CN116478860A - 高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基及制备方法、应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基及制备方法、应用，所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基组成为：酵母粉18～23 g/L、牛肉浸粉5～8 g/L、促生长肽3～6 g/L、水解乳蛋白2～5 g/L、氯化钠2～4 g/L，余量为水。使用本发明的培养基培养鸭疫里默氏杆菌2型，最终放罐发酵液活菌数峰值可达到4×10¹⁰CFU/mL以上，有利于细菌的生长繁殖，培养的活菌数高，而且使用该培养基制备的鸭疫里默氏杆菌2型灭活疫苗的抗原活性较高，制备的灭活疫苗能够取得更好的免疫效果，保护率高达100%，为鸭疫里默氏杆菌疫苗生产奠定了基础。

Description

高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基及制备方法、应用

技术领域

本发明属于微生物发酵领域，具体涉及一种高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基及其制备方法、应用。

背景技术

鸭疫里默氏杆菌有21个血清型，其中鸭疫里默氏杆菌2型(RA2)流行最广，发病率最高，是危害鸭养殖业的重要致病菌之一，鸭传染性浆膜炎、鸭疫综合征、新鸭病是该疾病的常用名称。该菌多感染1～8周龄雏鸭，其通过皮肤创口或呼吸道感染传播，感染率较高，某些地区甚至在90％以上，死亡率受环境影响较大，有时也能高达60％～75％。感染生病后的动物生长发育迟缓，可导致残鸭和僵鸭，给养鸭业造成严重的经济损失。长期以来，我国鸭的存栏数位居世界第一，并随着养鸭产业向规模化、集约化方向的发展，鸭疫里默氏杆菌已经严重阻碍我国养鸭业的发展。到目前为止，各国致力于鸭疫里默氏杆菌的研究一直是鸭病的热点，随着越来越多的2型菌株在病鸭体内被分离，关于2型菌株抗原活性的研究也就愈发必要，且随着国家对减抗的力度加强，研究相应的高抗原活性疫苗迫在眉睫。

目前有许多的鸭疫里默氏杆菌推荐培养基，但是缺乏鸭疫里默氏杆菌2型的专用培养基，2型鸭疫里默氏杆菌对培养条件要求不高，研究中常用TSB、P-L肉汤、马丁肉汤来培养鸭疫里默氏杆菌，但是在实际培养过程中，难以实现其高密度发酵，活菌数以及抗原活性较低，不适宜大规模生产，阻碍了相应疫苗的研究生产。

CN104623650A中公开了一种鸭疫里默氏杆菌、大肠埃希氏杆菌二联灭活疫苗的制备方法及其制品，该发明中的培养基制备得到的菌体密度值在10h可达到3.5×10¹⁰CFU/mL，而且通过该培养基制备的免疫疫苗的保护率只有70％左右。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的至少一个不足，提供一种高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基及其制备方法、应用。

本发明所采取的技术方案是：

第一个方面，本发明提供了一种高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基，包括：酵母粉18～23g/L、牛肉浸粉5～8g/L、促生长肽3～6g/L、水解乳蛋白2～5g/L、氯化钠2～4g/L，余量为水；其中，所述促生长肽的制备方法为：以豆粕为原料，蒸煮后加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：温度为50～60℃，酶解pH值为9.0～11.0，酶解时间为6～8h，酶的质量百分比用量为0.9～1.1％，豆粕浓度4.0～5.0g/100mL，经灭酶、离心、干燥后得到。

在一些实例中，所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基包括：酵母粉18.9g/L、牛肉浸粉6g/L、促生长肽5g/L、水解乳蛋白4g/L、氯化钠2g/L，余量为水。

第二个方面，本发明提供第一个方面所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基的制备方法，包括以下步骤：

1)按照配方量将酵母粉、牛肉浸粉、促生长肽、水解乳蛋白、氯化钠用水溶解，得混合液；

2)然后调节该混合液的pH值至7.2～7.4，高温灭菌冷却后即得到所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基。

在一些实例中，所述高温灭菌的温度为115～121℃，时间为15～30min。

第三个方面，本发明提供一种鸭疫里默氏杆菌2型的高密度培养方法，包括以下步骤：

1)种子活化：将鸭疫里默氏杆菌2型接种到TSA平板中培养，获得纯化菌株；

2)种子液制备：将纯化菌株接种到摇瓶TSB种子液培养基中进行发酵培养得到种子液；

3)发酵培养：在发酵罐中放入培养基，接种种子液进行培养，制得鸭疫里默氏杆菌2型的发酵培养物；其中，所述培养基为第一个方面所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基。

在一些实例中，所述鸭疫里默氏杆菌2型种子活化的温度为36～38℃，活化时间为15～20h。

在一些实例中，所述鸭疫里默氏杆菌2型种子液制备的条件为：培养温度为36～38℃，摇床转速为180～200r/min，培养时间为10～15h。

在一些实例中，所述发酵培养的条件为：发酵温度为36～38℃，转速为280～320r/min，每分钟通气量为发酵液体积的1.2～1.5倍。

在一些实例中，所述发酵培养中鸭疫里默氏杆菌2型二级种子的接种体积为以培养基体积计的2～4％。

在一些实例中，所述发酵培养时间为10～12h。

本发明的有益效果是：

1、使用本发明的培养基培养鸭疫里默氏杆菌2型，有利于细菌的生长繁殖，培养的活菌数高。

2、本发明的培养基的制备方法简单，所使用的原料相比于常用的脑心浸液培养基和胰酪大豆胨液体培养基的原料，成本更低。

3、本发明的培养基可以显著提高鸭疫里默氏杆菌2型发酵放罐活菌数，最终放罐发酵液活菌数峰值可达到4×10¹⁰CFU/mL以上，解决了目前鸭疫里默氏杆菌2型发酵过程中，放罐发酵液活菌数普遍偏低的问题，实现了高质量的工业化生产转化。

4、使用本发明的培养基培养鸭疫里默氏杆菌2型，菌株的抗原活性较高，制备的灭活疫苗，能够取得更好的免疫效果，保护率高达100％，为鸭疫里默氏杆菌疫苗生产奠定了基础。

附图说明

图1为培养基中各组分不同添加量摇瓶发酵的单因素试验结果；

图2为本发明提出的鸭疫里默氏杆菌2型高密度发酵培养基中各成分的影响因素间交互作用的响应面图；

图3为本发明所述的TSB培养基与发明后培养基的生长曲线和活菌数对比；

图4为鸭疫里默氏杆菌2型攻击各组小鼠的存活率。

具体实施方式

下文的公开提供了许多不同的实施方式或例子用来实现本发明的不同方案。

方便比较起见，以下实例中使用的促生长肽制备方法如下：

以豆粕为原料，将豆粕进行粉碎过80目筛后进行收集，加入水，使得豆粕：水＝1:30(m:v)，在室温下进行搅拌15min，经蒸煮30min后，冷却至55℃后，在蒸煮液中加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：温度为50～60℃，酶解pH值为9.0～11.0，酶解时间为6～8h，酶的质量百分比用量为0.9～1.1％，豆粕浓度4.0～5.0g/100mL，酶解完成后进行灭酶操作(水浴条件：100℃，8min)，将酶解液冷却至室温后，进行离心处理(4℃，6000r/min，5min)，离心完成后取上清液调节pH到7，最后将离心液脱盐、干燥后得到促生长肽。使用的木瓜蛋白酶的酶活约6000U/g。

实施例1

培养基中各组组分摇瓶发酵单因素试验结果对比：

鸭疫里默氏杆菌2型培养基各组分最适添加量需采用单因素试验方法，包括验证不同浓度牛肉浸粉、酵母粉、水解乳蛋白、促生长肽、氯化钠以及不同pH对鸭疫里默氏杆菌菌体密度的影响，每次均改变某一成分的含量并保持其他成分的含量不变，基础培养基各组分详细添加剂量如下：(1)牛肉浸粉添加量分别为：1、2、3、4、5、6g/L；(2)酵母粉添加量分别为：4、6、8、10、12、14g/L；(3)水解乳蛋白添加量分别为：1、2、3、4、5、6g/L；(4)促生长肽添加量分别为：1、2、3、4、5、6g/L；(5)氯化钠添加量分别为：0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0g/L。

培养基配制方法是：将上述培养基对应的各成分混合均匀，使用超纯水溶解，用用1mol/L的碳酸氢钠溶液调节所述基础培养基的pH，将配置好的培养基装入250mL三角瓶中，搅拌均匀，于116℃高温高压灭菌30min。

为达到培养基的最佳发酵效果，使用上述的培养基发酵鸭疫里默氏杆菌2型时，发酵步骤如下：

(1)将冷冻保存的鸭疫里默氏杆菌2型在TSA琼脂平板上活化，挑取单菌落接种于TSB培养基液体试管中，37℃培养12小时后作为种子培养液；

(2)按照培养基配方，分别配制基础发酵培养基50mL装入250mL三角瓶中，灭菌后将温度降至37℃；

(3)以v/v计，按3％的接种量分别接种于相应三角瓶中；

(4)培养条件设定为：温度37℃，转速200r/min，发酵15小时。

培养结果对比方法：

在实施例1制备的各基础培养基上接种鸭疫里默氏杆菌2型，每隔1小时取样1次，使用酶标仪测定鸭疫里默氏杆菌2型光密度值(OD_620nm)，连续测定15小时，比较各组培养基的OD_620nm最大值，记录并汇总相应数据如图1所示。

分析图1结果表明：在牛肉浸粉添加量为2g/L时菌株OD_620nm高于其他浓度，随着酵母粉及水解乳蛋白添加量的增加，菌株OD_620nm值具有先增加而后下降的趋势，当酵母粉添加量在12g/L及水解乳蛋白添加量为4g/L时，菌株OD_620nm值达到最大值，同时，随着促生长肽、氯化钠添加量的不断增加，菌株OD_620nm值有不同程度的升高，当促生长肽含量超过4g/L、氯化钠添加量超过1g/L时，菌株OD_620nm值增加不明显。

实施例2

按照实施例1中单因素试验的各组分最佳添加量组成配方A，将配方A中的促生长肽替换成大豆胨，大豆胨的添加量分别为1、2、3、4、5、6g/L，配方其他组分不变进行对比试验。本实施例采用实施例1中的发酵培养方法和培养结果对比方法，比较不同添加量的大豆胨与配方A对鸭疫里默氏杆菌的增菌效果，记录并汇总相应数据如表1所示。

表1

根据表1可以得出，配方中添加3g/L的大豆胨的增菌效果最好，但相较于在配方中添加促生长肽的增菌效果尚有明显差距，因此可以看出促生长肽在增菌培养基中起到了关键作用，应采用促生长肽进行后续的培养基优化试验。

实施例3

本实施例是对实施例1的进一步优化处理，具体的为：在单因素实验筛选的基础上，还需进行Plackett-Burman(PB)试验设计设计，且步骤为，选择选择牛肉浸粉A、酵母粉B、水解乳蛋白C、促生长肽D、氯化钠E这5个因子进行PB试验，以鸭疫里默氏杆菌2型光密度值(OD_620nm)为评价指标，使用Design-Expert软件进行n＝13的PB试验设计，考察5个影响因子，筛选出影响鸭疫里默氏杆菌生长的显著因素，各因子水平设计见表2，每组三个平行，依照模型所设计出的试验方案，在实施例1中的培养条件下，测定鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值。依照Design-Expert软件所设计出的试验方案，在实施例1中的培养条件下，测得鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值，试验安排及结果见表3。实验结果如表4所示。

表2 PB试验因素和水平表

表3 PB试验设计及结果

表4 PB试验设计结果分析

根据表4可以得出，各因素对鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值影响大小的顺序为：酵母粉>氯化钠>促生长肽>水解乳蛋白>牛肉浸粉，在所有因素中，酵母粉、促生长肽、氯化钠的P值均小于0.05，说明这三个因素对鸭疫里默氏杆菌的生长具有显著影响。因此根据试验结果选择酵母粉、氯化钠、促生长肽这三个因素进行后续最陡爬坡试验和响应面试验。对于另外两个不显著的因素，在后续的试验中保持单因素优化后的水平。

实施例4

本实施例是对实施例2的进一步补充优化，具体的为：在PB试验的基础上，还需进行最陡爬坡试验设计，根据PB试验结果可知，以酵母粉、氯化钠、促生长肽三个显著因素进行最陡爬坡试验，而酵母粉、氯化钠、促生长肽的相关系数t值为正，说明其添加量与菌体密度呈正相关，应依次增加，根据上述结果设计试验方案，依照实施例1中的培养条件，测得鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值，最陡爬坡试验设计及结果如表5所示。

表5最陡爬坡试验设计与结果

由上表可知，当酵母粉添加量为20g/L、促生长肽添加量为5g/L、氯化钠添加量为2g/L时，所得到的菌体密度最高。因此本试验选择第四组数据，作为后续试验响应面的中心点。

实施例5

本实施例是对实施例3的进一步补充优化，具体的为：在最陡爬坡试验的基础上，还需进行Box-Behnken(BB)试验设计，且步骤为，本试验根据PB试验得到的影响显著的因素，再以最陡爬坡试验的结果确定响应面试验的中心点，利用Design-Expert软件设计出响应面分析试验，各组因子水平设计见表6，每组三个平行，依照模型所设计出的试验方案，按照实施例1中的培养条件，测得鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值。

表6 BB试验设计水平表

依照Design-Expert软件所设计出的试验方案，在实施例1中的培养条件下，测得鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值，试验安排及结果见表7。

表7响应面试验设计方案及结果

针对响应面模型方差进行分析，参考表8的数据可以得知，模型的P<0.0001，差异有统计学意义，模型的失拟项的P＝0.4493>0.05，说明失拟项没有显著性差异，表明该模型建立是成功的，该模型可以很好的拟合实际情况，从方差分析结果可以看出，方程中的X₁，X₂，X₃和X₁ ²，X₂ ²，X₃ ²对鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值的影响影响有统计学意义(P<0.01)。

利用Design-Expert软件，绘制响应面三维图，参考图2和图3，其中图2A为X₁酵母粉-X₂促生长肽，图2B为X₁酵母粉-X₃氯化钠，图2C为X₂促生长肽-X₃氯化钠。

响应面的三维图均呈椭圆形，在酵母粉、促生长肽、氯化钠所选范围内均存在最高点，说明酵母粉、促生长肽和氯化钠的交互作用显著。

表8响应面试验设计分析

通过方差分析和二次多项回归拟合，得到酵母粉(X₁)、促生长肽(X₂)、氯化钠(X₃)与OD_620nm值之间的多元二次回归方程：

OD_620nm＝1.6+0.042X₁+0.013X₂+0.013X₃+0.031X₁X₂+0.0097X₁X₃-0.034X₂X₃-0.076X₁2-0.097X₂2-0.10X₃2

对上述回归方程求最优解，可得各营养因子在1000mL培养基中最佳添加量为：酵母粉18.9g、牛肉浸粉6.0g、促生长肽5.0g、水解乳蛋白4.0g、氯化钠2.0g，剩余组分为超纯水，预测的最大响应值为1.646。利用发明后的配方，进行多次摇瓶试验，得到平均鸭疫里默氏杆菌2型OD_620nm值为1.634，与预测值接近，说明方程拟合良好。

实施例6

TSB培养基与本发明培养基的生长曲线和活菌数对比：

(1)菌种活化：将鸭疫里默氏杆菌2型接种到TSA固体培养基中进行活化，活化温度为37℃，活化时间为15～20h，获得纯化菌株，将纯化菌株接种到TSA固体培养基中37℃恒温培养，备用；

(2)制备种子液：将活化后的鸭疫里默氏杆菌2型菌株接种到摇瓶TSB种子液培养基中进行发酵培养，培养温度为37℃，摇床转速为150～300r/min，优选180～200r/min，培养时间为10～15h，优选12h，得到种子液；

(3)发酵罐发酵：以v/v计，按接种量为3％，分别将上述种子液接种至装有本发明培养基和TSB培养基发酵罐中进行发酵，发酵体积均为3L，发酵温度设置37℃，发酵罐转速为300r/min，通气量为4L/min，每隔1h取样一次，利用酶标仪测定菌液的OD_620nm，并采用稀释平板计数法测定活菌数，重复发酵3次。

所述发明后的高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型高密度发酵培养基配方为：每1000mL所述培养基由以下部分组成：酵母粉18.9g、牛肉浸粉6.0g、促生长肽5.0g、水解乳蛋白4.0g、氯化钠2.0g，剩余组分为超纯水。

所述TSB培养基配方为：每1000mL所述培养基由以下部分组成：胰酪蛋白胨17g、大豆胨3g、氯化钠5g、磷酸氢二钾2.5g、葡萄糖2.5g，剩余组分为超纯水。

由图3可知，鸭疫里默氏杆菌2型在TSB培养基中8h达到平台期，此时OD_620nm约为1.18，活菌数约9.62×10⁹CFU/mL。鸭疫里默氏杆菌2型使用本发明培养基进行发酵，发酵10h到达平台期，此时OD_620nm约为1.62，活菌数能够达到约4.68×10¹⁰CFU/mL。数据证明，本发明培养基较TSB培养基的增菌效果提高4.86倍，利用上述本发明培养基进行发酵，菌株密度高，发酵效果稳定，可用于鸭疫里默氏杆菌的发酵制苗生产。

实施例7

为了验证本发明培养基的发酵制苗效果，具体为利用上述培养基发酵制作疫苗，并对疫苗的免疫效果进行分析：

按照实施例5中的发酵方法，使用上述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基发酵菌株，发酵10h后开始放罐，在发酵液中加入0.2％(v/v)甲醛灭活12h，6000r/min离心，利用PBS溶液重悬三次，再加入50％(v/v)白油佐剂制成灭活疫苗，使用该疫苗进行动物免疫保护试验，并与相应商品化疫苗进行免疫效果比较。选取适龄Balb/c小鼠，随机分成4组(每组10只)：RA2灭活疫苗组、RA2商品化灭活疫苗组、PBS攻毒组、PBS空白组，疫苗组每隔14d进行一次免疫，攻毒组、空白组仅注射等量PBS，在免疫后第14、28d采集血液，离心后收集血清，备用；在二次免疫14d后，对疫苗组和PBS攻毒组小鼠注射致死剂量10LD₅₀ RA2(5×10⁸CFU)，空白组注射等剂量的PBS，上述注射剂量均为0.1mL/只；以自制RA2灭活疫苗为实验组，以RA2商品化灭活疫苗为对照组，观察并记录7d内小鼠出现的临床症状和死亡情况。

攻毒试验结果如图4所示，自制RA2灭活疫苗组和PBS空白组存活率为100％，而商品化RA2灭活疫苗组存活率为90％，对照组所有小鼠均表现出病症，如嗜睡、腹泻、无法站立等，最终全部死亡。在7d的观察期内，空白组和疫苗组的小鼠均未发现临床病症。试验证明，利用本发明培养基发酵制作的疫苗，效果良好，且无不良反应，可用于鸭疫里默氏杆菌2型灭活疫苗的大规模菌苗生产。

实施例8

一种鸭疫里默氏杆菌2型不同发酵时间段的抗原活性测定方法，具体操作步骤如下：

(1)收集上述实施例6中二次免疫后小鼠血清，备用。

(2)按照上述实施例5中的发酵方法，使用本发明培养基发酵鸭疫里默氏杆菌2型菌株，收集4.0、6.0、8.0、10.0、12.0、14.0h发酵液，6000r/min离心后，利用PBS溶液重悬，分别进行超声破碎至澄清透明状态，收集各时间段发酵液的上清抗原，备用。

(3)利用BCA法测定各发酵液对应的上清抗原浓度，而后将各发酵液中的抗原稀释到10mg/mL，按照ELISA的方法，使用上述血清测定不同发酵时间段发酵液的抗原活性。

从表9可以看出，当开始发酵鸭疫里默氏杆菌2型时，，菌株的OD_620nm和抗原活性随着发酵时间的增加而增加；当发酵10h时，菌株OD_620nm达到最高，但此时的抗原对应的血清抗体效价并未达到最高；当发酵12h时，菌株抗原对应的血清效价最高，可达1∶128000，说明菌株在发酵12h时抗原活性最高，可为后续疫苗生产提供有效帮助。

表9各发酵时间菌株抗原蛋白的免疫原性

以上是对本发明所作的进一步详细说明，不可视为对本发明的具体实施的局限。对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的简单推演或替换，都在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基，其特征在于，包括：酵母粉18～23 g/L、牛肉浸粉5～8 g/L、促生长肽3～6 g/L、水解乳蛋白2～5 g/L、氯化钠2～4 g/L，余量为水；其中，所述促生长肽的制备方法为：以豆粕为原料，蒸煮后加入碱性蛋白酶进行酶解，酶解条件为：温度为50～60℃，酶解pH值为9～11，酶解时间为6～8h，酶的质量百分比用量为0.9～1.1%，豆粕浓度4.0～5.0g/100mL，经灭酶、离心、干燥后得到。

2.根据权利要求1所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基，其特征在于，包括：酵母粉18.9 g/L、牛肉浸粉6 g/L、促生长肽5 g/L、水解乳蛋白4 g/L、氯化钠2 g/L，余量为水。

3.权利要求1或2所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

按照配方量将酵母粉、牛肉浸粉、促生长肽、水解乳蛋白、氯化钠用水溶解，得混合液；

然后调节该混合液的pH值至7.2～7.4，高温灭菌冷却后即得到所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基；

其中，所述培养基如权利要求1或2所述。

4.根据权利要求3所述鸭疫里默氏杆菌2型培养基的制备方法，其特征在于，所述高温灭菌的温度为115～121℃，时间为15～30min。

5.一种鸭疫里默氏杆菌2型的高密度培养方法，其特征在于，包括以下步骤：

种子活化：将鸭疫里默氏杆菌2型接种到TSA平板中培养，获得纯化菌株；

种子液制备：将纯化菌株接种到摇瓶TSB种子液培养基中进行发酵培养得到种子液；

发酵培养：在发酵罐中放入培养基，接种种子液进行培养，制得鸭疫里默氏杆菌2型的发酵培养物；

其中，所述培养基为根据权利要求1或2所述高抗原活性的鸭疫里默氏杆菌2型培养基。

6.根据权利要求5所述的高密度培养方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌2型种子活化的温度为36～38℃，活化时间为15～20 h。

7.根据权利要求5所述的高密度培养方法，其特征在于，所述鸭疫里默氏杆菌2型种子液制备的条件为：培养温度为36～38℃，摇床转速为180～200 r/min，培养时间为10～15h。

8.根据权利要求5～7任一项所述的高密度培养方法，其特征在于，所述发酵培养的条件为：发酵温度为36～38℃，转速为280～320 r/min，每分钟通气量为发酵液体积的1.2～1.5倍。

9.根据权利要求5～7任一项所述的高密度培养方法，其特征在于，所述发酵培养中鸭疫里默氏杆菌2型二级种子的接种体积为以培养基体积计的2～4%。

10.根据权利要求5～7任一项所述的高密度培养方法，其特征在于，所述发酵培养时间为10～12 h。