CN116440882A - 一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及色谱层析介质领域，本发明公开了一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质及其制备方法。该制备方法包括：（1）通过端烯基卤代烃对天然多糖凝胶微球进行活化，得到端烯基活化天然多糖凝胶微球；（2）通过硫醇或苯硫酚对端烯基活化天然多糖凝胶微球进行巯基‑烯点击反应偶联疏水配基，得到疏水分离层析介质。本发明在对天然多糖凝胶微球表面改性的过程中残留的活化基团不会导致蛋白在层析介质中的非特异性结合，因此不会降低纯化效率，不会影响层析介质的重复使用效果。本发明通过选择特定分子链长度的端烯基卤代烃对天然多糖凝胶微球表面进行修饰，反应率高，最终所得疏水分离层析介质具有较高的配基密度。
Description
技术领域
本发明涉及色谱层析介质领域，尤其涉及一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质及其制备方法。
背景技术
天然多糖因其良好的生物相容性，已成为酶、疫苗、单克隆抗体和病毒等生物制药产品的重要分离层析介质。天然多糖表面修饰上不同的功能基团或标签蛋白等，可实现离子交换、疏水和亲和等不同方式的色谱分离模式，用于分离不同的生物制剂。其中的疏水分离层析利用蛋白质分子与固定相疏水相互作用力不同，实现不同性质的蛋白分离，所得蛋白的活性保留值高。常用疏水分离层析介质是在天然多糖的活性羟基上，修饰上苯基、丁基和辛基等疏水基团，提高天然多糖的疏水性，实现天然多糖与蛋白的疏水相互作用。这些疏水基团通常采用活化偶联法制备，即首先使用多官能团环氧化合物使天然多糖带上环氧活性官能团，而后用醇或酚与环氧反应，偶联上疏水基团(青岛科技大学学报，2011(32)，556-559)。
然而，多官能团环氧化合物活化过程中，环氧与天然多糖上的羟基同样具有较高的反应活性，因而难以获得较高活化度的环氧活化天然多糖，进而进一步地限制疏水基团偶联密度的提高，更进一步地影响蛋白纯化效率。此外，偶联反应后残余的环氧基团易与蛋白上的基团(如氨基)产生非特异性吸附，影响纯化效果和介质使用寿命。
最后，由于天然多糖凝胶微球具有复杂的分子结构，采用小分子改性剂对其表面进行修饰改性时，受限于天然多糖凝胶微球分子结构的空间位阻等不利因素，小分子改性剂的反应效率普遍较低，从而影响最终所得材料的配基密度。
发明内容
为了解决上述技术问题，本发明提供了一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质及其制备方法。首先，本发明在对天然多糖凝胶微球表面改性过程中残留的活化基团不会导致蛋白在层析介质中的非特异性结合，因此不会降低纯化效率，不会影响层析介质的重复使用效果。其次，本发明通过选择特定分子链长度的端烯基卤代烃对天然多糖凝胶微球表面进行修饰，反应率高，最终所得疏水分离层析介质具有较高的配基密度。
本发明的具体技术方案为：
第一方面，本发明提供了一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质，化学结构式为：
其中，为天然多糖凝胶微球；R1为C4H9、C8H17或C6H5；n＝1-10(优选3-6)。
第二方面，本发明提供了一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质的制备方法，合成路线为：
本发明的上述合成路线具有以下优点：
(A)无负面影响的活性基团残留。本发明在制备结束后残余的活化基团不会导致蛋白在层析介质中的非特异性结合。现有技术中环氧活化的层析介质，未偶联的环氧基团，可在层析过程中与蛋白上的氨基特异性结合，降低纯化收率，并影响层析介质的重复使用效果。因而，使用环氧活化偶联法制备层析介质时往往需在偶联反应后使用乙醇胺等使残余的环氧基团灭活。而本发明使用的端烯基活化法，残余的双键官能团不会有此问题。
(B)配基密度高、可控范围广。本发明使用仅单一官能团对天然多糖羟基具有反应活性的端烯基卤代烃活化天然多糖，活化效率高，能得到较高双键含量的活性中间体。同时，本发明通过选择特定分子链长度的端烯基对天然多糖凝胶微球表面进行修饰，反应率高，最终所得疏水分离层析介质具有较高的配基密度。
另一方面，本发明先采用端烯基卤代烃对天然多糖凝胶微球表面进行修饰后(即针对天然多糖凝胶微球表面的丰富羟基)，使得天然多糖凝胶微球表面接枝有端烯基烷烃官能团。当我们进一步对端烯基进行巯基-烯点击反应时，发现端烯基的反应率并不高。分析其原因可能在于天然多糖凝胶微球具有种类丰富的官能团且分子量较大，导致其分子三维构象较为复杂。受限于天然多糖凝胶微球分子中各种官能团的空间位阻等不利因素，使得大量端烯基被“遮掩”，反应活性不高，因此导致反应率较低，从而影响材料的配基密度。为此，本发明发现将端烯基卤代烃的碳链长度控制在n＝3-6范围时，可使端烯基摆脱天然多糖凝胶微球分子中各种官能团的空间位阻，充分暴露于天然多糖凝胶微球表面，从而具有较高的反应活性；同时，上述范围也不会因为碳链过长而导致材料的疏水性过高。
(C)含硫疏水配基偶联效率高。本发明使用巯基-烯点击反应法偶联疏水配基，偶联效率高。点击反应具有反应效率高、反应条件温和、立体选择性好、对水和氧气不敏感等优点，是一种高效的合成方法。
(D)配基稳定性高，不易脱落。疏水配基通过硫醚键偶联在天然多糖凝胶微球表面，稳定性好。
作为优选，所述制备方法具体包括如下步骤：
(1)端烯基活化：在天然多糖凝胶微球中加入水、氢氧化钠溶液、硼氢化钠和无水硫酸钠，加热搅拌混合后加入端烯基卤代烃，继续反应，过滤、洗涤后得到端烯基活化天然多糖凝胶微球。
(2)含硫疏水配基偶联：在端烯基活化天然多糖凝胶微球中加入硫醇或苯硫酚、水和催化剂，加热反应，过滤、洗涤后得到基于端烯基活化的疏水分离层析介质。
作为优选，步骤(1)中，所述天然多糖凝胶微球为琼脂糖凝胶微球、纤维素凝胶微球和葡聚糖凝胶微球中的一种。
作为优选，步骤(1)中，所述端烯基卤代烃为6-氯-1-己烯、6-溴-1-己烯等。
作为优选，步骤(1)中，所述天然多糖凝胶微球与端烯基卤代烃的质量比为1∶(0.05～1.5)
作为优选，步骤(1)中，所述天然多糖凝胶微球与水的质量体积比为1g∶(0.2～1.5)mL。
作为优选，步骤(1)中，所述加热搅拌的温度为25～80℃，时间为0.5～2h；所述反应的温度为30～80℃，反应时间为5～20h。
作为优选，步骤(1)中，所述洗涤方式为水洗、醇洗或两者交替洗涤。
作为优选，步骤(2)中，所述端烯基活化天然多糖凝胶微球与硫醇或苯硫酚的质量体积比为1g∶(0.05～1)mL。
作为优选，步骤(2)中，所述端烯基活化天然多糖凝胶微球与水的质量体积比为1g∶(0.5～1.5)mL。
作为优选，步骤(2)中，所述洗涤方式为水洗、醇洗或两者交替洗涤。
与现有技术相比，本发明具有以下技术效果：
(1)本发明制备结束后残余的活化双键基团不会导致蛋白在层析介质中的非特异性结合，因此不会降低纯化效率，不会影响层析介质的重复使用效果。
(2)本发明使用仅单一官能团对天然多糖羟基具有反应活性的端烯基卤代烃活化天然多糖，活化效率高，能得到较高双键含量的活性中间体。并且本发明通过选择特定分子链长度的端烯基卤代烃对天然多糖凝胶微球表面进行修饰，反应率高，最终所得疏水分离层析介质具有较高的配基密度。
(3)本发明使用巯基-烯点击反应法偶联疏水配基，偶联效率高。点击反应具有反应效率高、反应条件温和、立体选择性好、对水和氧气不敏感等优点，是一种高效的合成方法。
(4)本发明中疏水配基通过硫醚键偶联在天然多糖凝胶微球表面，稳定性好，不易脱落。
具体实施方式
下面实施例对本申请做进一步详细的说明。应当注意的是：此处所描述的具体实施例仅用于解释相关发明，而非对该发明范围的限制。对本领域的技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，可以做出若干修改，但这些都属于本发明保护的范围。
总实施例
一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质，化学结构式为：
其中，R1为C4H9、C8H17或C6H5；n＝1-10(优选3-6)；为天然多糖凝胶微球，优选为琼脂糖凝胶微球、纤维素凝胶微球和葡聚糖凝胶微球。
一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质的制备方法，合成路线为：
其制备方法具体包括如下步骤：
(1)端烯基活化：在天然多糖凝胶微球中加入水、氢氧化钠溶液(20～50％)、硼氢化钠和无水硫酸钠，25～80℃加热搅拌混合0.5～2h后加入端烯基卤代烃(优选为6-氯-1-己烯、6-溴-1-己烯等)，继续30～80℃反应5～20h，过滤、洗涤(水洗、醇洗或两者交替洗涤)后得到端烯基活化天然多糖凝胶微球。
其中，天然多糖凝胶微球与端烯基卤代烃的质量比为1∶(0.05～1.5)天然多糖凝胶微球与水的质量体积比为1g∶(0.2～1.5)mL；天然多糖凝胶微球与氢氧化钠溶液的质量体积比为1g∶(0.1～1.5)mL；硼氢化钠加入后的含量为0.1～1mg/mL；无水硫酸钠用加入后的含量为0.1～0.5g/mL。
(2)含硫疏水配基偶联：在端烯基活化天然多糖凝胶微球中加入硫醇或苯硫酚(优选为苯硫酚、丁硫醇和辛硫醇)、水和催化剂(优选为过硫酸盐、偶氮二异丁腈、2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐)，30～80℃加热反应1～10h，过滤、洗涤(水洗、醇洗或两者交替洗涤)后得到基于端烯基活化的疏水分离层析介质。
其中，端烯基活化天然多糖凝胶微球与硫醇或苯硫酚的质量体积比为1g∶(0.05～1)mL；端烯基活化天然多糖凝胶微球与水的质量体积比为1g∶(0.5～1.5)mL。
实施例1
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入1g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、1mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为9μmol/mL。
实施例2
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为43μmol/mL。
实施例3
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入10g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、5mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为81μmol/mL。
实施例4
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入20g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、10mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为167μmol/mL。
实施例5
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-溴-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为40μmol/mL。
实施例6
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g偶氮二异丁腈，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为46μmol/mL。
实施例7
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g 2，2′-偶氮二异丁基脒二盐酸盐，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为41μmol/mL。
实施例8
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4g苯硫酚和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到苯基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得苯基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为49μmol/mL。
实施例9
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4mL辛硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到辛基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得辛基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为38μmol/mL。
实施例10
(1)端烯基活化：取20g纤维素凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到纤维素活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得纤维素活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基纤维素疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基纤维素疏水分离层析介质配基密度为37μmol/mL。
实施例11
(1)端烯基活化：取20g葡聚糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g 6-氯-1-己烯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到葡聚糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得葡聚糖活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基葡聚糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基葡聚糖疏水分离层析介质配基密度为52μmol/mL。
对比例1
本对比例为使用环氧氯丙烷活化琼脂糖基质，然后用丁硫醇进行偶联。具体步骤如下：
(1)环氧氯丙烷活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL 33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入10mL环氧氯丙烷，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL 33％氢氧化钠溶液和4mL丁硫醇，50℃搅拌反应16h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离材料。
经过核磁检测，所制得丁基琼脂糖疏水分离材料配基密度为24μmol/mL。
对比例2
(1)端烯基活化：取20g琼脂糖凝胶微球，加入5mL水、3g无水硫酸钠、8mL33％氢氧化钠溶液和0.02g硼氢化钠，常温搅拌30min后升温至50℃，继续搅拌30min。加入5g烯丙基氯，50℃搅拌反应10h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到琼脂糖活化中间体。
(2)含硫配基偶联：将步骤(1)中所得琼脂糖活化中间体中加入10mL水、4mL丁硫醇和0.15g过硫酸铵，50℃搅拌反应5h。反应结束后过滤，依次用水、无水乙醇、水清洗产物，得到丁基琼脂糖疏水分离层析介质。
经核磁检测，所得丁基琼脂糖疏水分离层析介质配基密度为32μmol/mL。
性能测试
实施例1-11以及对比例1-2所得材料的配基密度数据如下表所示：
| 名称 | 配基密度/μmol·mL-1 |
| 实施例1 | 9 |
| 实施例2 | 43 |
| 实施例3 | 81 |
| 实施例4 | 167 |
| 实施例5 | 40 |
| 实施例6 | 46 |
| 实施例7 | 41 |
| 实施例8 | 49 |
| 实施例9 | 38 |
| 实施例10 | 37 |
| 实施例11 | 52 |
| 对比例1 | 24 |
| 对比例2 | 32 |
由以上实施例1-11和对比例1-2的结果可知，实施例1-11采用本发明端烯基活化，巯基-烯点击反应偶联疏水配基，可以高效地偶联上含硫疏水基团，配基密度可根据需要在从9-167μmol·mL-1一个较宽的范围内调整。而对比例1为使用环氧氯丙烷活化琼脂糖基质，然后用丁硫醇进行偶联，配基密度仅能做到24μmol·mL-1。而对比例2使用的端烯基活化物质n＝1，最终得到的疏水层析介质配基密度低于相同条件下用n＝4的实施例2所得的结果，说明使用合适链长的端烯基修饰，可提高疏水分离层析介质的配基密度。
需要说明的是：上述各案例仅用于说明本发明的技术方案，并非对本发明进行限制。本领域的相关技术人员可以在权利要求范围内进行修改和变形，但这些修改与变形并不会使相应技术方案脱离本发明的各实施例技术方案的范围。
Claims (10)
1.一种基于端烯基活化的疏水分离层析介质，其特征在于：化学结构式为：
其中，为天然多糖凝胶微球；R1为C4H9、C8H17或C6H5；n＝1-10。
2.如权利要求1所述的疏水分离层析介质，其特征在于：n＝3-6。
3.一种如权利要求1或2所述疏水分离层析介质的制备方法，其特征在于：合成路线为：
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于：具体包括如下步骤：
(1)端烯基活化：在天然多糖凝胶微球中加入水、氢氧化钠溶液、硼氢化钠和无水硫酸钠，加热搅拌混合后加入端烯基卤代烃，继续反应，过滤、洗涤后得到端烯基活化天然多糖凝胶微球；
(2)含硫疏水配基偶联：在端烯基活化天然多糖凝胶微球中加入硫醇或苯硫酚、水和催化剂，加热反应，过滤、洗涤后得到基于端烯基活化的疏水分离层析介质。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述天然多糖凝胶微球与端烯基卤代烃的质量比为1∶(0.05～1.5)。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述天然多糖凝胶微球与水的质量体积比为1g∶(0.2～1.5)mL。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中，所述天然多糖凝胶微球为琼脂糖凝胶微球、纤维素凝胶微球和葡聚糖凝胶微球中的一种。
8.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述端烯基活化天然多糖凝胶微球与硫醇或苯硫酚的质量体积比为1g∶(0.05～1)mL。
9.如权利要求4或8所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中，所述端烯基活化天然多糖凝胶微球与水的质量体积比为1g∶(0.5～1.5)mL。
10.如权利要求4或9所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)和步骤(2)中，所述洗涤的方式为水洗、醇洗或两者交替洗涤。
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