CN116478222A - 3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法 - Google Patents
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Abstract
本申请提供一种3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法，属于核苷酸合成技术领域。3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法包括：将含有核苷原料、2‑氯‑1,3,2‑苯并二氧磷杂环己烷‑4‑酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的混合液于0～30℃下进行第一反应。于‑5～5℃下将含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行第二反应；向第二反应后的体系中加入淬灭剂进行淬灭反应，再加入水进行水解开环反应。对水解反应后的体系进行保护基的脱除反应。本申请提供的合成3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法为“一锅法”，原料易得，反应条件温和，无需较为苛刻的反应条件；3’三磷酸核苷及其衍生物的得率高，后续纯化步骤简单，易于工业化生产。
Description
技术领域
本申请涉及核苷酸合成技术领域，具体而言，涉及一种3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法。
背景技术
含2’羟基的3’三磷酸核苷(即3’TP)可以用于研究生物体内的新陈代谢，也可以用于融入DNA聚合酶以扩展DNA或RNA的引物等等，其结构式如下：
目前，有关含2’羟基的3’三磷酸核苷的合成方法的报道较少；Roger A.Johnson等人(Journal of Biological Chemistry,272(14),8962–8966)以3’AMP为原料，在氮气条件下，在含有H2NPO3H2以及HCONH2的溶液中超声反应过夜，得到含有3’ADP、3’ATP以及2’:3’cAMP的混合物；上述方法不仅需要适用昂贵的超声设备，且原料不易获得、成本低，目标产物含2’羟基的3’三磷酸核苷的得率低，反应后的体系分离纯化较为复杂，不利于工业化生产。
因此，提供一种原料易得、纯化简单且利于工业化生产的合成含2’羟基的3’三磷酸核苷的方法，迫在眉睫。
发明内容
本申请的目的在于提供一种3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法，其旨在提供一种原料易得、目标产物得率高、纯化简单且利于工业化生产的合成3’三磷酸核苷及其衍生物的方法。
本申请提供一种3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法，包括：
将含有核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的混合液于0～30℃下进行第一反应。于-5～5℃下，将含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行第二反应；向第二反应后的体系中加入淬灭剂进行淬灭反应，然后再加入水进行水解反应。对水解反应后的体系进行保护基的脱除反应。
其中，氧化剂为过氧化叔丁醇；和/或，氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系。淬灭剂为具有还原性的物质。核苷原料的结构式如下：
B为天然或修饰的碱基。碱基具有氨基，且氨基上的一个活泼氢被R3取代；或，碱基不具有氨基。R1、R2以及R3均为保护基。
本申请选用五碳糖的2’端以及5’端的羟基被保护基团的保护的核苷原料作为起始物(若核苷原料上的碱基具有氨基，该氨基上的一个活泼氢也被保护基团保护)，与2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱在溶液条件下、于0～30℃下进行第一反应，可以使得核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环；然后依次加入氧化剂进行氧化反应、加入淬灭剂进行淬灭反应以及加入水进行水解开环反应，可以使得核苷原料的3’端的六元磷环被氧化水解开环形成三磷酸基团；去除核苷原料上的原始保护基团(即进行保护基的脱除反应)，进而得到3’三磷酸核苷及其衍生物。
本申请提供的合成3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法为“一锅法”，各个步骤之间无需纯化，可连续进行投料反应；且原料易得成本低，反应条件温和，无需较为苛刻的反应条件；目标产物3’三磷酸核苷及其衍生物的得率高，后续纯化步骤简单，易于工业化生产。
本申请可选的实施方式中，核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的摩尔比为1:(1.5-3.0):(1.5-3.0):(2-4)。
上述配比条件下，可提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
本申请可选的实施方式中，核苷原料与氧化剂的摩尔比为1:(1.0-3.0)。
上述配比条件下，可提高核苷原料的3’端的六元磷环被氧化的比例，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
可选地，氧化剂为过氧化叔丁醇，核苷原料与过氧化叔丁醇的摩尔比为1:(1.5-3.0)。
可选地，氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系，核苷原料与碘的摩尔比为1:(1.0-2.0)。
本申请可选的实施方式中，第一有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种；和/或，第二有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种；和/或，淬灭剂选包括硫代硫酸钠、亚硫酸钠以及硫酸亚铁中的至少一种。
在上述技术方案中，第一有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种，可促进核苷原料的3’端的羟基向六元磷环的转化，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系时，第二有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种，可提高核苷原料的3’端的六元磷环被氧化的比例，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。淬灭剂选包括硫代硫酸钠、亚硫酸钠以及硫酸亚铁中的至少一种，可实现有效淬灭第二反应的进行。
本申请可选的实施方式中，第一反应的时间为50-100min；和/或，第二反应的时间为2-4h；和/或，淬灭反应的时间为20-40min；和/或，水解反应的时间为2-4h。
反应时间在上述条件下，有利于保证反应的充分进行，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
本申请可选的实施方式中，第一反应包括：先将核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮以及第三有机碱的混合液于0～5℃下进行第三反应；然后将含有第三反应后的体系、三丁基焦磷酸铵以及第四有机碱的混合液于20-30℃下进行第四反应。
在上述技术方案中，第一反应包括依次进行的第三反应和第四反应，有利于提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
可选地，第三有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种。
可选地，第四有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种。
可选地，第三反应在惰性气体保护的条件下进行。
可选地，第三反应的时间为20～50min。
可选地，第四反应的时间为30～50min。
本申请可选的实施方式中，含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液的制备步骤包括：于-5～5℃下，将氧化剂以逐滴加入的方式加入至第一反应后的体系中。
由于含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行的第二反应较为剧烈，于-5～5℃下，将氧化剂以逐滴加入的方式加入至第一反应后的体系中，便于控制反应的进行，使得整个反应体系较为稳定可控。
本申请可选的实施方式中，核苷原料的结构式如下：
可选地，R1基为苯甲酰基或者二甲氧基三苯甲基，R2基为叔丁基二甲硅基。
本申请可选的实施方式中，保护基为苯甲酰基、乙酰基或异丁酰基，3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法还包括：将水解反应后的体系与第一脱除剂进行第一脱除反应；其中，第一脱除剂为氨水与甲醇的混合液。
和/或，保护基为二甲氧基三苯甲基，3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法还包括：将水解反应后的体系与第二脱除剂进行第二脱除反应；其中，第二脱除剂为有机酸与甲醇的混合液；有机酸包括醋酸、三氟乙酸以及二氯乙酸中的至少一种。
和/或，保护基为叔丁基二甲硅基，3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法还包括：将水解反应后的体系与第三脱除剂进行第三脱除反应；其中，第三脱除剂包括氟化氢吡啶、氟化四丁基铵以及氟化氢三乙胺中的至少一种。
在上述技术方案中，可有效脱除核苷原料上的原始保护基团。
可选地，第一脱除反应的时间为10-12h，第一脱除反应的温度为20-30℃。
可选地，第二脱除反应的时间为2-3h，第二脱除反应的温度为15-25℃。
可选地，第三脱除反应的时间为15-20h，第三脱除反应的温度为20-30℃。
本申请可选的实施方式中，核苷原料为经过干燥处理后的核苷原料。
在上述技术方案中，有利于避免由于核苷原料上含有水，而导致的核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率受到影响的情况。
附图说明
为了更清楚地说明本申请实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本申请的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
图1为本申请提供的3’三磷酸核苷及其衍生物的制备工艺流程图。
图2为本申请实施例1提供的3’三磷酸核苷的核磁共振磷谱图。
图3为本申请实施例1提供的3’三磷酸核苷的核磁共振氢谱图。
图4为本申请实施例2提供的3’三磷酸核苷的核磁共振磷谱图。
图5为本申请实施例2提供的3’三磷酸核苷的核磁共振氢谱图。
图6为本申请实施例3提供的3’三磷酸核苷的核磁共振磷谱图。
图7为本申请实施例4提供的3’三磷酸核苷的核磁共振磷谱图。
具体实施方式
在本申请中，3’三磷酸核苷是指：含2’羟基的3’三磷酸核苷，其结构式如下：
3’三磷酸核苷的衍生物是指：3’三磷酸核苷的各种可接受的盐型。
本申请提供一种3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法，包括：将含有核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮(CAS：5381-99-7)、三丁基焦磷酸铵(CAS：5975-18-8，即Tributylammonium pyrophosphate)以及第一有机碱的混合液于0～30℃下进行第一反应。于-5～5℃下，将含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行第二反应；向第二反应后的体系中加入淬灭剂进行淬灭反应，然后再加入水进行水解开环反应。对水解反应后的体系进行保护基的脱除反应。
其中，氧化剂为过氧化叔丁醇；和/或，氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系。淬灭剂为具有还原性的物质。
核苷原料的结构式如下：
B为天然或修饰的碱基。
碱基具有氨基，且氨基上的一个活泼氢被R3取代；或，碱基不具有氨基。
R1、R2以及R3均为保护基。
发明人发现，核苷原料中五碳糖上不同位点处的活泼氢(包括：五碳糖的2’端、3’端以及5’端的羟基上的氢原子，或者五碳糖的碱基中氨基上的氢原子)反应活性不同。
因此，本申请选用五碳糖的2’端以及5’端的羟基被保护基团的保护的核苷原料作为起始物(若核苷原料上的碱基具有氨基，该氨基上的一个活泼氢也被保护基团保护)，与2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱在溶液条件下、于0～30℃下进行第一反应，可以使得核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环；然后依次加入氧化剂进行氧化反应、加入淬灭剂进行淬灭反应以及加入水进行水解反应，可以使得核苷原料的3’端的六元磷环被氧化水解开环形成三磷酸基团；去除核苷原料上的原始保护基团(即进行保护基的脱除反应)，进而得到3’三磷酸核苷及其衍生物。
本申请提供的合成3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法为“一锅法”，各个步骤之间无需纯化，可连续进行投料反应；且原料易得成本低，反应条件温和，无需较为苛刻的反应条件；目标产物3’三磷酸核苷及其衍生物的得率高，后续纯化步骤简单，易于工业化生产。
图1为本申请提供的3’三磷酸核苷及其衍生物的制备工艺流程图，本申请提供的3’三磷酸核苷及其衍生物的合成路径如下：
请参阅图1和上述合成路径，3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法包括：
S10，将含有核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的混合液于0～30℃下进行第一反应。
在本申请中，核苷原料的结构式如下：
式中，B为天然或修饰的碱基。
碱基具有氨基，且氨基上的一个活泼氢被R3取代；或，碱基不具有氨基。
R1、R2以及R3均为保护基。
将含有核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的混合液于0～30℃下进行第一反应后，生成中间体A。
可以理解的是，“碱基具有氨基，且氨基上的一个活泼氢被R3取代；或，碱基不具有氨基”是指：核苷原料中的碱基上可以具有氨基也可以不具有氨基；若核苷原料上的碱基上具有氨基时，氨基上的一个活泼氢被R3取代。
在本申请一些可行的实施方式中，R1、R2以及R3可各自独立地选自苯甲酰基(Bz)、叔丁基二甲硅基(TBS)、乙酰基(Ac)、二甲氧基三苯甲基(DMT)或者异丁酰基(iBu)。需要说明的是，在其他可行的实施方式中，R1、R2以及R3也可以选自其他保护基团，本申请不做限定。
作为示例性地，R1可以为DMT或Bz，R2可以为TBS或Bz，R3可以为Bz、Ac或者iBu。
作为示例性地，核苷原料的碱基可以为A、G、C、T或者假尿苷等等。
在本申请的实施例中，核苷原料的结构式可以如下：
其中，R1基为Bz或DMT，R2基为TBS。
在本申请一些可行的实施方式中，第一反应的时间为50-100min。第一反应时间在上述范围内，有利于保证第一反应的充分进行，提高核苷原料向中间体A的转化率，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，第一反应的温度可以为0℃、5℃、10℃、15℃、20℃、25℃和30℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；第一反应的时间可以为50min、55min、60min、65min、70min、75min、80min、90min和100min中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
在本申请一些可行的实施方式中，核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的摩尔比为1:(1.5-3.0):(1.5-3.0):(2-4)。上述配比条件下，可提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的摩尔比可以为1:1.5:1.5:2、1:1.5:3.0:2、1:1.5:3:4、1:2:2:3、1:3:1.5:2、1:3:3:2、1:3:1.5:4和1:3:3:4的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
在本申请一些可行的实施方式中，第一有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种，可促进核苷原料的3’端的羟基向六元磷环的转化，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
在本申请一些可行的实施方式中，第一反应包括：先将核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮以及第三有机碱的混合液于0～5℃下进行第三反应(即由核苷原料反应生成中间体A’)；然后将含有第三反应后的体系、三丁基焦磷酸铵以及第四有机碱的混合液于20-30℃下进行第四反应(即由中间体A’反应生成中间体A)。上述步骤对应的第一反应的合成路径如下：
第一反应包括依次进行的第三反应和第四反应，有利于进一步提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。其中，第三反应较为剧烈，在0～5℃下进行第三反应，便于控制反应的进行。
作为示例性地，第三反应的温度可以为0℃、2℃、2.5℃、4℃和5℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；第四反应的温度可以为20℃、22℃、25℃、27℃和30℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
进一步地，第三反应的时间为20～50min，第四反应的时间为30～50min，第三反应和第四反应的时间分别在上述范围内，有利于保证第三反应和第四反应的充分进行，提高核苷原料向中间体A的转化率，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，第三反应的时间可以为20min、25min、30min、40min、45min和50min中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；第四反应的时间可以为30min、35min、40min、45min和50min中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
在本申请一些可行的实施方式中，第三有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种，可促进第三反应的进行，提高核苷原料与2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的反应程度，进而有利于进一步提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率。
作为示例性地，第三有机碱选自吡啶。
在本申请一些可行的实施方式中，第四有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种，可促进第四反应的进行，提高中间体A与三丁基焦磷酸铵的反应程度，进而有利于进一步提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率。
作为示例性地，第四有机碱选自三戊胺。
在本申请一些可行的实施方式中，第三反应在惰性气体保护的条件下进行，可促进第三反应的进行，提高核苷原料与2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮的反应程度，进而有利于进一步提高核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率。
作为示例性地，惰性气体可以为氮气，本申请不做限定。
在本申请一些可行的实施方式中，核苷原料为经过干燥处理后的核苷原料。若核苷原料上含有水，2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮会受到核苷原料上的水的影响，2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮会与水反应发生分解，从而导致可参与第一反应的2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮存在损失。因此，核苷原料为经过干燥处理后的核苷原料，有利于避免由于核苷原料上含有水，而导致的核苷原料的3’端的羟基转化成六元磷环的转化率受到影响的情况。
进一步地，核苷原料的含水量符合：K.F.<200ppm。
S20，于-5～5℃下，将含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行第二反应；向第二反应后的体系中加入淬灭剂进行淬灭反应，然后再加入水进行水解反应。其中，氧化剂为过氧化叔丁醇；和/或，氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系。淬灭剂为具有还原性的物质。
由于第二反应较为剧烈，在-5～5℃下进行，不仅可以使得第二反应的进行便于控制，且也有利于减少副产物的生成，同时也有利于避免反应后的体系发生分解。氧化剂为过氧化叔丁醇；和/或，氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系；可以实现核苷原料的3’端形成六元磷环被氧化。
作为示例性地，第二反应的温度可以为-5℃、-2.5℃、-1℃、0℃、1℃、2℃、2.5℃、4℃和5℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
在本申请一些可行的实施方式中，第二反应的时间为2-4h。第二反应时间在上述范围内，有利于保证第二反应的充分进行，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，第二反应的时间可以为2h、2.2h、2.5h、3h、3.5h和4h中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
进一步地，在本申请一些可行的实施方式中，含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液的制备步骤包括：于-5～5℃下，将氧化剂以逐滴加入的方式加入至第一反应后的体系中。
由于含有第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行的第二反应较为剧烈，于-5～5℃下，将氧化剂以逐滴加入的方式加入至第一反应后的体系中，便于控制反应的进行，使得整个反应体系较为稳定可控。
在本申请一些可行的实施方式中，核苷原料与氧化剂的摩尔比为1:(1.0-3.0)。上述配比条件下，可提高核苷原料的3’端的六元磷环被氧化的比例，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，核苷原料与氧化剂的摩尔比可以为1:1.0、1:1.2、1:1.5、1:1.7、1:2.0、1:2.2、1:2.5、1:2.7和1:3.0中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
由于在本申请中，氧化剂可以为过氧化叔丁醇，或氧化剂可以为含有碘以及第二有机碱的混合体系。当氧化剂为过氧化叔丁醇时，核苷原料与过氧化叔丁醇的摩尔比为1:(1.5-3.0)；当氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系时，核苷原料与碘的摩尔比为1:(1.0-2.0)。
作为示例性地，碘以及第二有机碱的混合体系可以含有碘以及第二有机碱的水溶液的混合体系。碘以及第二有机碱的混合体系中，碘的质量占比为1-5％。进一步地，当第二有机碱为吡啶时，吡啶与水的体积比为80:20-98:2。
在本申请一些可行的实施方式中，氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系时，第二有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种，可提高核苷原料的3’端的六元磷环被氧化的比例，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，第二有机碱选自吡啶。
由提供的3’三磷酸核苷及其衍生物的合成路径可知，向第二反应后的体系中加入淬灭剂硫代硫酸钠进行淬灭反应，可以淬灭第二反应；然后再加入水进行水解反应，可以使得核苷原料的3’端被氧化的六元磷环水解开环形成三磷酸基团，得到中间体B。
在本申请一些可行的实施方式中，淬灭剂选包括硫代硫酸钠、亚硫酸钠以及硫酸亚铁中的至少一种，可实现有效淬灭第二反应的进行。
进一步地，核苷原料与淬灭剂的摩尔比为1:(1.4-6.0)，可实现有效淬灭第二反应的进行。
作为示例性地，核苷原料与淬灭剂的摩尔比可以为1:1.4、1:1.48、1:2.0、1:2.37、1:2.38、1:2.5、1:3.0、1:3.5、1:4.0、1:5.0、1:5.67和1:6.0中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
在本申请一些可行的实施方式中，淬灭反应的温度为20-30℃，淬灭反应的时间为20-40min；上述淬灭反应条件下，可以使得淬灭反应充分的进行。
作为示例性地，淬灭反应的温度可以为20℃、22℃、25℃、27℃和30℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；淬灭反应的时间可以为20min、25min、30min、35min和40min中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
在本申请一些可行的实施方式中，水解反应的温度为20-30℃，水解反应的时间为2-4h；上述水解反应条件下，可以使得水解反应充分的进行，进而有利于提高最终得到的3’三磷酸核苷及其衍生物的得率。
作为示例性地，水解反应的温度可以为20℃、22℃、25℃、27℃和30℃中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值；水解反应的时间可以为2h、2.2h、2.5h、3h、3.5h和4h中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
S30，对水解反应后的体系进行保护基的脱除反应。
对水解反应后的体系进行保护基的脱除反应，可去除核苷原料上的原始保护基团(即进行保护基的脱除反应)，进而得到3’三磷酸核苷及其衍生物(即目标产物C)。
对水解反应后的体系进行保护基的脱除反应包括：依次去除R3、R1和R2。
若保护基为苯甲酰基、乙酰基或异丁酰基，脱除反应的步骤包括：将水解反应后的体系与第一脱除剂进行第一脱除反应；其中，第一脱除剂为氨水与甲醇的混合液。上述方式可有效脱除核苷原料上的原始保护基团——苯甲酰基。
进一步地，第一脱除反应的时间为10-12h，第一脱除反应的温度为20-30℃；上述反应条件下，可以使得酰基类保护基的脱除较为彻底。
再进一步地，第一脱除剂中，氨水与甲醇的体积比为1:(0.5-2)；作为示例性地，氨水与甲醇的体积比可以为1:0.5、1:0.7、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.7和1:2中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
若保护基为二甲氧基三苯甲基，脱除反应的步骤包括：将水解反应后的体系与第二脱除剂进行第二脱除反应；其中，第二脱除剂为有机酸与甲醇的混合液，有机酸包括醋酸、三氟乙酸以及二氯乙酸中的至少一种。上述方式可有效脱除核苷原料上的原始保护基团——二甲氧基三苯甲基。
进一步地，第二脱除反应的时间为2-3h，第二脱除反应的温度为15-25℃；上述反应条件下，可以使得二甲氧基三苯甲基的脱除较为彻底。
再进一步地，第二脱除剂中，有机酸与甲醇的体积比为1:(0.5-2)；作为示例性地，有机酸与甲醇的体积比可以为1:0.5、1:0.7、1:1、1:1.2、1:1.5、1:1.7和1:2中的任意一者点值或者任意两者之间的范围值。
若保护基为叔丁基二甲硅基，脱除反应的步骤包括：将水解反应后的体系与第三脱除剂进行第三脱除反应；其中，第三脱除剂包括氟化氢吡啶、氟化四丁基铵以及氟化氢三乙胺中的至少一种。上述方式可有效脱除核苷原料上的原始保护基团——叔丁基二甲硅基。作为示例性地，若第三脱除剂为氟化氢吡啶时，S10步骤中使用的核苷原料与氟化氢吡啶的摩尔比为1:(2-4)；若第三脱除剂为氟化四丁基铵时，S10步骤中使用的核苷原料与氟化四丁基铵的摩尔比为1:(2-4)；若第三脱除剂为氟化氢三乙胺时，S10步骤中使用的核苷原料与氟化氢三乙胺的摩尔比为1:(4-6)。
进一步地，第三脱除反应的时间为15-20h，第三脱除反应的温度为20-30℃；上述反应条件下，可以使得叔丁基二甲硅基的脱除较为彻底。
再进一步地，第三脱除反应的pH为4.8-5.2，可以使得叔丁基二甲硅基的脱除较为彻底。
在本申请一些可行的实施方式中，将脱除每个保护基(R1、R2和R3)后体系用去离子水和乙酸乙酯萃取。
S40，对脱除反应后的体系进行纯化处理。
在本申请中，纯化处理采用核苷酸的常规纯化方法；作为示例性地，纯化处理包括：依次使用阴离子交换树脂和C18硅胶柱对脱除反应后的体系进行反相制备液相色谱纯化。
作为示例性地，使用阴离子交换树脂进行柱层析时，流动相为氯化钠水溶液和去离子水。
为使本申请实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本申请实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
实施例1
本实施例提供一种3’三磷酸核苷的制备方法，包括如下步骤：
(1)在旋转蒸发仪上，30℃下，通过减压蒸馏，将21.5g的核苷原料用乙腈带水干燥2遍，得到干燥后的核苷原料；其中，核苷原料的结构式如下：
(2)将步骤(1)得到的干燥的核苷原料加入反应瓶，向反应瓶内加入吡啶150mL，降温至体系温度在0℃，搅拌至固体溶解溶液变澄清。向上述反应瓶中加入16.4g的2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮，氮气保护且于0℃下搅拌反应30min。然后继续向上述反应瓶中加入49.1g的三丁基焦磷酸铵和41.0g的三戊胺，升温至25℃搅拌反应40min。随后降温至0℃，向上述反应瓶中滴加12.2g的过氧化叔丁醇，滴毕后搅拌反应3h。随后升温至20℃，向上述反应瓶中继续加入17g的硫代硫酸钠，搅拌反应30min。随后再加入去离子水350mL，继续搅拌反应3h。
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入250mL的氨水以及250mL的甲醇，于20℃下搅拌反应2.5h，然后于30℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为110mL，向减压浓缩后的体系中加入225mL的去离子水和250mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于30℃下减压浓缩至水相体积为125mL。
(4)向步骤(3)得到的水相中加入12g的氟化氢吡啶，于25℃下搅拌反应17.5h，慢慢滴加1M氢氧化钠调pH5.0，随后加入2L去离子水稀释，得到待层析液。
(5)选用DEAE-Sephadex阴离子交换树脂柱，以1M的氯化钠和水做流动相加以分离提出，流速为150mL/min。
(6)浓缩阴离子交换树脂柱纯化后的产物，再用反相HPLC以水做流动相加以分离，填料为AQ-C18(330g，X*11)Flash C18柱纯化，60mL/min，柱先用体积比为1：1的乙腈和H2O的混合溶液洗10min，再用去离子水洗10min；载样，得到收集液，然后用纯化水进行洗脱。将收集到HPLC≥95％且31P-NMR≥90％的产品合并浓缩至30mL。产品以钠盐形式保存在水溶液中储存温度2-8℃，浓度为0.5M。
实施例2
本实施例提供一种3’三磷酸核苷的制备方法，包括如下步骤：
(1)在旋转蒸发仪上，25℃下，通过减压蒸馏，将19g的核苷原料用乙腈干燥2遍，得到干燥后的核苷原料；其中，核苷原料的结构式如下：
(2)将步骤(1)得到的干燥的核苷原料加入反应瓶，向反应瓶内加入三乙胺150mL，降温至体系温度在0℃，搅拌至固体溶解溶液变澄清。向上述反应瓶中加入7.5g的2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮，氮气保护且于0℃下搅拌反应50min。然后继续向上述反应瓶中加入16.3g的三丁基焦磷酸铵和11.3g的三丁胺，升温至20℃搅拌反应30min。随后降温至0℃，向上述反应瓶中滴加的含6.1g碘以及吡啶的水溶液600mL的混合液，滴毕后搅拌反应2h。随后升温至20℃，向上述反应瓶中继续加入5.6g的硫代硫酸钠，搅拌反应20min。随后再加入去离子水300mL，继续搅拌反应2h。
其中，含有碘以及吡啶的水溶液的混合液中，碘的质量占比为1％；吡啶的水溶液中，吡啶的体积占比为98％。
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入200mL的氨水和200mL甲醇溶液，于20℃下搅拌反应10h，然后于25℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为100mL，向减压浓缩后的体系中加入200mL的去离子水和200mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于28℃下减压浓缩至水相体积为100mL。
(4)向步骤(3)得到的反应体系中加入200mL的质量分数为50％的二氯乙酸以及200mL的甲醇，于20℃下搅拌反应2h，然后于28℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为110mL，向减压浓缩后的体系中加入150mL的去离子水和150mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于28℃下减压浓缩至水相体积为100mL。
(5)向步骤(4)得到的水相中加入17.4g的氟化氢三乙胺，于20℃下搅拌反应15h，慢慢滴加1M氢氧化钠调pH至5.0，随后加入2L去离子水稀释，得到待层析液。
(6)选用DEAE-Sephadex阴离子交换树脂柱，以1M的氯化钠和水做流动相加以分离提出，流速为150mL/min。
(7)浓缩阴离子交换树脂柱纯化后的产物，再用反相HPLC以水做流动相加以分离，填料为AQ-C18(330g，X*11)Flash C18柱纯化，60mL/min，柱先用体积比为1：1的乙腈和H2O的混合溶液洗10min，再用去离子水洗10min；载样，得到收集液，然后用纯化水进行洗脱。将收集到HPLC≥90％且31P-NMR≥85％的产品合并浓缩至30mL。产品以钠盐形式保存在水溶液中储存温度2-8℃，浓度为0.2M。
实施例3
本实施例提供一种3’三磷酸核苷的制备方法，包括如下步骤：
(1)在旋转蒸发仪上，35℃下，通过减压蒸馏，将20g的核苷原料用乙腈干燥2遍，得到干燥后的核苷原料；其中，核苷原料的结构式如下：
(2)将步骤(1)得到的干燥的核苷原料加入反应瓶，向反应瓶内加入三戊胺200mL，降温至体系温度在5℃，搅拌至固体溶解溶液变澄清。向上述反应瓶中加入11.5g的2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮，氮气保护且于5℃下搅拌反应50min。然后继续向上述反应瓶中加入93.4g的三丁基焦磷酸铵和10.5g的三丁胺，升温至30℃搅拌反应50min。随后降温至-5℃，向上述反应瓶中滴加含有14g碘的吡啶的水溶液600mL的混合液，滴毕后搅拌反应4h。随后升温至30℃，向上述反应瓶中继续加入10.7g的硫代硫酸钠，搅拌反应40min。随后再加入去离子水400mL，继续搅拌反应4h。
其中，含有碘以及吡啶的水溶液的混合液中，碘的质量占比为5％；吡啶的水溶液中，吡啶的体积占比为98％。
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入400mL的氨水和400mL甲醇溶液，于30℃下搅拌反应12h，然后于35℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为120mL，向减压浓缩后的体系中加入250mL的去离子水和300mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于32℃下减压浓缩至水相体积为120mL。
(4)向步骤(3)得到的反应体系中加入300mL的三氟乙酸以及300mL的甲醇，于25℃下搅拌反应3h，然后于32℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为150mL，向减压浓缩后的体系中加入250mL的去离子水和250mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于32℃下减压浓缩至水相体积为150mL。
(5)向步骤(4)得到的水相中加入28g的氟化四丁基铵，于30℃下搅拌反应20h，慢慢滴加1M氢氧化钠调pH至5.0，随后加入2L去离子水稀释，得到待层析液。
(6)选用DEAE-Sephadex阴离子交换树脂柱，以1M的氯化钠和水做流动相加以分离提出，流速为150mL/min。
(7)浓缩阴离子交换树脂柱纯化后的产物，再用反相HPLC以水做流动相加以分离，填料为AQ-C18(330g，X*11)Flash C18柱纯化，60mL/min，柱先用体积比为1：1的乙腈和H2O的混合溶液洗10min，再用去离子水洗10min；载样，得到收集液，然后用纯化水进行洗脱。将收集到HPLC≥80％且31P-NMR≥80％的产品合并浓缩至30mL。产品以钠盐形式保存在水溶液中储存温度2-8℃，浓度为0.3M。
实施例4
本实施例提供一种3’三磷酸核苷的制备方法，包括如下步骤：
(1)在旋转蒸发仪上，30℃下，通过减压蒸馏，将19.0g的核苷原料用乙腈干燥2遍，得到干燥后的核苷原料；其中，核苷原料的结构式如下：
(2)将步骤(1)得到的干燥的核苷原料加入反应瓶，向反应瓶内加入吡啶150mL，降温至体系温度在0℃，搅拌至固体溶解溶液变澄清。向上述反应瓶中加入4g的2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮，氮气保护且于0℃下搅拌反应20min。然后继续向上述反应瓶中加入11.8g的三丁基焦磷酸铵和7.4g的三丙胺，升温至25℃搅拌反应40min。随后降温至0℃，向上述反应瓶中滴加3.5g的过氧化叔丁醇，滴毕后搅拌反应2h。随后升温至25℃，向上述反应瓶中继续加入11.2g的硫酸亚铁，搅拌反应30min。随后再加入去离子水350mL，继续搅拌反应3h。
(3)向步骤(2)得到的反应体系中加入100mL的氨水和100mL的乙醇，于25℃下搅拌反应11h，然后于30℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为100mL，向减压浓缩后的体系中加入225mL的去离子水和250mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于30℃下减压浓缩至水相体积为130mL。
(4)向步骤(3)得到的水相中加入240mL的质量分数为50％的醋酸以及240mL的甲醇，于25℃下搅拌反应2.5h，然后于30℃下减压浓缩至反应瓶内的液相体积为110mL，向减压浓缩后的体系中加入225mL的去离子水和250mL的乙酸乙酯进行两次萃取，保留水相，然后于30℃下减压浓缩至水相体积为125mL。
(5)向步骤(4)得到的水相中加入5.1g的氟化氢吡啶，于25℃下搅拌反应17.5h，慢慢滴加1M氢氧化钠调pH至5.0，随后加入2L去离子水稀释，得到待层析液。
(6)选用DEAE-Sephadex阴离子交换树脂柱，以1M的氯化钠和水做流动相加以分离提出，流速为150mL/min。
(7)浓缩阴离子交换树脂柱纯化后的产物，再用反相HPLC以水做流动相加以分离，填料为AQ-C18(330g，X*11)Flash C18柱纯化，60mL/min，柱先用体积比为1：1的乙腈和H2O的混合溶液洗10min，再用去离子水洗10min；载样，得到收集液，然后用纯化水进行洗脱。将收集到HPLC≥75％且31P-NMR≥80％的产品合并浓缩至50mL。产品以钠盐形式保存在水溶液中储存温度2-8℃，浓度为0.2M。
实验例1
对实施例1制得的3’三磷酸核苷分别进行核磁共振磷谱和核磁共振氢谱的表征，表征结果分别如图2和图3所示。
从图2可以看出，1HNMR(500MHz,D2O):7.85(s,1H)，4.46(t,J＝5.5Hz,2H)，4.27-4.25(m,2H)，3.92(dd,J＝3.0,13.0Hz,1H)，3.85(dd,J＝3.0,13.0Hz,1H)，3.42(s,3H)；其中4.0-4.5处的峰部分与溶剂水峰重叠。
从图3可以看出，31PNMR(202MHz,D2O):δ-9.84(d,J＝11Hz)，-11.61(d,J＝19Hz)，-22.74(t,J＝19Hz)。
因此，实施例1制得的3’三磷酸核苷符合如下预期结构：
实验例2
对实施例2制得的3’三磷酸核苷分别进行核磁共振磷谱和核磁共振氢谱表征，表征结果分别如图4和图5所示。
从图4可以看出，1HNMR(500MHz,D2O):8.44(s,1H)，6.70(s,1H)，6.04(d,J＝5.5Hz,1H)，4.54(t,J＝4.0Hz,2H)，4.31(t,J＝2.5Hz,1H)，2.23-2.19(m,1H)，4.14-4.10(m,1H)；其中4.0-4.5处的峰部分与溶剂水峰重叠。
从图5可以看出，31PNMR(202MHz,D2O):δ-6.44(d,J＝19Hz)，-10.8(d,J＝18Hz)，-21.4(t,J＝18Hz)。
因此，实施例2制得的3’三磷酸核苷符合如下预期结构：
实验例3
对实施例3制得的3’三磷酸核苷进行核磁共振磷谱表征，表征结果如图6所示。
从图6可以看出，31PNMR(202MHz,D2O):δ-6.20(d,J＝19Hz)，-11.0(d,J＝18Hz)，-21.6(t,J＝19Hz)。
因此，实施例3制得的3’三磷酸核苷符合如下预期结构：
实验例4
对实施例4制得的3’三磷酸核苷进行核磁共振磷谱表征，表征结果如图7所示。
从图7可以看出，31PNMR(202MHz,D2O):δ-6.37(d,J＝19Hz)，-11.1(d,J＝19Hz)，-21.6(t,J＝19Hz)。
因此，实施例4制得的3’三磷酸核苷符合如下预期结构：
实验例5
对实施例1-4制得3’三磷酸核苷的得率进行计算，计算结果如表1所示。
表1
从表1可以看出，采用本申请提供的3’三磷酸核苷的合成方法，最终制得的3’三磷酸核苷得率较高。
综上，本申请提供的合成3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法为“一锅法”，各个步骤之间无需纯化，可连续进行投料反应；且原料易得成本低，反应条件温和，无需较为苛刻的反应条件；目标产物3’三磷酸核苷及其衍生物的得率高，后续纯化步骤简单，易于工业化生产。
以上所描述的实施例是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。本申请的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本申请的范围，而是仅仅表示本申请的选定实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本申请保护的范围。
Claims (10)
1.一种3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法，其特征在于，包括：
将含有核苷原料、2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、三丁基焦磷酸铵以及第一有机碱的混合液于0～30℃下进行第一反应；
于-5～5℃下，将含有所述第一反应后的体系与氧化剂的混合液进行第二反应；向所述第二反应后的体系中加入淬灭剂进行淬灭反应，然后再加入水进行水解反应；
对所述水解反应后的体系进行保护基的脱除反应；
其中，所述氧化剂为过氧化叔丁醇；和/或，所述氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系；
所述淬灭剂为具有还原性的物质；
所述核苷原料的结构式如下：
B为天然或修饰的碱基；
所述碱基具有氨基，且所述氨基上的一个活泼氢被R3取代；或，所述碱基不具有氨基；
R1、R2以及R3均为保护基。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核苷原料、所述2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮、所述三丁基焦磷酸铵以及所述第一有机碱的摩尔比为1:(1.5-3.0):(1.5-3.0):(2-4)。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述核苷原料与所述氧化剂的摩尔比为1:(1.0-3.0)；
可选地，所述氧化剂为过氧化叔丁醇，所述核苷原料与所述过氧化叔丁醇的摩尔比为1:(1.5-3.0)；
可选地，所述氧化剂为含有碘以及第二有机碱的混合体系，所述核苷原料与所述碘的摩尔比为1:(1.0-2.0)。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种；
和/或，所述第二有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种；
和/或，所述淬灭剂选包括硫代硫酸钠、亚硫酸钠以及硫酸亚铁中的至少一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应的时间为50-100min；
和/或，所述第二反应的时间为2-4h；
和/或，所述淬灭反应的时间为20-40min；
和/或，所述水解反应的时间为2-4h。
6.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述第一反应包括：先将所述核苷原料、所述2-氯-1,3,2-苯并二氧磷杂环己烷-4-酮以及第三有机碱的混合液于0～5℃下进行第三反应；然后将含有所述第三反应后的体系、所述三丁基焦磷酸铵以及第四有机碱的混合液于20-30℃下进行第四反应；
可选地，所述第三有机碱包括吡啶、三乙胺以及三戊胺中的至少一种；
可选地，所述第四有机碱包括三戊胺、三丙胺以及三丁胺中的至少一种；
可选地，所述第三反应在惰性气体保护的条件下进行；
可选地，所述第三反应的时间为20～50min；
可选地，所述第四反应的时间为30～50min。
7.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，含有所述第一反应后的体系与所述氧化剂的混合液的制备步骤包括：于-5～5℃下，将所述氧化剂以逐滴加入的方式加入至所述第一反应后的体系中。
8.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述核苷原料的结构式如下：
可选地，所述R1基为苯甲酰基或二甲氧基三苯甲基，所述R2基为叔丁基二甲硅基。
9.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述保护基为苯甲酰基、乙酰基或异丁酰基，所述3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法还包括：将所述水解反应后的体系与第一脱除剂进行第一脱除反应；其中，所述第一脱除剂为氨水与甲醇的混合液；
和/或，所述保护基为二甲氧基三苯甲基，所述3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法还包括：将所述水解反应后的体系与第二脱除剂进行第二脱除反应；其中，所述第二脱除剂为有机酸与甲醇的混合液；所述有机酸包括醋酸、三氟乙酸以及二氯乙酸中的至少一种；
和/或，所述保护基为叔丁基二甲硅基，所述3’三磷酸核苷及其衍生物的制备方法还包括：将所述水解反应后的体系与第三脱除剂进行第三脱除反应；其中，所述第三脱除剂包括氟化氢吡啶、氟化四丁基铵以及氟化氢三乙胺中的至少一种；
可选地，所述第一脱除反应的时间为10-12h，所述第一脱除反应的温度为20-30℃；
可选地，所述第二脱除反应的时间为2-3h，所述第二脱除反应的温度为15-25℃；
可选地，所述第三脱除反应的时间为15-20h，所述第三脱除反应的温度为20-30℃。
10.根据权利要求1-5中任一项所述的制备方法，其特征在于，所述核苷原料为经过干燥处理后的核苷原料。
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|---|---|---|---|
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