CN116478865A - 一种增产阿维菌素的发酵培养基及发酵方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种增产阿维菌素的发酵培养基及发酵方法，所述发酵培养基如下浓度的各原料：黄豆饼粉25～28g/L，鱼粉3～8g/L，淀粉170～174g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵0.2～0.3g/L，轻质碳酸钙1～2g/L，消泡剂4～5g/L，固体碱0.2～0.3g/L，淀粉酶，其中淀粉酶的添加量为淀粉重量的0.025％。本发明能够提高阿维菌素含量，同时提高B2a/B1a的比值。
Description
技术领域
本发明属于发酵技术领域，具体涉及一种增产阿维菌素的发酵培养基及发酵方法。
背景技术
阿维菌素(avermectin，AVM)是一类由阿维链霉菌(streptomyces avermitilis)经液体发酵产生的一类大环内酯类抗生素，是一种全新的无公害生物农兽医药，与Bt号称世界2大生物杀虫剂具有广谱、高效、低毒、低残留、与环境友好等特点，是目前世界上最有前途的生物杀虫杀螨剂。在农药、兽药及医药上均有广泛应用。
天然阿维菌素中含有8个组分，其中，主要成分为4种即A1a、A2a、B1a和B2a，其总含量≥80％，由于这些组分中，阿维菌素B1a的应用范围更广，药效更强，因此，在对阿维菌素的研究过程中，通常以阿维菌素B1a为指标进行发酵方法的研究，然而随着B1a和B2a高产菌株的发现，对阿维菌素B2a进行了深入研究，发现阿维菌素B2a对根结线虫具有特殊的防治效果，是阿维菌素B1a无法比拟的，具有良好的市场前景，因此，在一定程度上提高B1a效价的前提下，同时提高B2a含量，甚至提高B2a/B1a的比值，对于增加企业效益、提高市场竞争力，有着积极的意义。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的缺陷，提供一种增产阿维菌素的发酵培养基及发酵方法。
为了实现上述目的，本发明采取的技术方案如下：
一种增产阿维菌素的发酵培养基，包括黄豆饼粉、淀粉、酵母粉、硫酸铵、轻质碳酸钙、消泡剂、固体碱和淀粉酶，还包括有鱼粉。
进一步的，所述鱼粉的浓度为3-8g/L，优选4～6g/L。
进一步的，一种增产阿维菌素的发酵培养基，包括如下浓度的各原料：
黄豆饼粉25～28g/L，鱼粉4～6g/L，淀粉170～174g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵0.2～0.3g/L，轻质碳酸钙1～2g/L，消泡剂4～5g/L，固体碱0.2～0.3g/L，淀粉酶，其中淀粉酶的添加量为淀粉重量的0.025％。
进一步的，一种增产阿维菌素的发酵培养基，包括如下浓度的各原料：
黄豆饼粉28g/L、鱼粉6g/L、酵母粉4g/L、淀粉174g/L、轻质碳酸钙2g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂4g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％；
或
黄豆饼粉26g/L、鱼粉4g/L、酵母粉3g/L、淀粉172g/L、轻质碳酸钙2g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂4g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％；
或
黄豆饼粉25g/L、鱼粉5g/L、酵母粉4g/L、淀粉173g/L、轻质碳酸钙1.5g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂5g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％。
所述消泡剂具体可以为泡的、玉米油、豆油中的一种或几种。
本发明还涉及一种如前述发酵培养基的制备方法，其特征在于，
将黄豆饼粉、鱼粉、淀粉、酵母粉、硫酸铵、轻质碳酸钙、消泡剂、固体碱和淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化35～40min后，灭菌，备用。
所述灭菌可采用常用灭菌方法，包括但不限于采用120℃～122℃湿热灭菌30min。
按8～10％的接种量，将种子液一次性接入前述发酵培养基中发酵培养350-360h，放罐，即可；
发酵过程中的培养条件为：温度27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)。
所述种子液的发酵方法为：将孢子悬浮液接入灭菌且降温至29℃的种子培养基中，于温度28℃～29℃、风量0.8～1m3/(h·m3)的条件下发酵培养至50h-60h，即可；
所述种子培养基包括如下浓度的各原料：
淀粉25g/L，黄豆饼粉6g/L，花生饼粉6g/L，酵母膏3g/L，酵母膏3g/L，氯化钴0.025g/L。
采用前述发酵方法制备的阿维链霉菌发酵液，所述发酵液中，阿维菌素B1a的效价大于等于7000μg/mL，B2a效价大于8000μg/mL，阿维菌素B2a与阿维菌素B1a的比值为1.0-1.2。
与现有技术相比，本发明所取得的有益效果如下：
本发明以黄豆饼粉、鱼粉、酵母粉为缓效氮源，以硫酸铵为速效氮源，这些氮源共同满足阿维链霉菌不同时期菌体生长繁殖和合成产物的需要；本发明在传统培养基配方中创造性的加入鱼粉，并通过对含量、氮源选择、培养时间进行优化，结果显示，鱼粉中除了蛋白质外，还富含多种脂肪酸、锌、晒等微量元素，这些物质可能会引起阿维链霉菌生物合成路径的变化、致比值(B2a/B1a)增加。本培养基在在一定程度提高B1a产出的同时，还增加了B2a的产出，阿维菌素B1a的效价大于等于7000μg/mL，B2a效价大于8000μg/mL。显然对增加企业效益，提高市场竞争力，有着积极的意义。
另外，碳源为淀粉除了满足菌体生长繁殖外，主要为阿维链霉菌中后期生物合成阿维菌素提供能量；轻质碳酸钙用于中和发酵过程产生的有机酸，稳定发酵液的PH值；固体碱用于培养基灭菌前的pH调整；消泡剂用于培养基灭菌过程和菌种发酵培养过程的消沫，防止逃料、逃液；淀粉酶的功能将淀粉水解为小分子的葡萄糖，便于阿维链霉菌吸收利用；是培养基发挥作用必不可少的部分。
附图说明
图1是实施例1和对比例1发酵过程中B2a/B1a的比值对比图；
具体实施方式
以下结合实施例对本发明进行进一步详细的叙述。
本发明所用原料如无特别说明，均为市购。
实施例1
一种增产阿维菌素的发酵方法，其包括如下步骤：
步骤1、种子液的制备
1)采用12m3种子罐
2)种子培养基，包括：
淀粉25g/L、花生饼粉6g/L、酵母膏3g/L、黄豆饼粉6g/L、酵母膏3g/L、氯化钴0.025g/L、消后体积8m3；灭菌后备用；
3)培养：将阿维链霉菌的孢子悬浮液接入灭菌并降温至29℃的种子培养基中，于28℃～29℃培养，风量0.8～1m3/(h·m3)条件下发酵培养50-60h，镜检菌丝成球良好，且无杂菌污染，降温培养备用。
步骤2、发酵罐培养
1)采用120m3发酵罐；
2)发酵培养基，包括以下浓度的各原料：黄豆饼粉28g/L、鱼粉6g/L、酵母粉4g/L、淀粉174g/L、轻质碳酸钙2g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂4g/L、淀粉酶∶淀粉＝0.025％。
3)发酵培养基的制备：
按体积92m3计算用料量投料后，将黄豆饼粉、鱼粉、酵母粉、淀粉、轻质碳酸钙、硫酸铵、固体碱、消泡剂、淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化40min后，120℃～122℃湿热灭菌30min，备用
4)发酵培养：
将步骤1制备的种子液，一次性转入灭菌并降温至28℃发酵罐中，于27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)条件下发酵培养355h，放罐，
在发酵50小时后每24小时测定B1a效价和并根据B2a、B1a峰面积，计算比值(B2a/B1a)，结果见表1和图1。数据显示，在阿维链霉菌生物合成B1a过程中，B2组分同时进行生物合成，且比值的变化，总体上显下降的趋势，至355小时放罐时B1a效价7096μg/mL，比值(B2a/B1a)由1.27逐步降低到1.16。
表1 B1a效价、比值随培养时间变化表
实施例2
一种增产阿维菌素的发酵方法，其包括如下步骤：
步骤1、种子液的制备
1)采用12m3种子罐
2)种子培养基，包括：
淀粉25g/L、花生饼粉6g/L、酵母膏3g/L、黄豆饼粉6g/L、酵母膏3g/L、氯化钴0.025g/L、消后体积8m3；灭菌后备用；
3)培养：将阿维链霉菌的孢子悬浮液接入灭菌并降温至29℃的种子培养基中，于28℃～29℃培养，风量0.8～1m3/(h·m3)条件下发酵培养50-60h，镜检菌丝成球良好，且无杂菌污染，降温培养备用。
步骤2、发酵罐培养
1)采用120m3发酵罐；
2)发酵培养基，包括以下浓度的各原料：黄豆饼粉26g/L、鱼粉4g/L、酵母粉3g/L、淀粉172g/L、轻质碳酸钙2g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂4g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％。
3)发酵培养基的制备：
按体积92m3计算用料量投料后，将黄豆饼粉、鱼粉、酵母粉、淀粉、轻质碳酸钙、硫酸铵、固体碱、消泡剂、淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化40min后，120℃～122℃湿热灭菌30min，备用
4)发酵培养：
将步骤1制备的种子液，一次性转入灭菌并降温至28℃发酵罐中，于27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)条件下发酵培养357h，放罐，放罐时B1a效价为7024μg/mL，比值B2a/B1a＝1.08。
实施例3
一种增产阿维菌素的发酵方法，其包括如下步骤：
步骤1、种子液的制备
1)采用12m3种子罐
2)种子培养基，包括：
淀粉25g/L、花生饼粉6g/L、酵母膏3g/L、黄豆饼粉6g/L、酵母膏3g/L、氯化钴0.025g/L、消后体积8m3；灭菌后备用；
3)培养：将阿维链霉菌的孢子悬浮液接入灭菌并降温至29℃的种子培养基中，于28℃～29℃培养，风量0.8～1m3/(h·m3)条件下发酵培养50-60h，镜检菌丝成球良好，且无杂菌污染，降温培养备用。
步骤2、发酵罐培养
1)采用120m3发酵罐；
2)发酵培养基，包括以下浓度的各原料：黄豆饼粉25g/L、鱼粉5g/L、酵母粉4g/L、淀粉173g/L、轻质碳酸钙1.5g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂5g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％。
3)发酵培养基的制备：
按体积92m3计算用料量投料后，将黄豆饼粉、鱼粉、酵母粉、淀粉、轻质碳酸钙、硫酸铵、固体碱、消泡剂、淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化40min后，120℃～122℃湿热灭菌30min，备用
4)发酵培养：
将步骤1制备的种子液，一次性转入灭菌并降温至28℃发酵罐中，于27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)条件下发酵培养357h，放罐，放罐时B1a效价为705lμg/mL，比值B2a/B1a＝1.10。
对比例1
一种阿维菌素发酵方法，其包括如下步骤：
步骤1、种子液的制备
1)采用12m3种子罐；
2)种子培养基，包括：淀粉25g/L、黄豆饼粉6g/L、花生饼粉6g/L、酵母膏3g/L、酵母膏3g/L、氯化钴0.025g/L、消后体积8m3。
3)发酵培养：将阿维链霉菌的孢子悬浮液接入灭菌并降温至29℃的种子培养基中，于28℃～29℃、风量0.8～1m3/(h·m3)条件下发酵培养50-60h，镜检菌丝成球良好，且无杂菌污染，降温培养备用。
步骤2、发酵罐培养
1)采用120m3发酵罐
2)发酵培养基，包括：黄豆饼粉28g/L、淀粉174g/L、酵母粉10g/L、硫酸铵0.3g/L、轻质碳酸钙2g/L、消泡剂4g/L、固体碱0.2g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％。
3)发酵培养基的制备：
按体积92m3计算用料量投料后，将黄豆饼粉、淀粉、酵母粉、硫酸铵、轻质碳酸钙、消泡剂、固体碱、淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化40min后，120℃～122℃湿热灭菌30min，备用；
4)发酵培养
将步骤1制备的种子液，一次性转入灭菌并降温至28℃发酵罐中，于27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)条件下发酵培养355h，
在发酵50小时后每24小时测定B1a效价和并根据B2a、B1a峰面积，计算比值(B2a/B1a)，结果见表2。
表2 B1a效价、比值随培养时间变化表
结果分析：
数据显示，在阿维链霉菌由初级代谢向次级代谢转变过程中，B2a组分和B1a组分同步进行生物合成，比值(B2a/B1a)总体表现为逐步增加的趋势。由于发酵全过程，比值最大才0.88，即在原培养基配方条件下，阿维菌素B2a组分的含量始终少于B1a。
从实施例1和对比例1比较中发现，355小时放罐时B1a效价分别是7096μg/mL和5843μg/mL。但，放罐比值(B2a/B1a)也不同(见图1)，实施例1比值大于1，达到1.16，即B2a的产出多于B1a；而对比例1小于1，为0.85，即B2a的产出少于B1a，而且发酵培养的全过程，实施例1的比值均高于对比例1。由于微生物发酵是具有生命特征的高度复杂系统的连锁反应，任何一个发酵条件的变化都可能引起发酵过程和发酵结果的连锁变化。鱼粉中除了蛋白质外，还富含多种脂肪酸、锌、晒等微量元素，这些物质可能会引起阿维链霉菌生物合成路径的变化、致比值(B2a/B1a)增加。本培养基在一定程度提高B1a产出的同时，还增加了B2a的产出，显然对增加企业效益，提高市场竞争力，有着积极的意义。
实施例4鱼粉浓度实验
一种增产阿维菌素的发酵方法，其包括如下步骤：
步骤1、种子液的制备
1)采用12m3种子罐
2)种子培养基，包括：
淀粉25g/L、花生饼粉6g/L、酵母膏3g/L、黄豆饼粉6g/L、酵母膏3g/L、氯化钴0.025g/L、消后体积8m3；灭菌后备用；
3)培养：将阿维链霉菌的孢子悬浮液接入灭菌并降温至29℃的种子培养基中，于28℃～29℃培养，风量0.8～1m3/(h·m3)条件下发酵培养50-60h，镜检菌丝成球良好，且无杂菌污染，降温培养备用。
步骤2、发酵罐培养
1)采用120m3发酵罐；
2)发酵培养基，包括以下浓度的各原料：黄豆饼粉25g/L、鱼粉Xg/L、酵母粉4g/L、淀粉173g/L、轻质碳酸钙1.5g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂5g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％。
3)发酵培养基的制备：
按体积92m3计算用料量投料后，将黄豆饼粉、鱼粉、酵母粉、淀粉、轻质碳酸钙、硫酸铵、固体碱、消泡剂、淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化40min后，120℃～122℃湿热灭菌30min，备用
4)发酵培养：
将步骤1制备的种子液，一次性转入灭菌并降温至28℃发酵罐中，于27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)条件下发酵培养355h，放罐，检测B1a效价和并根据B2a、B1a峰面积，计算比值(B2a/B1a)
组别设置与结果
从实施例4的比较实验可以看出，鱼粉浓度从1g/L到10g/L的变化过程中，B2a/B1a的比值变化不是非常大，总体在0.99到1.16之间，但总体都大于对比例1的比值0.85，并且在A4-A6组的范围内相对更高一些，在大于6g/L时，B1a效价值变化不大但B2a的效价有所下降，因此综合物料节约原因和B1a和B2a的产值，可选择3-8g/L的范围，优选4-6g/L的鱼粉含量。
实施例5鱼粉与其他氮源对比实验
一种增产阿维菌素的发酵方法，其包括如下步骤：
步骤1、种子液的制备
1)采用12m3种子罐
2)种子培养基，包括：
淀粉25g/L、花生饼粉6g/L、酵母膏3g/L、黄豆饼粉6g/L、酵母膏3g/L、氯化钴0.025g/L、消后体积8m3；灭菌后备用；
3)培养：将阿维链霉菌的孢子悬浮液接入灭菌并降温至29℃的种子培养基中，于28℃～29℃培养，风量0.8～1m3/(h·m3)条件下发酵培养50-60h，镜检菌丝成球良好，且无杂菌污染，降温培养备用。
步骤2、发酵罐培养
1)采用120m3发酵罐；
2)发酵培养基，包括以下浓度的各原料：黄豆饼粉25g/L、“氮源选择(具体见下表)，，、酵母粉4g/L、淀粉173g/L、轻质碳酸钙1.5g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂5g/L、淀粉酶：淀粉＝0.025％。
3)发酵培养基的制备：
按体积92m3计算用料量投料后，将黄豆饼粉、鱼粉、酵母粉、淀粉、轻质碳酸钙、硫酸铵、固体碱、消泡剂、淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化40min后，120℃～122℃湿热灭菌30min，备用
4)发酵培养：
将步骤1制备的种子液，一次性转入灭菌并降温至28℃发酵罐中，于27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)条件下发酵培养355h，放罐，检测B1a效价和并根据B2a、B1a峰面积，计算比值(B2a/B1a)。
组别设置
数据显示，通过对植物蛋白、动物蛋白的不同选择，玉米浆、棉籽饼粉作为氮源并不能有效提高B2a·B1a-1的比值，反而会降低，并且基本和对比例l维持一致，只有动物蛋白牛肉蛋白胨对于B1a和B2a的效价提高有略微的帮助，然而牛肉蛋白胨的使用并不能有利于提高B2a·B1a-1的比值，并且从绝对数值来看B1a和B2a的效价也不及鱼粉带来的效价数值。因此，鱼粉的选择优于其他氮源的选择。
Claims (9)
1.一种发酵培养基，包括黄豆饼粉、淀粉、酵母粉、硫酸铵、轻质碳酸钙、消泡剂、固体碱和淀粉酶，其特征在于，还包括有鱼粉。
2.根据权利要求1所述的一种增产阿维菌素B2的发酵培养基，其特征在于，所述鱼粉的浓度为3-8g/L。
3.根据权利要求1所述的发酵培养基，其特征在于，包括如下浓度的各原料：
黄豆饼粉25～28g/L，鱼粉4～6g/L，淀粉170～174g/L，酵母粉2～4g/L，硫酸铵0.2～0.3g/L，轻质碳酸钙1～2g/L，消泡剂4～5g/L，固体碱0.2～0.3g/L，淀粉酶。
4.根据权利要求3所述的发酵培养基，其特征在于，包括如下浓度的各原料：
黄豆饼粉28g/L、鱼粉6g/L、酵母粉4g/L、淀粉174g/L、轻质碳酸钙2g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂4g/L、淀粉酶∶淀粉＝0.025％；
或
黄豆饼粉26g/L、鱼粉4g/L、酵母粉3g/L、淀粉172g/L、轻质碳酸钙2g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂4g/L、淀粉酶∶淀粉＝0.025％；
或
黄豆饼粉25g/L、鱼粉5g/L、酵母粉4g/L、淀粉173g/L、轻质碳酸钙1.5g/L、硫酸铵0.3g/L、固体碱0.2g/L、消泡剂5g/L、淀粉酶∶淀粉＝0.025％。
5.一种如权利要求1-4任一项所述发酵培养基的制备方法，其特征在于，
将黄豆饼粉、鱼粉、淀粉、酵母粉、硫酸铵、轻质碳酸钙、消泡剂、固体碱和淀粉酶加入到水中，搅拌溶解后定容，然后于90℃时糖化35～40min后，灭菌，备用。
6.根据权利要求5所述的一种增产阿维菌素的发酵培养基的制备方法，其特征在于，
所述灭菌采用120℃～122℃湿热灭菌30min。
7.一种阿维链霉菌的发酵方法，其特征在于，
按8～10％的接种量，将种子液一次性接入如权利要求1-4任一项所述的发酵培养基中发酵培养350-360h，放罐，即可；
发酵过程中的培养条件为：温度27℃～28℃、风量0.5～0.8m3/(h·m3)。
8.根据权利要求7所述的一种阿维链霉菌的发酵方法，其特征在于，
所述种子液的发酵方法为：将孢子悬浮液接入灭菌且降温至29℃的种子培养基中，于温度28℃～29℃、风量0.8～1m3/(h·m3)的条件下发酵培养至50h-60h，即可；
所述种子培养基包括如下浓度的各原料：
淀粉25g/L，黄豆饼粉6g/L，花生饼粉6g/L，酵母膏3g/L，酵母膏3g/L，氯化钴0.025g/L。
9.一种采用如权利要求7-8任一项所述发酵方法制备的阿维链霉菌发酵液，其特征在于，所述发酵液中，阿维菌素Bla的效价大于等于7000μg/mL，阿维菌素B2a的效价大于等于8000μg/mL，阿维菌素B2a与阿维菌素B1a的比值为1.0-1.2。
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| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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