琼脂平板上出现白色菌群，并且对氨苄青霉素和氯霉素均敏感，预计这些菌群已失去供体和辅助质粒，并且在galK位点中含有插入。使用引物O48(SEQ ID NO:13)和O49(SEQ ID NO:14)通过菌群PCR鉴定galK位点的插入，并且通过测序(Eurofins Genomics，德国)验证插入的DNA。
使用不同的选择标记基因以类似的方式在大肠杆菌染色体DNA的其它位点插入遗传盒。
深孔测定
来自LB平板的单个菌群在含有5g/L葡萄糖、1M MgSO4和4mg/L硫胺素的1mL基本最低培养基中，在10mL 24孔板(Axygen)中预培养。在使用疏水性气体渗透粘合剂密封(Axygen)培养之前，将培养板密封，并且在34℃下在轨道振动筛(Edmund Buhler GmbH)中以700rpm的转速振动培养24小时。使用S-20分光光度计(德国Boeco)在600nm处监测培养物的细胞密度。在含有0.1g/L葡萄糖、5g/L乳糖、20g/L蔗糖、1M MgSO4、4mg/L硫胺素和0.25mg/L SUH(Sigma)的2mL基本最低培养基中接种40μl过夜培养物。如果合适，添加IPTG。用密封箔覆盖深孔板，并且在28℃下培养48或72小时，以700rpm的速度振荡轨道。温育后，测量OD600，并且用密封胶带覆盖板进行加热(Saveen Werner)，并且在100℃温度下在热混合器中以400rpm摇动温育1小时。
为了分析总样品，通过4.700rpm离心10分钟沉淀通过煮沸制备的细胞裂解物。通过HPLC或HPAC方法测定上清液中的HMO浓度。
在以4.700rpm对深孔板进行10分钟的初始离心后，保留上清液样品以进行分析测量。为了分析细胞沉淀，丢弃剩余的上清液，并且用2mL冷PBS洗涤细胞。在该洗涤步骤和重新离心后，将沉淀重新悬浮在500mL MQ水中，并且将整个深孔板在热混合器中以400rpm摇动煮沸1小时。通过以4.700rpm离心10分钟沉淀通过煮沸制备的细胞裂解物。上清液中的HMO浓度通过HPLC或HPAC方法测定。
结果
实施例1.表达nec基因的2’-FL生产的大肠杆菌工程化
大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可被操纵以表达目的异源基因。例如，菌株MPA1是过表达α-1,2-岩藻糖基转移酶基因、futC和结肠酸基因(gmd-fcl-gmm-wcal-cpsB-cpsG)的2’-FL生产菌株。将含有与nec基因连接的启动子元件(PglpF)的表达盒插入MPA2染色体DNA，导致i)相对较高滴度的2’-FL(图1A)，ii)细胞组分中较低量的2’-FL和培养基中较高量的2’-FL(图1B)，iii)相对较低的DFL与2’-FL的比率(图1C)，和iv)当在600nm处测量细胞密度时相对较低的光密度(图1D)。
实施例2.表达nec基因的3-FL生产的大肠杆菌工程化
大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可被操纵以表达目的异源基因。例如，菌株MPA3是过表达α-1,3-岩藻糖基转移酶基因futA和结肠酸基因(gmd-fcl-gmm-wcal-cpsB-cpsG)的3-FL生产菌株。将含有与nec基因连接的启动子元件(Plac)的表达盒以单拷贝插入MPA3背景菌株(见MPA4菌株)，导致i)培养基组分中相对较高量的3-FL，和ii)细胞内相对较低量的3-FL。
实施例3.表达nec基因的LNT2生产的大肠杆菌工程化
大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可被操纵以表达目的异源基因。例如，菌株MP4002是最佳过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因IgtA的LNT2生产菌株(表4)。
总样品分析(图3)表明，当含有与nec基因连接的启动子元件(PglpF)的表达盒整合到菌株MP4002的染色体DNA中以生成菌株MP4039时，LNT2滴度可显著提高(表2)。有趣的是，菌株MP4039的LNT2细胞外部分也比菌株MP4002大得多，这一事实还反映在表达nec的菌株MP4039的沉淀部分中检测到的三糖水平低于非转运体表达菌株MP4002中的对应水平(图3)。
实施例4.使用nec基因的LNT生产的大肠杆菌工程化
大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可被操纵以表达目的的异源基因。例如，菌株MP4473是过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因IgtA和β-1,3-半乳糖基转移酶基因galTK的LNT生产菌株(表4)。
将含有与nec基因连接的启动子元件(PglpF)的表达盒插入菌株MP4473的染色体DNA中生成菌株MP4537(表2)，导致i)总LNT滴度增加2倍以上，ii)总LNT2浓度适度增加，以及iii)总pLNH2形成增加2倍以上(图4)。
与在MP4473培养基中测得的浓度相比，菌株MP4537培养物上清液中的LNT浓度增加了2倍(图4)。尽管可观察到有限的Nec介导的LNT2输出，但菌株MP4537中的细胞外LNT2部分仅略高于菌株MP4473中的部分。LNT2转运事件的发生速度可能比Nec介导的LNT输出事件要慢。有趣的是，尽管转运体表达细胞中总pLNH2形成量大幅增加，但pLNH2仅在菌株MP4537的细胞沉淀中发现(图4)。
实施例5.使用nec基因的LNFP-I生产的大肠杆菌工程化
大肠杆菌K-12(DH1)MDO菌株可被操纵以表达目的异源基因。例如，菌株MP2789是过表达β-1,3-N-乙酰氨基葡萄糖转移酶基因IgtA、β-1,3-半乳糖基转移酶基因galTK、α-1,2-岩藻糖基转移酶基因futC和天然结肠酸基因(gmd-fcl-gmm-wcal-cpsB-cpsG)的LNFP-I生产菌株(表4)。将含有与nec基因连接的启动子元件(PglpF)的表达盒插入菌株MP2789的染色体DNA中以生成菌株MP4597(表2)，导致i)类似的LNFP-I滴度，ii)总2’-FL滴度增加2倍以上，以及iii)显著更高的总HMO总和(2’-FL、LNFP-I和LNT)(图5)。此处提供的数据表明，2’-FL而不是LNFP-I和LNT被有效地转运出表达nec转运体的细胞，并且以这种方式2’-FL的形成和后续输出在表达Nec的LNFP-I生产细胞中是有利的。
序列表
<110> 格礼卡姆股份公司
<120> HMO生产
<130> P2937WO00
<150> DK202000833
<151> 2020-07-13
<150> DK202000085
<151> 2020-01-23
<160> 17
<170> BiSSAP 1.3.6
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> Rosenbergiella nectarea
<220>
<223> Nec_WP_092672081.1\优化的翻译
<400> 1
Met Gln Ser Phe Thr Pro Pro Ala Pro Lys Gly Gly Asn Pro Val Phe
1 5 10 15
Met Met Phe Met Leu Val Thr Phe Phe Val Ser Ile Ala Gly Ala Leu
20 25 30
Gln Ala Pro Thr Leu Ser Leu Tyr Leu Ser Gln Glu Leu Ala Ala Lys
35 40 45
Pro Phe Met Val Gly Leu Phe Phe Thr Ile Asn Ala Val Thr Gly Ile
50 55 60
Ile Ile Ser Phe Ile Leu Ala Lys Arg Ser Asp Arg Lys Gly Asp Arg
65 70 75 80
Arg Arg Leu Leu Met Phe Cys Cys Ala Met Ala Ile Ala Asn Ala Leu
85 90 95
Met Phe Ala Phe Val Arg Gln Tyr Val Val Leu Ile Thr Leu Gly Leu
100 105 110
Ile Leu Ser Ala Leu Thr Ser Val Val Met Pro Gln Leu Phe Ala Leu
115 120 125
Ala Arg Glu Tyr Ala Asp Arg Thr Gly Arg Glu Val Val Met Phe Ser
130 135 140
Ser Val Met Arg Thr Gln Met Ser Leu Ala Trp Val Ile Gly Pro Pro
145 150 155 160
Ile Ser Phe Ala Leu Ala Leu Asn Tyr Gly Phe Ile Thr Leu Tyr Leu
165 170 175
Val Ala Ala Ala Leu Phe Leu Leu Ser Leu Ile Leu Ile Lys Thr Thr
180 185 190
Leu Pro Ser Val Pro Arg Leu Tyr Pro Ala Glu Asp Leu Ala Lys Ser
195 200 205
Ala Ala Ser Gly Trp Lys Arg Thr Asp Val Arg Phe Leu Phe Ala Ala
210 215 220
Ser Val Leu Met Trp Val Cys Asn Leu Met Tyr Ile Ile Asp Met Pro
225 230 235 240
Leu Tyr Ile Ser Lys Ser Leu Gly Met Pro Glu Ser Phe Ala Gly Val
245 250 255
Leu Met Gly Thr Ala Ala Gly Leu Glu Ile Pro Val Met Leu Leu Ala
260 265 270
Gly Tyr Leu Ala Lys Arg Val Gly Lys Arg Pro Leu Val Ile Val Ala
275 280 285
Ala Val Cys Gly Leu Ala Phe Tyr Pro Ala Met Leu Val Phe His Gln
290 295 300
Gln Thr Gly Leu Leu Ile Ile Gln Leu Leu Asn Ala Val Phe Ile Gly
305 310 315 320
Ile Val Ala Gly Leu Val Met Leu Trp Phe Gln Asp Leu Met Pro Gly
325 330 335
Lys Ala Gly Ala Ala Thr Thr Leu Phe Thr Asn Ser Val Ser Thr Gly
340 345 350
Met Ile Phe Ala Gly Leu Cys Gln Gly Leu Leu Ser Asp Leu Leu Gly
355 360 365
His Gln Ala Ile Tyr Val Leu Ala Thr Val Leu Met Val Ile Ala Leu
370 375 380
Leu Leu Leu Leu Arg Val Lys Glu Gln Ala
385 390
<210> 2
<211> 1185
<212> DNA
<213> Rosenbergiella nectarea
<220>
<223> nec核苷酸序列
<400> 2
atgcagagct tcaccccgcc ggcgccgaag ggtggcaacc cggtgttcat gatgtttatg 60
ctggtgacct tctttgtgag cattgcgggt gcgctgcagg cgccgaccct gagcctgtac 120
ctgagccaag agctggcggc gaaaccgttc atggtgggcc tgttctttac cattaacgcg 180
gttaccggta tcattatcag ctttatcctg gcgaagcgta gcgaccgtaa aggtgaccgt 240
cgtcgtctgc tgatgttctg ctgcgcgatg gcgatcgcga acgcgctgat gttcgcgttt 300
gttcgtcagt acgtggttct gattaccctg ggcctgatcc tgagcgcgct gaccagcgtg 360
gttatgccgc aactgttcgc gctggcgcgt gagtatgcgg accgtaccgg tcgtgaagtg 420
gttatgttta gcagcgtgat gcgtacccaa atgagcctgg cgtgggttat tggcccgccg 480
atcagcttcg cgctggcgct gaactacggt tttattaccc tgtatctggt ggctgcggcg 540
ctgtttctgc tgagcctgat tctgatcaag accaccctgc cgagcgttcc gcgtctgtat 600
ccggcggaag acctggcgaa gagcgcggcg agcggttgga aacgtaccga tgtgcgtttc 660
ctgtttgcgg cgagcgtgct gatgtgggtt tgcaacctga tgtacattat cgatatgccg 720
ctgtatatca gcaaaagcct gggtatgccg gagagcttcg cgggtgttct gatgggcacc 780
gcggcgggtc tggaaattcc ggtgatgctg ctggcgggct acctggcgaa gcgtgttggt 840
aaacgtccgc tggtgattgt tgcggcggtg tgcggcctgg cgttctatcc ggcgatgctg 900
gtttttcacc agcaaaccgg tctgctgatt atccagctgc tgaacgcggt gttcattggc 960
atcgtggcgg gtctggttat gctgtggttt caagacctga tgccgggtaa agcgggtgcg 1020
gcgaccaccc tgttcaccaa cagcgttagc accggcatga tctttgcggg cctgtgccag 1080
ggtctgctga gcgatctgct gggtcaccaa gcgatttacg tgctggcgac cgtgctgatg 1140
gttatcgcgc tgctgctgct gctgcgtgtt aaagagcagg cgtaa 1185
<210> 3
<211> 300
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> PglpF 表达元件
<300>
<310> WO2019123324
<311> 19.12.2018
<312> 27.06.2019
<400> 3
gcggcacgcc ttgcagatta cggtttgcca cacttttcat ccttctcctg gtgacataat 60
ccacatcaat cgaaaatgtt aataaatttg ttgcgcgaat gatctaacaa acatgcatca 120
tgtacaatca gatggaataa atggcgcgat aacgctcatt ttatgacgag gcacacacat 180
tttaagttcg atatttctcg tttttgctcg ttaacgataa gtttacagca tgcctacaag 240
catcgtggag gtccgtgact ttcacgcata caacaaacat taaccaagga ggaaacagct 300
<210> 4
<211> 195
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Plac 表达元件
<300>
<310> WO2019123324
<311> 19.12.2018
<312> 27.06.2019
<400> 4
atgcgcaaat tgtgagttag ctcactcatt aggcacccca ggctttacac tttatgcttc 60
cggctcgtat gttgtgtgga attgtgagcg gataacaatt tcacacagga aacagctatg 120
accatgatta cgccaagcgc gcaattaacc ctcactaaag ggaacaaaag ctgggtacct 180
aaggaggaaa cagct 195
<210> 5
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O40 主链.for
<220>
<221> misc_RNA
<222> 9
<400> 5
attaacccuc caggcatcaa ataaaacgaa aggc 34
<210> 6
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Plac.for
<400> 6
atgcgcaaau tgtgagttag ctcactcatt ag 32
<210> 7
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O79 主链.rev
<220>
<221> misc_RNA
<222> 10
<400> 7
atttgcgcau caccaatcaa attcacgcgg cc 32
<210> 8
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Plac.rev
<400> 8
agctgttucc tccttaggta cccagctttt gttccc 36
<210> 9
<211> 32
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O261, PglpF.for
<220>
<221> misc_RNA
<222> 10
<400> 9
atgcgcaaau gcggcacgcc ttgcagatta cg 32
<210> 10
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O262, PglpF.rev
<220>
<221> misc_RNA
<222> 8
<400> 10
agctgttucc tccttggtta atgtttgttg tatgcg 36
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O741, nec.for
<220>
<221> misc_RNA
<222> 8
<400> 11
aaacagcuat gcagagcttc accccgcc 28
<210> 12
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O742, nec.rev
<220>
<221> misc_RNA
<222> 9
<400> 12
agggttaaut tacgcctgct ctttaacacg cagc 34
<210> 13
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O48, galK.for
<400> 13
cccagcgaga cctgaccgca gaac 24
<210> 14
<211> 24
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物 O49, glaK.rev
<400> 14
ccccagtcca tcagcgtgac tacc 24
<210> 15
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列PmglB_70UTR
<400> 15
tgcgtcgcca ttctgtcgca acacgccaga atgcggcggc gatcactaac tcaacaaatc 60
aggcgatgta accgctttca atctgtgagt gatttcacag tatcttaaca atgtgatagc 120
tatgattgca ccgtgcctac aagcatcgtg gaggtccgtg actttcacgc atacaacaaa 180
cattaaccaa ggaggaaaca gct 203
<210> 16
<211> 203
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列PmglB_70UTR_SD4
<400> 16
tgcgtcgcca ttctgtcgca acacgccaga atgcggcggc gatcactaac tcaacaaatc 60
aggcgatgta accgctttca atctgtgagt gatttcacag tatcttaaca atgtgatagc 120
tatgattgca ccgtgcctac aagcatcgtg gaggtccgtg actttcacgc atacaacaaa 180
cattaaccaa ctaggaaaca gct 203
<210> 17
<211> 291
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 启动子序列PgatY_70UTR
<400> 17
cggcaaccta tgcctgatgc gacgctgaag cgtcttatca tgcctacata gcactgccac 60
gtatgtttac accgcatccg gcataaaaac acgcgcactt tgctacggct tccctatcgg 120
gaggccgttt ttttgccttt cactcctcga ataattttca tattgtcgtt tttgtgatcg 180
ttatctcgat atttaaaaac aaataatttc attatatttt gtgcctacaa gcatcgtgga 240
ggtccgtgac tttcacgcat acaacaaaca ttaaccaagg aggaaacagc t 291

Claims (14)

1.一种能够生产一种或多种人乳寡糖(HMO)的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物的重组核酸，所述功能性同源物的氨基酸序列与SEQID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性。
2.根据权利要求1所述的遗传修饰细胞，其中所述寡糖选自2’-岩藻糖基乳糖(2’-FL)、3-岩藻糖基乳糖(3-FL)、二岩藻糖基乳糖(DFL)、3’-唾液酸乳糖(3’-SL)、6’-唾液酸乳糖(6’-SL)、乳-N-三糖-2(LNT-2)、乳-N-四糖(LNT)、乳-N-岩藻五糖I(LNFP I)、乳-N-岩藻五糖II(LNFP II)、乳-N-岩藻五糖III(LNFP III)、乳-N-岩藻五糖IV(LNFP IV)、和乳-N-岩藻五糖V(LNFP V)、和/或对-乳-N-新六糖(pLNnH)。
3.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述遗传修饰细胞是大肠杆菌Escherichia coli。
4.根据前述权利要求中任一项所述的遗传修饰细胞，其中所述细胞还包含重组DNA序列，所述重组DNA序列包含用于调控所述重组核酸表达的调控元件。
5.根据权利要求4所述的遗传修饰细胞，其中用于调控所述重组核酸表达的所述调控元件是表达元件，诸如lac启动子Plac，或glp启动子PglpF。
6.一种核酸构建体，其包含编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物的核酸序列，所述功能性同源物与SEQ ID NO:1具有超过80％的序列同一性，其中编码SEQ ID NO:1的蛋白的所述核酸序列与SEQ ID NO:2具有至少70％的序列同一性。
7.根据权利要求6所述的核酸构建体，其中所述构建体还包含含有调控元件的核酸序列。
8.根据权利要求7所述的核酸构建体，其中所述调控元件调控与SEQ ID NO:2具有至少70％序列同一性的所述核酸序列的表达。
9.根据权利要求7-8中任一项所述的核酸构建体，其中用于调控重组核酸表达的所述调控元件是表达元件，诸如lac启动子Plac，或glp启动子PglpF。
10.一种生产一种或多种寡糖的方法，所述方法包括以下步骤：
(i)提供能够生产HMO的遗传修饰细胞，其中所述细胞包含编码SEQ ID NO:1的蛋白或其功能性同源物的重组核酸，所述功能性同源物的氨基酸序列与SEQ ID NO:1具有至少80％同一性，优选至少85％同一性，更优选至少90％同一性；
(ii)在合适的细胞培养基中培养根据(i)所述的细胞，以表达所述重组核酸；
(iii)收获步骤(ii)中生产的一种或多种HMO。
11.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体在生产一种或多种寡糖，优选一种或多种人乳寡糖中的用途。
12.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体在生产选自2’-FL、3-FL、DLF、LNT、LNT-II、LNnT、LNFP-1、pLNnH和pLNH-II的HMO中的用途。
13.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体在生产选自2’-FL、3-FL、DLF、LNT、LNT-II、LNnT、pLNnH和pLNH-II的HMO中的用途。
14.根据权利要求1-5中任一项所述的遗传修饰细胞或根据权利要求6-9中任一项所述的核酸构建体在生产选自2’-FL、3-FL、LNT、LNT-II、LNnT和pLNH-II的HMO中的用途。
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