CN116466093A - 一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法 - Google Patents
一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物检测技术领域，提供了一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法，所述用于检测阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒包括抗CD63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体‑DNA寡核苷酸偶联物、qPCR核酸扩增试剂。本发明利用上述试剂盒，通过将抗原抗体识别与PCR的灵敏度相结合创建一种免疫PCR方法，在纳米磁珠消除高背景的辅助下，可检测到的血液外泌体生物标志物浓度低至10fg/mL。利用本发明公开的方法可以实现对血液外泌体标志物的高精度及高灵敏度的检测，操作简便，具有较高的临床应用价值。
Description
技术领域
本发明涉及生物检测技术领域，尤其涉及一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法。
背景技术
阿尔茨海默病(AD)是一种隐匿的神经系统退行性疾病，其临床表现为进行性认知功能下降，包括记忆障碍、定向障碍、语言障碍和行为异常，严重影响患者日常生活能力。AD已经被列为继肿瘤、心脏病和脑血管疾病之后引起老年人死亡的第四大病因。目前的临床诊断主要依靠神经心理测试和神经影像学。由于AD生物标志物是用于评估疾病风险的神经化学指标，因此鉴定和检测AD生物标志物对AD很重要。在临床研究中，脑脊液被认为是AD生物标志物的最佳来源。但脑脊液的采集使用的是腰椎穿刺这种侵入性手术，手术风险偏高并且有可能产生副作用。与脑脊液相比，血液测试的简易性和低成本为临床应用和治疗发展开辟了许多令人兴奋的可能性。血液中包含多种蛋白质，肽，脂质和代谢产物，它们反映了包括大脑在内的许多器官的生理活动。其血液外泌体可以作为AD筛查中理想的生物标志物载体。
越来越多的研究表明，外泌体参与AD病变的阮病毒样传播。AD中血脑屏障的损伤可能会增加大脑和血液之间生物标志物的双向流动。在此过程中，脑内分泌的外泌体也可以穿过血脑屏障进入外周血。最近的研究发现，血液外泌体中的生物标志物(淀粉样蛋白和磷酸化蛋白)与脑脊液中的生物标志物密切相关。现有的检测方法是利用一些昂贵的商用试剂盒和单分子阵列(Simoa)，Simoa的检测方法对检测仪器和样本的要求较高，目前临床医院检测的普及性差，多为第三方检测机构辅助检测，仅供研究参考。已知血液外泌体中所含的病理性蛋白水平趋近于常规酶联免疫吸附测定(ELISA)检测的下限，这使得准确可靠的生物标志物检测变得困难。因此，开发简易且超灵敏的检测平台可以为AD生物标志物的检测提供一次创新。
免疫聚合酶链反应(免疫PCR)是利用抗原抗体反应的特异性和PCR扩增反应的高灵敏性而建立的一种微量抗原检测技术。然而在检测应用中该技术受到许多局限，如非特异性结合导致的高背景等。有研究报道，利用纳米磁珠可以减少非特异性结合。但目前的研究还没有针对AD血液外泌体生物标志物检测的免疫PCR技术。
发明内容
本发明的目的在于提供一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法，利用本发明试剂盒可以实现对血液外泌体标志物的高精度及高灵敏度的检测，操作简便，具有较高的临床应用价值。
为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
本发明提供了一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒，包括抗CD63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物、qPCR核酸扩增试剂。
优选的，所述抗CD63抗体为生物素偶联的抗CD63抗体。
优选的，所述磁珠为抗生物素超顺磁性磁珠。
优选的，所述目标生物标志物抗体包括抗Aβ1-42抗体、抗Aβ1-40抗体、抗p-tau396,404抗体和抗p-tau181抗体中的一种或几种。
优选的，所述DNA寡核苷酸为巯基修饰的DNA寡核苷酸；
优选的，所述DNA寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物的制备方法为：
将纯化后的目标生物标志物的抗体和DNA寡核苷酸以摩尔比为1:5～1:15的比例混合，0～5℃孵育10～15h。
本发明还提供了一种非诊断目的利用上述任一项所述试剂盒检测阿尔兹海默病生物标志物的方法，包括以下步骤：
(1)血液中外泌体的富集；
(2)将步骤(1)富集的外泌体与目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物结合，得到磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物，然后进行qPCR，即可对血液外泌体中生物标志物进行检测。
优选的，步骤(1)中所述富集的方法包括以下步骤：
将血液与抗CD63抗体混合，再加入磁珠，得到磁珠-外泌体复合物。
优选的，步骤(2)中所述进行qPCR前，还包括以下步骤：
将磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物用1×PBS洗涤1～5次，在磁珠沉淀物中加入洗脱缓冲液孵育5～15min，进行磁性分离，上清液用于qPCR检测。
相比于现有技术，本发明的有益效果为：
(1)血液外泌体的提取采用外泌体膜蛋白的抗原抗体与磁珠相结合的特点，具有特异性好、富集能力高的优势，所富集的外泌体形态均一。通过这一手段富集外泌体，简化了传统外泌体提取的操作步骤，且节约血液样本。
(2)利用磁珠提取外泌体进行免疫PCR可以减少清洗和孵育步骤，并减少非特异性结合。
(3)巯基修饰的DNA寡核苷酸可以与对应标志物的抗体结合，用于后续检测。
(4)免疫PCR通过将抗原抗体作用与PCR的灵敏度相结合，利用PCR扩增信号放大，对目标生物标志物的检测灵敏度更高，所需仪器普遍，操作简便，适合广泛推广应用。利用不同的DNA寡核苷酸可以实现同一样品中多种生物标志物的同时检测。
附图说明
图1为基于免疫PCR对外泌体中AD生物标志物的检测示意图；
图2为使用聚丙烯酰胺凝胶电泳表征偶联产物，其中，A为抗体和磁珠偶联产物，B为抗体与DNA寡核苷酸偶联产物；
图3为免疫PCR反应条件的探究，其中，A为抗体-寡核苷酸偶联物的不同稀释浓度，B为抗体-寡核苷酸偶联物的不同孵育时间，C为洗涤次数；
图4为以检测Aβ1-42为例，采用免疫PCR方法检测一系列不同浓度的Aβ1-42。其中，A为免疫PCR检测的循环数与Aβ1-42的浓度负相关，B为免疫PCR检测的ΔCt值与Aβ1-42的浓度正相关；
图5为外泌体提取的流程以及表征，其中，A为外泌体提取的流程图；B为蛋白免疫印迹法表征外泌体包含的CD63，C图为蛋白免疫印迹法表征外泌体中的Aβ1-42；
图6为C57阴性鼠和AD转基因鼠5×FAD鼠血液外泌体中所含Aβ1-42的差异分析，其中，A～C为ELISA检测方法评估，D～F为免疫PCR检测方法评估；
图7为不同稀释环境下Aβ1-42的免疫PCR荧光实时信号检测以及Aβ1-42浓度与ΔCt值的拟合曲线，其中，A～B为全血稀释环境，C～D为血浆稀释环境，E～F为外泌体稀释环境；
图8为免疫PCR检测AD患者和非AD患者血液外泌体中的关键标志物(Aβ1-42、Aβ1-40、p-tau396,404和p-tau181)的差异分析，其中，A～B为Aβ1-42的差异分析，C～D为Aβ1-42的差异分析，E～F为p-tau396,404的差异分析，G～H为p-tau181的差异分析，I为当生物标志物(Aβ1-42、Aβ1-40、p-tau396,404和p-tau181)被用作单一预测因子时，免疫PCR检测的ROC曲线，J为当复合生物标志物(p-tau396,404/Aβ1-42)被用作预测因素时，免疫PCR检测的ROC曲线。
具体实施方式
本发明提供了一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒，包括抗CD63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物、qPCR核酸扩增试剂。
在本发明中，所述抗CD63抗体优选为生物素偶联的抗CD63抗体。
在本发明中，所述磁珠优选为抗生物素超顺磁性磁珠。在本发明一个具体实施方式中，所述抗生物素超顺磁性磁珠可市售获得。
在本发明中，所述目标生物标志物抗体包括抗Aβ1-42抗体、抗Aβ1-40抗体、抗p-tau396,404抗体和抗p-tau181抗体中的一种或几种。
在本发明中，所述目标生物标志物抗体的制备方法包括以下步骤：将所述抗体-PBS混合液浓缩至1～3mg/mL，优选为1.5～2.5mg/mL，进一步优选为1.8～2.2mg/mL；然后与马来酰亚胺-PEG-NHS酯交联剂在0～5℃下反应0.5～3h，反应温度优选为1～4℃，进一步优选为2～3℃；反应时间优选为1～2.5h，进一步优选为1.5～2h。
在本发明中，所述DNA寡核苷酸优选为巯基修饰的DNA寡核苷酸，所述DNA寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示，DNA寡核苷酸的序列如下：
SEQ ID NO.1：5'-CATGTTACTCCTATGATGAATACGGATATAGACTC GAACTGCTTCCCTCTAACTTCCATCAACTCCTGCAACCTCCTCGAACGA CTA-3'；
SEQ ID NO.4：5'-ATGTTACTCCAATGATTTCTGAAAGTTCTACTGGC TTATACCGGATATAGACTCGAACTGCTTCCCTCTAACTTCCATCAACTCC TGCAACCTCCTCGAACCCACCAGCG-3'。
在本发明中，所述DNA寡核苷酸的制备方法包括以下步骤：将2～10nmol硫醇修饰的DNA寡核苷酸加入到二硫苏糖醇(DTT，100mM)中，DNA寡核苷酸与二硫苏糖醇的摩尔比为1:15～1:80，优选为1:25～1:65，进一步优选为1:40～1:50；在室温黑暗中反应1～3h，反应时间优选为1.5～2.5h，进一步优选为2h；所述室温优选为22～28℃，进一步优选为24～26℃。
在本发明中，所述目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物的制备方法为：
将纯化后的目标生物标志物的抗体和DNA寡核苷酸以摩尔比为1:5～1:15的比例混合，0～5℃孵育10～15h，所述目标生物标志物的抗体和DNA寡核苷酸的摩尔比优选为1:7～1:12，进一步优选为1:9～1:11；所述孵育的温度优选为1～4℃，进一步优选为2～3℃；所述孵育的时间优选为11～14h，进一步优选为12～13h。
在本发明中，所述qPCR核酸扩增试剂优选为2×Taq Pro Universal SYBR qPCRMasterMix。在本发明一个具体实施方式中，所述2×Taq Pro Universal SYBR qPCRMasterMix可市售获得。
本发明还提供了一种非诊断目的利用上述任一项所述试剂盒检测阿尔兹海默病生物标志物的方法，包括以下步骤：
(1)血液中外泌体的富集；
(2)将步骤(1)富集的外泌体与目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物结合，得到磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物，然后进行qPCR，即可对血液外泌体中生物标志物进行检测。
在本发明中，首先对血液中的外泌体进行富集，所述富集的方法包括以下步骤：将血液与抗CD63抗体混合，再加入磁珠，得到磁珠-外泌体复合物。
在本发明中，将富集的外泌体与目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物结合，得到磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物，然后进行qPCR，即可对血液外泌体中生物标志物进行检测。在本发明中，所述富集的外泌体与目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物进行免疫孵育得到磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物，所述目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物在免疫孵育前进行稀释，所述稀释的比例为1:100～200，优选为1:120～180，进一步优选为1:140～160；所述免疫孵育的时间为0.5～3h，优选为1～2.5h，进一步优选为1.5～2h。
在本发明中，在得到磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物后，将磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物用1×PBS洗涤1～5次，优选为2～4次，进一步优选为3次；在磁珠沉淀物中加入洗脱缓冲液孵育5～15min，优选为7～13min，进一步优选为8～12min；然后进行磁性分离，得到的上清液调节至中性后用于qPCR检测。
在本发明中，上述基于免疫PCR对外泌体中的AD生物标志物的检测示意图见图1。
下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1基于抗体的免疫PCR检测方法的建立
步骤1：Fe3O4-COOH磁珠与抗体偶联
步骤1.1：取1mLFe3O4-COOH磁珠悬浮液(5mg/mL)，置于1.5mL EP管中进行磁分离，用1mL活化缓冲液洗涤两次。
步骤1.2：向步骤1.1中加入200μL20 mg/mL 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，与磁珠混合均匀，室温下活化反应30min。
步骤1.3：将步骤1.2中活化后的磁珠进行磁分离，用活化缓冲液洗涤两次，去除剩余的EDC/NHS。
步骤1.4：向步骤1.3中加入100μL 500μg/mL目标生物标志物抗体工作液，4℃偶联过夜。
步骤1.5：将步骤1.4中磁珠与抗体偶联物置于1mL 100mM Tris-HCl缓冲液(0.05％吐温-20)中封闭3h，封闭非特异性吸附位点，然后在1mL PBS-T缓冲液(10mM PBS/0.05％吐温-20)中洗涤5次。
步骤1.6：将步骤1.5中洗涤后的磁珠与抗体偶联物重悬于500μL的1×PBS缓冲液中，置于冰箱4℃保存。
步骤2：抗体与寡核苷酸偶联
步骤2.1：将100mM二硫苏糖醇(DTT)加入到25μL的1mM硫醇修饰的DNA寡核苷酸中，在室温黑暗中激活反应2h。
步骤2.2：将步骤2.1中反应后的混合溶液用7kDa Zeba脱盐柱纯化以去除多余的DTT。
步骤2.3：将单一抗体-PBS混合液用0.5mL 50-kDaAmbiconUltra Filters浓缩至2mg/mL，并与马来酰亚胺-PEG-NHS酯交联剂在4℃反应1.5h(100μg抗体：2.5～3.4μL0.85mg/mL交联剂)。
步骤2.4：将步骤2.3中反应后的抗体用0.5mL 50-kDaZeba脱盐柱纯化抗体，去除多余的交联剂。用Nanodrop检测纯化抗体的浓度。
步骤2.5：将步骤2.2中纯化后的DNA寡核苷酸与步骤2.4中的纯化抗体(抗体与DNA的摩尔比为1:10)在4℃下孵育过夜。
步骤2.6：将步骤2.5中结合的抗体用2mL 50kDaAmicon Ultra Filters洗涤5次，以去除未反应的DNA寡核苷酸。采用BCA蛋白检测试剂盒(购自武汉赛维尔生物科技有限公司Servicebio，货号G2026)检测纯化的抗体-DNA寡核苷酸偶联物的浓度。
对步骤1得到的抗体和磁珠偶联产物与步骤2得到的抗体和DNA寡核苷酸偶联产物使用聚丙烯酰胺凝胶电泳进行表征，结果见图2，其中，A为抗体与DNA寡核苷酸偶联反应产物；B为抗体和磁珠偶联产物。
步骤3：免疫PCR检测Aβ1-42多肽
步骤3.1：以Aβ1-42为例，选择的抗体对为1F12单克隆抗体和2C6单克隆抗体，所述1F12单克隆抗体和2C6单克隆抗体由申请号为CN202011227808.5，公开号CN113308439A的发明专利公开。20μL 5mg/mL Fe3O4磁珠-1F12偶联物和100μL的10倍等梯度稀释的Aβ1-42溶液，其对应浓度分别为100 ng/mL，10 ng/mL，1 ng/mL，100 pg/mL，10 pg/mL，1 pg/mL，100 fg/mL，10 fg/mL。上述溶液混合至1.5 mL低吸附的离心管中，置于旋转仪上，4℃过夜反应。
步骤3.2：将步骤3.1中反应后的混合溶液进行磁分离，剩余磁珠结合物用1×PBS洗涤三次后，将寡核苷酸偶联抗体按1：100～1：500的比例稀释，然后与磁珠结合物混合后置于旋转仪上室温下反应0.5～3 h，磁分离沉淀，1×PBS洗涤1～5次。探究免疫PCR反应条件对检测结果的影响，结果见图3，其中，A为抗体-寡核苷酸偶联物的不同稀释浓度对检测结果的影响；B为抗体-寡核苷酸偶联物的不同孵育时间对检测结果的影响；C为抗体DNA偶联物洗涤次数对检测结果的影响。结果表明，抗体-DNA寡核苷酸偶联物在免疫孵育时的稀释比例最佳为1：100；免疫结合的孵育时间在0.5～3.0 h之间均可；洗涤次数在1～5次之间均可。
步骤3.3：将步骤3.2中的磁珠沉淀物中加入20μL洗脱缓冲液混合均匀，室温孵育10 min。
步骤3.4：将步骤3.3中的沉淀混合物进行磁性分离收集上清液至新的离心管中，并加入1μL中和缓冲液将洗脱产物pH调节至中性，用于后期qPCR实验。
步骤4：荧光定量PCR
qPCR扩增中采用SYBR Green I染料法。
反应体系20μL；
正向引物0.5μL(10μmol/L，引物序列见表1)；
反向引物0.5μL(10μmol/L，引物序列见表1)；
2×TaqPro Universal SYBR qPCRMasterMix 10μL；
步骤3.4中的洗脱产物1～2μL；
超纯水补足至20μL。
反应程序：
预变性：95℃，5 s；
循环(30～40轮)：95℃，10 s；60℃，30 s。
探究免疫PCR的循环次数和ΔCt值与Aβ1-42的浓度的关系，每个样本的ΔCt由阴性对照的平均Ct值减去不同样本的Ct值得到。结果见图4，其中，A为免疫PCR检测的循环数与Aβ1-42的浓度负相关；B为免疫PCR检测的ΔCt值与Aβ1-42的浓度正相关。
实施例2血液外泌体的提取
步骤5：取50μL新鲜血液，用1×PBS稀释血液样品(体积比1:1)，置于冰上备用。0.5μL生物素修饰的anti-human CD63抗体加入到已稀释的血液样品中，室温下孵育10min。随后加入10μL抗生物素的超顺磁性磁珠，用1mL枪头吹打3次混合均匀，室温下孵育10min。再添加1×PBS至2mL。用1mL枪头吹打混匀，将装有混合溶液的试管置于磁极器中，室温条件静置5min。从磁极中取出含有结合外泌体的试管，加入1mL 1×PBS反复洗涤3次。最后吸取100μL 1×PBS来清洗管壁上的外泌体，得到超顺磁性磁珠-外泌体复合物。血液外泌体的提取步骤图见图5，其中，A为外泌体提取的流程图；B为蛋白免疫印迹法表征外泌体包含的CD63；C为蛋白免疫印迹法表征外泌体中的Aβ1-42。
实施例3基于抗体的免疫PCR检测AD小鼠血液外泌体中的Aβ1-42病理蛋白
将收集的C57BL/6小鼠和5×FAD小鼠(均购买自鼠来宝(武汉)科技有限公司)血液外泌体(步骤5中超顺磁性磁珠-外泌体复合物)与实施例1步骤2中2C6-DNA偶联物混合反应1h。随后在上述混合反应的溶液中加入1.5mL的1×PBS，吹打混合均匀，将混合溶液置于磁极器中，室温条件静置5min。从磁极中取出含有结合外泌体的试管，加入1mL PBS-T缓冲液反复洗涤3次。最后收集到的外泌体@2C6-DNA体积50～200μL。随后将1.5μL外泌体@2C6-DNA与0.5μL引物混合物(10μM正向/反向引物，引物序列见表1)、10μL 2×Taq Pro UniversalSYBR qPCR Mastermix和7.5μL H2O混合。使用QuantStudioTM3检测器进行qPCR。
对C57BL/6小鼠和AD转基因鼠5×FAD小鼠血液外泌体中所含Aβ1-42的差异进行分析，结果见图6，其中，A～C为ELISA检测方法评估；D～F为免疫PCR检测方法评估。由图6可知，通过免疫PCR检测发现在5×FAD组和C57BL/6对照组之间外泌体中Aβ1-42水平的显著差异(p<0.0001，unpairedttest)高于ELISA评估的差异分析(p＝0.001，unpairedttest)。对比这两种检测方法所得到的p值，说明免疫PCR检测体系在外泌体样本中的检测灵敏度更高，更有利于疾病进程的检测分析。
为了评估该免疫PCR检测体系在临床不同样品环境中定量检测生物标志物的能力，探究不同稀释环境下Aβ1-42的免疫PCR荧光实时信号检测以及Aβ1-42浓度与ΔCt值的关系，结果见图7，其中，A～B为全血稀释环境；C～D为血浆稀释环境；E～F为外泌体稀释环境。对比这三种稀释环境下的检测结果得知外泌体稀释的检测环境背景较低。我们将样本和对照组之间的ΔCt值与Aβ1-42浓度绘制成线性关系，观察到ΔCt值随Aβ1-42浓度增加呈线性增加。尽管我们在全血样品的检测中观察到更高的检测背景，但该体系下检测到的最低浓度仍然维持在0.1pg/mL，这说明该免疫PCR检测可以进行全血、血浆和外泌体的直接检测，具有潜在的临床可实用性。
实施例4采用该免疫PCR体系对临床血液外泌体中的Aβ1-42、Aβ1-40、p-tau396,404和p-tau181在同一样本中进行检测
采用免疫PCR法检测临床血液外泌体中Aβ1-42、Aβ1-40、p-tau396,404和p-tau181的含量。该步骤和实施例3类似，只是对应的抗体-DNA偶联物分别为2C6-DNA、anti-Aβ1-40-DNA、anti-p-tau396,404-DNA和anti-p-tau181-DNA。结果见图8，其中，A～B为Aβ1-42的差异分析；C～D为p-tau396,404的差异分析；E～F为p-tau181的差异分析；G为当生物标志物(Aβ1-42、Aβ1-40、p-tau396,404和p-tau181)被用作单一预测因子时，免疫-PCR检测的ROC曲线；H为当复合生物标志物(p-tau396,404/Aβ1-42)被用作预测因素时，免疫-PCR检测的ROC曲线。统计分析通过非配对t检验进行(***p<0.0005，****p<0.0001)。由图8可知，使用该免疫PCR检测体系对临床外泌体中单一生物标志Aβ1-42、Aβ1-40、p-tau396,404和p-tau181进行检测，即使是单一预测指标，也可以成功区分AD患者和正常对照组。进一步通过接收者操作特征(ROC)曲线评估该检测方法的灵敏度和特异度，研究每种生物标志物对应的ROC曲线下面积(AUC)值，其AUC参数值可以量化检测方法的准确性，由分析结果可知Aβ1-42和p-tau396,404对应的AUC值超过了0.95，说明这两种单一预测指标在区分AD患者和正常对照组之间的准确度高，且高于复合生物标志物的预测分析，具有潜在的临床应用价值。
表1：免疫PCR免疫寡核苷酸和引物序列
由以上实施例可知，本发明提供了一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒及检测生物标志物的方法，利用本发明试剂盒可以实现对血液外泌体标志物的高精度及高灵敏度的检测，操作简便，具有较高的临床应用价值。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于检测血液外泌体中阿尔兹海默病生物标志物的试剂盒，其特征在于，包括抗CD63抗体、磁珠、目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物、qPCR核酸扩增试剂。
2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述抗CD63抗体为生物素偶联的抗CD63抗体。
3.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述磁珠为抗生物素超顺磁性磁珠。
4.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述目标生物标志物抗体包括抗Aβ1-42抗体、抗Aβ1-40抗体、抗p-tau396,404抗体和抗p-tau181抗体中的一种或几种。
5.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述DNA寡核苷酸为巯基修饰的DNA寡核苷酸；
所述DNA寡核苷酸的序列如SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.4所示。
6.根据权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于，所述目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物的制备方法为：
将纯化后的目标生物标志物的抗体和DNA寡核苷酸以摩尔比为1:5～1:15的比例混合，0～5℃孵育10～15h。
7.一种非诊断目的利用权利要求1～6任一项所述试剂盒检测阿尔兹海默病生物标志物的方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)血液中外泌体的富集；
(2)将步骤(1)富集的外泌体与目标生物标志物的抗体-DNA寡核苷酸偶联物结合，得到磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物，然后进行qPCR，即可对血液外泌体中生物标志物进行检测。
8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(1)中所述富集的方法包括以下步骤：
将血液与抗CD63抗体混合，再加入磁珠，得到磁珠-外泌体复合物。
9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述进行qPCR前，还包括以下步骤：
将磁珠-外泌体@抗体-DNA复合物用1×PBS洗涤1～5次，在磁珠沉淀物中加入洗脱缓冲液孵育5～15min，进行磁性分离，上清液用于qPCR检测。
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Cited By (3)
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| CN118150843A (zh) * | 2024-04-01 | 2024-06-07 | 北京热景生物技术股份有限公司 | 一种阿尔兹海默症检测标志物糖链外泌体P-Tau-217及其应用 |
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2023
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