CN116425836A - A+多肽/蛋白质及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一系列氨基酸序列，包含所述氨基酸序列的多肽、蛋白质和组合物，编码所述氨基酸序列、多肽、蛋白和组合物的核酸序列，该组合物或其可药用盐在制备皮肤类产品中的应用。本发明所述的氨基酸序列由丙氨酸‑缬氨酸‑谷氨酸‑酪氨酸‑脯氨酸‑酪氨酸‑赖氨酸‑组氨酸‑丝氨酸‑甘氨酸‑酪氨酸‑酪氨酸‑组氨酸‑精氨酸组成。包含本发明所述氨基酸序列的产品，在抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘方面具有显著的疗效，且安全可靠、副作用小。

Description

A+多肽/蛋白质及其应用
技术领域
本发明属于生物医药和护肤品技术领域，具体涉及一系列氨基酸序列，包含所述氨基酸序列的多肽，蛋白和组合物，编码所述氨基酸序列、多肽、蛋白和组合物的核酸序列，以及包含所述氨基酸序列，多肽，蛋白，组合物或核酸序列的产品在皮肤病预防和治疗领域的应用。
技术背景
皮肤是人体最外在的器官，可反映机体的健康和衰老状况。皮肤衰老的发生被认为是内在和外在因素共同作用的结果。皮肤衰老往往表现为表皮变薄，真皮皱缩，厚度减少，胶原纤维变细甚至排列紊乱、断裂。在衰老过程中，细胞增殖能力下降是衰老的重要特征，衰老的细胞由于蛋白质合成能力下降、免疫系统相关基因表达失调等，往往表现为增殖能力下降的趋势。
皮脂膜为覆盖于皮肤表面的一层透明薄膜，主要由皮脂腺分泌的皮脂、角质层细胞崩解产生的脂质与汗腺分泌的汗液乳化形成，呈弱酸性，其主要成分角鲨烯、亚油酸、亚麻酸及脂质成分，具有锁住水分及一定的抗炎作用。皮肤屏障由皮脂膜、角质层角蛋白、脂质、"三明治"结构、砖墙结构、真皮粘多糖类、粘多糖类等共同构成，抵御外界有害、刺激物、日光进入，同时具有保湿及调节抗炎作用。皮肤屏障受损将引起皮肤干燥，皮肤老化、色素沉着、皮炎等。组织修复包括伤口愈合、皮肤屏障功能的修复等。皮肤屏障功能的恢复也有利于防治皮肤局部细菌感染，辅助治疗急慢性皮肤炎症，防止皮肤炎症的反复发作，包括脂溢性皮炎、糖激素依赖性皮炎、湿疹、特异性皮炎和银屑病等。
斑秃(alopecia areata，AA)是一种非瘢痕性脱发，我国流行病学调查显示男性雄激素性脱发患病率为21.3％，女性为6.0％。斑秃通常情况下表现为突发的脱发斑，严重时可累及整个头皮，此时称为全秃(alopecia totalis，AT)，当累及包括腋毛、阴毛在内的全身所有毛发时，称为普秃(alopecia universalis，AU)，容易给患者的容貌和心理带来严重的影响。自身免疫功能异常或不稳定、神经精神因素被认为是重要相关因素。斑秃越早介入治疗，治愈几率越高。米诺地尔可促进皮肤血管扩张、改善局部血液循环、促进毛发生长，是一种治疗斑秃常见的外用药物。严重斑秃常用糖皮质激素，主要包括泼尼松龙、复方倍他米松等等，可以口服、外用或皮内注射。对于不适用糖皮质激素类药物的患者，可采用免疫抑制剂治疗，常见的药物有环孢素、甲氨蝶呤。糖皮质激素和免疫抑制剂副作用多。
雄性激素源性脱发(androgenetic alopecia，AGA)，又名雄激素性脱发，脂溢性脱发(Seborrheic alopecia，SA)，男性脱发或遗传性脱发，是一种雄激素依赖性的遗传性毛发脱落，男性脱发多呈马蹄形外观。脱发处皮肤光亮，毛孔缩小或残留少许细软毳毛。脱发的速度、范围和严重程度，受遗传和个体影响。女性多为发生于头顶的弥漫性脱发。雄激素性脱发的病因及发病机制尚不明确，一般认为雄激素及其受体在本病的发生中起关键作用。正常生理状态下，雄激素在体内对毛发的生长发育起一定的刺激促进作用，但在某些特定部位能诱导毛发脱失；睾酮是体内主要的雄激素，它经5α-还原酶转化为二氢睾酮，后者可引起终毛向毳毛转变，最终导致脱发。雄激素源性秃发是脱发性疾病难治的类型，该病的动物模型通常作为脱发性疾病的代表模型。米诺地尔是一种非特异性治疗脱发的药物，是FDA批准用于治疗脱发的一线外用药物，但使用过程中可能引起面部和四肢多毛症，停用后治疗效果逐渐消失。非那雄胺是一种Ⅱ型5α-还原酶选择性抑制剂，FDA批准口服非那雄胺用于治疗雄激素性脱发，可持续改善头发的生长情况，但非那雄胺存在引起性功能异常，精子一过性减少和男性乳房发育异常等不良反应，在动物实验中发现有致畸作用，故不宜用于小儿和育龄妇女。西咪替丁需连服5个月或更久，副作用为男性乳房发育、阳痿、性欲降低等。口服避孕药：主要有的索高诺酮、左炔诺孕酮(左旋甲基炔诺孕酮)、炔诺孕酮、炔诺酮、诺孕酯(肟炔诺酯)、双酯炔诺醇和醋炔诺酮等，常用来治疗女性AGA，治疗6～12个月后头发会有所改善。
抗肿瘤药物引起的脱发是最常见的生长期秃发，抗肿瘤药物在消除迅速分裂的癌细胞的同时，也攻击毛囊四周迅速分裂的细胞引起脱发。以上脱发治疗较困难，容易反复。因此，需要寻找更多安全、有效的治疗脱发的产品。
痤疮(acne)俗称青春豆，是好发于毛囊皮脂腺的慢性炎症性疾病，发病率约9.4％，于青春期多见。临床表现主要有粉刺、丘疹、脓疱、结节、囊肿、疤痕等，愈合时间长，给患者的容貌和心理带来严重的影响。痤疮与多个发病机制相关，毛囊口角化异常是本病发病的重要基础，炎症和感染是痤疮的发病因素。痤疮患者的皮脂腺较大，皮脂腺分泌增加，皮脂中亚油酸水平相对减少，影响脂肪的合成，导致滤泡上皮缺乏脂肪酸，从而诱导滤泡过度角化，使上皮细胞不能正常脱落，毛囊皮脂腺口过度变小，皮脂不能顺畅排出，形成粉刺，继发感染形成丘疹、脓疱、结节、囊肿、疤痕等。
目前人们已经发现和分离出一百多种存在于人体的肽和蛋白，对维护细胞、组织及器官的正常生理功能有着重要作用，被广泛的应用于医学材料及药物方面、美容化妆品、保健品以及各种实用工业中。但是对上诉问题效果好、安全的产品很少，已有的产品远不能满足临床需求，因此需要寻找更多疗效好、副作用少、价格便宜的新产品来控制疾病进展，减少复发和并发症。
人体内含有多种胶原蛋白，占人体蛋白质总量的1/3，负责人体机能的正常运转。皮肤是人体最大的器官，其中真皮层里80％都是胶原蛋白，主要是I型和Ⅲ型胶原蛋白。随着年龄增加胶原总量呈下降趋势，现代医学证明，衰老本质是柔软富有弹性的Ⅲ型胶原蛋白持续加速流失，且成年后无法自体再生。因此皮肤弹性下降、松弛、修复效果降低、是人皮肤衰老的原因之一。三型胶原蛋白具有促进细胞增生、增加细胞活性、帮助机体修复老化受损皮肤，起到抗衰老、修复创口的作用。Ⅲ型重组人源胶原蛋白为非动物源、有三级结构、是具高活性的胶原蛋白，具备全人源、水溶性强、高生物活性、透皮吸收率高等特点，通过利用其网状高聚结构和亲水特性，可有效补充真皮层缺损的胶原蛋白，填补修复皮肤屏障，修复肌肤内受损的弹性纤维，促进组织细胞再生，同时屏蔽外来有害物质的作用，实现深度肌肤屏障修复。
发明内容
针对所述问题，本发明披露了具有多种功效的氨基酸序列，利用DNA重组技术结合生物合成技术生产的多肽或重组胶原蛋白，很好保证了多肽/蛋白的生物活性，同时增强了多方面的功效。不仅保障医学应用安全，而且在生物相容性、生物吸收性、细胞黏附性上具有更稳定的表现。
为实现所述目的，本申请采用了以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种氨基酸序列，所述氨基酸序列为含有第一序列的氨基酸序列、片段或或其突变体。
进一步地，所述第一序列包括SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1至少70％同源的且功能相同或相似的延伸序列。
进一步地，所述SEQ ID NO.1为AVEYPYKHSGYYHR。
进一步地，所述同源是指在原序列基础上增加、减少或改变至少一个氨基酸。
进一步地，所述延伸序列包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ IDNO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10或者与前述任意一个延伸序列至少70％同源的且功能相同或相似的序列、片段或突变体，
SEQ ID NO.2：AVEFPFKWSGYYHR；
SEQ ID NO.3：EYPYKHSGYYHRA；
SEQ ID NO.4：AVEYTYNGAGYYHR；
SEQ ID NO.5：EYTYKGSGYYHRAV；
SEQ ID NO.6：AVEYTYIGAGYYHR；
SEQ ID NO.7：AVEYPWKGSGYYHRP；
SEQ ID NO.8：AVEYTFKHSGYYHRP；
SEQ ID NO.9：AVEYPYDYSGYYHRP；
SEQ ID NO.10：AVEYTYEGAGYYHRP。
进一步地，所述突变体具有与所述氨基酸序列(例如，SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9或SEQ IDNO.10)或其片段具有至少70％同源，例如该突变体为与所述氨基酸序列至少70％,71％,72％,73％,74％,75％,76％,77％,78％,79％,80％,81％,82％,83％,84％,85％,86％,87％,88％,89％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,或至少99％同源的氨基酸序列。
第二方面，本发明提出一种产品。
进一步地，所述产品包括所述任意一个氨基酸序列，例如，SEQ ID NO.1、SEQ IDNO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ IDNO.10。
进一步地，所述产品为多肽或蛋白质。
进一步地，所述多肽为A+多肽，所述蛋白为A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
进一步地，在多肽包含氨基酸序列(例如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10)的情况中，其可包含超出参照序列的在其N和/或C端的额外氨基酸，例如多肽可以包含在其N端的额外氨基酸。同样地，在多肽包含依照参照序列的氨基酸序列的片段、突变体或衍生物的情况中，其可包含在其N和/或C端的额外氨基酸。
进一步地，所述多肽可以包含依照参照序列的氨基酸序列的突变体或所述突变体的片段或由所述突变体或所述突变体的片段组成，而此类突变体可以是非天然存在的。
进一步地，所述多肽或蛋白质还包含免疫球蛋白。
第三方面，本发明提出一种核酸序列。
进一步地，所述核酸序列编码SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9及SEQ ID NO.10中任意一项所述的氨基酸序列，或编码所述多肽或蛋白质。
第四方面，本发明提出一种组合物。
进一步地，所述组合物包括如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ IDNO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，所述多肽，所述蛋白质，所述核酸序列，所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列的衍生物或其可药用盐。
进一步地，所述衍生物为对于多肽中的氢原子、羟基、羧基、亚氨基用能够取代的公知的取代基取代而成。作为可用盐，没有特别限定，可列举出例如与无机碱的盐、与有机碱的盐、与无机酸的盐、与有机酸的盐、与碱性、中性或酸性氨基酸的盐等。
本发明所述的多肽或蛋白质制备方法可以采用现有技术常用的方法，如公知的化学合成法或生物合成法或遗传工程学的合成法等。优选地，本发明所述多肽或蛋白质的合成方法属于基于基因工程技术的生物合成法，包括在适于表达编码所述多肽的核酸的条件下的原核或真核的宿主细胞，由宿主细胞回收所述多肽或蛋白质，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。
进一步地，所述组合物以所述氨基酸序列SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10，所述多肽，所述蛋白质，所述核酸序列，所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列突变体、所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列融合物、所述氨基酸序列/多肽/蛋白质/核酸序列衍生物或其可药用盐为活性成分或主要活性成分，辅以药学上可接受的载体。
进一步地，所述药学上可接受的载体选自水、生理盐水、生理上可匹配的缓冲液、生理上可匹配的溶液和生理上可匹配的悬浮液中的至少一种。
进一步地，所述多肽的“突变体”包括插入、缺失和取代，其或是保守的或是非保守的。保守取代指将相同通用类别(例如酸性氨基酸、碱性氨基酸、非极性氨基酸、极性氨基酸或芳香族氨基酸)内的氨基酸用相同类别内的另一种氨基酸的取代。保守氨基酸取代和非保守氨基酸取代的意义是本领域中公知的。
进一步地，所述的多肽或蛋白质或组合物可制备为溶液、酊剂、醑剂、搽剂、喷雾剂、乳剂、膏剂、凝胶剂、贴剂、水剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂、注射剂或其他药用剂型。
进一步地，所述的多肽或蛋白质或组合物可单独使用，也可与一种或多种产品组合使用。
第五方面，本发明提出一种制备所述多肽或蛋白质的方法。
进一步地，所述方法包括：培养宿主细胞，后从所述宿主细胞回收所述多肽或蛋白质，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。
第六方面，本发明提出所述氨基酸序列，多肽，蛋白质，核酸序列及组合物在制备皮肤类产品中的应用。
进一步地，所述产品包括但不限于药品、医疗器械、保健品或护肤品。
进一步地，所述产品的用途包括但不限于抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘产品。
本发明所述的多肽或蛋白质或组合物可制备为药学上允许的任何剂型，例如为适于皮肤外用、口服、肠胃外、腹膜内、静脉内、动脉内、透皮、舌下、肌内、直肠、透颊、鼻内、吸入、阴道、眼内、局部、皮下、脂肪内、关节内、腹膜内或鞘内任意给药方式的制剂。
在一种优选的实施方式中，本发明所述多肽或蛋白质或组合物的剂型为溶液、酊剂、醑剂、搽剂、喷雾剂、乳剂、膏剂、凝胶剂、贴剂、水剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂或注射剂。
第七方面，本发明提出一种用于治疗或预防皮肤病的方法。
进一步地，所述方法包括施用治疗有效量的包含所述氨基酸序列，多肽，蛋白或组合物的产品。
进一步地，所述皮肤病包括但不限于皮肤衰老、皮肤炎症、皮肤损伤、脱发、斑秃和痤疮。
进一步地，所述产品的施用对象是人。
本发明所指的A+多肽，是指包含但不限于如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ IDNO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，其片段或其突变体的多肽。
本发明所指的A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白，是指包含但不限于如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQID NO.8、SEQ IDNO.9或SEQ ID NO.10所示的氨基酸序列，其片段或其突变体的重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
与现有技术相对比，本申请具有以下优点：
(1)本发明所述的氨基酸序列或其突变体，能显著修复皮肤屏障，在抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘等方面效果显著，且安全、副作用小。
(2)包括该氨基酸序列的系列A+多肽生物活性高，同时具有较好的抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘等多种功效，优于目前所知的绝大多数多肽/蛋白产品，安全、稳定、生物相容性好、生产成本不高，尤其适用于功效性护肤品原料领域，适合生产出多种功效性护肤品，可以长期使用。
(3)重组蛋白显著提高功效：A+多肽与人胶原蛋白合成体系相融，采用基因工程技术，通过生物法合成的A+重组Ⅲ型胶原蛋白能够明显增强系列A+多肽的功效，包括但不限于抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘等，A+重组人Ⅲ型胶原蛋白增加了较好的抗炎和生发功能(迄今未见其他重组人胶原蛋白报道有此功效)，达到了1+1＞2的效果，而且安全性好。
(4)质量可控：重组人源Ⅲ型胶原蛋白的纯化方法通过在温度为65～75℃条件下热处理，由具有表达出重组人源Ⅲ型胶原蛋白能力的重组酵母菌发酵得到的发酵液,有效地防止了发酵液中的重组人源Ⅲ型胶原蛋白降解成小分子肽,并降低发酵液中内毒素的产生,大大提高了重组人源Ⅲ型胶原蛋白纯度。基因工程技术可表达特定分子量的类人胶原片段，批次之间重复性好，而从动物提取的胶原蛋白通常为不同种类胶原蛋白的混合产物，批次之间差异大，不利于质量控制；化学合成不能保证多肽/蛋白的生物活性。
(5)较低的排异反应：类人胶原蛋白以人体胶原蛋白基因为基础构建，其免疫排异反应比动物来源的胶原蛋白小。
附图说明
图1SDS-PAGE检测A+重组胶原蛋白工程菌的表达情况。泳道1：诱导前；泳道2-4：3种不同重组胶原蛋白工程菌表达情况(稀释2倍)。
图2SDS-PAGE检测A+多肽3重组胶原蛋白表达形式，泳道1：表达全菌；泳道2：超声破碎上清液；泳道3：超声破碎沉淀。
图3SDS-PAGE检测A+多肽3重组胶原蛋白纯化结果，泳道1：纯化流穿液；泳道2：纯化后(10倍稀释)；泳道3：纯化后(20倍稀释)。
图4具有代表性的A+多肽的氢谱分析结果。
图5培养72h样品孔镜下观察A+多肽3试验组3T3细胞较0h细胞增多(100×)。
图6培养72h样品孔镜下观察阴性对照组3T3细胞较0h细胞大部分死亡(100×)。
图7空白对照组(NC)、纤连蛋白组(FN)和各实验组0h和24h细胞迁移情况(40×)：显示FN组细胞迁移率为100％，A+多肽3重组胶原蛋白组、A+多肽1组和A+多肽3组细胞迁移率均较空白对照组明显增高，A+多肽3重组胶原蛋白组细胞迁移率明显高于Ⅲ型胶原蛋白组。
图8建模第45天各组小鼠的毛发生长情况，A+多肽3重组胶原蛋白组、A+多肽1和A+多肽3组比较模型组毛发生长更快，与阴性对照比较无显著差异；A+多肽3重组胶原蛋白组毛发生长明显快于胶原蛋白组。
图9免疫组化结果显示模型组皮肤毛囊中VEGF蛋白表达减少，比较模型组，A+多肽3重组胶原蛋白组、A+多肽1组、A+多肽2组、A+多肽3组、A+多肽4组、A+多肽5组、A+多肽6组和A+多肽7组VEGF蛋白表达明显增加，与阴性对照比较无显著差异；A+多肽3重组胶原蛋白组VEGF蛋白表达明显高于胶原蛋白组。
图10某痤疮患者接受0.5％A+多肽3溶液治疗8周后红斑、丘疹、粉刺好转。
图11某中度痤疮患者接受0.5％A+多肽重组胶原蛋白溶液治疗8周后丘疹、脓疱、粉刺明显好转。
具体实施方式
为了进一步了解本申请，下面结合最佳实施例对本申请作进一步的详细说明。
以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。
如无特别说明，本发明实施例中的实验方法，均为常规方法。
如无特别说明，本发明所用的试验材料，均为自常规生化试剂商店购买得到的。
如无特别说明，本发明所用制剂配方中的百分比均为重量百分比。
实施例1制备A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白的方法
1.材料
E.coli DH5α感受态细胞、BL21(DE3.0)感受态细胞、BALB/c3T3细胞；质粒由通用生物公司合成；发酵培养基购自OXOID公司。
2.设备与仪器
-80℃超低温冰箱、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、高压灭菌锅、核酸电泳仪、蛋白质电泳仪、金属浴、PCR仪、水浴锅、凝胶成像仪、台式离心机、冷冻离心机、高压均质仪、GE纯化仪、制冰机、台式离心机、二氧化碳培养箱等。
3方法
3.1目的基因的获取
合成目的基因并获得表达质粒和工程菌：根据Col3A1多肽序列，在羧基端分别添加A+多肽1的氨基酸序列：AVEYPYKHSGYYHR，或A+多肽2的氨基酸序列：AVEFPFKWSGYYHR，或A+多肽3的氨基酸序列：EYPYKHSGYYHRAV。以大肠杆菌为原核表达系统，构建工程菌。目的基因送公司进行优化合成并连接相应表达质粒。
3.2表达工程菌构建
将重组质粒分别转化到E.coli DH5α感受态细胞中，经抗性筛选后挑取阳性转化子进行培养。再提取质粒进行测序。测序无误证明成功获得表达质粒。
3.3工程菌形态、生长特性鉴定
对工程菌进行革兰氏染色镜检，结果呈红色杆菌形态，大小约为0.3μm×1.0μm左右。工程菌能在含有相应抗性的LB平板上正常生长，37℃培养24h，形成圆形、边缘整齐、突起、乳白色有光泽的光滑菌落，呈典型大肠埃希菌落形态。
3.4表达量及表达形式的鉴定
菌种用LB培养基复壮，经37℃扩大培养后，以终浓度为1Mm IPTG、30℃培养诱导5h。收集菌体后进行超声破碎、离心，分别留取破碎后的菌体、离心后的上清和沉淀做SDS-PAGE电泳分析，并用软件分析目的蛋白表达水平。
3.5蛋白纯化
离心收集培养液上清，用0.22μm滤膜过滤用以上样。使用GE Healthcare公司Chelating Sepharose TM FastFlow镍离子螯合亲和层析填料自行装柱，用3个柱体积的纯化水清洗Ni2+螯合亲和层析柱，再用PBS平衡2-3个柱体积。在线检测电导率值及280nm波长吸收值，待两者都稳定后开始上样，设置样品经过泵过层析柱的流速5-6ml/min。再用PBS过层析柱，洗去未与层析柱结合的杂蛋白，直到OD280nm稳定。再以含500Mm咪唑PBS缓冲液过层析柱，梯度洗脱并收集洗脱峰对应的蛋白。
4.结果
4.1A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白工程菌表达鉴定
挑取多个单菌落，培养、转接，诱导表达。经SDS-PAGE电泳检测相应优势表达条带，说明工程菌成功表达(见图1)。超声破碎后，分别取破碎全菌、上清和沉淀，检测结果显示90％为上清表达(见图2)。
4.2表达与纯化
发酵2L，诱导表达。收集菌体，经高压均质，离心收集上清液。过滤，经亲和层析纯化可得到纯度大于95％的目的A+重组人源Ⅲ型胶原蛋白(见图3)。
成功构建A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白工程菌，成功诱导表达A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白。经表达形式检测，目的A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白为上清表达，纯度大于95％。
实施例2A+多肽对皮肤成纤维细胞增殖的影响
1.材料
BALB/C 3T3细胞株；
A+多肽系列和DZ多肽系列：由上海生工合成，纯度大于95％。系列A+多肽氨基酸序列如上述发明内容中所示，具有代表性的A+多肽氢谱分析结果如图4所示。系列DZ多肽氨基酸序列如下：DZ多肽1：EYPYKHSGYYHR，DZ多肽2：EYTYEGAGYYHRP，DZ多肽3：EYTYNGAGYYHR，DZ多肽4：EYTYKGSGYYHR，DZ多肽5：EYPWKGSGYYHRP，DZ多肽6：EYTFKHSGYYHRP，DZ多肽7：EYPYDYSGYYHRP，DZ多肽8：EFPFKWSGYYHR，在以下实验中作为实验对照组；A+多肽1重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白1)和A+多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白3)：由实施例1所示方法合成；人源Ⅲ型胶原蛋白(同实施例1所示)；A醇：又名视黄醇(南京中益旭元生物科技公司生产)；纤连蛋白：武汉艾美捷科技有限公司生产。
2.方法
在体外功效模型中，成纤维细胞增殖实验属于较成熟且有效的体外评测皮肤抗皱紧致功效的手段。本发明中设计的试验通过促进3T3细胞的增殖试验，来检测包含所属A+多肽对细胞的增值促进效果。A醇(视黄醇)是目前国家药监局批准的护肤品可添加成份目录中公认抗衰效果好的成分，在本实验中作为阳性对照。
MTT比色法测定促皮肤成纤维细胞增殖活性。
3.结果
在DMEM培养基条件下培养成纤维细胞BALB/C 3T3细胞株，72h检测细胞活性。阴性对照孔细胞仅有极少数细胞存活，而A+多肽组的细胞数量增多，见图5和6。检测系列A+多肽、系列DZ多肽、人源Ⅲ型胶原蛋白和A+重组胶原蛋白和实验组OD值结果如表1所示。细胞增殖活性结果如下表2所示。可见系列A+多肽、系列DZ多肽、人源Ⅲ型胶原蛋白和A+重组胶原蛋白实验组的OD值和细胞增殖活性均高于阴性对照组，有统计学差异(P均＜0.01)；系列A+多肽实验组的OD值和细胞增殖活性均高于系列DZ多肽组，有统计学差异(P均＜0.05)。A+重组胶原蛋白组高于人源Ⅲ型胶原蛋白组，有统计学差异(P＜0.01)。纤连蛋白组与阴性对照组比较无统计学差异。
Figure BDA0004004401920000111
Figure BDA0004004401920000121
表1各组OD值检测结果
样品组别 工作效价(U/ml) 比活(U/mg)
阴性对照(NC) 0 0
A醇(阳性对照) 164 5248
纤连蛋白 1265 152
A+多肽1号 215 3526
A+多肽2号 192 3368
A+多肽3号 186 3612
A+多肽4号 326 3268
A+多肽5号 312 3287
A+多肽6号 283 3016
A+多肽7号 265 2967
A+多肽8号 207 3146
A+多肽9号 226 3265
A+多肽10号 169 2876
A+重组胶原蛋白1 1018 5498
A+重组胶原蛋白3 1126 5636
Ⅲ型胶原蛋白 886 1378
DZ多肽1 320 1836
DZ多肽2 336 2236
DZ多肽3 347 1832
DZ多肽4 382 2187
DZ多肽5 318 2062
DZ多肽6 342 1735
DZ多肽7 328 2139
DZ多肽8 319 2265
表2各组细胞增殖活性效价测定结果
所述一系列A+多肽、DZ多肽和A+多肽重组胶原蛋白均能抑制成纤维细胞衰老，促进成纤维细胞增殖，具有抗衰的作用，系列A+多肽抑制成纤维细胞衰老，促进成纤维细胞增殖明显好于系列DZ多肽；A+多肽与Ⅲ型胶原蛋白重组结合能明显提高抗衰作用；纤连蛋白几乎没有促进成纤维细胞增殖的作用。
实验结果表明，本发明公开的一系列A+多肽和A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白均具有较强促进成纤维细胞增殖作用，A+多肽和人源Ⅲ型胶原蛋白结合能明显提高对成纤维细胞的增殖作用，具有抗衰抗皱紧致作用。
实施例3A+多肽对体外细胞划痕修复的作用
1.材料
供试品：纤连蛋白(FN)：武汉艾美捷科技有限公司生产；A醇：又名视黄醇(南京中益旭元生物科技公司生产)；系列A+多肽和系列DZ多肽：由上海生工合成，纯度大于95％。系列A+多肽氨基酸序列如上述发明内容中所示，具有代表性的A+多肽氢谱分析结果如图4所示；系列DZ多肽氨基酸序列如实施例2所示，在以下实验中作为实验对照组；A+多肽1重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白1)和A+多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白3)：由实施例1所示方法合成；人源Ⅲ型胶原蛋白(同实施例1所示)。
细胞株：Balb/c 3T3细胞，购自美国ATCC。
其他试剂：细胞营养液、无血清培养基、PBS、0.25％胰蛋白酶
其他物品：96孔细胞培养板、TIP头和微量移液器，试验前进行灭菌或过滤除菌处理。
2.方法
(1)用Marker笔在6孔板背后，用直尺对齐，均匀得划横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。
(2)向6孔板孔中加入浓度为5×105个/ml的细胞悬液2ml。
(3)第二天观察到6孔板内细胞均长满单层，用枪头比着直尺，垂直于背后的横线划痕，每孔内划2道。
(4)用PBS洗细胞3次，洗掉划下的悬浮细胞。
(5)根据分组往孔中加入1.8ml无血清培养液，之后加入200μl的样品，细胞对照孔加入等量的PBS溶液。
(6)放入37度5％CO2培养箱，培养。0时拍照，记录每孔内拍照位置。后续观察时对固定位置进行观察、拍照。
3.结果
细胞对照孔与各个样品孔0h与24h观察结果如图7所示。
数据处理：面积检测方法(划痕距离测量为等效测量)
划痕宽度平均值＝划痕空隙面积/长度
细胞迁移率＝(0h划痕宽度-培养后划痕宽度)/0h划痕宽度×100％
由此计算出体外促细胞迁移率(见表3)，可见系列A+多肽、系列DZ多肽、人源Ⅲ型胶原蛋白、A+重组胶原蛋白1和A+重组胶原蛋白3实验组Balb/c 3T3细胞迁移率均高于阴性对照组，比较有统计学差异(P均＜0.01)。A醇Balb/c 3T3细胞迁移率与阴性对照组比较没有统计学差异。系列A+多肽高于系列DZ多肽组，有统计学差异(P＜0.05)。A+多肽重组胶原蛋白组高于Ⅲ型胶原蛋白组，有统计学差异(P＜0.01)。
样品 含量(mg/ml) 迁移率(％)
纤连蛋白(FN) 0.5 100
阴性对照(NC) 0 0
A醇 0.5 0
A+多肽1 0.5 53.60
A+多肽2 0.5 48.65
A+多肽3 0.5 62.36
A+多肽4 0.5 45.61
A+多肽5 0.5 49.38
A+多肽6 0.5 53.57
A+多肽7 0.5 57.46
A+多肽8 0.5 51.29
A+多肽9 0.5 58.43
A+多肽10 0.5 61.28
A+重组胶原蛋白1 0.7 91.68
A+重组胶原蛋白3 0.7 95.72
Ⅲ型胶原蛋白 0.6 46.70
DZ多肽1 0.5 26.23
DZ多肽2 0.5 25.63
DZ多肽3 0.5 26.45
DZ多肽4 0.5 25.83
DZ多肽5 0.5 27.28
DZ多肽6 0.5 28.36
DZ多肽7 0.5 22.27
DZ多肽8 0.5 23.68
表3各组细胞迁移率
在体外功效模型中，成纤维细胞迁移或移行实验属于较成熟有效的体外评测组织修复和重建功能的手段。纤连蛋白具有较强的促细胞迁移和组织修复功效，在本实验中作为阳性对照。基于体外细胞划痕修复实验模型，检测A+多肽是否有利于细胞的识别、移行，从而起到组织修复和重建的功效。当细胞长到融合成单层状态时，在融合的单层细胞上人为制造一个空白区域，称为“划痕”。划痕边缘的细胞会逐渐进入空白区域使“划痕”愈合。在细胞迁移过程中的开始时和定期捕获图像，通过比较图像以确定细胞迁移速率。
实验结果表明系列A+多肽和A+多肽重组人源Ⅲ型胶原蛋白均具有促进成纤维细胞迁移能力，A+多肽和人源Ⅲ型胶原蛋白结合能明显提高组织修复功能。
实施例4A+系列多肽对小鼠耳部炎症模型的影响
1.材料
系列A+多肽和系列DZ多肽：由上海生工合成，纯度大于95％。系列A+多肽氨基酸序列如上述发明内容中所示，具有代表性的A+多肽氢谱分析结果如图4所示。系列DZ多肽氨基酸序列如实施例2所示，在以下实验中作为实验对照组。
A+多肽1重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白1)和A+多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白3)：由实施例1所示方法合成；人源Ⅲ型胶原蛋白(同实施例1所示)。
纤连蛋白(FN)：武汉艾美捷科技有限公司生产。
卵清蛋白(OVA)：PBS配成20g/L，保存于-20℃。
卡泊三醇搽剂(达力士搽剂)：丹麦利奥制药有限公司产品。
阳性药：糠酸莫米松乳膏(艾洛松)，上海先灵葆雅制药有限公司产品。
IL-4ELISA试剂盒：购自美国Raybiotech公司。
PCSK9 ELISA试剂盒：美国R&D公司的Human Proprotein Convertase 9/PCSK9Quantikine ELISAKit试剂盒。
A+系列多肽乳膏和基质制备方法：基质组成成分包括甲基硅油(15％)、硬脂酸(6％)、白凡士林(5％)、液体石蜡(5％)、十八醇(5％)、甘油(20％)、烷基芳基聚乙醇醚(1％)、脂肪醇聚氧乙烯醚(1％)、吐温-80 7(1％)、尼泊金乙酯(0.1％)、蒸馏水(约31-55％)，与适量多肽溶液形成不同浓度的混合乳剂。本实施例所用的乳膏基质是指多肽乳膏除去活性成分的基质成分。
动物：SPF级健康纯系小鼠(C57BL/6)；8周龄。
2.方法
购SPF级雌性8周龄C57BL/6小鼠，随机分为阴性对照组、模型组、阳性对照组、A+重组胶原蛋白组1(皮肤涂抹0.25％A+多肽1重组Ⅲ型胶原蛋白乳膏)、A+重组胶原蛋白组3(皮肤涂抹0.25％A+多肽3重组Ⅲ型胶原蛋白乳膏)、胶原蛋白组(皮肤涂抹0.25％Ⅲ型胶原蛋白乳膏)、纤连蛋白组(皮肤涂抹0.25％纤连蛋白乳膏)、多肽组1(皮肤涂抹0.25％A+多肽1号乳膏)、多肽组2(皮肤涂抹0.25％A+多肽3号乳膏)、多肽组3(皮肤涂抹0.25％A+多肽5号乳膏)、多肽组4(皮肤涂抹0.25％A+多肽3号乳膏)、多肽组5(皮肤涂抹0.25％A+多肽5号乳膏)、多肽组5(皮肤涂抹0.25％A+多肽8号乳膏)、多肽组6(皮肤涂抹0.25％A+多肽9号乳膏)、多肽组7(皮肤涂抹0.25％A+多肽10号乳膏)，系列DZ多肽组(皮肤分别涂抹0.25％DZ多肽系列乳膏)，每组各6只。
造模：阴性对照组小鼠两侧耳部涂抹75％乙醇14.3ul，同时其余各组每日定时先在两侧耳部涂抹1nmoI/L卡泊三醇搽剂14.3ul，风干后涂抹20g/L的OVA25ul，每日1次，连续涂抹12d造模。
造模开始后4天起，在空白对照组和模型组小鼠耳部皮肤上涂抹乳膏基质，阳性药组小鼠耳部皮肤上涂抹艾洛松，Ⅲ型胶原蛋白组、纤连蛋白组、各多肽组和A+多肽重组Ⅲ型胶原蛋白组小鼠耳部皮肤上分别涂抹上诉相应乳膏，每天1次，连续10天，每天拍照，进行评分。
分别在造模前和第14天用皮肤测试仪随机检测小鼠背部受试区3处部位，记录经皮水分丢失量(TEWL)值，取平均值。
分别在造模前和第14天用耳厚度测量仪测量记录小鼠耳廓厚度。于第14天测量完毕后脱颈处死小鼠，取血分离血清和血浆。
用兔抗小鼠白介素(IL)-4抗体包被酶标板，4℃过夜，染色并终止反应，检测血清IL-4水平。按照ELISA试剂盒说明书操作测定血浆中PCSK9浓度。
3.结果
(1)小鼠耳厚度比较：造模前，各组间耳厚度差异无统计学意义(P＞0.05)。造模后，各组小鼠耳厚度见表6。胶原蛋白组和纤连蛋白组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，其它各组明显低于模型组(P均＜0.01)，各A+多肽组明显低于各DZ多肽组(P均＜0.05)，A+多肽重组胶原蛋白组明显低于胶原蛋白组(P＜0.01)。
(2)各组小鼠皮肤经皮水分丢失量(TEWL)比较：造模前，各组间TEWL值差异无统计学意义(P＞0.05)。造模14天后，各组小鼠TEWL值见表6。胶原蛋白组和纤连蛋白组与模型组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，其它各组明显低于模型组(P均＜0.01)，各A+多肽组明显低于各DZ多肽组(P均＜0.05)，A+多肽重组胶原蛋白组明显低于胶原蛋白组(P＜0.01)。
(3)血清IL-4浓度：各组小鼠外周血中血清IL-4水平见表6。模型组与胶原蛋白组和纤连蛋白组比较差异无统计学意义(P＞0.05)，除胶原蛋白组和纤连蛋白组外，其它各组明显低于模型组(P均＜0.01)，各A+多肽组明显低于系列DZ多肽组(P均＜0.05)，A+多肽重组胶原蛋白组明显低于胶原蛋白组(P均＜0.01)。
(4)血浆中PCSK9的表达：除各DZ多肽组外，其余各组小鼠外周血血浆中PCSK9的表达比较差异无统计学意义(P均＞0.05)。
组别 耳厚度(mm) TEWL(g.m-2.h-1) IL-4水平(pg/ml)
阴性对照组 0.223±0.006 5.13±0.39 5.18±0.09
模型对照组 0.379±0.046 36.32±4.26 9.29±0.78
阳性对照组 0.235±0.006 9.51±0.45 5.43±0.13
A+重组胶原蛋白组1 0.275±0.007 10.83±0.57 5.92±0.28
A+重组胶原蛋白组3 0.262±0.008 10.31±0.46 5.85±0.26
胶原蛋白组 0.366±0.021 32.56±4.15 8.86±0.64
纤连蛋白组 0.369±0.048 35.36±4.23 8.92±0.71
A+多肽组1 0.284±0.023 18.52±2.57 6.81±0.28
A+多肽组2 0.323±0.021 15.17±2.41 6.36±0.26
A+多肽组3 0.318±0.024 21.16±2.26 6.93±0.72
A+多肽组4 0.322±0.021 19.53±2.45 7.12±0.65
A+多肽组5 0.315±0.022 16.35±1.36 7.45±0.59
A+多肽组6 0.293±0.021 15.56±1.45 6.53±0.51
A+多肽组7 0.312±0.023 17.61±1.48 6.96±0.58
DZ多肽1 0.346±0.029 28.15±2.38 8.26±0.35
DZ多肽2 0.327±0.023 29.52±2.41 7.96±0.31
DZ多肽3 0.336±0.021 24.68±2.28 7.89±0.32
DZ多肽4 0.359±0.031 28.63±2.37 7.95±0.39
DZ多肽5 0.343±0.027 27.16±2.38 8.36±0.43
DZ多肽6 0.341±0.023 28.52±2.42 8.17±0.29
DZ多肽7 0.357±0.032 25.83±2.36 7.95±0.26
DZ多肽8 0.338±0.026 25.61±2.33 7.79±0.32
表4造模后各组小鼠耳厚度和TEWL值
A+系列多肽和A+重组胶原蛋白均能通过抑制炎症因子IL-4来减轻炎症，同时减少皮肤经皮水分丢失量(TEWL)；Ⅲ型胶原蛋白和纤连蛋白几乎无抗炎功能，A+多肽与人源Ⅲ型胶原蛋白重组能明显增强抗炎作用。系列A+多肽和A+重组胶原蛋白对血浆中PCSK9的含量均无影响。
实施例5A+系列多肽或蛋白质对雄性激素性脱发(AGA)大鼠模型的影响
1.材料
系列A+多肽和系列DZ多肽：由上海生工合成，纯度大于95％。系列A+多肽氨基酸序列如上述发明内容中所示，具有代表性的A+多肽氢谱分析结果如图4所示。系列DZ多肽氨基酸序列如实施例2所示，在以下实验中作为实验对照组。
A+多肽1重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白1)和A+多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白3)：由实施例1所示方法合成；人源Ⅲ型胶原蛋白(同实施例1所示)；纤连蛋白(FN)：武汉艾美捷科技有限公司生产。
1％A+多肽或1％DZ多肽溶液、1％人源Ⅲ型胶原蛋白、1％A+重组人源Ⅲ型胶原蛋白和1％纤连蛋白溶液、配制方法：各组样品粉末分别加适量蒸馏水混匀配成。
2％米诺地尔液：由医科院皮肤病研究所生产。
2.动物分组与造模
选取SPF级Wistar大鼠，采用随机排列表法分为阴性对照组(涂抹蒸馏水)、模型对照组(涂抹蒸馏水)、纤连蛋白组(皮肤涂抹1％纤连蛋白溶液)、阳性对照组(皮肤涂抹2％米诺地尔液)、A+多肽重组胶原蛋白组1(皮肤涂抹1％A+多肽1重组Ⅲ型胶原蛋白溶液)、A+多肽重组胶原蛋白组3(皮肤涂抹1％A+多肽3重组Ⅲ型胶原蛋白溶液)、胶原蛋白组(皮肤涂抹1％Ⅲ型胶原蛋白溶液)，A+多肽组1(皮肤涂抹1％A+多肽1号溶液)、A+多肽组2(皮肤涂抹1％A+多肽3号溶液)、A+多肽组3(皮肤涂抹1％A+多肽5号溶液)、A+多肽组4(皮肤涂抹1％A+多肽7号溶液)、A+多肽组5(皮肤涂抹1％A+多肽8号溶液)、A+多肽组6(皮肤涂抹1％A+多肽9号溶液)和A+多肽组7(皮肤涂抹1％A+多肽10号溶液)，以及系列DZ多肽组(皮肤分别涂抹1％DZ多肽系列溶液)。每组10只，雌雄各半。
实验前每只大鼠选取背部4cmx5cm面积的区域将毛脱去作为观察区。除阴性对照组外，其他各组大鼠颈后皮下注射丙酸睾酮注射液[5ml/(kg·d)，每天1次，连续60d，建立AGA模型。连续皮下注射丙酸睾丸酮4周后大鼠逐渐出现毛发脱落.残存毛发变得纤细、质脆，证明雄性激素性脱发模型成功建立。造模同时于对应治疗组大鼠背部观察区皮肤分别涂抹各治疗组溶液，涂抹1mL/(只·次)，每日1次，连续60d。阴性对照组和模型对照组涂抹蒸馏水1mL/(只·次)，每日1次，连续60d。
3.观察指标及测试方法
给药每15天于每只大鼠背部观察区拔取10根毛发，用游标卡尺测量毛发长度。给药60d后，取实验观察区皮肤，进行常规组织脱水、石蜡包埋、HE染色，光镜镜检，观察大鼠皮肤毛囊和皮脂腺组织病理学改变。对各组病变进行半定量分析。分级标准如下：皮肤真皮组织细胞和皮下毛囊、皮脂腺结构正常记为“一”：皮肤真皮未见有增生，毛囊、皮脂腺病变局限，皮下未见有炎症记为“±”：皮肤真皮组织未见有明显增生，毛囊明显囊性变.皮脂腺未见有明显增生，皮下未见有炎症记为“+”：皮肤真皮组织有节段性增生，不明显，少部分毛囊有囊性变，皮脂腺有轻度增生肥大.皮下未见有明显炎症记为“++”：皮肤真皮组织细胞有不同程度节段性增生，部分毛囊囊性变，表现毛囊大小不均匀，周边部无细胞。皮脂腺有增生，增生腺体内细胞核较少，个别大鼠皮下有轻度炎性增生记为“+++”。
4.结果
4.1对大鼠毛发生长的影响
如表5所示，系列DZ多肽组、系列A+多肽和A+多肽重组胶原蛋白实验组在给药第15、30、45、60天毛发生长长度均高于模型对照组，比较有统计学差异(P均＜0.01)；系列DZ多肽组、系列A+多肽组和A+重组胶原蛋白组与阴性对照组和阳性对照组比较均无统计学差异；系列A+多肽组毛发长度长于系列DZ多肽组，比较有统计学差异(P＜0.05)；A+重组胶原蛋白组毛发长度长于人源Ⅲ型胶原蛋白组，比较有统计学差异(P＜0.05)；纤连蛋白组和Ⅲ型胶原蛋白组与模型对照组比较无统计学差异。建模第45天各组小鼠的毛发生长情况见图8。
Figure BDA0004004401920000191
Figure BDA0004004401920000201
表5建模后不同时间各组大鼠毛发生长长度
*与模型组比较差异均有统计学意义(P均＜0.01)
4.2对大鼠观察区皮肤组织真皮浅层毛囊形态的影响
模型组大鼠部分皮肤真皮组织细胞有不同程度节段性增厚，大鼠皮下有轻度淋巴细胞增生；部分大鼠皮下毛囊有明显囊性变，毛囊大小不等，增大毛囊腔内有脱落角化物.周边有轻度纤维化，毛囊周边细胞消失或细胞层次明显减少，腔内似有钙化物染成蓝色，皮脂腺数目增多，部分腺体有肥大，肥大腺体细胞核明显减少，正常毛囊数减少。多肽组和米诺地尔液组大鼠皮肤真皮组织细胞及皮下毛囊、皮脂腺病变与模型组比较有不同程度减轻。与模型对照组比较，多肽组、A+重组胶原蛋白组和米诺地尔组大鼠皮肤真皮组织细胞及皮下毛囊、皮脂腺病变明显减轻(P均<0.01)，与阴性对照和阳性对照组比较无显著差异(P＞0.05)；系列A+多肽组与系列DZ多肽组比较明显减轻(P均＜0.05)；A+重组胶原蛋白组大鼠皮肤损伤毛囊数与系列A+多肽组比较差异有统计学意义(P均＜0.05)。纤连蛋白组和Ⅲ型胶原蛋白组与模型对照组比较无显著差异(P＞0.05)。见表6。免疫组化结果显示模型组皮肤毛囊中VEGF蛋白表达减少；比较模型组，A+重组胶原蛋白组和各多肽组VEGF蛋白表达均明显增加(P均＜0.01)，与阴性对照和阳性对照组比较无显著差异(P＞0.05)；A+重组胶原蛋白组VEGF蛋白表达明显高于系列A+多肽组(P＜0.05)；系列A+多肽组与系列DZ多肽组比较有统计学差异(P＜0.05)；Ⅲ型胶原蛋白组、纤连蛋白组与模型对照组比较无显著差异(P＞0.05)。见图9。
Figure BDA0004004401920000202
Figure BDA0004004401920000211
表6各组对大鼠皮肤毛囊和皮脂腺的影响(只)
注：*为与模型对照组比较有显著差异(P＜0.01)
所述一系列A+多肽和A+重组Ⅲ型胶原蛋白对雄性激素性脱发(AGA)大鼠的毛发具有明显的生发作用，系列A+多肽的生发作用明显强于系列DZ多肽，A+多肽与Ⅲ型胶原蛋白结合能明显提高生发作用；Ⅲ型胶原蛋白和纤连蛋白无明显生发作用。
实施例6A+多肽或A+重组Ⅲ型胶原蛋白对兔耳痤疮模型的影响
1.材料
系列A+多肽和系列DZ多肽：由上海生工合成，纯度大于95％。系列A+多肽氨基酸序列如上述发明内容中所示，具有代表性的A+多肽氢谱分析结果如图4所示。系列DZ多肽氨基酸序列如实施例2所示，在以下实验中作为实验对照组。
A+多肽1重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白1)、A+多肽2重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白2)和A+多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白(简称A+重组胶原蛋白3)：由实施例1所示方法合成；人Ⅲ型胶原蛋白(同实施例1所示)；纤连蛋白(FN)：武汉艾美捷科技有限公司生产。
阳性治疗药：0.1％阿达帕林凝胶(商品名：达芙文，法国高德美制药公司生产)
实验动物：普通级新西兰家兔，1.9～2.4kg，雄性，来源于上海斯莱克实验动物有限责任公司。
治疗乳膏制备方法：赋形剂基质组成成分包括甲基硅油(15％)、硬脂酸(6％)、白凡士林(5％)、液体石蜡(5％)、十八醇(5％)、甘油(20％)、烷基芳基聚乙醇醚(1％)、脂肪醇聚氧乙烯醚(1％)、吐温-80 7(1％)、尼泊金乙酯(0.1％)、蒸馏水(约31-55％)，分别与适量以上纤连蛋白或系列多肽或蛋白质混匀形成0.5％混合乳剂。本专利实施例所用的乳膏基质是指乳膏除去活性成分的基质成分。
2.动物分组与造模
按体重编号，采用随机排列表法分为阴性对照组(涂抹乳膏基质)、模型对照组(涂抹乳膏基质)、纤连蛋白组(皮肤涂抹0.5％纤连蛋白乳膏)、阳性对照组(皮肤涂抹达芙文)、A+重组胶原蛋白组(皮肤涂抹0.5％A+多肽重组Ⅲ型胶原蛋白乳膏)、胶原蛋白组(皮肤涂抹0.5％Ⅲ型胶原蛋白乳膏)、A+多肽组1(皮肤涂抹0.5％A+多肽1号乳膏)、A+多肽组2(皮肤涂抹0.5％A+多肽3号乳膏)、A+多肽组3(皮肤涂抹0.5％A+多肽5号乳膏)、A+多肽组4(皮肤涂抹0.5％A+多肽6号乳膏)、A+多肽组5(皮肤涂抹0.5％A+多肽8号乳膏)、A+多肽组6(皮肤涂抹0.5％A+多肽9号乳膏)、A+多肽组7(皮肤涂抹0.5％A+多肽10号乳膏)、系列DZ多肽组(皮肤分别涂抹各0.5％DZ多肽乳膏)。每组10只，雌雄各半，外用每天1次。取兔右耳内侧脱毛处理作为观察区，所有家兔左耳作为自身阴性对照，涂抹95％酒精，模型组和实验组右耳内侧均涂2％煤焦油(Alfa Aesar中国公司，用95％酒精配制成2％的煤焦油溶液)，用无菌棉签均匀涂于家兔耳内侧面耳导管开口处约2cm×2cm范围，每天1次，每次0.5mL，并且用温水擦拭前次涂药部位，连续涂14d，建立痤疮微粉刺模型。肉眼观察局部皮肤的变化，包括耳厚薄、硬度、粗糙程度和毛囊口有无黑色角栓等。末次涂18h后处死取材，10％甲醛固定，石蜡包埋切片，HE染色后，进行病理组织学观察分析。
3.观察指标
痤疮模型组织学判定分级标准：按组织学级别为3级。0级“一”为漏斗部仅有松散的角化的细胞，无粉刺生成；1级为兔耳表面皮肤发红，或毛囊漏斗部见少量致密角化物质，漏斗部不扩张“+”；2级为毛囊漏斗部见中等致密角化物质，并向皮脂腺延伸，伴随皮脂腺导管的增生，漏斗扩张“2+”；3级为毛囊内有广泛的角化物质，毛囊中紧密的角质栓塞引起毛囊重度扩张，皮脂腺导管上皮明显增生，皮肤凸起、瘢痕，部分皮脂腺发生退行变“3+”。
在显微镜下观察其组织病理改变情况，并用Biomias99图像分析系统测量一张切片上5处不同表皮的厚度，计算平均值；检测4张切片中位置相同而结构最完整的2个毛囊的面积和4个皮脂腺的直径，计算各自的平均值，然后将各组兔左、右外耳道数据相减，即得各兔的左、右耳表皮厚度差、毛囊面积差和皮脂腺直径差。
4统计学处理
用SPSS22软件进行统计分析。自身左右对照采用配对t检验，各组间比较用t检验，P<0.05为差异有统计学意义。
5.结果
肉眼观察：涂煤焦油14d后，所有组兔左耳皮肤柔软，其外耳道毛囊口排列整齐，未见粉刺、丘疹及脓疱等。模型对照组兔右耳涂煤焦油后耳厚度增加、变硬，表面粗燥，毛囊口有黑色角栓，形成黑头粉刺，毛囊口隆起呈丘疹状，触之较硬，部分融合成片。阳性治疗组兔右耳与左耳相比，皮肤轻度发红，有少许脱屑，少量毛囊角栓和粉刺，粉刺减少变平，毛孔缩小，皮肤稍干燥。其余各治疗组右耳表现为不同程度的皮肤柔软，粉刺减少，毛孔明显缩小，无脱屑，基本接近正常兔耳。
组织切片观察：模型组左耳显示表皮较薄，可见毛囊，真皮与表皮交界清楚。模型组右耳造模后见表皮增厚，角化过度，颗粒层和棘层增厚，毛囊扩大，角栓堵塞毛囊口，并向皮脂腺延伸，毛囊漏斗部充满角化物质并扩大呈壶状；真皮上层毛细血管扩张，毛囊周围散在炎症细胞浸润，少量中性粒细胞浸润；皮脂腺数量增多，皮脂腺体积增大。
各组镜下实验性粉刺组织学分级(见表7)：模型组兔右耳与其左耳(阴性对照)进行比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示兔耳痤疮模型复制成功；Ⅲ型胶原蛋白组和纤连蛋白组右耳与模型组右耳比较，差异均无统计学意义(P均＞0.05)；其余各治疗组兔右耳与模型组兔右耳进行比较，差异均有统计学意义(P均＜0.01)；A+多肽组明显低于DZ多肽组(P均＜0.05)；A+重组胶原蛋白组明显低于系列A+多肽组(P均＜0.05)。
模型组兔右耳表皮厚度、毛囊画积和皮脂腺直径与其左耳(阴性对照)进行比较，差异有统计学意义(P＜0.01)，提示兔耳痤疮模型复制成功；Ⅲ型胶原蛋白组和纤连蛋白组右耳与模型组右耳比较，差异均无统计学意义(P均＞0.05)；其余各治疗组兔右耳表皮厚度、毛囊画积和皮脂腺直径与模型组兔右耳进行比较，差异均有统计学意义(P均＜0.01)；A+多肽组低于DZ多肽组(P均＜0.05)；A+重组胶原蛋白组低于系列A+多肽组(P均＜0.05)。(见表8)。
Figure BDA0004004401920000231
/>
Figure BDA0004004401920000241
表7各组痤疮粉刺的组织学分级
Figure BDA0004004401920000242
/>
Figure BDA0004004401920000251
表8各组耳表皮厚度、毛囊面积和皮脂腺直径(*为与模型组右耳比较P<0.01)
兔耳是一种常用来衡量引起粉刺物质作用强度的动物模型，兔和人一样毛囊皮脂腺大小变化很大。动物随着年龄的增加，形成粉刺的能力也增加，因此选择成年雄性家兔来复制痤疮模型，使其体内的雄性激素对皮肤具有一定的刺激作用。阿达帕林可通过调节毛囊皮脂腺上皮角化异常过程来去除角质栓，从而起到防止及消除粉刺皮损的作用，故本发明选择阿达帕林作为阳性对照品。
所述一系列多肽和A+重组Ⅲ型胶原蛋白均能明显抑制煤焦油诱导的兔耳痤疮模型症状，减少毛孔堵塞和黑头粉刺形成，对痤疮具有治疗作用；系列A+多肽组明显优于系列DZ多肽组；胶原蛋白组和纤连蛋白组对痤疮无明显作用；A+多肽与Ⅲ型胶原蛋白结合能明显提高对痤疮的治疗效果。
实施例7：多肽和重组胶原蛋白治疗痤疮患者面部皮疹的临床观察
1.材料
A+多肽3的氨基酸序列：EYPYKHSGYYHRAV和DZ多肽1的氨基酸序列：EYPYKHSGYYHR由上海生工合成；多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白(合成方法同实施例1)。
A+多肽3、DZ多肽1和多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液配制：分别与适量纯净水混合配成0.5％A+多肽3或0.5％DZ多肽1或0.5％多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液。
2.方法
2.1分组：
本次试验共招募28名面部痤疮患者，所有患者被随机分为四组，四组分别为
A组：安慰剂组(6人)，男女各半，面部皮疹外用纯净水，每天2次外用。
B组：A+多肽3组(8人)，男女各半，面部皮疹外用0.5％多肽3溶液，每天2次外用。
C组：DZ多肽1组(6人)，男女各半，面部皮疹外用0.5％DZ多肽1溶液，每天2次外用。
D组：多肽3重组胶原蛋白组(8人)，男女各半，面部皮疹外用0.5％多肽3重组人源Ⅲ型胶原蛋白溶液，每天2次外用。
2.2患者纳入和排除标准
纳入标准：
(1)所有患者均为寻常性痤疮，发病部位为面部，据Pillsbury分级标准，患者为轻中度。(2)就诊前2周内未接受系统和外用药治疗者。(3)患者知情，签署了知情同意书。
排除标准：
(1)对多肽或蛋白过敏者。(2)排除患有面外伤的患者。(3)排除患有免疫系统、器官功能障碍的患者。(4)6个月内口服或外用过维甲酸类药物患者。(5)排除其他类型痤疮患者。(6)未同时参加其他试验。
试验期为8周，每2周随访一次，记录面部皮疹情况和不良反应。
2.3观察指标
(1)评价两各组患者临床疗效，统计患者皮损总数，减少60％以上为显效；皮损总数减少超过30％为有效；皮损总数减少不足30％，为无效。
(2)检测患者TEWL(经表皮失水率)，使用1.5.3皮肤生理检测仪进行检测，将探头放置在颧骨最高点，读取数值，计算出平均值。
2.4统计学方法
采用SPSS 21.0软件处理数据，使用t检验计量资料(x±s)，使用χ2检验计数资料(％)，P＜0.05视为差异有统计学意义。
3.结果
3.1各组临床疗效对比
A+多肽3组和重组胶原蛋白组治疗有效率分别为87.5％和100％，与安慰剂组对比差异显著(P＜0.01)；A+多肽3组和重组胶原蛋白组治疗有效率与DZ多肽1组比较差异也显著(P＜0.05)；DZ多肽1组与安慰剂组比较差异无统计学意义(P＞0.05)。详见
表9。
分组 n 治愈 显效 有效 无效 总有效率(％)
安慰剂组 6 0 0 0 6 0
DZ多肽1组 6 0 0 1 5 16.7％
A+多肽3组 8 2 3 2 1 87.5％*
重组胶原蛋白组 8 4 2 2 0 100％*
表9各组痤疮治疗8周后疗效比较
*与安慰剂组比较有显著差异(P＜0.01)
3.2各组患者TEWL对比
A+多肽3组和A+重组胶原蛋白组治疗4周和8周后下颌部TEWL与安慰剂组对比差异显著(P＜0.01)；A+多肽3组和重组胶原蛋白组治疗4周和8周后与DZ多肽1组比较差异显著(P＜0.05)；详见表10。
Figure BDA0004004401920000271
表10各组患者TEWL对比
*与安慰剂组比较有显著差异(P＜0.05)
3.3A+多肽组和重组胶原蛋白组患者治疗8周前后对比
某患者，女，22岁，轻度寻常性痤疮，接受0.5％A+多肽3溶液治疗，治疗8周前后对比如图10所示：
某患者，女，23岁，中度寻常性痤疮，接受0.5％A+多肽3重组胶原蛋白溶液治疗，治疗8周前后对比如图11所示。
4结论
A+多肽和A+重组Ⅲ型胶原蛋白均能明显改善痤疮患者面部皮疹，减少毛孔堵塞和黑头粉刺形成；A+多肽组明显优于DZ多肽组；A+多肽与Ⅲ型胶原蛋白重组能明显提高对痤疮的治疗作用。

Claims (15)

1.一种氨基酸序列，其特征在于，所述氨基酸序列为含有第一序列的氨基酸序列、片段或突变体：
所述第一序列包括SEQ ID NO.1或与SEQ ID NO.1至少70％同源的且功能相同或相似的延伸序列，SEQ ID NO.1为AVEYPYKHSGYYHR；
所述的同源为在原序列基础上增加、减少或改变至少一个氨基酸。
2.根据权利要求1所示的氨基酸序列，其特征在于，所述延伸序列包括SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQID NO.9、SEQ IDNO.10或者与前述任意一个延伸序列至少70％同源的且功能相同或相似的序列、片段或突变体，
SEQ ID NO.2：AVEFPFKWSGYYHR；
SEQ ID NO.3：EYPYKHSGYYHRAV；
SEQ ID NO.4：AVEYTYNGAGYYHR；
SEQ ID NO.5：EYTYKGSGYYHRAV；
SEQ ID NO.6：AVEYTYIGAGYYHR；
SEQ ID NO.7：AVEYPWKGSGYYHRP；
SEQ ID NO.8：AVEYTFKHSGYYHRP；
SEQ ID NO.9：AVEYPYDYSGYYHRP；
SEQ ID NO.10：AVEYTYEGAGYYHRP。
3.一种包括权利要求1或2所述氨基酸序列的产品，其特征在于，所述产品为多肽或蛋白质，优选地，所述蛋白质为重组人源Ⅲ型胶原蛋白。
4.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，其为能够在抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘中应用的产品。
5.根据权利要求3所述的产品，其特征在于，所述多肽或蛋白质还包含免疫球蛋白。
6.一种编码如权利要求1或2所述氨基酸序列或权利要求3～5中任意一项所述产品的核酸序列。
7.一种组合物，其特征在于，该组合物包括如权利要求1或2所述氨基酸序列、权利要求3～5中任意一项所述产品、权利要求6所述核酸序列或者前述任意一个的衍生物或其可药用盐。
8.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述产品或组合物可制备为溶液、酊剂、醑剂、搽剂、喷雾剂、乳剂、膏剂、凝胶剂、贴剂、水剂、片剂、冲剂、口服液剂、胶囊剂、滴丸剂、灌肠剂、膜剂、注射剂或其他药用剂型。
9.根据权利要求7所述的组合物，其特征在于，所述产品和组合物可单独使用，也可与一种或多种产品组合使用。
10.一种制备如权利要求3～5中任意一项所述产品的方法，其特征在于，所述方法包括：培养宿主细胞，后从所述宿主细胞回收所述多肽或蛋白质，其中所述宿主细胞是原核的或真核的。
11.如权利要求1或2所述氨基酸序列、权利要求3～5中任意一项所述产品或权利要求6所述的核酸序列在制备皮肤类产品中的应用，其特征在于，所述皮肤类产品包括但不限于药品、医疗器械、保健品或护肤品。
12.如权利要求11所述的应用，其特征在于，所述皮肤类产品包括但不限于抗衰、抗炎、组织修复、生发和祛痘产品。
13.一种用于治疗或预防皮肤病的方法，其特征在于，所述方法包括施用治疗有效量的包含依照权利要求1或2所述的氨基酸序列，或权利要求3～5中任意一项所述的产品，或权利要求6所述的组合物的产品。
14.根据权利要求13的方法，其特征在于，所述皮肤病包括但不限于皮肤衰老、皮肤炎症、皮肤损伤、脱发、斑秃和痤疮。
15.根据权利要求13的方法，其特征在于，所述施用对象是人。
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