CN116429870A - 一种消除成像质谱流式灵敏度差异的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种成像质谱流式的信号校准方法,其通过标准品信号对样本信号进行正反两次线性回归:首先选择一个样本作为标准样本,并根据其玻片上的标准品建立第一标准曲线及第一回归模型,然后根据待校准样本玻片上的标准品建立第二标准曲线及第二回归模型,然后采用第一分辨率扫描所述待校准样本,对得到的原始信号值进行log处理,并输入所述第二回归模型,以得到待校准样本的每个像素的实际金属含量,最后通过第一回归模型将每个像素的实际金属含量转化为校准信号值,完成数据的校准,进而消除仪器灵敏度波动带来的影响。
Description
技术领域
本发明涉及多通道成像技术,特别涉及一种成像质谱流式的信号校准方法。
背景技术
成像质谱流式(Imaging Mass Cytometry)是一个组织多通道成像技术平台。其利用金属标签抗体标记组织样本形成组织切片,然后通过激光逐点扫描采样后,送入电感耦合等离子体质谱(ICP-mass)主机中进行元素分析,从而得到所检测区域金属标签的分布信息,重构出同一视野几十个通道的图像。相较于其他基于荧光的组织成像技术而言,成像质谱流式具有通道多、无串色、不受组织背景荧光干扰等优势,因此目前已经在肿瘤、I型糖尿病及一些感染性疾病的组织微环境的研究中发挥重要的作用。
但是,由于环境及采样锥相关部件的氧化等因素的综合影响,成像质谱流式的灵敏度会发生波动,直接影响所检测的信号的强度,进而会对数据的一致性以及后续的生信数据分析会产生一定影响。为了获取更为准确地数据分析结果,如何消除仪器灵敏度波动所造成的影响至关重要。
发明内容
为了消除仪器灵敏度波动对样本信号的影响,本发明提供一种成像质谱流式的信号校准方法,通过标准品信号对样本信号进行校准,所述信号校准方法包括:
选择一个样本作为标准样本,并根据其上的标准品建立第一标准曲线;
根据所述第一标准曲线建立第一回归模型,其中所述第一回归模型用于将实际金属含量转化为信号值;
根据待校准样本上的标准品建立第二标准曲线;根据所述第二标准曲线建立第二回归模型,其中所述第二回归模型用于将经过log处理的原始信号值转化为实际金属含量;
扫描待校准样本,并根据所述第二回归模型计算得到所述待校准样本的每个像素实际金属含量;
通过第一回归模型将计算得到的每个像素实际金属含量转化为校准信号值,完成数据的校准。
进一步地,所述第一标准曲线和/或第二标准曲线的建立包括:
对样本玻片上的标准品划定扫描区域;以及
扫描所述标准品感兴趣区域,以建立标准曲线,其中所述样本玻片上包括至少三个标准品。
进一步地,扫描所述标准品感兴趣区域所采用的分辨率低于扫描待校准样本的分辨率。
进一步地,所述方法还包括根据样本区域和标准品区域的氩二聚体、或氙、或碘元素的信号比值变化,消除样本区域内部以及样本区域和标准品区域之间的灵敏度差异。
进一步地,所述标准品包括一种或多种包含镧系金属的卤化物和/或可溶性盐,且所述标准品的原子量覆盖139至176镧系元素范围。
进一步地,所述标准品包括氯化铈、硝酸钐、氯化钬、以及氯化镥。
进一步地,所述标准品通过如下步骤设置于样本的玻片上:
形成多个不同浓度的标准品稀释液;
将所述多个标准品稀释液分别与指定浓度的台盼蓝混合,得到多种工作液;
对玻片的局部进行加热;以及
指定时长后,将指定量的多种工作液分别点至玻片的加热处。
进一步地,所述标准品稀释液的形成包括:
采用指定浓度的稀盐酸对金属盐进行稀释。
进一步地,所述稀盐酸的浓度为0.01M,所述标准品稀释液的浓度在10-4M至10-8M之间。
进一步地,所述标准品稀释液有三个,所述三个标准品稀释液的浓度分别为:10- 6M、10-7M以及10-8M。
进一步地,所述台盼蓝的浓度为0.5%,其与所述标准品稀释液1:1混合。
进一步地,对玻片的局部进行加热包括:
通过加热模块对玻片上需要设置标准品的部位进行加热。
进一步地,所述加热模块的加热范围为40摄氏度至70摄氏度。
本发明提供的一种成像质谱流式的信号校准方法,将含有一系列镧系金属的标准溶液点在样本一侧作为标准品。仪器在检测样本前,先扫描标准品区域,然后再对样本进行扫描。由于标准品区域含有的金属含量是固定的,其信号强度会随着仪器灵敏度而变化,因此可以利用标准品的信号,对样本的信号进行校准,进而消除仪器灵敏度波动带来的影响。所述信号校准方法还通过标准样本对待校准样本进行正反两次线性回归,进而进一步地消除仪器灵敏度波动带来的影响。
附图说明
为进一步阐明本发明的各实施例的以上和其它优点和特征,将参考附图来呈现本发明的各实施例的更具体的描述。可以理解,这些附图只描绘本发明的典型实施例,因此将不被认为是对其范围的限制。在附图中,为了清楚明了,相同或相应的部件将用相同或类似的标记表示。
图1示出本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法的流程示意图;
图2示出本发明一个实施例的对玻片进行局部加热的示意图;
图3a、3b分别示出采用成像质谱流式在不同灵敏度下扫描得到的图像示意图;
图3c、3d分别示出采用本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法对图3a、3b进行信号校准后的示意图;
图3e示出图3a至3d的统计数据示意图;
图4a、4b分别示出采用本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法对某一组织区域图像进行校准前后的示意图;
图5a、5b分别示出采用本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法对又一组织区域图像进行校准前后的示意图;
图5c、5d分别示出图5a、5b对应的tsne降维分析的示意图;
图6a示出本发明一个实施例中样本区域氩二聚体信号变化情况;
图6b示出根据图6a所示的氩二聚体信号变化情况计算得到的各行的adj.factor;以及
图6c、6d分别示出采用本发明一个实施例的氩二聚体信号校准方法进行校准前后的HistoneH3的信号分布示意图。
具体实施方式
以下的描述中,参考各实施例对本发明进行描述。然而,本领域的技术人员将认识到可在没有一个或多个特定细节的情况下或者与其它替换和/或附加方法、材料或组件一起实施各实施例。在其它情形中,未示出或未详细描述公知的结构、材料或操作以免模糊本发明的发明点。类似地,为了解释的目的,阐述了特定数量、材料和配置,以便提供对本发明的实施例的全面理解。然而,本发明并不限于这些特定细节。此外,应理解附图中示出的各实施例是说明性表示且不一定按正确比例绘制。
在本说明书中,对“一个实施例”或“该实施例”的引用意味着结合该实施例描述的特定特征、结构或特性被包括在本发明的至少一个实施例中。在本说明书各处中出现的短语“在一个实施例中”并不一定全部指代同一实施例。
需要说明的是,本发明的实施例以特定顺序对方法步骤进行描述,然而这只是为了阐述该具体实施例,而不是限定各步骤的先后顺序。相反,在本发明的不同实施例中,可根据实际需求的调节来调整各步骤的先后顺序。
针对现有的采用成像质谱流式进行组织多通道成像时,易受到仪器灵敏度变化影响的问题,本发明提供一种成像质谱流式的信号校准方法,利用标准品的信号,对样本的信号进行校准,消除仪器灵敏度波动带来的影响。
在本发明的实施例中,标准品是指含有一系列镧系金属的标准溶液,其点在样本的一侧,仪器在检测样本前,先以较低分辨率,例如5至10um扫描标准品区域,然后以正常的较高的分辨率,例如1um对样本进行扫描。由于标准品区域含有的金属含量是固定的,且其信号强度会随着仪器灵敏度而变化,因此可以利用标准品的信号,对样本的信号进行校准,进而消除仪器灵敏度波动带来的影响。在本发明的一个实施例中,所述标准品采样的template设置为:laser energy设为2,x-step和y-step均设置为10,选取从139至176之间的多有镧系金属通道,在扫描前,需要为每个标准品区域划定扫描区域,确保整个标准品区域被划入范围,在本发明的一个实施例中,扫描单个标准品的ROI区域耗时大约5分钟。
在本发明的一个实施例中,所述标准品是指稀释的金属盐,所述金属盐例如包括镧系金属,如铈Ce、钐Sm、钬Ho、镥Lu等其它与其化学性质相似的镧系金属,或包含镧、镨、钕、钷、铕、钆、铽、镝、铒、铥、镱等元素的卤化物、硝酸盐、醋酸盐或其他可溶性盐形式。在本发明的一个实施例中,所述金属盐的原子量应当覆盖139至176镧系元素范围,表1给出相关元素的同位素丰度,所述金属盐可根据表1进行选择。
表1
在本发明的一个实施例中,选取氯化铈、硝酸钐、氯化钬、及氯化镥作为标准品,在对所有金属盐精准称重后,采用0.01M的稀盐酸将其稀释成多份不同浓度的标准品稀释液,存储备用。在本发明的一个实施例中,所述标准品稀释液的浓度在10-4M至10-8M之间。在本发明的一个实施例中,采用了三个标准品,且各个标准品稀释液的浓度分别为10-6M、10-7M以及10-8M。
所述标准品稀释液还需进一步与指定浓度的台盼蓝按照预设比例混合,方可得到所需的标准溶液。在本发明的一个实施例中,是采用0.5%台盼蓝和不同浓度的标准品稀释液分别1:1混合,得到标准溶液。
在本发明的一个实施例中,将所述标准溶液点至样品一侧时,首先需要对样品切片的玻片进行预加热。图2示出本发明一个实施例的对玻片进行局部加热的示意图。如图2所示,在本发明的一个实施例中,通过加热模块对玻片上需要设置标准品的部位进行加热,具体而言,首先将加热模块预热至40摄氏度至70摄氏度范围内,优选地预热至60摄氏度,然后在加热模块的一侧设置等高的支持物,使得样本切片的一端,即需要点标准品的部位,搭在所述加热模块上实现局部加热,所述样本切片的另一端则搭在所述支持物上,以保持水平,加热指定时长后,依次吸取不同浓度的标准品溶液分别点在玻片上,在本发明的一个实施例中,所述指定时长为1分钟。在本发明的又一个实施例中,每个浓度的标准品去0.3ul点在玻片上,所述标准品溶液通常可在20秒内风干,形成一个直径约为1.3mm的圆形区域。为了消除样本区域内部以及样本区域和标准品区域之间的灵敏度差异,还可以根据样本区域和标准品区域的氩二聚体、或氙、或碘元素的信号比值变化来消除信号漂移(signaldrift)带来的影响。
在设置标准品的基础上,本发明还进一步地采用了正反两次线性回归实现信号校准,即首先通过一个回归模型将扫描得到的信号转换为金属含量,然后在通过另一回归模型将所述金属含量转换为校准信号,在本发明的一个实施例中,将两个回归模型分别记为第一回归模型Model R及第二回归模型Model F,其中所述第一回归模型Model R用于将金属含量转换为信号值,以及第二回归模型Model F用于将信号值转换为金属含量。
下面结合实施例附图对本发明的方案做进一步描述。
图1示出本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法的流程示意图。如图1所示,一种成像质谱流式的信号校准方法,包括:
首先,在步骤101,建立第一回归模型。在本发明的一个实施例中,所述第一回归模型Model R通过标准样本来建立。具体而言,所述第一回归模型Model R的建立包括:
首先,选择一个样本作为标准样本,并对所述标准样本进行抗体和Ir染色,风干切片;
接下来,采样如前所述的方法,在所述标准样本的一侧设置多个标准品;以及
最后,根据所述标准品建立第一标准曲线,并建立从实际金属含量转化为信号值(count)的第一回归模型Model R;
接下来,在步骤102,建立第二回归模型。在本发明的一个实施例中,所述第二回归模型Model F通过待校准样本来建立。具体而言,所述第二回归模型Model F的建立包括:
首先,对所述待校准样本进行抗体和Ir染色,风干切片;
接下来,采样如前所述的方法,在所述待校准样本的一侧设置多个标准品;以及
最后,根据所述标准品建立第二标准曲线,并建立从经过log处理,即取对数操作后的原始信号值count转化为实际金属含量的第二回归模型Model F;
接下来,在步骤103,获取原始信号值。扫描待校准样本,得到原始信号值;
接下来,在步骤104,计算实际金属含量。对所述原始信号值进行log处理,并输入至所述第二回归模型,进而计算得到所述待校准样本的每个像素实际金属含量;在本发明的一个实施例中,在进行计算前,还对样本区域内部以及样本区域和标准品区域之间的灵敏度差异进行消除,具体而言,是首先计算样本各行的adj.factor,即该行氩二聚体、或氙、或碘元素的信号中位数和标准品区域的氩二聚体或氙、或碘元素信号的中位数的比值,然后将各通道的信号值逐行与所述adj.factor相除,以消除信号漂移(signal drift)带来的影响。图6a示出本发明一个实施例中样本区域氩二聚体信号变化情况,图6b示出根据图6a所示的氩二聚体信号变化情况计算得到的各行的adj.factor;以及图6c、6d分别示出采用本发明一个实施例的氩二聚体信号校准方法进行校准前后的HistoneH3的信号分布示意图,如图所示,校准前,在氩气二聚体信号切变的位置,即箭头所指处,可以看出明显的信号强度变化,而校准后图像信号分布变得均一,其中所述HistoneH3为一个核小体蛋白,其分布在细胞核;以及
最后,在步骤105,计算校准信号值。通过第一回归模型将计算得到的每个像素实际金属含量转化为校准信号值,所述校准信号值相当于采用与所述标准样本完全相同的灵敏度下检测到的数值,由此完成数据的标准化。
为了验证本发明提供的信号校准方法的效果,采用所述信号校准方法对不同的图像进行了校准。
图3a、3b分别示出采用成像质谱流式在不同灵敏度下扫描得到的图像示意图。其中,图3a为高灵敏度下扫描得到的图像,以及图3b为低灵敏度下扫描得到的图像,可以看出,在不同灵敏度下所得到的图像存在明显的信号差异。图3c、3d分别示出采用本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法对图3a、3b进行校准后的示意图,可以看出,经信号校准后,两个灵敏度下的监测数据基本相同。为了直观显示两者区别,图3e进一步地示出了图3a至3d的统计数据示意图,其中较深颜色的柱体显示出图3a及3b的统计数据,以及较浅颜色的柱体显示出图3c及3d的统计数据。具体而言,在图3e中分为左中右三个区域,分别显示根据图像统计得到Ce、Sm、Lu的含量值,在每个区域中,靠左侧的两个柱体显示的为图3a、3c,即高灵敏度下所获取图像对应的金属含量值,以及靠右侧的两个柱体显示的为图3b、3d,即低灵敏度下所获取图像对应的金属含量值。
图4a、4b分别示出采用本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法对某一组织区域(人体扁桃体)的图像进行校准前后的示意图,其中图4a的上部分为高灵敏度下扫描得到,以及下部分在低灵敏度下扫描得到,可以看出,下半部分明显较弱,而信号校准以后,如图4b所示,上下两部分已没有明显区分,显著改善了组织图片的可比性。
图5a、5b分别示出采用本发明一个实施例的一种成像质谱流式的信号校准方法对又一组织区域进行校准前后的示意图,以及图5c、5d分别示出图5a、5b对应的tsne降维分析的示意图。其中图5a的上部分为低灵敏度下扫描得到,以及下部分在高灵敏度下扫描得到,可以看出,两个区域的信号有显著差异,这一点从图5ctsne降维分析图中可以明显看出上面低灵敏度区域细胞集中分布在一处,说明其与其他区域的细胞存在较明显的表型差异。而进行信号校准后,如图5b、5d所示,该区域的细胞分布融合入大群中,灵敏度的影响基本消除了,显著减少了灵敏度差异对生信分析结果的影响。
尽管上文描述了本发明的各实施例,但是,应该理解,它们只是作为示例来呈现的,而不作为限制。对于相关领域的技术人员显而易见的是,可以对其做出各种组合、变型和改变而不背离本发明的精神和范围。因此,此处所公开的本发明的宽度和范围不应被上述所公开的示例性实施例所限制,而应当仅根据所附权利要求书及其等同替换来定义。
Claims (10)
1.一种消除成像质谱流式灵敏度差异的方法,其特征在于,包括步骤:
逐行计算样本的氩二聚体、或氙、或碘元素的信号中位数,得到第一数值;
逐行计算所述样本上的标准品区域的氩二聚体或氙、或碘元素的信号的中位数,得到第二数值;
逐行计算所述第一数值与第二数值的比值;以及
将各通道的信号值逐行与所述比值相除,以消除各通道信号值的灵敏度差异。
2.如权利要求1所述的方法,其特征在于,还包括:
扫描待测量样本,得到原始信号值;
对消除灵敏度差异后的信号值进行log处理,并输入第二回归模型,以得到所述待测量样本的每个像素的实际金属含量;以及
通过第一回归模型将所述每个像素的实际金属含量转化为测量信号值。
3.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述第一回归模型根据如下步骤建立:
选择一个样本作为标准样本,并对所述标准样本进行抗体及Ir染色,风干切片;
在所述标准样本的一侧设置多个标准品;以及
根据所述标准品建立第一标准曲线,并建立从实际金属含量转化为信号值的第一回归模型。
4.如权利要求2所述的方法,其特征在于,所述第二回归模型根据如下步骤建立:
对所述待测量样本进行抗体及Ir染色,风干切片;
在所述待测量样本的一侧设置多个标准品;以及
根据所述标准品建立第二标准曲线,并建立从经过取对数操作后的原始信号值转化为实际金属含量的第二回归模型。
5.如权利要求3或4所述的方法,其特征在于,所述标准品包括一种或多种包含镧系金属的卤化物和/或可溶性盐,且所述标准品的原子量覆盖139至176镧系元素范围。
6.如权利要求3或4所述的方法,其特征在于,所述标准品通过如下步骤设置于样本的玻片上:
采用指定浓度的稀盐酸对金属盐进行稀释,形成多个不同浓度的标准品稀释液;
将所述多个标准品稀释液分别与指定浓度的台盼蓝混合,得到多种工作液;
对玻片的局部进行加热;以及
指定时长后,将指定量的多种工作液分别点至玻片的加热处。
7.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述稀盐酸的浓度为0.01M,所述标准品稀释液的浓度在10-4M至10-8M之间。
8.如权利要求6所述的方法,其特征在于,所述台盼蓝的浓度为0.5%,其与所述标准品稀释液1:1混合。
9.如权利要求6所述的方法,其特征在于,对玻片的局部进行加热包括:
通过加热模块对玻片上需要设置标准品的部位进行加热。
10.如权利要求9所述的方法,其特征在于,所述加热模块的加热范围为40摄氏度至70摄氏度。
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