CN116473966A - Sb-222200在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用 - Google Patents

Sb-222200在抑制nlrp3炎症小体活化中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种SB‑222200在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。该SB‑222200能够特异性抑制NLRP3炎症小体活化，对NLRP3炎症小体活化的抑制不依赖于对NK3受体的拮抗作用。SB‑222200通过直接结合NLRP3蛋白，抑制NLRP3炎症小体的组装，还抑制NLRP3炎症小体活化过程中的ASC蛋白的寡聚和斑点形成，抑制GSDMD的剪切及其引起的细胞焦亡，抑制NLRP3蛋白自身的寡聚化以及NLRP3蛋白与ASC蛋白的相互作用；同时，该SB‑222200还可以缓解腹膜炎和炎症性肠病。可以作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。

Description

SB-222200在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种SB-222200在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
背景技术
NOD样受体蛋白3(NLRP3)炎症小体(inflammasome)为炎症过程的组分，且其异常的活化在遗传性病症诸如冷炎素相关周期性综合征(CAPS)和复杂疾病诸如多发性硬化、2型糖尿病、阿尔茨海默氏病和动脉粥样硬化中具有致病性。NLRP3炎症小体是一种模式识别受体(pattern recognition receptor，PRR)，是caspase-1的炎症性激活平台。它能够识别外源性的病原体相关分子模式(pathogen-associated molecμlar pattern，PAMP)如脂多糖LPS、病毒RNA，或内源性的损伤相关分子模式(damage-associated molecμlar pattern，DAMP)如DNA、内毒素、尿酸、ATP、Aβ和细胞碎片等。这些物质能够激活细胞内NLRP3炎症小体，释放出IL-1β和IL-18，并诱导细胞焦亡。过度激活的NLRP3炎症小体会导致多种疾病发生发展，例如痛风、2型糖尿病以及神经退行性疾病等。尽管在基础研究中许多抑制剂对NLRP3炎症小体相关的疾病都有一定的缓解作用，但目前临床上，仍缺乏特异性抑制NLRP3炎症小体活化的药物，特别是缺乏能够直接结合NLRP3蛋白从而抑制NLRP3炎症小体活化的小分子药物。
发明内容
本发明的目的在于提供一种SB-222200在抑制NLRP3炎症小体活化中的应用。
实现上述目的包括如下技术方案。
本发明第一方面，提供一种SB-222200在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为心肌炎、阿尔茨海默病、帕金森病、中风、多发性硬化、动脉粥样硬化、肺炎、肾炎、肝炎、特发性肺纤维化、慢性阻塞性肺病(COPD)、哮喘、支气管炎、银屑病、糖尿病、关节炎、感染、冷炎素相关周期性综合征(CAPS)、穆-韦二氏综合征(MWS)、家族性寒冷型自身炎症性综合征(FCAS)、新生儿发作型多系统炎症性疾病(NOMID)、家族性地中海热(FMF)、化脓性关节炎、坏疽性脓皮病和痤疮综合征(PAPA)、高免疫球蛋白血症D和周期性发热综合征(HIDS)、肿瘤坏死因子(TNF)受体相关的周期性综合征(TRAPS)、全身性幼年特发性关节炎、成年发作型斯蒂尔氏病(AOSD)、复发性多软骨炎、施尼兹勒氏综合征、斯威特氏综合征、白塞氏病、抗合成酶综合征、白介素1受体拮抗剂缺乏(DIRA)、A20单倍剂量不足(HA20)。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病为硅肺、石棉肺、矽肺、帕金森病、抑郁症、II型糖尿病、非酒精性脂肪肝病、酒精性肝病、肾病、肌萎缩侧索硬化、急性呼吸窘迫综合征。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病是急性NLRP3炎症小体异常活化相关疾病或慢性NLRP3炎症小体异常活化相关疾病。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病是炎症性肠病。
在其中一些实施例中，所述炎症性肠病为溃疡性结肠炎。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病是盆腔炎。
在其中一些实施例中，所述盆腔炎是急性盆腔炎。
在其中一些实施例中，所述盆腔炎是腹膜炎。
在其中一些实施例中，所述腹膜炎是急性腹膜炎。
在其中一些实施例中，所述溃疡性结肠炎为硫酸葡聚糖钠盐诱导的溃疡性结肠炎。
在其中一些实施例中，所述腹膜炎为尿酸盐结晶诱导的急性腹膜炎。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化为经典的NLRP3炎症小体活化，所述经典的NLRP3炎症小体活化为由激活剂诱导的NLRP3炎症小体活化。
在其中一些实施例中，所述激活剂为尼日利亚菌素、ATP、尿酸盐结晶、二氧化硅、咪奎莫特和硫酸葡聚糖钠盐中的至少一种。
在其中一些实施例中，所述NLRP3炎症小体异常活化为非经典的NLRP3炎症小体活化，所述非经典的NLRP3炎症小体活化为由胞内脂多糖诱导的NLRP3炎症小体的活化。
在其中一些实施例中，所述药物包括SB-222200以及药学可接受的辅料。
在其中一些实施例中，所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液或酊剂。
在其中一些实施例中，所述药物的剂型为口服溶液。
在其中一些实施例中，所述药物的给药方式为口服。
在其中一些实施例中，所述药物用于哺乳动物或人。
在其中一些实施例中，所述辅料包括填料、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、润滑剂、润湿剂、悬浮剂、矫味剂或香料中的至少一种。
具体地，所述辅料可选自以下组分中的至少一种：
(a)填料或增容剂，例如，淀粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和硅酸；
(b)粘合剂，例如，羟甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯基吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯胶；
(c)保湿剂，例如，甘油；
(d)崩解剂，例如，琼脂、碳酸钙、马铃薯淀粉或木薯淀粉、藻酸、某些复合硅酸盐、和碳酸钠；
(e)缓溶剂，例如石蜡；
(f)吸收加速剂，例如，季胺化合物；
(g)润湿剂，例如鲸蜡醇和单硬脂酸甘油酯；
(h)吸附剂，例如，高岭土；
(i)润滑剂，例如，滑石、硬脂酸钙、硬脂酸镁、固体聚乙二醇、十二烷基硫酸钠，或其混合物。胶囊剂、片剂和丸剂中，剂型也可包含缓冲剂。
除了活性成分外，液体剂型可包含惰性稀释剂，如水或其它溶剂，例知，乙醇、异丙醇、碳酸乙酯、乙酸乙酯、丙二醇、1,3-丁二醇、二甲基甲酰胺以及油，特别是棉籽油、花生油、玉米胚油、橄榄油、蓖麻油和芝麻油或这些物质的混合物等。除了这些惰性稀释剂外，组合物也可包含助剂，如润湿剂、乳化剂和悬浮剂、甜味剂、矫味剂和香料。
除了活性成分外，悬浮液可包含悬浮剂，例如，乙氧基化异十八烷醇、聚氧乙烯山梨醇和脱水山梨醇酯、微晶纤维素、甲醇铝和琼脂或这些物质的混合物等。
用于肠胃外注射的组合物可包含生理上可接受的无菌含水或无水溶液、分散液、悬浮液或乳液，和用于重新溶解成无菌的可注射溶液或分散液的无菌粉末。可包含适宜的含水和非水载体、稀释剂、溶剂或赋形剂，例如水、乙醇、多元醇及其适宜的混合物。
本发明第二方面，提供一种SB-222200在体外抑制NLRP3炎症小体活化中非治疗目的的应用。
本发明中，首次发现NK3受体拮抗剂SB-222200能够抑制NLRP3炎症小体活化，但不影响沙门氏菌鞭毛蛋白引起的NLRC4炎症小体活化和细胞内Poly(dA:dT)引起的AIM2炎症小体的活化，并且SB-222200对NLRP3炎症小体活化的抑制不依赖于对NK3受体的拮抗作用；此外，研究还发现SB-222200能够通过直接结合NLRP3蛋白，从而干扰NLRP3蛋白与NEK7蛋白的相互作用，抑制NLRP3炎症小体的组装，还抑制NLRP3炎症小体活化过程中的ASC蛋白的寡聚和斑点形成，抑制GSDMD的剪切及其引起的细胞焦亡，抑制NLRP3蛋白自身的寡聚化以及NLRP3蛋白与ASC蛋白的相互作用；同时，通过建模发现该SB-222200还可以缓解腹膜炎和炎症性肠病。可见，SB-222200可以作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。
附图说明
图1为SB-222200对NLRP3炎症小体活化的抑制作用结果图；其中，图1A为尼日利亚菌素(Nigericin)诱导NLRP3炎症小体活化时IL-1β的分泌的效果图，SB-222200抑制IL-1β的分泌；图1B为Nigericin诱导NLRP3炎症小体时IL-1β前体的剪切以及caspase-1的自我剪切情况，SB-222200抑制成熟IL-1β和caspase-1的生成；图1C为SB-222200抑制ATP、Nigericin、IMQ(咪喹莫特)、MSU(Monosodium urate，尿酸钠盐)或SiO2(二氧化硅)诱导的经典NLRP3炎症小体活化以及胞内转染LPS诱导的非经典NLRP3炎症小体活化后IL-1β的分泌；图1D为另一NK3受体拮抗剂Talnetant不影响Nigericin诱导NLRP3炎症小体活化时IL-1β的分泌。
图2为SB-222200对NLRC4和AIM2炎症小体活化依赖的IL-1β分泌的影响结果图；其中，图2A为SB-222200抑制沙门氏杆菌鞭毛蛋白(FLA-ST)诱导的NLRC4炎症小体依赖的IL-1β分泌；图2B为SB-222200抑制poly(dA:dT)诱导的AIM2炎症小体活化依赖的IL-1β分泌。
图3为SB-222200抑制NLRP3炎症小体活化介导GSDMD剪切及其引起的细胞焦亡结果图；其中，图3A为SB-222200抑制尼日利亚菌素(Nigericin)诱导NLRP3炎症小体活化时细胞焦亡执行蛋白GSDMD蛋白的剪切；图3B为SB-222200抑制细胞焦亡时LDH的释放。
图4为SB-222200对NLRP3炎症小体活化过程中ASC蛋白的寡聚化和斑点形成的抑制作用结果图；其中，图4A为SB-222200抑制NLRP3炎症小体活化过程中的ASC蛋白寡聚化；图4B为SB-222200抑制NLRP3炎症小体活化过程中巨噬细胞胞内ASC斑点的形成；图4C是对图4B的定量统计图，为包含ASC斑点的细胞比例。
图5为SB-222200抑制NLRP3蛋白与ASC蛋白的相互作用结果图。
图6为SB-222200抑制尼日利亚菌素引起的NLRP3蛋白的自身寡聚结果图，其中曲尼斯特(Tranilast)为阳参。
图7为SB-222200抑制NLRP3蛋白与NEK7蛋白的相互作用结果图。
图8为SB-222200直接结合NLRP3蛋白结果图；其中，图8A为SB-222200能够阻止链霉蛋白酶(pronase)对胞内NLRP3蛋白的酶解，MCC950为阳参；图8B为SB-222200能够阻止NLRP3蛋白的热降解；图8C为采用SPR方法检测SB-222200与重组人源NLRP3蛋白的结合能力，结合常数为351.8nM。
图9为SB-222200对尿酸盐结晶诱导小鼠腹膜炎后对腹腔液、肝脏和脾脏中IL-1β和IL-6的影响结果图；其中图9A，图9B为SB-222200对腹膜液中IL-1β和IL-6的影响；图9C，图9D为SB-222200对肝脏中IL-1β和IL-6的影响；图9E，图9F为SB-222200对脾脏中IL-1β和IL-6的影响。
图10为SB-222200对DSS诱导的炎症性肠病的影响结果图；其中图10A和图10B显示小鼠结肠大体形态改变及结肠长度改变；图10C为小鼠每日便血的变化；图10D和图10E显示小鼠结肠组织的HE染色(200×)和结肠组织的组织病理学评分。
图11为SB-222200对DSS诱导的炎症性肠病中结肠组织中炎症的影响结果图；其中图11A和图11B为SB-222200抑制DSS诱导的小鼠结肠炎模型中小鼠结肠组织的IL-1β及IL-6的升高；图11C为SB-222200降低结肠组织中caspase-1和GSDMD的剪切。
具体实施方式
为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
本发明其一实施例提供一种NK3受体拮抗剂SB-222200在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
其中，SB-222200的结构式如下所示：
其分子式为C26H24N2O，分子量为380.48，CAS号为174635-69-9。SB-222200是一种有效、选择性、口服活性的，具有血脑屏障(BBB)渗透性的NK3受体(NK-3receptor)拮抗剂。
本发明中，通过建模首次发现NK3受体拮抗剂SB-222200能够抑制尼日利亚菌素、ATP、尿酸盐结晶、二氧化硅、咪奎莫特等激活剂诱导的经典的NLRP3炎症小体活化，也能够抑制细胞内脂多糖引起的非经典的NLRP3炎症小体活化，但不影响沙门氏菌鞭毛蛋白引起的NLRC4炎症小体活化和细胞内Poly(dA:dT)引起的AIM2炎症小体的活化，并且SB-222200对NLRP3炎症小体活化的抑制不依赖于对NK3受体的拮抗作用。
此外，研究还发现该SB-222200能够通过直接结合NLRP3蛋白，从而干扰NLRP3蛋白与NEK7蛋白的相互作用，抑制NLRP3炎症小体的组装，还抑制NLRP3炎症小体活化过程中的ASC蛋白的寡聚和斑点形成，抑制GSDMD的剪切及其引起的细胞焦亡，抑制NLRP3蛋白自身的寡聚化以及NLRP3蛋白与ASC蛋白的相互作用。
通过建模还发现该SB-222200可以缓解尿酸盐结晶诱导的腹膜炎和硫酸葡聚糖钠盐诱导的炎症性肠病。
可见，NK3受体拮抗剂SB-222200可以作为预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的潜在药物。
以下为具体实施例。
实施例1SB-222200对NLRP3炎症小体活化的抑制作用
(1)本实施例采用的细胞为小鼠单核巨噬细胞J774A.1(广州吉妮欧生物科技有限公司)。第一天，将J774A.1细胞分到96孔板上，每个孔5×104个细胞。种板过夜，弃上清，每孔加入100μL含细菌脂多糖(LPS，1μg/mL；Sigma-Aldrich公司，L2630)的含10％血清的DMEM培养基处理5小时，然后加入不同浓度的SB-222200(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)(MCE公司，HY-15722)或另一NK3受体拮抗剂Talnetant(0μM、0.625μM、1.25μM、2.5μM、5μM、10μM)(MCE公司，HY-14552)处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，10μM；InvivoGen公司，tlrl-nig-5)或ATP(5mM；Sigma-Aldrich公司，74804-12-9)处理1小时。收集细胞上清液，采用小鼠IL-1βELISA试剂盒(ThermoFishe公司，88-7013-77)测定IL-1β含量，结果见图1A、图1B和图1D。Western Blotting检测IL-1β前体(pro-IL-1β)及IL-1β的剪切体(p17)，caspase-1前体(pro-caspasse-1)及caspasse-1的剪切体(p20)，上清和裂解液按常规方法提取蛋白，用抗IL-1β抗体(R&D公司，88-7013-77)和抗Caspase-1抗体(AdipoGen公司，#AG-20B-0042)进行Western Blotting分析，结果如图1B所示。
(2)本实施例采用的细胞为骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)。BMDMs的培养和分化:取7～8周龄雄性C57BL/6小鼠(广东省实验动物中心)分离出骨髓细胞，用RPMI 1640培养基[含10％(v/v)胎牛血清(依科赛生物科技有限公司)，巨噬细胞集落刺激因子M-CSF(R&D公司，416-ML-050)和谷氨酰胺]分化5～6天，获得小鼠骨髓来源的巨噬细胞。将BMDMs细胞分到96孔板上，每个孔1×104个细胞。种板过夜，弃上清，每孔加入100μL含细菌脂多糖(LPS，100ng/mL；Sigma-Aldrich公司，L2630)的含10％血清的DMEM培养基处理3小时，然后加入10μM的SB-222200处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，10μM，0.5小时)，ATP(5mM，0.5小时；Sigma-Aldrich公司，74804-12-9)，咪奎莫特(IMQ，900μM，2小时；TargetMol公司，T0134)，尿酸盐结晶(MSU，200μg/mL，8小时；InvivoGen公司，tlrl-msu)，SiO2(50μg/mL，8小时，InvivoGen公司，tlrl-sio-2)。非经典的NLRP3炎症小体活化方案为：在每孔中加入Pam3CSK4(1μg/mL；InvivoGen公司，tlrl-pms)处理5小时，然后加入10μM的SB-222200处理1小时，然后Lipo3000转染试剂转入LPS(2μg/mL,16小时)，利用小鼠IL-1βELISA试剂盒测定IL-1β含量，结果见图1C。
由图1的结果可以看出：SB-222200可以剂量依赖地抑制小鼠巨噬细胞中尼日利亚菌素或其他激活剂引起的NLRP3炎症小体活化后的IL-1β的释放，抑制尼日利亚菌素引起的NLRP3炎症小体活化后caspase-1的自剪切和IL-1β前体的剪切，并且SB-222200对NLRP3炎症小体活化的抑制不依赖于对NK-3受体的拮抗作用。
实施例2SB-222200对NLRC4和AIM2炎症小体活化依赖的IL-1β分泌的影响
(1)本实施例采用的细胞为骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)。小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的培养和分化：同实施例1步骤(2)。
(2)将分化后的细胞(即小鼠骨髓来源的巨噬细胞)接种到96孔板中，每孔5×104(个)的细胞密度。对于激活BMDMs细胞的NLRC4炎症小体，先用100ng/mL的LPS刺激细胞3小时，然后加入不同浓度的SB-222200处理14小时，再加入2.5μg/mL沙门氏杆菌鞭毛蛋白(FLA-ST；InvivoGen公司，tlrl-epstfla-5)孵育4小时。对于激活BMDMs细胞的AIM2炎症小体，先用100ng/mL的LPS刺激细胞3小时,然后加入不同浓度的SB-222200处理1小时，然后用Lipo 3000转染Poly dA:dT(0.25μg/mL；InvivoGen公司，86828-69-5)刺激细胞14小时，收集以上刺激后的细胞培养上清液，采用小鼠IL-1βELISA试剂盒测定IL-1β含量，结果见图2A和图2B。
由图2的结果可以看出：SB-222200不影响FLA-ST引起的NLRC4炎症小体活化依赖的IL-1β分泌，也不影响Poly dA:dT引起的AIM2炎症小体活化依赖的IL-1β分泌。
实施例3SB-222200抑制NLRP3炎症小体活化介导GSDMD的剪切及其引起的细胞焦亡
(1)本实施例采用的细胞为小鼠单核巨噬细胞J774A.1。第一天，将J774A.1细胞分到6孔板上。种板过夜，弃上清，每孔加入100μL含细菌脂多糖(LPS)(1μg/mL)的含10％血清的DMEM培养基，然后加入不同浓度的SB-222200处理1小时，再加入尼日利亚菌素(Nigericin，10μM)处理1小时，收集上清液或细胞裂解液。
(2)Western blot检测GSDMD和剪切的GSDMD，裂解液按常规方法提取蛋白，用抗GSDMD抗体(Abcam，ab209845)进行western blot分析，结果如图3A所示。
(3)收集上清液，采用乳酸脱氢酶(LDH)细胞毒性检测试剂盒(碧云天公司，C0016)检测，评估细胞死亡情况，结果如图3B所示。
从图3的结果看，SB-222200可以抑制NLRP3炎症小体活化介导的GSDMD的剪切及其引起的细胞焦亡。
实施例4SB-222200对NLRP3炎症小体活化过程中ASC蛋白的寡聚化和斑点形成的抑制作用
(1)小鼠骨髓来源巨噬细胞(BMDMs)的培养和分化：同实施例1步骤(2)。
(2)将分化后的细胞接种到6孔板中，每孔1×106的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加100ng/mL LPS预处理3小时，接着加入不同浓度的SB-222200(0μM,2μM,5μM)处理1小时，加入5μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激1小时。检测ASC蛋白的寡聚化，方法如下：吸掉培养基，加入IP裂解液(碧云天公司，P0013)裂解细胞，半小时后收集裂解液，4℃、12,000rpm离心10分钟，PBS洗三次后加入500μL冷PBS重悬。接着加入4mM的双琥珀酰亚胺辛二酸酯作为交联剂(上海生工，C100015-0100)进行交联，室温孵育30分钟。4℃、5000g离心10分钟，去掉上清，收集沉淀，最后采用抗ASC抗体(CST公司，67824S)进行Western Blotting检测，结果如图4A所示。由图4A的结果可以看出：尼日利亚菌素刺激可以显著的促进ASC蛋白的寡聚，SB-222200处理可以剂量依赖地抑制这一过程，说明SB-222200可以抑制尼日利亚菌素引起的NLRP3炎症小体活化过程中的ASC蛋白的寡聚化。
(3)将分化的细胞接种到放有爬片的24孔板中，每孔5×105的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加100ng/mL LPS预处理3小时，接着加入不同浓度的SB-222200(0μM,5μM,10μM)处理1小时，加入10μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激30min。然后用免疫荧光法检测ASC的斑点形成和斑点统计分析。结果如图4B和4C所示。由图4B和4C的结果可以看出：尼日利亚菌素刺激可以引起ASC的斑点的形成，SB-222200处理可以抑制这一过程，说明SB-222200可以抑制尼日利亚菌素引起的NLRP3炎症小体活化过程中的ASC的斑点形成。
实施例5SB-222200抑制NLRP3蛋白与ASC蛋白的相互作用
本实施例采用的细胞为小鼠单核巨噬细胞J774A.1。将细胞接种到10cm的培养皿中，每孔6×106的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加1μg/mL LPS预处理5小时，接着加入5μM SB-222200处理1小时，加入10μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激1小时。通过免疫共沉淀实验，将ASC蛋白拉下，通过抗ASC抗体和抗NLRP3抗体(AdipoGen公司，AG-20B-0014-C100)Western Blotting检测，结果如图5所示。由图5的结果可以看出：尼日利亚菌素刺激可以明显地促进ASC蛋白与NLRP3蛋白的结合，而SB-222200的处理则可以抑制这一过程。以上结果表明，SB-222200可以抑制NLRP3蛋白与ASC蛋白的相互作用。
实施例6SB-222200抑制尼日利亚菌素引起的NLRP3蛋白的自身寡聚
本实施例采用的细胞为小鼠单核巨噬细胞J774A.1。将细胞接种到6孔板中，每孔1×106的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加1μg/mL LPS预处理5小时，接着加入5μM SB-222200或阳参曲尼司特(Tranilast)处理1小时，加入10μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激1小时。采用半变性琼脂糖凝胶电泳(SDD-AGE)，方法如下：弃细胞培养基，加入裂解液100μL/孔，4℃摇床裂解30分钟，4℃离心机300g离心10分钟，取上清至新的1.5mL EP管。定量后取60μg蛋白加入20μl非变性非还原性蛋白上样缓冲液(碧云天公司，P0016N)，混匀，采用1.3％的琼脂糖胶进行分离，然后进行Western Blotting检测，结果如图6所示。由图6的结果可以看出：尼日利亚菌素刺激明显引起NLRP3蛋白寡聚，而SB-222200的处理则可以抑制这一过程，说明SB-222200可以抑制尼日利亚菌素引起的NLRP3蛋白的自身寡聚。
实施例7SB-222200抑制NLRP3蛋白与NEK7蛋白的相互作用
本实施例采用的细胞为小鼠单核巨噬细胞J774A.1。将细胞接种到10cm的培养皿中，每孔6×106的细胞密度。培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加1μg/mL LPS预处理5小时，接着加入5μM SB-222200处理1小时，加入10μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激1小时。通过免疫共沉淀实验，将NEK7蛋白拉下，采用抗NEK7抗体(Abcam公司，ab133514)和抗NLRP3抗体通过Western Blotting检测，结果如图7所示。由图7的结果可以看出：尼日利亚菌素刺激可以明显地促进NEK7蛋白与NLRP3蛋白的结合，而SB-222200的处理则可以抑制这一过程。以上结果表明，SB-222200可以抑制NEK7蛋白与NLRP3蛋白的相互作用。
实施例8SB-222200直接结合NLRP3蛋白
(1)本实施例采用的细胞为小鼠单核巨噬细胞J774A.1，将细胞种于10cm培养皿中，培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加1μg/mL LPS预处理5小时，接着加入不同浓度的SB-222200(0μM、5μM、15μM)或MCC950(10μM)处理1小时，加入10μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激1小时。采用细胞裂解液孵育30分钟，12000rpm离心10分钟。40μg蛋白裂解液与链霉蛋白酶(pronase，0.04mg/mL)共同孵育10分钟，加入20×蛋白酶抑制剂终止反应，采用抗NLRP3抗体通过Western Blotting检测，结果如图8A所示。结果可以看出：SB-222200的处理可以抑制链霉蛋白酶对NLRP3蛋白的降解，表明SB-222200可以与NLRP3蛋白结合。
(2)将J774A.1细胞种于10cm培养皿中，培养过夜后，将培养基换成opti-MEM，并添加1μg/mL LPS预处理5小时，接着加入10μM的SB-222200处理1小时，加入10μM尼日利亚菌素(Nigericin)刺激1小时。采用胰酶消化收集细胞，800g离心5分钟。利用反复冻存的方式裂解细胞，随后将其分别在如下温度中加热(43,45,50,55,60,和65℃)，3000g离心25分钟，采用抗NLRP3抗体通过Western Blotting检测，结果如图8B所示。结果可以看出：SB-222200的处理可以抑制对NLRP3蛋白的热解，表明SB-222200可以与NLRP3蛋白结合。
(3)采用SPR方法检测SB-222200与NLRP3蛋白的结合能力，采用Biacore T200(GEHealthcare公司)执行SPR实验，CM5检测芯片选自Cytiva公司(10324467)。将重组人源NLRP3蛋白(华美生物，CSB-EP822275HU)固定在CM5检测芯片上，将SB-222200逐级稀释注入，检测结合能力，结果如图8C所示。结果表明：SB-222200可以和人源NLRP3蛋白直接结合，结合常数为351.8nM。
实施例9SB-222200对尿酸盐结晶诱导小鼠腹膜炎后对腹腔液、肝脏和脾脏中IL-1β和IL-6的影响
(1)选取6～8周龄的C57BL/6雄性小鼠(体重相近)，分成6组：第一组先注射溶剂[包含2％二甲基亚砜(DMSO)，20％ PEG300和78％生理盐水]，一小时后注射PBS作为对照组；第二组先注射溶剂，一小时后注射3mg尿酸盐结晶(MSU，Sigma-Aldrich公司，U 2875)；第三到六组先注射不同剂量的SB-222200(10，15，20mg/kg)或者阳参MCC950(5mg/kg；MCE，HY-12815)，一小时候后注射3mg MSU。
(2)4个小时后，颈椎脱臼处理小鼠；用1mL PBS注入腹腔，轻柔腹腔使其均匀充满腹腔，然后将其吸出，吸出的液体于3000rpm离心3分钟，上清用来检测细胞因子。肝脏和脾脏样本分别研磨。利用小鼠IL-1βELISA试剂盒和小鼠IL-6ELISA试剂盒(ThermoFishe公司，88-7064-77)采用ELISA方法分别检测腹水、肝脏和脾脏中IL-1β和IL-6水平，如图9A至图9F所示。
腹腔注射NLRP3炎症小体活化激活剂尿酸盐结晶诱导小鼠患腹膜炎，是一种常见的NLRP3相关的急性疾病模型。急性腹膜炎发生的过程中，会导致腹腔和组织中炎性因子IL-1β和IL-6的分泌。在注射尿酸盐结晶一小时前注射SB-222200，小鼠腹腔中IL-β和IL-6分泌减少，肝脾组织中的炎性因子IL-β分泌降低但是IL-6含量不变，以上结果说明SB-222200能够缓解尿酸盐结晶诱导的急性腹膜炎，在体内证明SB-222200能够抑制NLRP3炎症小体的活化。
实施例10SB-222200对DSS诱导的炎症性肠病的影响
(1)利用6-8周龄C57BL/6小鼠，分成6组：第一组每天注射溶剂[包含2％二甲基亚砜(DMSO)，20％ PEG300和78％生理盐水]作为对照组；第二组每天腹腔注射注射溶剂，从第二天到第八天饲喂新鲜的2.5％DSS溶液(MP Biomedicals公司，216011080)作为模型组；第三和第四组每天注射不同剂量的SB-222200(10，20mg/kg)，从第二天到第八天饲喂新鲜的2.5％DSS溶液。观察健康对照组、DSS模型组、SB-222200处理组小鼠的一般情况和便血情况，进行DAI评分，第9天处死小鼠，采集结肠标本，比较结肠长度，进行肠道组织病理学检查。
结果显示，SB-222200干预可以显著减轻结肠的缩短程度(图10A和B)，改善DSS诱导的溃疡性结肠炎模型小鼠便血(图10C)，降低组织病理学评分、保护小鼠肠黏膜完整性及正常隐窝结构(图10D)和改善组织评分(图10E)，提示SB-222200可以改善炎症性肠病。
实施例11SB-222200对DSS诱导的炎症性肠病中结肠组织中炎症的影响
实验方法如下：采集结肠组织，结肠远端取下1cm肠段，研磨裂解得到组织蛋白裂解液，ELISA检测上清液中IL-1β及IL-6的表达，通过Western Blotting检测结肠组织中caspase-1和GSDMD的剪切情况，结果见图11A至图11C。
结果显示，SB-222200抑制DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎模型中小鼠结肠组织的IL-1β及IL-6的升高(图11A和图11B)，降低结肠组织中caspase-1和GSDMD的剪切(图11C)，可知该SB-222200可以改善溃疡性结肠炎病。
以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (10)

1.SB-222200在制备预防和/或治疗NLRP3炎症小体异常活化相关疾病的药物中的应用。
2.如权利要求1所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体异常活化相关疾病是炎症性肠病。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述炎症性肠病是溃疡性结肠炎。
4.如权利要求1所述的应用，其特征在于，NLRP3炎症小体异常活化相关疾病是腹膜炎。
5.如权利要求4所述的应用，其特征在于，所述腹膜炎是急性腹膜炎。
6.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体异常活化为经典的NLRP3炎症小体活化，所述经典的NLRP3炎症小体活化为由激活剂诱导的NLRP3炎症小体活化。
7.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述NLRP3炎症小体异常活化为非经典的NLRP3炎症小体活化，所述非经典的NLRP3炎症小体活化为由胞内脂多糖诱导的NLRP3炎症小体活化。
8.如权利要求1至5任一项所述的应用，其特征在于，所述药物包括SB-222200以及药学可接受的辅料。
9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述药物的剂型为胶囊剂、颗粒剂、注射剂、丸剂、糖浆剂、散剂、膏剂、乳液、溶液、悬浮液和酊剂中的至少一种。
10.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述辅料包括赋形剂、填料、增容剂、粘合剂、保湿剂、崩解剂、缓溶剂、吸收加速剂、吸附剂、稀释剂、增溶剂、乳化剂、润滑剂、润湿剂、悬浮剂、矫味剂和香料中的至少一种。
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