CN1164739C - 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 - Google Patents
一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1164739C CN1164739C CNB021477809A CN02147780A CN1164739C CN 1164739 C CN1164739 C CN 1164739C CN B021477809 A CNB021477809 A CN B021477809A CN 02147780 A CN02147780 A CN 02147780A CN 1164739 C CN1164739 C CN 1164739C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- cell
- freeze
- cells
- storing liquid
- frozen
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
Abstract
本发明公开了一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，采用了细胞培养液、小牛血清和二甲亚砜，均按一定比例混配。本发明配比合理，提高了冻存细胞的复苏率，可达80-90%以上，保证了细胞生长质量，缩短了细胞复苏的增殖周期。
Description
技术领域
本发明涉及活体组织细胞培养技术，更具体涉及一种提高细胞复苏率的细胞冻存液，广泛适用于细胞生物学技术领域。
背景技术
细胞冻存液是组织细胞冻存时必须的一种溶液。数十年来，大量国内外生物细胞学技术相关书籍，介绍常规冻存液配方均为：细胞培养液70-80％、牛血清10-20％、二甲亚砜10％。普遍使用的细胞培养液有四种：RPMI-1640、MEM、Eagle和TC-199细胞培养液均已市场商品化。冻存液的作用是将拟冻存的活性组织细胞悬浮于冻存液，供给细胞生命代谢所必须的营养物质，同时具有防止或减少冷冻冰晶对细胞的损伤作用。在长期的细胞生物学实验中，广泛地使用的是此常规配方的细胞冻存液，经过大量实际生物细胞学操作实验、相关学术刊物报道认为：在排除其它影响因素的情况下，复苏率为40-70％。在细胞生物学实验中，复苏率是指：在长期冷冻保存状态下的细胞，经过复苏过程，恢复其活性与生物学特性的细胞数量。
冻存细胞经复苏后培养16-24小时，在普通光学显微镜下观察：当复苏率小于40％时，见活细胞较少，细胞形态小而且不规则，生长繁殖速度缓慢，甚至不生长，5-7天全部死亡后；当复苏率大于40％或小于60％时，显示有部分成活细胞，细胞大小不均匀，生长繁殖速度慢，培养5-7天则能生长成单层细胞；当复苏率大于70％时，显示成活细胞较多，细胞形态正常，生长繁殖速度快，培养2-3天则能生长成单层细胞。
目前，采用细胞冻存液的冻存与复苏效果：
配制常规配方的细胞冻存液比例如下：
RPMI-1640培养液 70％
小牛血清 20％
二甲亚砜 10％
混合摇匀即成
(一)细胞冻存
1、培养生长成单层的绿猴肾细胞(Vero Cell)细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10毫升，吹打混匀细胞悬液，离心4000转/10分钟，弃上清，加入常规的冻存液12毫升/管，混匀，置入洁净冻存小管；
2、小管置-20℃2小时，置-40℃2小时，置-80℃2小时，浸入液态氮中长期保存。
(二)细胞复苏过程
1、从液态氮中取出冻存的绿猴肾细胞(Vero)小管，置37℃水浴3分钟速溶，加入RPMI-1640培养液8毫升，离心4000转/10分钟，弃上清，加入10％小牛血清RPMI-1640培养液10毫升，静置37℃培养16小时-24小时；
2、镜下观察复苏后的细胞状态，可见约60％的Vero细胞贴壁生长，细胞形态呈多边形，大小不均匀，折光性差；
3、培养48小时后，观察细胞未生长成单层，更换10％小牛血清RPMI-1640培养液，继续培养，37℃培养，80-96小时后，传代培养；
4、完成了细胞复苏生长繁殖周期。
或细胞冻存液，MEM培养液；地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)的冻存与复苏效果实验：
细胞冻存液比例如下：
MEM培养液 80％
小牛血清 10％
二甲亚砜 10％
混合摇匀即成
(一)细胞冻存
1、取培养生长成单层的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)各一瓶，0.25％胰蛋白酶液，消化3分钟，弃胰酶液，加入MEM培养液10毫升，吹打混匀细胞悬液离心4000转/10分钟弃上清，加入常规的冻存液2毫升/管，混匀，置入洁净冻存小管；
2、小管置-40℃ 2小时，置-80℃2小时，浸入液态氮中长期保存。
(二)细胞复苏效果
1、从液态氮中取出冻存的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)各一小管，37℃水浴中3分钟速溶，加入8毫升细胞培养液离心4000转/10分钟，弃上清，加入10％小牛血清MEM培养液10毫升/瓶，静置37℃，培养16小时-24小时
2、光镜下观察复苏后的细胞状态，可见地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)均为部分细胞贴壁生长，细胞形态不规则，大小不均匀，折光性差；
3、复苏效果显示：BHK-21细胞复苏率约50％，Hep-2细胞复苏率约60％，FK-81细胞复苏率约50％，7721细胞复苏率约55％。
4、培养48小时后，细胞未生长成单层，更换10％小牛血清MEM培养液，继续培养，37℃培养，80-100小时后，传代培养；
5、完成了细胞复苏生长繁殖周期。
在生物学技术飞速发展的当今，人们在细胞生物学及其相关学科的研究中，越来越多的运用组织细胞培养增殖技术，将有研究意义或有应用前景的活体组织细胞采用低温度进行长期保存数年、数十年甚至数百年，一旦需要，可随时对所保存的组织细胞进行复苏，恢复其完整的形态结构与生物学特性，供生命科学研究实验。活性组织细胞的冻存和复苏过程，是直接影响人工培养组织细胞增殖是否成功和顺利进行的一个关键技术。
综上述，复苏率的高或低，是直接影响细胞生长质量与增殖周期的重要因素。细胞冻存液则是在细胞冻存过程中起到保护和营养细胞的关键溶液，所以，细胞冻存液的配方与含量，对细胞复苏率有重要和直接的影响作用。
发明内容
本发明目的在于提供了一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，调整了“常规细胞冻存液”内的细胞培养液与牛血清的百分比浓度，配比合理。提高了冻存细胞的复苏率，保证了细胞的生长质量，缩短了细胞复苏增殖的周期的作用。
为了达到其发明目的采用了以下技术措施，其特征是：
细胞培养液 10-30％
小牛血清 60-80％
二甲亚砜 10％
混合均匀即成
注：细胞培养液可任意选用一种：RPMI-1640或MEM或Eagle或TC199
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：使用改进后的细胞冻存液，细胞复苏率可达80-90％以上，较使用常规细胞冻存液的复苏率有了显著提高，保证了细胞生长质量和生物学特性，缩短了细胞复苏的增殖周期。使复苏后的组织培养细胞能及时、保质保量的提供生物学研究实验。在组织细胞培养增殖技术中，应用改进后的细胞冻存液明显了提高冻存细胞复苏率、提高了工作效力。
具体实施方式
实施例1：
采用改进含量配比后的细胞冻存液、非洲绿猴肾细胞(Vero)的冻存与复苏效果：
细胞冻存液由以下百分比浓度原料制成：
RPMI-1640培养液 30％或25％或20％
小牛血清 60％或65％或70％
二甲亚砜 10％
混合摇匀即成
(一)细胞冻存过程
1、取培养生长成单层的绿猴肾细胞(Vero)细胞一瓶，0.25％胰蛋白酶液消化3分钟，弃胰酶液，加入RPMI-1640培养液10毫升吹打混匀细胞悬液，离心4000转/10分钟，弃上清，加入上述冻存液2毫升/管，混匀，置入洁净冻存小管；
2、小管置-20℃ 2小时，置-40℃ 2小时，置-80℃ 2小时，浸入液态氮中长期保存。
(二)细胞复苏过程与效果
1、从液态氮中取出冻存的绿猴肾细胞(Vero)小管，置37℃水浴3分钟速溶，加入RPMI-1640培养液8毫升离心4000转/10分钟，弃上清，加入10％小牛血清RPMI-1640培养液10毫升，静置37℃培养16小时-24小时；
2、光镜下观察复苏后的细胞状态，可见约90％的Vero细胞大面积贴壁生长，细胞形态呈多边形，大小均匀，折光性好；
3、培养48小时后，细胞生长成单层，继续传代培养；
4、完成了细胞复苏生长繁殖周期。
实施例2：
采用改进配方后的细胞冻存液，地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)的冻存与复苏效果：
细胞冻存液由以下百分比浓度原料制成：
MEM培养液 10％或15％
小牛血清 80％或75％
二甲亚砜 10％
混合摇匀即成
(一)细胞冻存
1、取培养生长成单层的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)各一瓶，0.25％胰蛋白酶液，消化3分钟，弃胰酶液，加入MEM培养液10毫升吹打混匀细胞悬液，离心4000转/10分钟，弃上清，加入上述冻存液2毫升/管混匀，置入洁净冻存小管；
2、小管置-40℃2小时，置-80℃2小时，浸入液态氮中长期保存。
(二)细胞复苏过程与效果
1、从液态氮中取出冻存的地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)各一小管，37℃水浴中3分钟速溶，加入8毫升细胞培养液，离心4000转/10分钟，弃上清，加入10％小牛血清MEM培养液10毫升/瓶，静置37℃培养16小时-24小时；
2、光镜下观察复苏后的细胞状态，可见地鼠肾细胞(BHK-21)、人鼻咽癌组织细胞(Hep-2)、猫肾细胞(FK-81)、人肝癌细胞(7721)均见细胞大面积贴壁生长，细胞形态好，大小均匀，折光性好；
3、复苏效果显示：BHK-21细胞复苏率约85％，Hep-2细胞复苏率约95％，FK-81细胞复苏率约93％，7721细胞复苏率约90％；
4、培养48小时后，细胞生长成单层，继续传代培养；
5、完成了细胞复苏生长繁殖周期。
Claims (4)
1、一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，它由以下百分比浓度的原料制成：
细胞培养液 10-30％
小牛血清 60-80％
二甲亚砜 10％。
2、根据权利要求1所述的一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，其特征是各原料的百分比浓度是：
细胞培养液 15％
小牛血清 75％
二甲亚砜 10％。
3、根据权利要求1所述的一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，其特征是各原料的百分比浓度是：
细胞培养液 20％
小牛血清 70％
二甲亚砜 10％。
4、根据权利要求1所述的一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液，其特征是各原料的百分比浓度是：
细胞培养液 25％
小牛血清 65％
二甲亚砜 10％。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB021477809A CN1164739C (zh) | 2002-12-05 | 2002-12-05 | 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB021477809A CN1164739C (zh) | 2002-12-05 | 2002-12-05 | 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1412301A CN1412301A (zh) | 2003-04-23 |
| CN1164739C true CN1164739C (zh) | 2004-09-01 |
Family
ID=4751297
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB021477809A Expired - Fee Related CN1164739C (zh) | 2002-12-05 | 2002-12-05 | 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1164739C (zh) |
Families Citing this family (4)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN101063107B (zh) * | 2007-04-25 | 2010-06-16 | 哈尔滨医科大学 | Cik细胞的冻存及复苏 |
| CN102578078B (zh) * | 2012-02-02 | 2013-06-19 | 温州医学院附属第二医院 | 一种神经细胞的冻存液及冻存方法 |
| CN103891709A (zh) * | 2012-12-24 | 2014-07-02 | 深圳先进技术研究院 | 细胞冻存液及细胞冻存方法 |
| CN106635952B (zh) * | 2016-09-26 | 2019-04-19 | 北京焕生汇生物技术研究院 | 一种细胞复苏试剂 |
-
2002
- 2002-12-05 CN CNB021477809A patent/CN1164739C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1412301A (zh) | 2003-04-23 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN103910434B (zh) | 用于处理沼液超标氮磷的膜式光生物反应器及其处理方法 | |
| CN103834570B (zh) | 三角褐指藻和小新月菱形藻混合培养的培养基及培养方法 | |
| CN102851215B (zh) | 牟氏角毛藻培养基配方及白塑料桶充气培养方法 | |
| CN103981083B (zh) | 一种微藻封闭式兼养培养法 | |
| CN107937382B (zh) | 一种固定化微藻的制备方法 | |
| CN103820325A (zh) | 波吉卵囊藻高密度培养方法及藻细胞收集方法 | |
| TWI299652B (en) | Algae Culture System | |
| CN113151247A (zh) | 一种盐藻-嗜盐菌的固定化微球及其制备方法和应用 | |
| CN1164739C (zh) | 一种提高冻存细胞复苏率的细胞冻存液 | |
| CN112063611B (zh) | 一种固定化藻球及其制备方法及应用 | |
| CN202022940U (zh) | 一种微藻生物养殖的光生物反应器 | |
| CN1064709C (zh) | 一种酵母固定化载体和制造方法 | |
| CN102172237B (zh) | 一种细胞冻存液及其制备方法和应用 | |
| CN103184157B (zh) | 一种治理原生动物并实现稳定高产的藻类养殖工艺 | |
| CN1657444A (zh) | 超浓缩藻菌微生态平衡悬浮型水质改良剂及制备方法 | |
| CN109609384B (zh) | 一株小球藻Chlorella sorokinianaTX及其高密度快速培养方法 | |
| CN101481656A (zh) | 一种异养发酵培养小球藻的方法 | |
| CN102070250B (zh) | 一种光合细菌水质净化剂及其制备方法 | |
| CN1118563C (zh) | 中空纤维模拟骨髓造血装置 | |
| CN104593261A (zh) | 一种小型角毛藻浓缩培养液及培养小型角毛藻的培养方法 | |
| CN103103125A (zh) | 一种微生物絮凝与气浮相耦合的微藻采收方法 | |
| CN111066776A (zh) | 一种卵子冷冻保护剂及其应用 | |
| CN101407772B (zh) | 一种光合细菌的培养方法 | |
| CN110713933A (zh) | 一种保存微藻饵料的方法 | |
| CN110804584A (zh) | 一种优化脐带间充质干细胞培养液 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C19 | Lapse of patent right due to non-payment of the annual fee | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |