CN116490606A - 细胞的基因组修饰的组合物和方法以及它们的用途 - Google Patents

细胞的基因组修饰的组合物和方法以及它们的用途 Download PDF

Info

Publication number
CN116490606A
CN116490606A CN202180078424.8A CN202180078424A CN116490606A CN 116490606 A CN116490606 A CN 116490606A CN 202180078424 A CN202180078424 A CN 202180078424A CN 116490606 A CN116490606 A CN 116490606A
Authority
CN
China
Prior art keywords
cell
endogenous gene
sequence
transgene
rna
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN202180078424.8A
Other languages
English (en)
Inventor
A·库珀
A·伯勒斯
P-K·徐
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Arsenal Biosciences Inc
Original Assignee
Arsenal Biosciences Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Arsenal Biosciences Inc filed Critical Arsenal Biosciences Inc
Publication of CN116490606A publication Critical patent/CN116490606A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
    • C12N15/90—Stable introduction of foreign DNA into chromosome
    • C12N15/902—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination
    • C12N15/907—Stable introduction of foreign DNA into chromosome using homologous recombination in mammalian cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/461—Cellular immunotherapy characterised by the cell type used
    • A61K39/4611—T-cells, e.g. tumor infiltrating lymphocytes [TIL], lymphokine-activated killer cells [LAK] or regulatory T cells [Treg]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/46—Cellular immunotherapy
    • A61K39/463—Cellular immunotherapy characterised by recombinant expression
    • A61K39/4631—Chimeric Antigen Receptors [CAR]
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/16—Hydrolases (3) acting on ester bonds (3.1)
    • C12N9/22—Ribonucleases RNAses, DNAses
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2207/00—Modified animals
    • A01K2207/12—Animals modified by administration of exogenous cells
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2227/00—Animals characterised by species
    • A01K2227/10—Mammal
    • A01K2227/105—Murine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01K—ANIMAL HUSBANDRY; CARE OF BIRDS, FISHES, INSECTS; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
    • A01K2267/00—Animals characterised by purpose
    • A01K2267/03—Animal model, e.g. for test or diseases
    • A01K2267/0331—Animal model for proliferative diseases
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/715—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons
    • C07K14/7155—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants for cytokines; for lymphokines; for interferons for interleukins [IL]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/20—Type of nucleic acid involving clustered regularly interspaced short palindromic repeats [CRISPRs]
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/80—Vectors containing sites for inducing double-stranded breaks, e.g. meganuclease restriction sites

Abstract

本文提供了用于产生表达外源转基因并且恢复或继续表达内源基因的经基因组编辑的细胞的组合物和方法。还提供了使用所述经基因组编辑的细胞治疗或预防受试者的疾病的方法。

Description

细胞的基因组修饰的组合物和方法以及它们的用途
相关申请的交叉引用
本申请要求2020年10月29日提交的美国临时专利申请号63/107,401的权益和优先权，该临时专利申请的公开内容据此全文以引用方式并入以用于所有目的。
序列表
本申请含有已经以电子方式以ASCII格式提交并且通过引用完整并入本文的序列表。所述ASCII副本创建于2021年10月29日，名称为ANB-204WO_SL_ST25.txt，并且大小为368,991字节。
技术领域
本发明总体上涉及用于将转基因插入到细胞中以应用于过继性细胞疗法的组合物和方法。
背景技术
经遗传工程改造的免疫细胞疗法已经发展了数十年，并且已被证明在治疗某些癌症中是有效的。从随机整合病毒基因修饰方法到靶向非病毒整合的演变极有希望进一步解锁细胞免疫疗法的潜力。然而，靶向转基因整合所特有的关键工程改造的挑战仍然存在。转基因掺入的效率总是低于100％，并且目前用于选择和/或富集具有整合的转基因的细胞的方法主要基于允许亲和纯化或赋予抗生素抗性的转基因产物的表达。
例如，转基因可被工程改造成包含编码抗体试剂可接近的细胞表面蛋白的基因，所述抗体试剂可被荧光标记以实现荧光激活细胞分选(FACS)，或连接至磁珠以实现基于磁体的富集。可替代地，细胞可被工程改造成表达荧光蛋白(例如，绿色荧光蛋白)以实现FACS。在另一个示例中，可将抗生素抗性标记(例如，嘌呤霉素抗性基因)掺入到转基因中并且使该抗生素抗性标记由转基因表达，以使得具有转基因成功整合的细胞是抗生素抗性的，而不具有成功整合的细胞对抗生素治疗敏感。虽然这些标准方法是有效的，但它们需要表达相对长的外源蛋白，除非可以为转基因本身生产选择试剂，假设它是细胞表面蛋白。
在另一种方法中，可将转基因整合到诸如次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(HPRT)的基因座中。HPRT催化2-硫代鸟嘌呤转化为细胞毒性代谢物。转基因向HPRT基因座中的插入破坏了HPRT的表达，并且可通过用2-硫代鸟嘌呤处理细胞来选择整合的细胞。这种和其他位点特异性转基因插入方法常常被制作成宿主细胞存活或功能所必需的基因，并且插入通常使插入位点处的基因失活。因此，在校正基因破坏时同时实现转基因插入以促进细胞存活和功能的方法可有益于过继性免疫细胞疗法的开发和应用。
发明内容
本公开涉及用于在维持基因座基因产物的表达的同时将位点特异性转基因插入细胞基因组中以有益于细胞健康和存活的组合物和方法。
本文提供了一种用于靶向插入核酸的组合物，所述核酸包含与细胞的内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，该组合物包含：靶向内源基因的向导RNA(gRNA)；与gRNA复合的RNA指导的核酸酶；以及核酸，该核酸与RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及转基因。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，其中核酸的与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和转基因被插入到插入位点中，并且其中核酸的与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和转基因的插入导致内源基因的恢复或继续表达以及转基因在细胞中的表达。
在其他实施方案中，该组合物包含：靶向内源基因的gRNA；与gRNA复合的RNA指导的核酸酶；以及核酸，该核酸与RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、外源转基因以及与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，其中核酸的转基因和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列被插入到插入位点中，并且其中核酸的转基因和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的插入导致内源基因的恢复或继续表达以及转基因在细胞中的表达。
本文还提供了一种包含核酸的细胞，所述核酸从5'到3'包含：(1)编码所述细胞的内源基因的5'部分的序列，(2)与所述细胞的内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列，(3)编码外源转基因的序列，以及(4)编码所述细胞的内源基因的3'部分的序列，其中所述细胞表达由(1)和(2)编码的内源基因以及由(3)编码的转基因中的每一者。
在其他实施方案中，本文提供了一种包含核酸的细胞，所述核酸从5'到3'包含：(1)与所述细胞的内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列，(2)编码外源转基因的序列，(3)编码所述细胞的内源基因的5'部分的序列，以及(4)编码所述细胞的内源基因的3'部分的序列，其中所述细胞表达由(2)编码的转基因以及由(3)和(4)编码的内源基因中的每一者。
在另一方面，本文提供了一种用于编辑细胞的基因组的方法，该方法包括：向细胞中引入靶向细胞中的内源基因的gRNA、与gRNA复合的RNA指导的核酸酶，以及核酸，该核酸与RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，其中核酸的与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和外源转基因被插入到插入位点中，并且其中核酸的与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列、和外源转基因的插入导致内源基因的恢复或继续表达以及转基因在细胞中的表达。
在又一方面，本文提供了一种用于编辑细胞的基因组的方法，该方法包括：向细胞中引入靶向细胞中的内源基因的gRNA、与gRNA复合的RNA指导的核酸酶，以及核酸，该核酸与RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、外源转基因以及与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，其中核酸的外源转基因和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列被插入到插入位点中，并且其中核酸的外源转基因和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的插入导致内源基因的恢复或继续表达以及转基因在细胞中的表达。
在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和核酸经由非病毒递送被引入到细胞中。例如，在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和核酸经由电穿孔被引入到细胞中。在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和/或核酸经由病毒递送被引入到细胞中。例如，在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和/或核酸经由腺相关病毒(例如，AAV6)被引入到细胞中。
在一些实施方案中，内源基因选自由以下组成的组：T细胞受体α链恒定区(TRAC)、T细胞受体β链恒定区(TRBC)、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链和IL-2Rγ链(IL2RG)。例如，在一些实施方案中，内源基因是TRAC。例如，在其他实施方案中，内源基因是IL2RG。
在一些实施方案中，内源基因是β肌动蛋白(Actb)、ATP合酶H+转运子(transporting)、线粒体F0复合物亚基B1(Atp5f1)、β-2微球蛋白(B2m)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、葡萄糖醛酸酶β(Gusb)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)、磷酸甘油酸激酶I(Pgk1)、肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、核糖体蛋白S18(Rps18)、TATA盒结合蛋白(Tbp)、转铁蛋白受体(Tfrc)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白ζ多肽(Ywhaz)、Nanog同源框(Nanog)、锌指蛋白42(Rex1)和POU结构域5类转录因子1(Oct4)。在一些实施方案中，内源基因是Gapdh。
在一些实施方案中，转基因包含嵌合抗原受体(CAR)。
在一些实施方案中，细胞是免疫细胞，任选地是T细胞。例如，在一些实施方案中，T细胞是CD4+或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导性多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的自然杀伤细胞(iNK)。在一些实施方案中，免疫细胞是免疫细胞祖细胞，诸如多能干细胞。
在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶是Cas9。
在一些实施方案中，gRNA是单向导RNA(sgRNA)或crRNA:反式激活RNA(tracrRNA)。
在另一方面，提供了一种治疗受试者的疾病的方法，该方法包括：获得包含如本文所述的核酸的细胞，以及将细胞施用于受试者。在一些实施方案中，疾病是癌症。在一些实施方案中，细胞是从受试者获得的。例如，在某些实施方案中，细胞是T细胞，任选地是CD4+或CD8+ T细胞。
附图说明
图1是概念图，其展示出向导RNA(gRNA)、RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)和编码外源转基因(例如，嵌合抗原受体(CAR))的核酸，以及与细胞的内源基因(例如，T细胞受体α链恒定区(TRAC))的5'部分或3'部分具有等同编码潜能的序列向细胞(例如，T细胞)中的示例性引入，该引入导致外源转基因和内源基因的表达。
图2A是概念图，其展示出与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列、和外源转基因向被RNA指导的核酸酶切割的细胞中的内源基因中的双链断裂处的示例性插入。图2B是展示出在有和没有基因回路插入的情况下用IL2RG的非病毒靶向编辑T细胞的示例性结果的概念图。
图3示出了用靶向TRAC基因座的CRISPR核糖核蛋白(RNP)和质粒修复模板电穿孔的T细胞的流式细胞术点图。图3A示出了用CRISPR RNP和编码CAR的质粒修复模板和截短的EGFR转基因电穿孔的T细胞的流式细胞术点图。图3B示出了在CRISPR靶切割位点之后用CRISPR RNP和编码CAR的质粒修复模板、截短的EGFR转基因和TRAC的编码序列中的所有编码序列电穿孔的T细胞的流式细胞术点图。图3C示出了图3B的EGFR阳性细胞的流式细胞术点图。
图4是示出用靶向TRAC基因座的CRISPR RNP和质粒修复模板电穿孔并用CD3/CD28珠刺激的T细胞中表达CAR的细胞百分比增加倍数的图。
图5示出了在电穿孔后第9天和第14天从两个供体获得的T细胞的流式细胞术点图，该T细胞用靶向IL2RG基因座的CRISPR核糖核蛋白(RNP)和质粒修复模板进行了电穿孔以表达编码具有Prime和CAR受体和Myc标签的回路的外源转基因。
图6A是示出在电穿孔后第9天和第14天，在从四个供体获得的T细胞中表达IL2RG和外源转基因二者的细胞的百分比的图，该T细胞用靶向IL2RG基因座的CRISPR核糖核蛋白(RNP)和质粒修复模板进行了电穿孔以表达编码具有Prime和CAR受体和Myc标签(pS6651)的回路的外源转基因。
图6B是示出在电穿孔后第9天和第14天，在从四个供体获得的T细胞中敲除了IL2RG并且没有转基因整合的细胞的百分比的图，该T细胞用靶向IL2RG基因座的CRISPR核糖核蛋白(RNP)和质粒修复模板进行了电穿孔以表达编码具有Prime和CAR受体和Myc标签(pS6651)的回路的外源转基因。
具体实施方式
本发明提供了用于在细胞的内源基因内的靶位点处靶向插入核酸的组合物和方法，其中核酸包含外源转基因、和内源基因的一部分，并且核酸的插入允许外源转基因的表达和内源基因在细胞中的恢复或继续表达。细胞的内源基因的恢复或继续表达可有益于细胞的健康和存活并且/或者有利于治疗性细胞制造。
为促进对本发明的理解，下面定义了多个术语和短语。
除非上下文不适当，否则如本文所用的术语“一”和“一个(种)”意指“一个(种)或多个(种)”并且包括复数。
术语“核酸”、“核苷酸”或“寡核苷酸”是指呈单链或双链形式的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)以及它们的聚合物。除非明确限制，否则该术语涵盖含有天然核苷酸的已知类似物的核酸，该核酸具有与参考核酸相似的结合特性并且以类似于天然存在的核苷酸的方式代谢。除非另外指明，否则特定核酸序列还隐含地涵盖它的经保守修饰的变体(例如，简并密码子置换)、等位基因、直系同源物、SNP和互补序列，以及明确指出的序列。具体地，简并密码子置换可通过生成其中一个或多个选定(或所有)密码子的第三位被混合碱基和/或脱氧肌苷残基置换的序列来实现(Batzer等人，Nucleic Acid Res.19:5081(1991)；Ohtsuka等人，J.Biol.Chem.260:2605-2608(1985)；以及Rossolini等人，Mol.Cell.Probes 8:91-98(1994))。
术语“基因”可以指参与产生或编码多肽链的DNA节段(segment)。它可包含编码区之前和之后的区域(前导区和尾随区)以及各个编码节段(外显子)之间的间插序列(内含子)。可替代地，术语“基因”可以指参与产生或编码非翻译RNA(诸如rRNA、tRNA、向导RNA(gRNA)、短干扰RNA(siRNA)或微小RNA(miRNA))的DNA节段。
如本文所用，关于细胞中的核酸(例如基因)或蛋白质的术语“内源”是这样的核酸或蛋白质，该核酸或蛋白质如其在自然界被发现的那样(例如，在其天然基因组位置或基因座处)出现在该特定细胞中。此外，“内源性地表达”核酸或蛋白质的细胞如其在自然界被发现的那样表达该核酸或蛋白质。
“启动子”被定义为指导核酸转录的一个或多个核酸控制序列。如本文所用，启动子包含转录起始位点附近的核酸序列，诸如在聚合酶II型启动子情况下的TATA元件。启动子还任选地包括可位于距离转录起始位点多达数千碱基对的位置处的远端增强子或抑制子元件。
当核酸被置于与另一核酸序列的功能关系中时，该核酸是“可操作地连接的”。例如，如果启动子或增强子影响编码序列的转录，则该启动子或增强子可操作地连接至该编码序列；或者如果核糖体结合位点被定位为促进翻译，则该核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。
如本文所用，术语“具有等同编码潜能的序列”是指与另一参考核酸具有功能等同性的核酸序列。具有等同编码潜能的序列可能具有或可能不具有相同的一级核苷酸序列。例如，对于编码所表达的多肽的参考核酸，具有等同编码潜能的序列在功能上能够编码相同的所表达的多肽，并且可包含与参考核酸同一的一级核苷酸序列，或者与参考核酸相比，可包含一个或多个替代密码子。例如，可经由密码子优化来改变编码多肽的内源核酸序列，以得到编码同一多肽的序列。经密码子优化的序列可以是其中编码多肽的多核苷酸中的密码子已被置换以便修改该多核苷酸的活性、表达和/或稳定性的序列。例如，密码子优化可用于在保留编码内源基因的蛋白质产物的潜能的同时改变具有等同编码潜能的序列与内源基因序列相比的序列相似性程度。
“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文中可互换地用来指氨基酸残基的聚合物。如本文所用，该术语涵盖包括全长蛋白质在内的任何长度的氨基酸链，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。
如本文所用，术语“互补的”或“互补性”是指核苷酸或核酸之间的特定碱基配对。互补核苷酸通常是A和T(或A和U)，以及G和C。本文所述的向导RNA(gRNA)可包含序列，例如与基因组序列完全互补或实质上互补(例如，具有1-4个错配)的DNA靶向序列。
如本文所用，术语“靶向核酸酶”是指识别并结合至DNA的特定序列以在特定切割位点处引入单链或双链切割的内切核酸酶。靶核酸酶包括但不限于RNA指导的核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)和megaTAL。
如本文所用，术语“RNA指导的核酸酶”是指与向导RNA(例如，sgRNA或crRNA:tracrRNA)复合的可用于执行靶向基因组编辑的内切核酸酶。
如本文所用，术语“靶切割位点”是指内切酶特异性切割导致单链或双链断裂的基因组位点。
“CRISPR/Cas”系统是指用于防御外来核酸的广泛种类的细菌系统。CRISPR/Cas系统在广泛的真细菌和古细菌生物体中被发现。CRISPR/Cas系统包括I型、II型和III型亚型。野生型II型CRISPR/Cas系统利用与向导和活化RNA复合的RNA指导的核酸酶(例如Cas9)来识别和切割外来核酸。具有向导RNA和活化RNA二者的活性的向导RNA也是本领域已知的。在一些情况下，此类双活性向导RNA被称为单向导RNA(sgRNA)。
Cas9同源物在多种真细菌中被发现，这些真细菌包括但不限于以下分类群组的细菌：放线菌门(Actinobacteria)、产水菌门(Aquificae)、拟杆菌门-绿菌门(Bacteroidetes-Chlorobi)、衣原体门-疣微菌门(Chlam ydiae-Verrucomicrobia)、绿弯菌门(Chlroflexi)、蓝藻门(Cyanobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、螺旋体门(Spirocha etes)和热袍菌门(Thermotogae)。示例性Cas9蛋白是酿脓链球菌(Strep tococcus pyogenes)Cas9蛋白。其他Cas9蛋白及其同源物描述于例如Chylinksi等人，RNA Biol.2013年5月1日，10(5):726–737；Nat.Rev.Microbiol.2011年6月，9(6):467-477；Hou等人，Proc Na tl Acad Sci U S A.2013年9月24日，110(39):15644-9；Sampson等人，Nature.2013年5月9日，497(7448):254-7；以及Jinek等人，Science.2012年8月17日，337(6096):816-21中。本文提供的Cas9核酸酶中的任一Cas9核酸酶的变体可针对在宿主细胞中的有效活性或增强的稳定性进行优化。因此，也考虑了经工程改造的Cas9核酸酶。参见例如Slaymaker等人，Rationally engineered Cas9 nucleaseswith improved specificity,Science 351(6268):84-88(2016))。
如本文所用，术语“Cas9”是指RNA指导的核酸酶(例如，细菌或古细菌起源的，或从其中衍生的RNA指导的核酸酶)。示例性RNA指导的核酸酶包括前述Cas9蛋白及其同源物。其他RNA指导的核酸酶包括Cpf1(参见例如Zetsche等人，Cell，第163卷，第3期，第759-771页，2015年10月22日)及其同源物。
如本文所用，术语“核糖核蛋白”等是指靶向核酸酶的复合物，例如以下的复合物：Cas9蛋白和sgRNA、Cas9蛋白和crRNA、Cas9蛋白和反式激活crRNA(tracrRNA)、Cas9蛋白和向导RNA，或它们的组合(例如，Cas9蛋白、tracrRNA和crRNA向导RNA复合在一起)。应当理解，在本文所述的实施方案中的任一实施方案中，Cas9核酸酶可用Cpf1核酸酶或任何其他指导的核酸酶代替。
如本文所用，术语“复合”是指经由非共价相互作用物理地缔合的两个或更多个分子。例如，在与gRNA复合的RNA指导的核酸酶情况下，该核酸酶经由非共价相互作用与gRNA功能性地缔合，这可以促进该核酸酶募集到gRNA靶向的基因组基因座。类似地，在与核酸复合的RNA指导的核酸酶情况下，该核酸酶经由非共价相互作用与核酸功能性地缔合，这可以促进该核酸募集到靶向基因组基因座，在那里该核酸可用作例如同源定向修复(HDR)的模板。
如本文所用，在编辑或修饰细胞的基因组的上下文中的术语“编辑”或“修饰”是指在靶基因组区域处诱导基因组序列中的结构变化。例如，编辑或修饰可采取将核苷酸序列插入到细胞的基因组中的形式。例如，编码多肽的外源转基因可被插入到T细胞的T细胞受体(TCR)基因座的基因组序列中。如通篇所用，“TCR基因座”是基因组中编码TCRα亚基、TCRβ亚基、TCRγ亚基或TCRδ亚基的基因所位于的位置。此种编辑修饰可以例如通过诱导靶基因组区域内的双链断裂或者位于相对链上并且侧接靶基因组区域的一对单链切口来执行。用于在靶基因组区域处或靶基因组区域内诱导单链或双链断裂的方法包括使用被引导至靶基因组区域的Cas9核酸酶结构域或其衍生物，以及向导RNA(例如，sgRNA或crRNA:tracrRNA)或向导RNA对。
如本文所用，在引入核酸或包含核酸的复合物(例如，RNP-DNA模板复合物)的上下文中的术语“引入”是指使核酸序列或RNP-DNA模板复合物从细胞外部易位到细胞内部。在一些情况下，引入是指使核酸或复合物从细胞外部易位到细胞核内部。考虑了此种易位的各种方法，包括但不限于电穿孔、与纳米线或纳米管接触、受体介导的内化、经由细胞穿透肽的易位、脂质体介导的易位等。
如本文所用，术语“外源”是指自然界中通常没有发现的物质。例如，术语“外源基因”是指自然界中给定细胞中通常没有的基因。
如本文所用，术语“转基因”是指人工引入到细胞基因组中的外源基因，或人工引入到细胞基因组中的非天然基因座中的内源基因。转基因可以指参与产生或编码多肽链的DNA节段。转基因可包含编码区之前和之后的区域(前导区和尾随区)以及各个编码节段(外显子)之间的间插序列(内含子)。可替代地，转基因可以指参与产生或编码非翻译RNA(诸如rRNA、tRNA、gRNA、siRNA或miRNA)的DNA节段。
如本文所用，术语“管家基因”是指基本细胞功能所需的基因，并且在变化的生理和实验条件下在组成上稳定表达。示例性管家基因是Gapdh。
如本文所用，“细胞”可以是真核细胞、原核细胞、动物细胞、植物细胞、真菌细胞等。任选地，细胞是哺乳动物细胞，例如人类细胞。在一些情况下，细胞是免疫细胞。例如，在一些实施方案中，细胞是人类T细胞(例如，CD4+或CD8+ T细胞)或能够分化成表达TCR受体分子的T细胞的细胞。这些包括造血干细胞和衍生自造血干细胞的细胞。在一些实施方案中，细胞是诱导性祖细胞干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，细胞是iPSC衍生的自然杀伤细胞(iNK)。
如本文所用，术语“选择性标记”是指允许选择宿主细胞(例如，T细胞)的基因，该基因包含标记。选择性标记可包括但不限于：荧光标记、发光标记和药物选择性标记、细胞表面受体等。在一些实施方案中，选择可以是正选择；也就是说，从群体中分离表达标记的细胞，例如以创建表达选择性标记的富集细胞群体。可通过适于所用选择性标记的任何方便的分离技术进行分离。例如，如果使用荧光标记，则可通过荧光激活细胞分选术(FACS)分离细胞，而如果插入了细胞表面标记，则可通过亲和分离技术例如磁性分离、亲和色谱、用附着于固体基质的亲和试剂“淘选”、FACS或其他方便的技术从异质群体中分离细胞。
如本文所用，术语“造血干细胞”是指一类可产生血细胞的干细胞。造血干细胞可产生髓样或淋巴样谱系的细胞，或它们的组合。造血干细胞主要在骨髓中被发现，但它们也可以从外周血或其级分中分离。各种细胞表面标记可用于对造血干细胞进行鉴定、分选或纯化。在一些情况下，造血干细胞被鉴定为c-kit+和lin-。在一些情况下，人类造血干细胞被鉴定为CD34+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、lin-。在一些情况下，人类造血干细胞被鉴定为CD34-、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、lin-。在一些情况下，人类造血干细胞被鉴定为CD133+、CD59+、Thy1/CD90+、CD38lo/-、C-kit/CD117+、lin-。在一些情况下，小鼠造血干细胞被鉴定为CD34lo/-、SCA-1+、Thy1+/lo、CD38+、C-kit+、lin-。在一些情况下，造血干细胞是CD150+CD48-CD244-。
如本文所用，短语“造血细胞”是指衍生自造血干细胞的细胞。可通过从生物体、系统、器官或组织(例如，血液或其级分)中分离来获得或提供造血细胞。可替代地，可以分离造血干细胞并且通过使该干细胞分化来获得或提供造血细胞。造血细胞包括分化为此外的细胞类型的潜能有限的细胞。此类造血细胞包括但不限于多能祖细胞、谱系限制性祖细胞、普通髓样祖细胞、粒细胞-巨噬细胞祖细胞或巨核细胞-红细胞样祖细胞。造血细胞包括淋巴样和髓样谱系的细胞，诸如淋巴细胞、红细胞、粒细胞、单核细胞和血小板。在一些实施方案中，造血细胞是免疫细胞，诸如T细胞、B细胞、巨噬细胞、自然杀伤(NK)细胞或树突细胞。在一些实施方案中，细胞是先天免疫细胞。
如本文所用，术语“T细胞”是指表达TCR分子的淋巴样细胞。T细胞包括人alphabeta(αβ)T细胞和人gamma delta(γδ)T细胞。T细胞包括但不限于初始T细胞(T-cell)、经刺激的或经活化的T细胞、原代T细胞(例如，未经培养的)、经培养的T细胞、永生化T细胞、辅助T细胞、细胞毒性T细胞、记忆T细胞、调控性T细胞(Treg)、自然杀伤T细胞、它们的组合或它们的亚群。T细胞可以是CD4+、CD8+或CD4+和CD8+。T细胞也可以是CD4-、CD8-或CD4-和CD8-。T细胞可以是辅助细胞，例如TH1、TH2、TH3、TH9、TH17或TFH类型的辅助细胞。T细胞可以是细胞毒性T细胞。Treg可以是FO XP3+或FOXP3-。T细胞可以是α/βT细胞或γ/δT细胞。在一些情况下，T细胞是CD4+CD25hiCD127lo Treg。在一些情况下，T细胞是选自由1型调控性(Tr1)、TH3、CD8+CD28-、Treg17和Qa-1限制性T细胞或它们的组合或亚群组成的组的Treg。在一些情况下，T细胞是FOXP3+ T细胞。在一些情况下，T细胞是CD4+CD25loCD127hi效应T细胞。在一些情况下，T细胞是CD4+CD25loCD127hiCD45RAhiCD45RO-初始T细胞。T细胞可以是已被遗传操纵的重组T细胞。
如本文所用，在原代细胞的上下文中的术语“原代”是未被转化或永生化的细胞。此类原代细胞可以被培养、亚培养或传代有限次数(例如，被培养0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20次)。在一些情况下，原代细胞适应于体外培养条件。在一些情况下，将原代细胞从生物体、系统、器官或组织中分离，任选地分选，并且在不培养或亚培养的情况下直接使用。在一些情况下，对原代细胞进行刺激、活化或者使原代细胞分化。例如，原代T细胞可通过与CD3、CD28激动剂、IL-2、IFN-γ或它们的组合接触(例如，在存在CD3、CD28激动剂、IL-2、IFN-γ或它们的组合的情况下培养)来活化。
如本文所用，术语“同源定向修复”或HDR是指其中通过从同源模板核酸聚合来修复DNA链的被切割的末端或带切口的末端的细胞过程。因此，用模板序列替换原始序列。在一些情况下，可以引入外源模板核酸例如DNA模板以在靶位点处获得特异性HDR诱导的序列变化。这样，可以在切割位点例如由靶向核酸酶创建的切割位点处引入特异性突变。单链DNA模板或双链DNA模板可被细胞用作用于例如通过HDR编辑或修饰细胞的基因组的模板。一般来讲，单链DNA模板或双链DNA模板具有至少一个与靶位点具有同源性的区域。在一些情况下，单链DNA模板或双链DNA模板具有侧接含有待在靶切割或插入位点处插入的DNA模板的区域的两个同源区(例如5'端和3'端)。
如本文所用，术语“靶向插入”是指将分子(例如，核酸)整合到细胞内的特定位点。在核酸的情况下，靶向插入可以指例如经由HDR将核酸整合到细胞的基因组DNA中特定位置处的单链或双链断裂处，从而产生连续的基因组DNA链。
如在多核苷酸或多肽序列的上下文中所用的术语“实质同一性”或“实质上同一的”是指与参考序列具有至少60％序列同一性的序列。可替代地，同一性百分比可以是从60％至100％的任何整数。示例性实施方案包括：如使用本文所述的程序，优选利用如下所述的标准参数的BLAST与参考序列进行比较的至少60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。本领域技术人员将认识到，通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等，可以适当调整这些值以确定由两个核苷酸序列编码的蛋白质的对应同一性。
对于序列比较，通常一个序列充当与测试序列进行比较的参考序列。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机中，指定子序列坐标(如果需要)，并指定序列算法程序参数。可使用默认程序参数，也可指定可替代的参数。然后，序列比较算法基于程序参数计算测试序列相对于参考序列的序列同一性百分比。
适于确定序列同一性百分比和序列相似性的算法是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于Altschul等人(1990)J.Mol.Biol.215:403-410和Altschul等人(1977)NucleicAcids Res.25:3389-3402中。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站公开获得。该算法包括首先通过识别查询序列中长度为W的短单词来识别高得分序列对(HSP)，该短单词在与数据库序列中相同长度的单词比对时匹配或满足一些正值阈值得分T。T被称为邻近单词得分阈值(Altschul等人，同上)。这些初始邻近单词命中充当启动搜索以找到含有它们的较长HSP的种子。然后使单词命中沿每个序列在两个方向上扩展，直到累积比对得分可以增加。对于核苷酸序列，使用参数M(一对匹配残基的奖励得分；始终>0)和N(错配残基的惩罚得分；始终<0)计算累计得分。对于氨基酸序列，使用评分矩阵计算累积得分。在以下情况下，单词命中在每个方向上的扩展会停止：累计比对得分从其最大实现值下降了数量X；由于一个或多个负评分残基比对的累积，累积得分趋于零或更低；或者到达任一序列的末端。BLAST算法参数W、T和X决定比对的灵敏度和速度。BLASTN程序(对于核苷酸序列)使用为28的单词长度(W)、为10的期望值(E)、M＝1、N＝-2和两条链的比较作为默认值。对于氨基酸序列，BLASTP程序使用为3的单词长度(W)、为10的期望值(E)和BLOSUM62评分矩阵(参见Henikoff和Henikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 89:10915(1989))作为默认值。
BLAST算法还对两个序列之间的相似性执行统计分析(参见例如Karlin和Altschul，Proc.Nat'l.Acad.Sci.USA 90:5873-5787(1993))。BLAST算法提供的一种相似性量度是最小总和概率(P(N))，其提供了两个核苷酸或氨基酸序列之间偶然发生匹配的概率的指示。例如，如果测试核酸与参照核酸的比较中最小总和概率小于约0.01，更优选地小于约10-5，并且最优选地小于约10-20，则认为核酸与参考序列相似。
如本文所用，术语“癌症特异性抗原”是指癌细胞所特有的抗原或在癌细胞中比在非癌细胞中更丰富地表达的抗原。在一些实施方案中，癌症特异性抗原是肿瘤特异性抗原。
如本文所用，术语“受试者”和“患者”是指待通过本文所述的方法和组合物治疗的生物体。此类生物体优选地包括但不限于哺乳动物(例如，鼠、猿、马、牛、猪、犬、猫等)，并且更优选地包括人类。
在整个说明书中，在组合物被描述为具有、包括或包含特定组分的情况下，或者在工艺和方法被描述为具有、包括或包含特定步骤的情况下，考虑了另外存在基本上由所列举组分组成或由所列举组分组成的本发明组合物，并且存在基本上由所列举处理步骤组成或由所列举处理步骤组成的根据本发明的工艺和方法。
I.组合物
本文提供了一种用于靶向插入核酸的组合物，所述核酸包含与细胞的内源基因的3'部分或5'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，该组合物包含：(A)向导RNA(gRNA)；(B)靶向核酸酶；以及(C)核酸(例如，用于DNA修复的模板)。在其他实施方案中，该组合物包含：(A)靶向核酸酶；以及(B)核酸(例如，用于DNA修复的模板)。
A.向导RNA
如本文所用，向导RNA(gRNA)是这样的核酸，该核酸与位点特异性核酸酶或靶向核酸酶相互作用并且与细胞基因组内的靶核酸特异性结合或杂交，从而使得gRNA和与其复合的核酸酶共同定位至细胞基因组中的靶核酸。在一些实施方案中，gRNA包含与基因组中的靶DNA序列特异性地结合或杂交的长度为约10个至约50个核苷酸的DNA靶向序列或前间区序列。例如，在一些实施方案中，DNA靶向序列的长度为约10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49或50个核苷酸。在一些实施方案中，gRNA包含单向导RNA(sgRNA)。在一些实施方案中，gRNA包含crRNA序列和反式激活crRNAtracrRNA序列(crRNA:tracrRNA)。在一些实施方案中，gRNA不包含tracrRNA序列。
在一些实施方案中，DNA靶向序列被设计成与靶DNA序列互补(例如，完全互补)或实质上互补。在一些情况下，DNA靶向序列可掺入摆动或简并碱基以结合多个遗传元件。在一些情况下，结合区的3'或5'端处的19个核苷酸与一个或多个靶遗传元件完全互补。在一些情况下，可改变结合区以增加稳定性。例如，可以掺入非天然核苷酸以增加RNA对降解的抗性。在一些情况下，结合区可被改变或设计成避免或减少结合区中的二级结构形成。在一些情况下，结合区可被设计成优化G-C含量。在一些情况下，G-C含量优选地为在约40％和约60％之间(例如，40％、45％、50％、55％、60％)。
在一些实施方案中，DNA靶向序列与细胞的内源基因互补或实质上互补。例如，在一些实施方案中，DNA靶向序列与编码T细胞受体α链恒定区(TRAC)、T细胞受体β链恒定区(TRBC)、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)的内源基因互补或实质上互补。在某些实施方案中，DNA靶向序列与内源I TRAC互补或实质上互补，并且包含序列AAGTCTCTCAGCTG GTACA(SEQ ID NO:1)。
B.靶向核酸酶
在一些实施方案中，组合物包含靶向核酸酶，包括但不限于RNA指导的核酸酶、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)、锌指核酸酶(ZFN)或megaTAL。例如，在一些实施方案中，靶向核酸酶是RNA指导的核酸酶，该RNA指导的核酸酶与gRNA复合并且被gRNA引导至细胞基因组中的靶区域，在那里该RNA指导的核酸酶在基因组DNA中引入单链或双链断裂。例如，在某些实施方案中，靶向核酸酶是RNA指导的核酸酶。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶是Cas9核酸酶。
在某些实施方案中，Cas9蛋白可呈活性内切核酸酶形式，因此当作为与gRNA的复合物的一部分和/或与核酸(例如，DNA模板)的复合物的一部分结合到靶核酸时，双链断裂被引入到靶核酸中。在本文提供的组合物和方法中，可将Cas9多肽或编码Cas9多肽的核酸引入到细胞中。双链断裂可通过HDR修复以将DNA模板插入到细胞的基因组中。各种Cas9核酸酶可用于本文所述的方法中。例如，可以利用这样的Cas9核酸酶，该Cas9核酸酶需要紧接着向导RNA所靶向区域的3'的NGG前间区序列邻近基序(PAM)。此类Cas9核酸酶可被靶向至例如TRAC的外显子1或TRAB的外显子1中含有NGG序列的区域。又如，具有正交PAM基序要求的Cas9蛋白可被用于靶向不具有相邻NGG PAM序列的序列。具有正交PAM序列特异性的示例性Cas9蛋白包括但不限于Esvelt等人，Nature Methods 10:1116–1121(2013)中描述的那些。
在一些情况下，Cas9蛋白是切口酶，因此当作为与agRNA的复合物的一部分结合至靶核酸时，单链断裂或切口被引入到靶核酸中。各自结合至结构上不同的gRNA的一对Cas9切口酶可被靶向至靶基因组区域的两个近侧位点并且因此将一对近侧单链断裂引入到靶基因组区域，例如TRAC基因的外显子1或TRBC基因的外显子1中。切口酶对可提供增强的特异性，因为脱靶效应可能导致单切口，该单切口一般通过碱基切除修复机制在没有损伤的情况下修复。示例性Cas9切口酶包括具有D10A或H840A突变的Cas9核酸酶(参见例如Ran等人，“Double nicking by RNA-guided CRISPR Cas9 for enhanced genome editingspecificity,”Cell 154(6):1380-1389(2013))。
在其他实施方案中，靶向核酸酶可以是TALEN、ZFN或megaT AL(参见例如Merkert和Martin，“Site-Specific Genome Engineering in Human Pluripotent Stem Cells,”Int.J.Mol.Sci.18(7):1000(2016))。
C.核酸
在一些实施方案中，该组合物还包含与RNA指导的核酸酶复合的核酸，其中该核酸包含与细胞的内源基因具有同源性的一个或多个区域、与内源基因的5'部分或3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，核酸用作DNA修复机制(诸如HDR)的模板。例如，在一些实施方案中，本文提供的核酸包含：与细胞的内源基因中侧接靶切割位点的至少一个区域具有同源性的一个或多个部分；与内源基因的5'编码部分或3'编码部分具有等同编码潜能的序列；以及外源转基因，其中与内源基因的5'编码部分或3'编码部分具有等同编码潜能的序列、和外源转基因被插入到细胞的内源基因内的靶切割位点中。
例如，在一个实施方案中，核酸按从5'到3'的顺序包含：(i)与细胞中内源基因的5'部分具有序列同源性或实质序列同源性的5'同源臂；(ii)与细胞中内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列，该序列具有终止密码子和编码内源基因的蛋白质产物的羧基末端部分的聚腺苷酸化序列；(iii)外源转基因；以及(iv)与细胞中内源基因的3'部分具有序列同源性或实质序列同源性的3'同源臂。当被引入到细胞中时，5'和3'同源臂将核酸与靶内源基因进行比对，并且编码内源基因的蛋白质产物的羧基末端部分的与细胞中内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列、和外源转基因经由DNA修复机制(例如，同源定向修复(HDR))被插入到内源基因内的靶切割位点(例如，通过靶向核酸酶引入)中。与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列、和外源转基因的插入导致内源基因产物的恢复或继续表达以及外源转基因的表达。
在另一个实施方案中，核酸按从5'到3'的顺序包含：(i)与细胞中内源基因的5'部分具有序列同源性或实质序列同源性的5'同源臂；(ii)外源转基因；(iii)编码内源基因的蛋白质产物的氨基末端部分的与细胞中内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列；以及(iv)与细胞中内源基因的3'部分具有序列同源性或实质序列同源性的3'同源臂。当被引入到细胞中时，5'和3'同源臂将核酸与靶内源基因进行比对，并且外源转基因和编码内源基因的蛋白质产物的氨基末端部分的与细胞中内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列经由DNA修复机制(例如，HDR)被插入到内源基因内的靶切割位点(例如，通过靶向核酸酶引入)中。外源转基因和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的插入导致外源转基因的表达以及内源基因产物的恢复或继续表达。
使用靶向核酸酶递送编码与细胞存活或扩增关连的蛋白质(例如，Gapdh、IL2RG或TRAC)的基因内的切割位点，并然后将与存活基因的3'部分或5'部分具有等同编码潜能的序列与期望的外源转基因(例如，CAR或基因回路)一起引入的概念可以被推广到与细胞存活关连的所有蛋白质。在某些方面，经历靶核酸酶活性的细胞将与或不与期望的转基因整合以恢复关键的蛋白质表达。未接受插入物(insert)的细胞集合将缺乏相应的蛋白质(例如，IL2RG或其他管家基因)，并且将不能存活。不具有整合的细胞一般将在培养物中随时间耗尽。相反，接受期望的转基因的细胞也将恢复相应蛋白质的表达，并且一般将在培养和制造期间在培养物中富集。使用这种方法，成功整合外源转基因(例如，CAR或基因回路)的细胞一般将具有优先存活和富集。在一些实施方案中，转基因可以是用于为感兴趣的细胞增添期望功能性的CAR、基因回路或任何其他有效载荷。靶基因可以编码例如在制造期间与细胞存活或扩增关连的任何蛋白质。在T细胞的情况下，这可包括构成TCR信号传导复合物、细胞因子受体以及它们的下游信号传导分子的一个或多个基因，和/或与T细胞存活或扩增关连的任何管家基因，例如TRAC、IL2RG或Gapdh。
在本文所述的一些实施方案中，与内源基因具有同源性的一个或多个区域中的每个区域的长度为至少约50、100、150、200、250、300、350、400或450个核苷酸。在一些实施方案中，与内源基因具有同源性的一个或多个区域与内源基因至少80％、90％、95％、99％或100％互补。在一些实施方案中，所述具有同源性的一个或多个区域与人免疫细胞(例如T细胞)中的基因组序列同源。在一些实施方案中，所述具有同源性的一个或多个区域与TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)同源。
例如，在一些实施方案中，与内源基因具有同源性的区域可具有至少约50、100、150、200、250、300、350、400或450个核苷酸的长度，并且在该具有同源性的区域的长度上与表1中的任何内源基因序列具有至少80％、90％、95％、99％或100％的互补性。
表1-内源基因
在一些实施方案中，所述具有同源性的一个或多个区域与一个或多个内源管家基因的基因组序列同源。在一些实施方案中，所述具有同源性的一个或多个区域与以下同源：β肌动蛋白(Actb)、ATP合酶H+转运子、线粒体F0复合物亚基B1(Atp5f1)、β-2微球蛋白(B2m)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、葡萄糖醛酸酶β(Gusb)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)、磷酸甘油酸激酶I(Pgk1)、肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、核糖体蛋白S18(Rps18)、TATA盒结合蛋白(Tbp)、转铁蛋白受体(Tfrc)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白ζ多肽(Ywhaz)、Nanog同源框(Nanog)、锌指蛋白42(Rex1)或POU结构域5类转录因子1(Oct4)。
例如，在一些实施方案中，与内源管家基因具有同源性的区域可具有至少约50、100、150、200、250、300、350、400或450个核苷酸的长度，并且在该具有同源性的区域的长度上与表2中的任何内源基因序列具有至少80％、90％、95％、99％或100％的互补性。
表2-内源管家基因
SEQ ID NO: 基因 NCBI参考序列
SEQ ID NO:17 ActB NM_007393.5
SEQ ID NO:18 Atp5f1 NM_009725.4
SEQ ID NO:19 B2m NM_009735.3
SEQ ID NO:20 Gapdh NM_001289726.1
SEQ ID NO:21 Gusb NM_010368.2
SEQ ID NO:22 Hprt NM_013556.2
SEQ ID NO:23 Pgk1 NM_008828.3
SEQ ID NO:24 Ppia NM_008907.1
SEQ ID NO:25 Rps18 NM_011296.2
SEQ ID NO:26 Tbp NM_013684.3
SEQ ID NO:27 Tfrc NM_001357298.1
SEQ ID NO:28 Ywhaz NM_011740.3
SEQ ID NO:29 Nanog NM_028016.3
SEQ ID NO:30 Rex1 NM_009556.3
SEQ ID NO:31 Oct4 NM_013633.3
在一些实施方案中，核酸包含同源定向修复(HDR)模板和一个或多个RNA指导的核酸酶靶序列。在一些实施方案中，核酸包含一个RNA指导的核酸酶靶序列和一个或多个前间区序列邻近基序(PAM)。含有RNA指导的核酸酶、gRNA和核酸的复合物可以在RNA指导的核酸酶靶序列不发生切割的情况下使HDR模板穿梭到期望的细胞内位置(例如，细胞核)，以使得HDR模板可以整合到内源基因中的被切割的靶位点中。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶靶序列和PAM位于HDR模板的5'末端处。具体地，在一些实施方案中，PAM可位于RNA指导的核酸酶靶序列的5'末端处。在其他实施方案中，PAM可位于RNA指导的核酸酶靶序列的3'末端处。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶靶序列和PAM位于HDR模板的3'末端处。具体地，在一些实施方案中，PAM可位于RNA指导的核酸酶靶序列的5'末端处。在其他实施方案中，PAM位于RNA指导的核酸酶靶序列的3'末端处。在一些实施方案中，核酸包含两个RNA指导的核酸酶靶序列和两个PAM。具体地，在一些实施方案中，第一RNA指导的核酸酶靶序列和第一PAM位于HDR模板的5'末端处，并且第二RNA指导的核酸酶靶序列和第二PAM位于HDR模板的3'末端处。在一些实施方案中，第一PAM位于第一RNA指导的核酸酶靶序列的5'末端处，并且第二PAM位于第二RNA指导的核酸酶靶序列的5'处。在其他实施方案中，第一PAM位于第一RNA指导的核酸酶靶序列的5'末端处，并且第二PAM位于第二RNA指导的核酸酶序列的3'处。在又其他实施方案中，第一PAM位于第一RNA指导的核酸酶靶序列的3'末端处，并且第二PAM位于第二RNA指导的核酸酶靶序列的5'处。在又其他实施方案中，第一PAM位于第一RNA指导的核酸酶靶序列的3'末端处，并且第二PAM位于第二RNA指导的核酸酶靶序列的3'处。
在一些实施方案中，本文所述的核酸包含与细胞中内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列。在某些实施方案中，与3'部分具有等同编码潜能的序列编码内源基因的蛋白质产物的羧基末端部分。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含终止密码子和聚腺苷酸化序列。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含位于靶切割位点的3'的编码序列中的所有编码序列。例如，当被插入到内源基因的靶切割位点中时，与3'部分具有等同编码潜能的被插入序列与位于紧接着靶切割位点的5'的内源基因的5'部分形成连续的开放阅读框，并且允许由内源基因编码并处于内源启动子控制下的蛋白质产物恢复或继续表达。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的3'的内源基因的3'部分同一的序列。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的3'的内源基因的3'部分不同一的序列，并且包含一个或多个替代密码子。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-2500个核苷酸长。例如，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-100、1-200、1-300、1-400、1-500、1-600、1-700、1-800、1-900、1-1000、100-2500、200-2500、300-2500、400-2500、500-2500、600-2500、700-2500、800-2500、900-2500、1000-2500、1100-2500、1200-2500、1300-2500、1400-2500、1500-2500、1600-2500、1700-2500、1800-2500、1900-2500、2000-2500、2100-2500、2200-2500、2300-2500、2500-2500、100-2000、200-2000、300-2000、400-2000、500-2000、600-2000、700-2000、800-2000、900-2000、1000-2000、1100-2000、1200-2000、1300-2000、1400-2000、1500-2000、1600-2000、1700-2000、1800-2000、1900-2000、100-1500、200-1500、300-1500、400-1500、500-1500、600-1500、700-1500、800-1500、900-1500、1000-1500、1100-1500、1200-1500、1300-1500、1400-1500、100-1250、200-1250、300-1250、400-1250、500-1250、600-1250、700-1250、800-1250、900-1250、1000-1250、1100-1250、1200-1250、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000或900-1000个核苷酸长。
在一些实施方案中，与3'部分具有等同编码潜能的序列在3'部分的长度上与内源基因约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列可以是TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)的3'部分。例如，与3'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表1中所述的序列中的任一序列的3'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列可以是Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rps18、Tbp、Tfrc、Ywhaz、Nanog、Rex1或Oct4的3'部分。例如，与3'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表2中所述的序列中的任一序列的3'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在其他实施方案中，本文所述的核酸包含与细胞中内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列。在某些实施方案中，与5'部分具有等同编码潜能的序列编码内源基因的蛋白质产物的氨基末端部分。在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列包含位于靶切割位点的5'的编码序列中的所有编码序列。例如，当被插入到内源基因的靶切割位点中时，与5'部分具有等同编码潜能的被插入序列与位于紧接着靶切割位点的3'的内源基因的3'部分形成连续的开放阅读框，并且允许由内源基因编码的蛋白质产物恢复或继续表达。在一些实施方案中，由内源基因编码的蛋白质产物的恢复或继续表达处于内源启动子的控制下。在其他实施方案中，将外源启动子插入到靶切割位点中并且和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列可操作地连接以驱动内源基因的蛋白质产物在细胞中的表达。在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的5'的内源基因的5'部分同一的序列。在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的5'的内源基因的5'部分不同一的序列，并且包含一个或多个替代密码子。
在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-2500个核苷酸长。例如，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-100、1-200、1-300、1-400、1-500、1-600、1-700、1-800、1-900、1-1000、100-2500、200-2500、300-2500、400-2500、500-2500、600-2500、700-2500、800-2500、900-2500、1000-2500、1100-2500、1200-2500、1300-2500、1400-2500、1500-2500、1600-2500、1700-2500、1800-2500、1900-2500、2000-2500、2100-2500、2200-2500、2300-2500、2500-2500、100-2000、200-2000、300-2000、400-2000、500-2000、600-2000、700-2000、800-2000、900-2000、1000-2000、1100-2000、1200-2000、1300-2000、1400-2000、1500-2000、1600-2000、1700-2000、1800-2000、1900-2000、100-1500、200-1500、300-1500、400-1500、500-1500、600-1500、700-1500、800-1500、900-1500、1000-1500、1100-1500、1200-1500、1300-1500、1400-1500、100-1250、200-1250、300-1250、400-1250、500-1250、600-1250、700-1250、800-1250、900-1250、1000-1250、1100-1250、1200-1250、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000或900-1000个核苷酸长。
在一些实施方案中，与5'部分具有等同编码潜能的序列在5'部分的长度上与内源基因约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列可以是TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)的5'部分。例如，与5'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表1中所述的序列中的任一序列的5'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列可以是Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rps18、Tbp、Tfrc、Ywhaz、Nanog、Rex1或Oct4的5'部分。例如，与5'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表2中所述的序列中的任一序列的3'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
本文所述的核酸还包含外源转基因。在一些实施方案中，将外源转基因插入到细胞中内源基因中的靶切割位点中，从而产生转基因的表达。在一些实施方案中，将外源启动子插入到靶切割位点中并且与外源转基因可操作地连接以驱动转基因在细胞中的表达。
在一些实施方案中，外源转基因包含编码在细胞中表达的一种或多种多肽的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码在细胞膜表面上表达的一种或多种蛋白质的序列。在一些实施方案中，外源转基因包含编码跨膜蛋白或其片段的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码嵌合受体CD28、CD45、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD83、CD86、CD127、CD134、CD137、CD154、CIITA、4-1BBL、PD-1、PD-1L、LIGHT、DAP10、DAP12、ICAM-1、LFA-1、LCK、TNFR2、ICOS、NKG2C、HLA-E、B7-H3或β2-微球蛋白的一个或多个序列。在一些实施方案中，外源转基因包含编码可用作将转基因成功地插入到细胞基因组中的细胞的选择标记的细胞表面标记的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码可以使用抗EGFR抗体和流式细胞术容易地检测到的表皮生长因子受体(EGFR)或其截短片段的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码具有根据表3中的根据SEQ ID NO:16的核苷酸序列的截短的EGFR的序列。
表3-表面标记
/>
在一些实施方案中，外源转基因包含编码可用作将转基因成功地插入到细胞基因组中的细胞的选择标记的荧光蛋白(例如，GFP或mCherry)的序列。
在一些实施方案中，外源转基因包含编码合成抗原受体的序列，其中合成抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或SynNotch受体。关于CA R和SynNotch设计和使用，参见例如Sadelain等人，Cancer Discov.3(4):388-398(2013))；Srivastava Trends Immunol.36(8):494-502(2015))；Toda等人，Science 361(6398):156-162(2018)；以及Cho等人，Scientific Reports 8:3846(2018)。在某些实施方案中，外源转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。在一些实施方案中，外源转基因包含特异性地识别癌细胞相关靶标的CAR，所述靶标为诸如CD19、BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD133、CEA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、ErbB家族、GPC3、HER2、FAP、FRα、FD2、Igχ、IL-13α2、间皮素、Muc1、PSMA、ROR1、VEGFR2、B7-H3、B7H6、CD5、CD23、CD70、CSPG4、EpCAM、GD3、HLA-A1+MAGE、IL-11Rα、Lewis-Y、Muc16、NKG2D配体、PSC A或TAG72。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码CD19-CD28-CD3ξCAR、CD19-4-1BB-CD3ξCAR、MSLN-CD28-CD3ξCAR或MSLN-4-1BB-CD3ξCAR的序列。
在一些实施方案中，外源转基因编码改变细胞功能性的一种或多种蛋白质。例如，在编码插入到T细胞基因组中的CAR的外源转基因情况下，CAR的表达可以改变T细胞的特异性和功能性。
在其他实施方案中，外源转基因编码一种或多种胞质蛋白、胞内蛋白或可溶性蛋白。在一些实施方案中，外源转基因编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，外源转基因编码细胞因子或其功能片段。在一些实施方案中，外源转基因编码转录因子。在一些实施方案中，外源转基因编码免疫检查点抑制剂。
在其他实施方案中，外源转基因可包含编码非翻译RNA(诸如rRNA、tRNA、gRNA、siRNA或miRNA)的序列。
在一些实施方案中，将核酸作为线性DNA模板引入到细胞中。在一些实施方案中，将核酸作为双链DNA模板引入到细胞中。在其他实施方案中，DNA模板是单链DNA模板。在一些实施方案中，DNA模板是双链或单链质粒。
在一些实施方案中，核酸包含一个或多个2A序列以促进两种或更多种蛋白质产物的共翻译。例如，在一些实施方案中，该一个或多个2A序列可以是根据表4中的SEQ ID NO:14或SEQ ID NO:15的序列。
表4-2A序列
例如，在一些实施方案中，核酸可以是具有根据表5中的SEQ ID NO:12、SEQ IDNO:13或SEQ ID NO:33的序列的质粒。
表5-质粒
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
/>
II.细胞
本公开还提供了一种包含核酸的细胞，所述核酸包含：细胞的内源基因的5'部分；内源基因的3'部分；与内源基因的5'部分或内源基因的3'部分具有等同编码潜能的外源序列；以及外源转基因，其中该细胞表达内源基因和外源转基因中的每一者。在一些实施方案中，通过将如先前描述的包含gRNA、靶向核酸酶和核酸的组合物引入到细胞中来产生本文所公开的细胞。
在一些实施方案中，本文所公开的细胞包含核酸，所述核酸从5'到3'包含：(1)编码所述细胞的内源基因的5'部分的序列；(2)与所述细胞的内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列；(3)编码外源转基因的序列；以及(4)编码所述细胞的内源基因的3'部分的序列，并且其中所述细胞表达(a)由(1)和(2)编码的内源基因以及(b)由(3)编码的外源转基因中的每一者。
在其他实施方案中，本文所公开的细胞包含核酸，所述核酸从5'到3'包含：(a)编码所述细胞的内源基因的5'部分的序列；(2)编码外源转基因的序列；(3)与所述细胞的内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列；以及(4)编码所述细胞的内源基因的3'部分的序列，并且其中所述细胞表达(a)由(2)编码的外源转基因以及(b)由(3)和(4)编码的内源基因中的每一者。
在某些实施方案中，与3'部分具有等同编码潜能的序列编码内源基因的蛋白质产物的羧基末端部分。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含位于靶切割位点的3'的编码序列中的所有编码序列。例如，当与3'部分具有等同编码潜能的序列是连续的并且与内源基因的5'部分可操作地连接时，细胞在内源启动子的控制下表达由内源基因编码的蛋白质产物。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的3'的内源基因的3'部分同一的序列。在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的3'的内源基因的3'部分不同一的序列，并且包含一个或多个替代密码子。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-2500个核苷酸长。例如，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-100、1-200、1-300、1-400、1-500、1-600、1-700、1-800、1-900、1-1000、100-2500、200-2500、300-2500、400-2500、500-2500、600-2500、700-2500、800-2500、900-2500、1000-2500、1100-2500、1200-2500、1300-2500、1400-2500、1500-2500、1600-2500、1700-2500、1800-2500、1900-2500、2000-2500、2100-2500、2200-2500、2300-2500、2500-2500、100-2000、200-2000、300-2000、400-2000、500-2000、600-2000、700-2000、800-2000、900-2000、1000-2000、1100-2000、1200-2000、1300-2000、1400-2000、1500-2000、1600-2000、1700-2000、1800-2000、1900-2000、100-1500、200-1500、300-1500、400-1500、500-1500、600-1500、700-1500、800-1500、900-1500、1000-1500、1100-1500、1200-1500、1300-1500、1400-1500、100-1250、200-1250、300-1250、400-1250、500-1250、600-1250、700-1250、800-1250、900-1250、1000-1250、1100-1250、1200-1250、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000或900-1000个核苷酸长。
在一些实施方案中，与3'部分具有等同编码潜能的序列在3'部分的长度上与内源基因约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列可以是TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)的3'部分。例如，与3'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表1中所述的序列中的任一序列的3'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列可以是Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rps18、Tbp、Tfrc、Ywhaz、Nanog、Rex1或Oct4的3'部分。例如，与3'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表2中所述的序列中的任一序列的3'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在某些实施方案中，与5'部分具有等同编码潜能的序列编码内源基因的蛋白质产物的氨基末端部分。在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列包含位于靶切割位点的5'的编码序列中的所有编码序列。例如，当与5'部分具有等同编码潜能的序列是连续的并且与内源基因的3'部分可操作地连接时，细胞在内源启动子的控制下表达由内源基因编码的蛋白质产物。在其他实施方案中，内源基因的蛋白质产物的表达处于外源引入的启动子的调控下。在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的5'的内源基因的5'部分同一的序列。在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列包含与位于紧接着靶切割位点的5'的内源基因的5'部分不同一的序列，并且包含一个或多个替代密码子。
在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-2500个核苷酸长。例如，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的长度为约1-100、1-200、1-300、1-400、1-500、1-600、1-700、1-800、1-900、1-1000、100-2500、200-2500、300-2500、400-2500、500-2500、600-2500、700-2500、800-2500、900-2500、1000-2500、1100-2500、1200-2500、1300-2500、1400-2500、1500-2500、1600-2500、1700-2500、1800-2500、1900-2500、2000-2500、2100-2500、2200-2500、2300-2500、2500-2500、100-2000、200-2000、300-2000、400-2000、500-2000、600-2000、700-2000、800-2000、900-2000、1000-2000、1100-2000、1200-2000、1300-2000、1400-2000、1500-2000、1600-2000、1700-2000、1800-2000、1900-2000、100-1500、200-1500、300-1500、400-1500、500-1500、600-1500、700-1500、800-1500、900-1500、1000-1500、1100-1500、1200-1500、1300-1500、1400-1500、100-1250、200-1250、300-1250、400-1250、500-1250、600-1250、700-1250、800-1250、900-1250、1000-1250、1100-1250、1200-1250、100-1000、200-1000、300-1000、400-1000、500-1000、600-1000、700-1000、800-1000或900-1000个核苷酸长。
在一些实施方案中，与5'部分具有等同编码潜能的序列在5'部分的长度上与内源基因约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％同一。
在一些实施方案中，与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列可以是TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)的5'部分。例如，与5'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表1中所述的序列中的任一序列的5'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
在一些实施方案中，与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列可以是Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rps18、Tbp、Tfrc、Ywhaz、Nanog、Rex1或Oct4的5'部分。例如，与5'部分具有等同编码潜能的序列可具有与表2中所述的序列中的任一序列的3'部分具有约80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的核苷酸序列。
本文所公开的细胞还包含外源转基因。在一些实施方案中，外源转基因的表达处于内源启动子的控制下。在其他实施方案中，外源转基因的表达处于外源引入且可操作地连接的启动子的调控下。
在一些实施方案中，外源转基因包含编码在细胞中表达的一种或多种多肽的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码在细胞膜表面上表达的一种或多种蛋白质的序列。在一些实施方案中，外源转基因包含编码跨膜蛋白或其片段的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码CD28、CD45、CD2、CD4、CD5、CD7、CD8、CD9、CD16、CD22、CD27、CD28、CD30、CD33、CD37、CD40、CD64、CD80、CD83、CD86、CD127、CD134、CD137、CD154、CIITA、4-1BBL、PD-1、PD-1L、LIGHT、DAP10、DAP12、ICAM-1、LFA-1、LCK、TNFR2、ICOS、NKG2C、HLA-E、B7-H3或β2-微球蛋白的一个或多个序列。在一些实施方案中，外源转基因包含编码可用作将转基因成功地插入到细胞基因组中的细胞的选择标记的细胞表面标记的序列。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码可以使用抗EGFR抗体和流式细胞术容易地检测到的表皮生长因子受体(EGFR)或其截短片段的序列。
在一些实施方案中，外源转基因包含编码合成抗原受体的序列，其中合成抗原受体是嵌合抗原受体(CAR)或SynNotch受体。关于CA R和SynNotch设计和使用，参见例如Sadelain等人，Cancer Discov.3(4):388-398(2013))；Srivastava Trends Immunol.36(8):494-502(2015))；Toda等人，Science 361(6398):156-162(2018)；以及Cho等人，Scientific Reports 8:3846(2018)。在某些实施方案中，外源转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。在一些实施方案中，外源转基因包含特异性地识别癌细胞相关靶标的CAR，所述靶标为诸如CD19、BCMA、CD20、CD22、CD30、CD33、CD123、CD133、CEA、EGFR、EGFRvIII、EphA2、ErbB家族、GPC3、HER2、FAP、FRα、FD2、Igχ、IL-13α2、间皮素、Muc1、PSMA、ROR1、VEGFR2、B7-H3、B7H6、CD5、CD23、CD70、CSPG4、EpCAM、GD3、HLA-A1+MAGE、IL-11Rα、Lewis-Y、Muc16、NKG2D配体、PSC A或TAG72。例如，在一些实施方案中，外源转基因包含编码CD19-CD28-CD3ξCAR、CD19-4-1BB-CD3ξCAR、MSLN-CD28-CD3ξCAR或MSLN-4-1BB-CD3ξCAR的序列。
在一些实施方案中，外源转基因编码改变细胞功能性的一种或多种蛋白质。例如，在编码插入到T细胞基因组中的CAR的外源转基因情况下，CAR的表达可以改变T细胞的特异性和功能性。
在其他实施方案中，外源转基因编码一种或多种胞质蛋白、胞内蛋白或可溶性蛋白。在一些实施方案中，外源转基因编码治疗性蛋白质。在一些实施方案中，外源转基因编码细胞因子或其功能片段。在一些实施方案中，外源转基因编码转录因子。在一些实施方案中，外源转基因编码免疫检查点抑制剂。
在其他实施方案中，外源转基因可包含编码非翻译RNA(诸如rRNA、tRNA、gRNA、siRNA或miRNA)的序列。
在一些实施方案中，本文所述的细胞是哺乳动物细胞。例如，在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞。在一些实施方案中，人类细胞是多能干细胞或诱导多能干细胞(iPSC)。在一些实施方案中，人类细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、髓样细胞、巨噬细胞、树突细胞、造血干细胞或其他免疫细胞。在一些实施方案中，T细胞是调控性T细胞、效应T细胞或初始T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞是CD8+ T细胞或CD4+ T细胞。在一些实施方案中，效应T细胞是CD8+CD4+ T细胞。在一些实施方式中，T细胞是表达TCR受体或分化为表达TCR受体的T细胞的T细胞。在一些实施方案中，人类细胞是iPSC衍生的NK细胞。在一些实施方案中，细胞是原代细胞。在一些实施方案中，细胞是从受试者获得的。例如，在一些实施方案中，细胞是从受试者获得并通过引入本文所述的组合物进行离体修饰。
III.基因组编辑方法
本文还公开了编辑细胞的基因组的方法，该方法包括向细胞中引入用于靶向插入核酸的组合物，该核酸包含编码细胞的内源基因的3'部分或5'部分的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括将组合物引入到细胞中，所述组合物包含：(A)向导RNA(gRNA)；(B)靶向核酸酶；以及(C)核酸(例如用于DNA修复的模板)。在其他实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括将组合物引入到细胞中，所述组合物包含：(A)靶向核酸酶；以及(B)核酸(例如，用于DNA修复的模板)。
在一些实施方案中，本文所公开的编辑细胞的基因组的方法包括：向细胞中引入靶向细胞中的内源基因的gRNA、与gRNA复合的RNA指导的核酸酶，以及核酸，该核酸与RNA指导的核酸酶复合并且包含与内源基因具有同源性的一个或多个区域、与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，在该插入位点中插入与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因，从而导致内源基因的恢复或继续表达以及外源转基因在细胞中的表达。
在其他实施方案中，本文所公开的编辑细胞的基因组的方法包括：向细胞中引入靶向细胞中的内源基因的gRNA、与gRNA复合的RNA指导的核酸酶，以及核酸，该核酸与RNA指导的核酸酶复合并且包含与内源基因具有同源性的一个或多个区域、外源转基因以及与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列。在一些实施方案中，RNA指导的核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，在该插入位点中插入外源转基因以及与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列，从而导致内源基因的恢复或继续表达以及外源转基因在细胞中的表达。
在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和核酸经由非病毒递送被引入到细胞中。例如，在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和核酸经由电穿孔被引入到细胞中。在一些实施方案中，gRNA、RNA指导的核酸酶和/或核酸经由病毒递送被引入到细胞中。例如，在一些实施方案中，经由病毒转导(例如，逆转录病毒、腺病毒、慢病毒或腺相关病毒)将gRNA、RNA指导的核酸酶和/或核酸引入到细胞中。在一些实施方案中，经由腺相关病毒(例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、AAV12或AAV13)将gRNA、RNA指导的核酸酶和/或核酸引入到细胞中。
例如，在一些实施方案中，将gRNA、靶向核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)和核酸序列作为核糖核蛋白复合物(RNP)-DNA复合物引入到细胞中，其中RNP-DNA复合物包含：(i)RNP，其中RNP包含RNA指导的核酸酶(例如，Cas9)和gRNA；以及(ii)用作DNA模板的核酸。
在一些实施方案中，RNP与核酸的摩尔比可为约3:1至约100:1。例如，摩尔比可为约5:1至10:1、约5:1至约15:1、5:1至约20:1、5:1至约25:1、约8:1至约12:1、约8:1至约15:1、约8:1至约20:1，或约8:1至约25:1。
在一些实施方案中，RNP-DNA模板复合物中的核酸的浓度为约2.5pM至约25pM。在一些实施方案中，核酸的量为约1μg至约10μg。
在一些实施方案中，通过将RNP与核酸在约20℃至约25℃的温度下温育少于约一分钟至约三十分钟来形成RNP-DNA复合物。在一些实施方案中，在将RNP-DNA复合物引入到细胞中之前，将RNP-DNA复合物和细胞混合。
在一些实施方案中，通过电穿孔将核酸序列或RNP-DNA复合物引入到细胞中。用于对细胞进行电穿孔以引入RNP-DNA复合物的方法、组合物和装置可包括本文的示例中描述的那些。用于对细胞进行电穿孔以引入RNP-DNA复合物的附加或可替代的方法、组合物和装置可包括WO/2006/001614或Kim,J.A.等人，Biosens.Bioelectron.23,1353–1360(2008)中描述的那些。用于对细胞进行电穿孔以引入RNP-DNA复合物的附加或可替代的方法、组合物和装置可包括美国专利申请公布号2006/0094095、2005/0064596或2006/0087522中描述的那些。用于对细胞进行电穿孔以引入RNP-DNA复合物的附加或可替代的方法、组合物和装置可包括Li,L.H.等人，Cancer Res.Treat.1,341–350(2002)；美国专利号：6,773,669、7,186,559、7,771,984、7,991,559、6485961、7029916；以及美国专利申请公布号2014/0017213和2012/0088842中描述的那些。用于对细胞进行电穿孔以引入RNP-DNA复合物的附加或可替代的方法、组合物和装置可包括Geng,T.等人，J.Control Release 144,91–100(2010)；以及Wang,J.等人，Lab.Chip 10,2057–2061(2010)中描述的那些。在一些实施方案中，在阴离子聚合物的存在下将RNP递送至细胞。在一些实施方案中，阴离子聚合物是阴离子多肽或阴离子多糖。在一些实施方案中，阴离子聚合物是阴离子多肽(例如，聚谷氨酸(PGA)、聚天冬氨酸或聚羧基谷氨酸)。在一些实施方案中，阴离子聚合物是阴离子多糖(例如，透明质酸(HA)、肝素、硫酸肝素或糖胺聚糖)。在一些实施方案中，阴离子聚合物是聚(丙烯酸)(PAA)、聚(甲基丙烯酸)(PMAA)、聚(苯乙烯磺酸盐)或聚磷酸盐(polyphosphate)。在一些实施方案中，阴离子聚合物具有至少15kDA(例如，在15kDa与50kDa之间)的分子量。在一些实施方案中，阴离子聚合物和RNA指导的核酸酶的摩尔比分别为在10:1与120:1之间(例如，10:1、20:1、30:1、40:1、50:1、60:1、70:1、80:1、90:1、100:1、110:1或120:1)。在一些实施方案中，gRNA:RNA指导的核酸酶的摩尔比为在0.25:1与4:1之间(例如，0.25:1、0.5:1、1:1、1.2:1、1.4:1、1.6:1、1.8:1、2:1、2.2:1、2.4:1、2.6:1、2.8:1、3:1、3.2:1、3.4:1、3.6:1、3.8:1或4:1)。
在一些实施方案中，将核酸或RNP-DNA复合物引入到约1×105至约100×106个细胞(例如，T细胞)中。例如，可将核酸或RNP-DNA复合物引入到约1×105个细胞至约5×105个细胞、约1×105个细胞至约1×106个细胞、1×105个细胞至约1.5×106个细胞、1×105个细胞至约2×106个细胞、约1×106个细胞至约1.5×106个细胞或约1×106个细胞至约2×106个细胞中。
在本文所公开的方法的一些实施方案中，在引入到细胞中后，RNP-DNA复合物易位至细胞中的内源基因的基因座，在这里靶向核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶9)被gRNA的DNA靶向序列引导并且在基因组DNA中在靶切割位点处引入双链断裂。在某些实施方案中，与细胞的内源基因具有同源性的一个或多个区域将核酸与细胞的内源基因进行比对，并且编码内源基因的蛋白质产物的羧基末端部分的与细胞中内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因经由HDR被插入到内源基因内的靶切割位点中。在一些实施方案中，与3'部分具有等同编码潜能的被插入序列与位于紧接着靶切割位点的5'的内源基因的5'部分形成连续的开放阅读框，并且允许由内源基因编码并处于内源启动子控制下的蛋白质产物恢复或继续表达。在一些实施方案中，外源转基因的插入导致由转基因(例如，CAR)编码的蛋白质产物的表达。在一些实施方案中，细胞中外源性转基因的表达处于内源启动子的控制下。在一些实施方案中，外源启动子与外源转基因可操作地连接，并且与外源转基因一起被插入到靶切割位点中以驱动转基因在细胞中的表达。
在本文所公开的方法的其他实施方案中，在引入到细胞中后，RNP-DNA复合物易位至细胞中的内源基因的基因座，在这里靶向核酸酶(例如，RNA指导的核酸酶)被gRNA的DNA靶向序列引导并且在基因组DNA中在靶切割位点处引入双链断裂。在某些实施方案中，与细胞的内源基因具有同源性的一个或多个区域将核酸与细胞的内源基因进行比对，并且外源转基因和编码内源基因的蛋白质产物的氨基末端部分的与细胞中内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列经由HDR被插入到内源基因内的靶切割位点中。在一些实施方案中，与5'部分具有等同编码潜能的被插入序列与位于紧接着靶切割位点的3'的内源基因的3'部分形成连续的开放阅读框，并且允许由内源基因编码的蛋白质产物恢复或继续表达。在一些实施方案中，外源转基因的插入导致由转基因(例如，CAR)编码的蛋白质产物的表达。在一些实施方案中，外源转基因的表达处于细胞中内源基因的内源启动子的控制下。在其他实施方案中，外源启动子与外源转基因可操作地连接，并且与外源转基因一起被插入到靶切割位点中以驱动转基因在细胞中的表达。在一些实施方案中，细胞中内源基因的表达处于内源启动子的控制下。在其他实施方案中，外源启动子和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列可操作地连接，并且和与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列一起被插入到靶切割位点中以驱动内源基因在细胞中的表达。
在一些实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括将本文所公开的组合物引入到哺乳动物细胞中。例如，在一些实施方案中，哺乳动物细胞是人类细胞，例如免疫细胞。在某些实施方案中，免疫细胞是T细胞，例如CD4+或CD8+ T细胞。在一些实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括将外源转基因插入到TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链(IL2RG)的基因组基因座中。例如，在某些实施方案中，外源转基因被插入到TRAC内的靶切割位点中。在一些实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括使表达被外源转基因的插入中断的内源基因的表达得以恢复或继续。例如，本文所公开的方法可以使TRAC、TRBC、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链IL-2Rα链、IL-2Rβ链或IL-2Rγ链的表达得以恢复或继续。
在一些实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括将外源转基因插入到Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rps18、Tbp、Tfrc、Ywhaz、Nanog、Rex1或Oct4中至少一者的基因组基因座中。在一些实施方案中，编辑细胞的基因组的方法包括使表达被外源转基因的插入中断的内源基因的表达得以恢复或继续。例如，本文所公开的方法可以使Actb、Atp5f1、B2m、Gapdh、Gusb、Hprt、Pgk1、Ppia、Rps18、Tbp、Tfrc、Ywhaz、Nanog、Rex1或Oct4的表达得以恢复或继续。
在可替代的实施方案中，本文所公开的编辑细胞的基因组的方法包括：向细胞中引入选自TALEN、ZFN或megaTAL的靶向核酸酶以及核酸，该核酸与靶向核酸酶复合并且包含与内源基因具有同源性的一个或多个区域、与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因。在一些实施方案中，靶向核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，在该插入位点中插入与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因，从而导致内源基因的恢复或继续表达以及外源转基因在细胞中的表达。
在又一个实施方案中，本文所公开的编辑细胞的基因组的方法包括：向细胞中引入选自TALEN、ZFN或megaTAL的靶向核酸酶以及核酸，该核酸与靶向核酸酶复合并且包含与内源基因具有同源性的一个或多个区域、外源转基因以及与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列。在一些实施方案中，靶向核酸酶特异性地切割细胞中的内源基因以创建插入位点，在该插入位点中插入外源转基因以及与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列，从而导致内源基因的恢复或继续表达以及外源转基因在细胞中的表达。
IV.治疗方法
本公开还提供了治疗或预防受试者的疾病的方法，该方法包括通过如本文所公开的方法编辑细胞的基因组并且/或者向受试者施用如本文所公开的细胞。
例如，在一些实施方案中，一种治疗或预防受试者的疾病的方法包括：获得包含核酸的细胞，所述核酸包含：细胞的内源基因的5'部分、内源基因的3'部分、与内源基因的5'部分或3'部分具有等同编码潜能的序列，以及外源转基因，其中所述细胞表达内源基因和外源转基因中的每一者；以及将所述细胞施用于受试者。
在一些实施方案中，本文所述的方法和组合物可用于编辑免疫细胞(例如T细胞)的基因组。在一些实施方案中，免疫细胞(例如，T细胞)是从患有疾病或处于患有疾病的风险的受试者获得的。例如，在一些实施方案中，可以将具有使用本文所述的方法和组合物编辑的基因组的免疫细胞(例如，T细胞)施用于受试者以治疗或预防受试者的疾病，诸如癌症、传染病、自身免疫性疾病、移植排斥、移植物抗宿主病或其他炎性病症。在一些实施方案中，外源转基因的表达改变细胞的特异性和/或功能性，从而使得细胞治疗和/或预防受试者的疾病。例如，在一些实施方案中，从受试者获得T细胞(例如，CD4+或CD8+T细胞)并且将它的基因组编辑成表达CAR，并且其中将该表达CAR的T细胞施用于受试者以治疗癌症。在某些示例中，本文所公开的方法用于治疗或预防受试者的癌症，并且CAR识别癌症特异性抗原(例如肿瘤特异性抗原或新抗原)。在某些示例中，本文所公开的方法用于治疗或预防受试者的自身免疫性疾病，并且CAR识别与自身免疫性病症相关的抗原。
在某些实施方案中，本文所公开的方法可用于治疗或预防受试者的癌症，其中癌症是膀胱癌、乳腺癌、宫颈癌、结直肠癌、食道癌、胃癌、头颈癌、肝细胞癌、白血病、肺癌、淋巴瘤、间皮瘤、黑素瘤、骨髓瘤、卵巢癌、子宫内膜癌、前列腺癌、胰腺癌、肾细胞癌、非小细胞肺癌、小细胞肺癌、脑癌、肉瘤、成神经细胞瘤或头颈鳞状细胞癌。
在一些实施方案中，本文所公开的方法可用于治疗或预防受试者的自身免疫性疾病。在某些实施方案中，自身免疫性病症选自由以下组成的组：多发性硬化、I型糖尿病、类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、炎性肠病、乳糜泻、格雷夫斯病(Graves’disease)、桥本自身免疫性甲状腺炎(Hashimoto’s autoimmune thyroiditis)、白癜风、风湿热、恶性贫血/萎缩性胃炎、斑秃、免疫性血小板减少性紫癜、颞动脉炎、溃疡性结肠炎、克罗恩病、硬皮病、抗磷脂综合征、自身免疫性肝炎1型、原发性胆汁性肝硬化、干燥综合征(Sjogren’ssyndrome)、阿狄森氏病(Addison’s disease)、疱疹样皮炎、川崎病、交感性眼炎、HLA-B27相关的急性前葡萄膜炎、原发性硬化性胆管炎、盘状红斑狼疮、结节性多动脉炎、CREST综合征、重症肌无力、多肌炎/皮肌炎、斯蒂尔病、自身免疫性2型肝炎、韦格纳肉芽肿病(Wegener’sgranulomatosis)、混合性结缔组织病、显微镜下多血管炎、自身免疫性多腺体综合征、费尔蒂综合征(Felty’s syndrome)、自身免疫性溶血性贫血、慢性炎性脱髓鞘性多发性神经病、古兰-巴雷综合征(Guillain-Barre Syndrome)、白塞病Behcet disease、自身免疫性中性粒细胞减少症、大疱性类天疱疮、原发性混合型冷球蛋白血症、线性硬斑病、自身免疫性多腺体综合征1(APECED)、获得性血友病A、巴滕病/神经元蜡样脂褐质沉积症、自身免疫性胰腺炎、桥本脑病(Hashimoto’s encephalopathy)、古德帕斯彻病(Goodpasture’s disease)、寻常型天疱疮、自身免疫性播散性脑脊髓炎、复发性多软骨炎、高安氏动脉炎(Takayasu arteritis)、查格-施特劳斯综合征(Churg-Strauss syndrome)、获得性大疱性表皮松解症、疤痕性类天疱疮、落叶型天疱疮、自身免疫性甲状旁腺功能减退、自身免疫性垂体炎、自身免疫性内耳病、自身免疫性淋巴细胞增生性综合征、自身免疫性卵巢炎、自身免疫性睾丸炎、自身免疫性多腺体综合征、科根综合征(Cogan’ssyndrome)、昏睡性脑炎、持久性隆起性红斑、伊文氏综合征(Evans syndrome)、免疫失调性多内分泌疾病性肠病性X-连锁综合征(IPEX)、艾萨克综合征(Issac’s syndrome)/获得性神经性肌强直、米勒费希尔综合征(Miller Fisher syndrome)、莫旺氏综合征(Morvan’s syndrome)、PANDAS、POEMS综合征、拉斯穆森脑炎(Rasmussen’s encephalitis)、僵人综合征、福格特–小柳–哈拉达综合症(Vogt-Koyanagi-Harada syndrome)、视神经脊髓炎、移植物抗宿主病和自身免疫性葡萄膜炎。
在一些实施方案中，从受试者获得细胞，对细胞的基因组进行编辑以使其表达外源转基因和内源基因，并且在施用于受试者以治疗或预防疾病之前进行离体扩增。例如，在一些实施方案中，从癌症受试者获得肿瘤浸润性淋巴细胞(其是一种异质性的癌症特异性T细胞群体)并且对其进行离体扩增。在某些实施方案中，受试者癌症的特征决定一组定制的细胞修饰(例如待插入细胞中的外源转基因)，并且使用本文所述的任一方法将这些修饰应用于肿瘤浸润性淋巴细胞。
以上说明书描述了本发明的多个方面和实施方案。本专利申请特别设想了这些方面和实施方案的所有组合和排列。
实施例
现在总体描述的本发明通过参考以下实施例将更容易理解，这些实施例仅出于说明本发明的某些方面和实施方案的目的而被包括，并且不旨在限制本发明。
实施例1-CAR转基因向TRAC中的插入
本文描述了将外源转基因(例如，编码CAR的外源转基因)插入到T细胞的TRAC基因内的靶向位点中的非病毒基因组编辑方法。成功插入外源转基因和与TRAC的3'部分具有等同编码潜能的序列的细胞表达外源引入的CAR和由TCRα链的恢复或继续表达产生的功能性TCR复合物。
T细胞分离和活化
使用EasySep人T细胞分离试剂盒(STEMCELL Technologies)从使用Lymphoprep(STEMCELL Technologies)由正常供体Leukopaks(STEMCELL Technologies)制备的外周血单核细胞(PBMC)中富集T细胞。随后在补充有3％人AB血清(Gemini Bio)和12.5ng/ml人IL-7和IL-15(Miltenyi优质级)的TexMACS培养基(Miltenyi 130-197-196)中用人T-CellTransAct(Miltenyi，130-111-160)活化T细胞，并且在电穿孔之前使该细胞在37℃、5％CO2下生长48小时。
T细胞基因编辑
通过以5:1:3:6的比率合并120μM靶向DNA序列AAGTCTCTC AGCTGGTACA(SEQ IDNO:1)的sgRNA(Synthego)、62.5μM sNL S-SpCas9-sNLS(Aldevron)、100ng/ml聚-L-谷氨酸(Sigma P4761-25MG)和P3缓冲液(Lonza)来制备CRISPR RNP。将5μg质粒DNA(即，具有根据SEQ ID NO:11、SEQ ID NO:12或SEQ ID NO:13的序列的质粒)与17.5μl RNP混合。对T细胞进行计数，将其以90X G离心10分钟，并以5x106个细胞/94μl添加有补充物的P3(Lonza)重悬。将94μl T细胞悬浮液添加到DNA/RNP混合物中，转移到Lonza电穿孔比色杯(cuvette)中，并在具有代码EH-115的Lonza X单元中脉冲。使细胞在室温下静置10分钟，然后将细胞转移到24孔G-Rex板(Wilson Worf)中补充有12.5ng/ml人IL-7和IL-15的TexMACS培养基(Miltenyi优质级)中。对于一些条件，用混合到前面提到的培养基配制物(formulation)中的1:1比率的CTS Dynabead(CD3/CD28)(Thermo Fisher)回收细胞。
流式细胞术
通过用抗EGFR抗体(BioLegend克隆AY13)染色并在Attune NxT流式细胞仪上分析来检测转基因表达。用CD3E抗体(BD克隆UCHT1)和TCRα/β抗体(BioLegend克隆IP26)检测TCRα/β复合物的表达。
对T细胞进行基因组编辑以使其表达CAR和TCRα链
经由靶向TRAC基因座的CRISPR RNP和质粒修复模板的电穿孔对T细胞进行基因组编辑，以使该T细胞表达编码连接至截短的EGFR表面标记基因的CD19-4-1BB-CD3ξ-CAR 2A的外源转基因。如图3A所示，TRAC基因座中的特异性靶切割位点破坏TRAC的编码序列，从而使得用具有根据SEQ ID NO:11的序列并表达外源CAR转基因的质粒电穿孔的细胞不再表达TCRα链蛋白，这通过如通过流式细胞术检测的CD3ε和TCRα/β(数据未示出)的不存在所指示的TCR复合物表面表达的损失得到证明。图3A和图3B显示外源转基因易于在用EGFR抗体染色并且通过流式细胞术分析的电穿孔细胞中被检测到。如图3B和图3C所示，用具有根据SEQID NO:12的序列的质粒(其中质粒修复模板包含跟随TRAC中CRISPR靶切割位点之后的3'编码序列)连同用于产生CAR和EGFR转基因的共翻译的2A序列电穿孔的细胞产生除该转基因之外还具有完整TCRα链编码序列的TRAC基因座。这些细胞在细胞表面上具有可检测的TCR复合物表达，如CD3(图3B)和TCRα/β(图3C)的存在所指示。如图4所示，与用缺乏跟随TRAC中CRISPR靶切割位点之后的3'编码序列的质粒(即，具有根据SEQ ID NO:11的序列的质粒)电穿孔的T细胞相比，用包含跟随TRAC中CRISPR靶切割位点之后的3'编码序列的质粒(即，具有根据SEQ ID NO:12和SEQ ID NO:13的序列的质粒)电穿孔的T细胞具有TCR复合物表达并且对用CD3/CD28 Dynabead进行的TCR刺激有响应。
实施例2-CAR转基因向IL2RG中的插入
本文描述了将外源基因回路(例如，编码CAR的外源基因回路)插入到T细胞的IL2RG基因内的靶向位点中的非病毒基因组编辑方法。成功插入外源转基因和与IL2RG的3'部分具有等同编码潜能的序列的细胞表达外源引入的CAR和功能性IL2RG复合物，其导致IL-2受体γ链的恢复或继续表达。
T细胞分离和活化
如实施例1所述的那样从PMBC富集T细胞并用T-Cell TransAct活化。
T细胞基因编辑
通过以16.5:1的比率合并36μM靶向DNA序列GTGTGTATTTCTGGCTGGAA(SEQ ID NO:32)的sgRNA(Synthego)和62.5μM sNLS-SpCas9-sNLS(Aldevron)来制备CRISPR RNP。将0.25μg质粒DNA(即，具有根据SEQ ID NO:33的序列的质粒)与3.5μl RNP混合。对T细胞进行计数，将T细胞以90X G离心10分钟，并以1x106个细胞/14.5μl添加有补充物的P3(Lonza)重悬。将20μl T细胞悬浮液添加到DNA/RNP混合物中，转移到Lonza 384孔电穿孔板中，并在具有代码EH-115 AA的Lonza HT中脉冲。让细胞在室温下静置15分钟，然后将细胞转移到96孔板(Sarstedt)中补充有12.5ng/ml人IL-7和IL-15的TexMACS培养基(Miltenyi优质级)中。
流式细胞术
通过用抗Myc抗体(Cell Signaling Technology克隆9B11)染色并在IntellicytiQue3仪器上分析来检测转基因表达。用CD132抗体(Biolegend克隆TUGh4)检测IL2RG表达。
对T细胞进行基因组编辑以使其表达回路和IL2RG链
经由靶向IL2RG基因座的CRISPR RNP和质粒修复模板的电穿孔对T细胞进行基因组编辑，以使该T细胞表达编码具有Prime和CAR受体及Myc标签的回路的外源转基因。图5显示外源转基因(Myc标记的prime受体)易于在用抗Myc抗体染色并且通过流式细胞术分析的电穿孔细胞中被检测到。如图5所示，用具有根据SEQ ID NO:33的序列的质粒(其中质粒修复模板包含紧随IL2RG中的CRISPR靶切割位点之后的3'编码序列)连同含Prime和CAR受体的回路电穿孔的细胞产生除转基因之外还表达全长IL-2受体γ链编码序列的IL2RG基因座。这些细胞在细胞表面上具有可检测的IL2RG复合物表达，如CD132的存在所指示(图5)。如图6A所示，用ps6651、IL2RG sgRNA和CAS9电穿孔并经由流式细胞术测定的来自4个供体的细胞展示出了从电穿孔后第9天到电穿孔后第14天表达IL2RG和外源转基因二者的细胞的百分比增加。另外，如图6B所示，敲除了IL2RG基因并且未整合转基因的细胞群体显示出由于IL2RG表达的缺乏而随时间耗尽。
实施例3
异种移植小鼠模型中实体瘤的体内治疗
经由本文所述的基因组编辑方法产生表达肿瘤抗原特异性CAR的T细胞。使原代人实体瘤细胞在免疫受损小鼠中生长。示例性实体癌细胞包括实体肿瘤细胞系，诸如癌症基因组图谱(Cancer Genome Atlas,TCGA)和/或广泛癌细胞系百科全书(Broad Cancer CellLine Encyclopedia,CCLE，参见Barretina等人，Nature 483:603(2012))中所提供的实体肿瘤细胞系。示例性实体癌细胞包括从肺癌、卵巢癌、黑素瘤、结肠癌、胃癌、肾细胞癌、食道癌、胶质瘤、尿道上皮癌、视网膜母细胞瘤、乳腺癌、非霍奇金淋巴瘤、胰腺癌、霍奇金淋巴瘤、骨髓瘤、肝细胞癌、白血病、宫颈癌、胆管癌、口腔癌、头颈癌或间皮瘤分离的原代肿瘤细胞。这些小鼠被用于测试表达外源CAR转基因和功能性TCR复合物的T细胞在人肿瘤异种移植模型中的功效。在皮下植入或注射1x105-1x107个肿瘤细胞后，在启动治疗之前让肿瘤生长至200-500mm3。然后将经基因组编辑成表达外源CAR转基因和功能性TCR复合物的T细胞引入到小鼠中。响应于用经基因组编辑成表达外源CAR转基因和功能性TCR复合物的T细胞处理的肿瘤收缩可通过肿瘤大小的卡尺测量，或通过追踪由表达ffluc的肿瘤细胞发出的萤光素酶蛋白(ffluc)信号的强度来评估。
以引用的方式并入
本文提及的专利文献和科学文章中每一篇的全部公开内容以引用方式并入以用于所有目的。
等效方案
本发明可在不脱离其实质或基本特征的情况下以其他特定形式来实施。因此，前述实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而非限制本文所述的本发明。因此，本发明的范围由所附权利要求而不是由前面的描述来指示，并且落入权利要求的等同物的含义和范围内的所有变化都旨在被涵盖在权利要求书中。

Claims (37)

1.一种用于靶向插入核酸的组合物，所述核酸包含与细胞的内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因，所述组合物包含：
向导RNA(gRNA)，所述向导RNA(gRNA)靶向所述内源基因；
RNA指导的核酸酶，所述RNA指导的核酸酶与所述gRNA复合；以及
核酸，所述核酸与所述RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与所述内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、所述与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及所述转基因，
其中所述RNA指导的核酸酶特异性地切割所述细胞中的所述内源基因以创建插入位点，其中所述核酸的所述与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和所述转基因被插入到所述插入位点中，并且其中所述核酸的所述与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和所述转基因的插入导致所述内源基因的恢复或继续表达以及所述转基因在所述细胞中的表达。
2.一种用于靶向插入核酸的组合物，所述核酸包含编码外源转基因的序列以及与细胞中的内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列，所述组合物包含：
向导RNA(gRNA)，所述向导RNA(gRNA)靶向所述内源基因；
RNA指导的核酸酶，所述RNA指导的核酸酶可操作地连接至所述gRNA；以及
核酸，所述核酸与所述RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与所述内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、所述转基因以及所述与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列，
其中所述RNA指导的核酸酶特异性地切割所述细胞中的所述内源基因以创建插入位点，其中所述核酸的所述转基因和所述与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列被插入到所述插入位点中，并且其中所述核酸的所述转基因和所述与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的插入导致所述内源基因的恢复或继续表达以及所述转基因在所述细胞中的表达。
3.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述内源基因选自由以下组成的组：T细胞受体α链恒定区(TRAC)、T细胞受体β链恒定区(TRBC)、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链和IL-2Rγ链(IL2RG)。
4.如权利要求3所述的组合物，其中所述内源基因是TRAC。
5.如权利要求3所述的组合物，其中所述内源基因是IL2RG。
6.如权利要求1或2所述的组合物，其中所述内源基因包括选自由以下组成的组的基因：β肌动蛋白(Actb)、ATP合酶H+转运子、线粒体F0复合物亚基B1(Atp5f1)、β-2微球蛋白(B2m)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、葡萄糖醛酸酶β(Gusb)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)、磷酸甘油酸激酶I(Pgk1)、肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、核糖体蛋白S18(Rps18)、TATA盒结合蛋白(Tbp)、转铁蛋白受体(Tfrc)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白ζ多肽(Ywhaz)、Nanog同源框(Nanog)、锌指蛋白42(Rex1)和POU结构域5类转录因子1(Oct4)。
7.如权利要求1至6中任一项所述的组合物，其中所述转基因包含编码嵌合抗原受体(CAR)的序列。
8.如权利要求1至7中任一项所述的组合物，其中所述细胞是免疫细胞，任选地是T细胞。
9.如权利要求8所述的组合物，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
10.如权利要求1至9中任一项所述的组合物，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9。
11.如权利要求1至10中任一项所述的组合物，其中所述gRNA是单向导RNA(sgRNA)或crRNA:反式激活RNA(tracrRNA)。
12.一种包含核酸的细胞，所述核酸从5'到3'包含：
(1)编码所述细胞的内源基因的5'部分的序列，
(2)与所述细胞的所述内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列，
(3)编码外源转基因的序列，以及
(4)编码所述细胞的所述内源基因的所述3'部分的序列；并且
其中所述细胞表达以下中的每一者：(a)由(1)和(2)编码的所述内源基因以及(b)由(3)编码的所述转基因。
13.一种包含核酸的细胞，所述核酸从5'到3'包含：
(1)编码所述细胞的内源基因的5'部分的序列，
(2)编码外源转基因的序列，
(3)与所述细胞的所述内源基因的所述5'部分具有等同编码潜能的序列，以及
(4)编码所述细胞的所述内源基因的3'部分的序列；并且
其中所述细胞表达(a)由(2)编码的所述转基因和(b)由(3)和(4)编码的所述内源基因中的每一者。
14.如权利要求12或13所述的细胞，其中所述内源基因选自由以下组成的组：T细胞受体α链恒定区(TRAC)、T细胞受体β链恒定区(TRBC)、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链和IL-2Rγ链(IL2RG)。
15.如权利要求14所述的细胞，其中所述内源基因是TRAC。
16.如权利要求14所述的细胞，其中所述内源基因是IL2RG。
17.如权利要求12或13所述的细胞，其中所述内源基因包括选自由以下组成的组的基因：β肌动蛋白(Actb)、ATP合酶H+转运子、线粒体F0复合物亚基B1(Atp5f1)、β-2微球蛋白(B2m)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、葡萄糖醛酸酶β(Gusb)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)、磷酸甘油酸激酶I(Pgk1)、肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、核糖体蛋白S18(Rps18)、TATA盒结合蛋白(Tbp)、转铁蛋白受体(Tfrc)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白ζ多肽(Ywhaz)、Nanog同源框(Nanog)、锌指蛋白42(Rex1)和POU结构域5类转录因子1(Oct4)。
18.如权利要求12至17中任一项所述的细胞，其中所述转基因包含嵌合抗原受体(CAR)。
19.如权利要求12至18中任一项所述的细胞，其中所述细胞是免疫细胞，任选地是T细胞。
20.如权利要求19所述的细胞，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
21.一种编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括：
向所述细胞中引入靶向所述细胞中的内源基因的向导RNA(gRNA)、与所述gRNA复合的RNA指导的核酸酶，以及核酸，所述核酸与所述RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与所述内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、与所述内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列以及外源转基因，
其中所述RNA指导的核酸酶特异性地切割所述细胞中的所述内源基因以创建插入位点，其中所述核酸的所述与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和所述外源转基因被插入到所述插入位点中，并且其中所述核酸的所述与内源基因的3'部分具有等同编码潜能的序列和所述外源转基因的插入导致所述内源基因的恢复或继续表达以及所述转基因在所述细胞中的表达。
22.一种编辑细胞的基因组的方法，所述方法包括：
向所述细胞中引入靶向所述细胞中的内源基因的向导RNA(gRNA)、与所述gRNA复合的RNA指导的核酸酶、以及核酸，所述核酸与所述RNA指导的核酸酶复合并且包含编码与所述内源基因具有同源性的一个或多个区域的序列、外源转基因以及与所述内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列，
其中所述RNA指导的核酸酶特异性地切割所述细胞中的所述内源基因以创建插入位点，其中所述核酸的所述外源转基因和所述与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列被插入到所述插入位点中，并且其中所述核酸的所述外源转基因和所述与内源基因的5'部分具有等同编码潜能的序列的插入导致所述内源基因的恢复或继续表达以及所述转基因在所述细胞中的表达。
23.如权利要求21或22所述的方法，其中所述内源基因选自由以下组成的组：T细胞受体α链恒定区(TRAC)、T细胞受体β链恒定区(TRBC)、CD3γ链、CD3δ链、CD3ε链、CD3ξ链、IL-2Rα链、IL-2Rβ链和IL-2Rγ链(IL2RG)。
24.如权利要求23所述的方法，其中所述内源基因是TRAC。
25.如权利要求23所述的方法，其中所述内源基因是IL2RG。
26.如权利要求21或22所述的方法，其中所述内源基因选自由以下组成的组：β肌动蛋白(Actb)、ATP合酶H+转运子、线粒体F0复合物亚基B1(Atp5f1)、β-2微球蛋白(B2m)、甘油醛-3-磷酸脱氢酶(Gapdh)、葡萄糖醛酸酶β(Gusb)、次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(Hprt)、磷酸甘油酸激酶I(Pgk1)、肽基脯氨酰异构酶A(Ppia)、核糖体蛋白S18(Rps18)、TATA盒结合蛋白(Tbp)、转铁蛋白受体(Tfrc)、酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶活化蛋白ζ多肽(Ywhaz)、Nanog同源框(Nanog)、锌指蛋白42(Rex1)和POU结构域5类转录因子1(Oct4)。
27.如权利要求21至26中任一项所述的方法，其中所述转基因包含嵌合抗原受体(CAR)。
28.如权利要求21至27中任一项所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞，任选地是T细胞。
29.如权利要求28所述的方法，其中所述T细胞是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
30.如权利要求21至29中任一项所述的方法，其中所述RNA指导的核酸酶是Cas9。
31.如权利要求21至30中任一项所述的方法，其中所述gRNA是单向导RNA(sgRNA)或crRNA:反式激活crRNA(tracrRNA)。
32.如权利要求21至31中任一项所述的方法，其中向所述细胞中的引入是非病毒的。
33.如权利要求32所述的方法，其中向所述细胞中的非病毒引入是经由电穿孔进行的。
34.一种治疗或预防受试者的疾病的方法，所述方法包括：
获得权利要求12至20中任一项所述的细胞，以及
向所述受试者施用所述细胞。
35.如权利要求34所述的方法，其中所述疾病是癌症。
36.如权利要求35所述的方法，其中所述细胞是从所述受试者获得的。
37.如权利要求36所述的方法，其中所述细胞是T细胞，任选地是CD4+T细胞或CD8+T细胞。
CN202180078424.8A 2020-10-29 2021-10-29 细胞的基因组修饰的组合物和方法以及它们的用途 Pending CN116490606A (zh)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202063107401P 2020-10-29 2020-10-29
US63/107,401 2020-10-29
PCT/US2021/057457 WO2022094348A1 (en) 2020-10-29 2021-10-29 Compositions and methods of genomic modification of cells and uses thereof

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN116490606A true CN116490606A (zh) 2023-07-25

Family

ID=81384376

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202180078424.8A Pending CN116490606A (zh) 2020-10-29 2021-10-29 细胞的基因组修饰的组合物和方法以及它们的用途

Country Status (5)

Country Link
US (1) US20230365997A1 (zh)
EP (1) EP4236969A1 (zh)
JP (1) JP2023548478A (zh)
CN (1) CN116490606A (zh)
WO (1) WO2022094348A1 (zh)

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
RU2020136054A (ru) * 2018-04-05 2022-05-06 Джуно Терапьютикс, Инк. Т-клетки, экспрессирующие рекомбинантный рецептор, соответствующие полинуклеотиды и способы
US20230066806A1 (en) * 2019-03-14 2023-03-02 The Regents Of The University Of California Pooled knock-in screening and heterologous polypeptides co-expressed under the control of endogenous loci

Also Published As

Publication number Publication date
EP4236969A1 (en) 2023-09-06
WO2022094348A1 (en) 2022-05-05
US20230365997A1 (en) 2023-11-16
JP2023548478A (ja) 2023-11-17

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11590171B2 (en) Targeted replacement of endogenous T cell receptors
JP2022160481A (ja) 初代造血細胞におけるタンパク質送達
CN113518821A (zh) 用于免疫疗法的经修饰的自然杀伤(nk)细胞
CN112040986A (zh) 用于改进的免疫疗法的基因调控组合物和方法
US20210207174A1 (en) Genetic engineering of endogenous proteins
CN114929250A (zh) 用于疗法的经工程化的细胞
WO2020160489A1 (en) Gene-regulating compositions and methods for improved immunotherapy
JP2023541458A (ja) Ｃｄ５修飾のための化合物および方法
KR20230036059A (ko) 표적 핵산을 변형시키는 조성물 및 방법
US20230365997A1 (en) Compositions and methods of genomic modification of cells and uses thereof
CN117795065A (zh) 使用细胞穿透crispr-cas系统在原代免疫细胞中进行基因编辑
CN116322794A (zh) 用于改善癌症t细胞免疫疗法的dna构建体
WO2024059824A2 (en) Immune cells with combination gene perturbations
WO2024059618A2 (en) Immune cells having co-expressed tgfbr shrnas
WO2024073440A1 (en) Inhibition of genotoxic stress to improve t cell engineering
CN117062831A (zh) T淋巴细胞中的高效tcr基因编辑

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
REG Reference to a national code

Ref country code: HK

Ref legal event code: DE

Ref document number: 40098584

Country of ref document: HK