CN1164236A - 鉴别对治疗自身免疫疾病有效的化合物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了鉴别化合物的方法，该化合物抑制CIITA的转录激活从而抑制MHC II类基因的表达。这样的化合物能够影响免疫应答的诱导。这些方法分别应用CIITA的激活和相互作用结构域。方法中也同时应用同型特异性CIITA蛋白激活和相互作用结构域，以用于鉴别这类化合物：它们是转录的同型特异抑制剂和选择性影响免疫系统中有效的化合物。

Description

鉴别对治疗自身免疫疾病有效的化合物的方法

发明背景

本发明与自身免疫疾病有关。

主要组织相容性(MHC)II类分子表达于抗原递呈细胞和B淋巴细胞表面。通过结合抗原并递呈抗原给T细胞，MHC II类分子参与了免疫应答的启动。于是，MHC II类分子表达的水平影响免疫应答的诱导。

编码MHC II类抗原α-和β-多肽的基因定位于染色体的HLA-D(组织相容性白细胞抗原-D)区域。II类基因的同型抗原包括HLA-DR、HLA-DQ、HLA-DP。这些基因中，存在基本的等位基因多态性；例如，HLA-DR的等位基因包括DR1、DR2、DR3和DR4。此外，存在这些等位基因的亚型；例如，DR4的亚型包括DW4、DW10、DW13、DW14和DW15。

几种自身免疫疾病与MHC II类基因特殊等位基因的表达相关。大约93％感染类风湿关节炎的病人表达HLA-DR1、HLA-DR4或二者均有表达(McDermott等，风湿疾病通报(Bulletin on the ReumaticDiseases)，38：1-10；见表1)。

表1：类风湿关节炎HLA相关的人种研究
					人种	HLA抗原	病人％	对照％	相对发病率
美国白人	DW4	54	16	6
					美国白人	DR4	70	28	6
美国黑人	DR4	46	14	5
					日本人	DR4	67	41	3
墨西哥人	DR4	26	3	11
					亚洲印度人(在英国)	DR4	17	14	1
	DR1	60	17	7
					以色列犹太人	DR1	31	11	4
以色列犹太人	DR4	48	38	1.5

续表一

	DR1	16	16	1
					雅基马印度人	DR4	41	38	1

其它自身免疫疾病也与特殊等位基因的表达相关。例如，Felty氏综合症、Sjogren氏综合症，系统红斑狼疮以及对金和青霉胺毒性的发作都与各种HLA-DR等位基因有关(McDermott等，风湿疾病通报(Bulletinon the Reumatic Diseases)，38：1-10；见表2)。

表2：与RA、毒霉胺和金的毒性和重症肌无力相关的HLA相关综合症
					Felty′s综合症	HLA抗原	病人％	对照％	相对发病率
综合症	DR4	96	36	43
					sjogren′s综合症
初期	B8	59	24	5
						DR3	64	31	4
sjogren′s综合症
					第二期RA	DR4	65	31	4
第二期SLE	DR2	40	24	2
					药物副作用
金-蛋白尿	DR3	79	10(受治疗的对照)	34
					金引起的血细胞毒性(harmatocytotoxicity)	DR3	88	17	36
	B8	88	25	22
					青霉胺引起的
血小板减少症	DR4	93	71	5
					重症肌无力	DR1	70	18	11
	B35 DR1	50	5	19

作为另外一个例子，特殊的青少年类风湿关节炎与HLA-DPB2.1相关(Begovich等，1989，PNAS86：9489-9493)。大约70％患有胰岛素依赖糖尿病的病人表达HLA-DQ3.2B、DQA1或DQB1，而且自身免疫皮肤病寻常天庖疮与HLA-DQB1.3的表达相关(Scharf等，1989，PNAS86：6215-6219)。

MHC II类基因的激活依赖于激活子CIITA(Steimle等，1993，细胞75：135-146)。

发明概述

已经发现缺乏蛋白的其余部分并且有其它完整的转录系统存在时，CIITA的一部分足以用来激活转录。这一结构域被称为CIITA转录激活结构域，而且我们已经揭示出它对抑制CIITA依赖转录的化合物的鉴别能提供有用的信息。这些化合物因其抑制MHC II类基因转录的能力而成为潜在的自身免疫疾病治疗药物。我们还发现缺乏蛋白的其余部分并且有其它完整的转录系统存在时，CIITA的第二部分足以用来介导细胞转录器中CIITA和其靶蛋白的相互作用而且激活所有的MHC II类启动子。我们称这一结构域为CIITA相互作用结构域，而且抑制这一结构域与其靶蛋白结合的化合物能够抑制CIITA依赖的转录从而是潜在的自身免疫疾病治疗药物。同时发现CIITA的一种突变子(在此称为克隆13CIITA)激活MHCII类基因一种亚类的转录。称该突变子为同型特异突变子；同型特异CIITA蛋白的转录激活和相互作用结构域在鉴别转录的同型特异抑制剂的化合物中也是有用的。

因此，本发明的特色在于其方法：用CIITA激活结构域或相互作用结构域确定化合物是否是潜在自身免疫治疗药物。用以下说明的转录测定技术可形成有功能的CIITA激活结构域或有功能CIITA相互作用结构域的存在或缺失。某一方法中，测定化合物抑制报告基因转录的能力，转录的抑制指示该化合物为潜在的自身免疫疾病治疗药物。用另一种方法测定化合物抑制CIITA相互作用结构域与靶蛋白结合的能力，抑制结合指示该化合物为潜在的自身免疫疾病治疗药物。在又一种方法中，CIITA转录激活结构域缺失而另外一种蛋白的转录激活结构域存在时测定了CIITA介导转录的能力。抑制相互作用功能的化合物为潜在的自身免疫疾病治疗药物。在待试化合物存在时通过测定野生型CIITA相互作用构域介导转录的能力和监测每一同型抗原的表达，这种方法可用于鉴别同型特异性转录抑制剂的化合物。存在同型特异性转录抑制剂时，野生型CIITA相互作用结构域只介导MHC II类基因一种亚类的转录。

此外本发明的特色方法即用同型特异性CIITA相互作用结构域和转录激活结构域鉴别同型特异性转录抑制剂的化合物。这些方法中，测定了化合物对野生型和同型特异CIITA相互作用和转录激活结构哉介导的转录的不同影响能力，这样的同型特异抑制剂对选择性影响免疫系统有效。

转录抑制可在体内、体外或细胞基础上分析。现有技术中有很多技术用以测定转录激活结构域的活力(例如，见Keegan等，1986，科学23：699；Ma等，1987，细胞48：847：Lin等，1988，细胞54：659；Sadowski等，1988，自然335：563；Robert等，1993，自然363：741：和Ma等，1988，细胞55：443)。这些以及其它转录分析可以鉴别抑制CIITA转录激活的化合物为目的进行改进这可通过用新鉴别出的转录激活结构域代替以前描述过的分析中所用的转录激活结构域来完成。给转录反应中加入化合物并确定化合物是否抑制转录，从而鉴别抑制CIITA转录激活的化合物。这些化合物为潜在的自身免疫疾病治疗药物。

在优选的实施方案中，潜在的自身免疫疾病治疗药物通过如下方法鉴别：

a)提供一种融合蛋白，该蛋白包含与DNA结合蛋白(如，LexA的DNA结合/二聚化结构域或GAL4的DNA结合结构域)融合的CIITA转录激活结构域(不含有功能的CIITA相互作用结构域)；

b)在一种转录系统(例如，体外或原核和真核细胞内如：细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中提供融合蛋白，此转录系统具有与融合蛋白结合的调节序列(如，在质粒或染色体上)而且调节序列与报告基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、虫荧光素酶、人生长激素或碱性磷酸酶)可操作地相连；

c)测定报告基因转录的水平(例如，通过标准方法测定报告基因RNA和蛋白产物的活力。举例如下，在含X-gal的培养基里或上培养细胞并且测定产生的蓝色发色团的数量可测定lacZ基因的转录，)；以及

d)在待试化合物存在时完成上述步骤a-c，转录水平的降低(相对于缺乏化合物时的水平)表明化合物抑制转录的CIITA激活从而是一种潜在的自身免疫疾病治疗药物。

其它优选的方案中，CIITA相互作用结构域用以鉴别潜在的自身免疫疾病治疗药物。这些方法包括：

a)提供一种融合蛋白，该蛋白包括与一个非CIITA激活结构域融合的CIITA相互作用结构域(如，单纯疱疹病毒α-诱导因子(α-TDF)的转录激活结构域)；

b)提供一种CIITA相互作用的靶蛋白(如，人B细胞的CIITA相互作用靶蛋白)；

c)在一种转录系统中提供融合蛋白和靶蛋白(如，体外或原核和真核细胞内如：细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞比如人B细胞(例如，克隆13、Raji或RM3细胞))，转录系统中具有含MHC II类启动子序列的调节序列(如，在质粒或染色体上)而且调节序列与报告基因(例如，MHC II类基因、编码β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、虫荧光素酶、人生长激素或碱性磷酸酶)可操作地地相连的DNA；以及

d)测定报告基因转录的水平(例如，通过标准方法测定报告基因RNA和蛋白产物的活力。举例如下，在人B细胞中用FACS分析细胞表面MHCII类分子表达的增加可测定MHC II类基因的转录)；以及

e)完成步骤a-d，在被测试化合物存在时转录水平的降低(相对于缺乏化合物时的水平)表明化合物抑制CIITA相互作用结构域介导转录的能力从而是一种潜在的自身免疫疾病治疗药物。同型特异转录抑制剂化合物可通过其差异抑制MHC II类基因表达能力的特征得以鉴别。例如，野生型CIITA相互作用结构域克隆13细胞的表达恢复了HLA-DR、-DQ和-DP同型抗原的转录。不以同型特异方式抑制转录的化合物会阻滞三个基因表达的恢复。相反，同型转录抑制剂只会干扰这些基因的亚类的表达恢复。

另外的优选方案中，作为潜在自身免疫疾病治疗药物的化合物的鉴别如下：

a)提供的第一个融合蛋白包括与一个DNA结合蛋白(如，LexA的DNA结合/二聚化结构域或GAL4的DNA激活结构域)融合的CIITA相互作用结构域(不含有功能的CIITA相互作用结构域)；

b)在一种转录系统(例如，体外或原核和真核细胞内如：细菌细胞、酵母细胞、植物细胞或哺乳动物细胞)中提供融合蛋白，转录系统具有与第一个融合蛋白结合的调节序列(如，在质粒或染色体上)而且调节序列与报告基因(例如，编码β-半乳糖苷酶、CAT、GUS、荧光素酶、人生长激素或碱性磷酸酶)可操作地相连的DNA；

c)提供第二个融合蛋白，其特征在于它包含了一种与在此定义过的CIITA相互作用靶蛋白融合的转录激活结构域(如，B42的转录激活结构域)；

d)测定报告基因转录的水平(例如，通过标准方法测定报告基因RNA和蛋白产物的水平和活力。举例如下，在含X-gal的培养基里培养细胞并且测定产生的蓝色发色团的数量可测定lacZ基因的转录，)；以及

e)在待试化合物存在时完成步骤a-d，转录水平的降低(相对于缺乏化合物时的水平)表明化合物能抑制CIITA相互作用结构域与靶蛋白结合力从而是一种潜在的自身免疫疾病治疗药物。抑制结合的化合物可通过很多方法发生作用，其中包括空间干扰结合或改变CIITA或靶蛋白的结构。尽管该化合物完全破坏转录的精确机理尚未明了。然而该化合物却是一种有价值的药物。另外一些测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法也可用来鉴别抑制CIITA相互作用结构域与靶蛋白结合的化合物。应用标准的分子生物学技术，本领结构域的技术人员可使用ELISA、Southwestern杂交、滤纸或膜结合的蛋白或固定化蛋白来鉴别抑制CIITA相互作用结构域与其靶蛋白结合的化合物。

本发明还包括一种基本纯化的多肽，后者包括一个不具功能性CIITA相互作用结构域的CIITA转录激活结构域。优选地，该多肽包括一种与图1中所示序列26-352的一个多于50个氨基酸序列基本相同的多于50个氨基酸的序列。

相关的工作中，本发明记述了基本纯化的编码CIITA转录激活结构域而不编码有功能的CIITA相互作用结构域的DNA(如，基因组DNA，cDNA或合成DNA)。

本发明进一步记述了一种基本纯化的多肽，它包括一种CIITA相互作用结构域而不包括一种有功能的CIITA转录激活结构域。优选地，该多肽包括与图1所示序列301-1130氨基酸的多于50个氨基酸的序列基本相同的一个多于50个氨基酸的序列。

相关的工作中，本发明记述了基本纯化的编码CIITA相互作用结构域而不编码有功能的CIITA转录激活结构域的DNA(如，基因组DNA，cDNA或合成DNA)。

此外，本发明记述了一种基本纯化的多肽，它包括克隆13细胞系(细胞系的描述，参看Ono等，1991，J.Exp.Med.(实验医学杂志)173：629-637)CIITA多肽的相互作用结构域。克隆13 CIITA激活MHC II类DQ基因的转录而不激活MHC II类DR和DP基因的转录。优选地，该多肽包括与图1所示序列301-1077氨基酸的多于50个氨基酸序列基本相同的一种多于50个氨基酸的序列，但是缺失了图1所示序列1-300和1078-1130的氨基酸。相关的工作中，本发明包括一种基本纯化的编码克隆13CIITA的DNA(如，基因组DNA，cDNA或合成DNA)。

本发明还包括其它同型特异CIITA突变子，而且进一步描述的方法中使用CIITA同型特异突变子的激活和相互作用结构域来确定化合物是否为转录的同型特异抑制剂。同型特异抑制剂的化合物也是潜在的自身免疫疾病治疗药物。当这种化合物能够抑制与自身免疫疾病有关的特殊基因而不影响其它MHC II类基因的表达时将会特别有用。于是，同型特异化合物作为自身免疫疾病治疗药物使用时，就可能避免引起普遍的免疫抑制。

一种化合物它能通过这儿描述的一个采用同型特异性CIITA的抑制测试并与那些同野生型CIITA和CIITA突变子不同同型特异性相比较而得到的结果鉴定的，例如，抑制依赖于野生型而非克隆13CIITA转录的化合物在对抑制MHC II类DR和DP基因中是有效的。因为DR1和/或DR4的表达与类风湿关节炎93％的病例有关，所以特异性抑制DR基因转录的化合物是类风湿关节炎疗法中一个有力的候选药物。类似的，两种CIITA的同型特异抑制剂能够用来确定一个化合物是否是转录的同型特异抑制剂。例如，一种可比较的方法可用于第一个激活DR和DP转录的突变子，而第二个突变子只激活DP的转录。抑制第一个突变子活力而不抑制第二个突变子的化合物可用于选择性抑制DR基因的表达。

“II类转录激活基因(CIITA基因)”是指编码转录激活子的基因，该基因80％或更多序列与图1所示的CIITA序列相同(SEQ ID NO：1)。

“CIITA转录激活结构域”指一种80％或更多序列与图1所示CIITA多肽序列26-352氨基酸相同的多肽，不具有一个功能性CIITA相互作用结构域。

“CIITA相互作用结构域”是指一种80％或更多序列与图1所示CIITA多肽序列301-1130氨基酸相同的多肽，不具有功能性CIITA转录激活结构域。CIITA相互作用结构域一种突变子的例子是克隆13 CIITA的相互作用结构域，该DNA序列至少部分特征在于：图1所示野生型CIITA序列3211-3214核苷酸的缺失(这与以前描述过的(Steimle等，)cDNA序列3326-3329核苷酸相对应)从而产生一种相对于野生型为53个氨基酸截短的蛋白质。

应该明白的是在此定义的CIITA转录激活结构域和相互作用结构域有51个氨基酸的重叠。然而重叠区域不足于形成一个有功能的转录激活或相互作用结构域。于是，含有图1所示26-352氨基酸而缺失353-1130氨基酸序列的多肽具有有功能的转录激活结构域而缺失有功能的相互作用结构域。类似的，含有图1所示301-1130氨基酸而缺失1-300氨基酸序列的多肽具有功能的相互作用结构域而缺失有功能的转录激活结构域。

“多肽”是指任何氨基酸链，不用考虑长度或转录后修饰(例如，糖基化或磷酸化)。

“可切割地相连”是指一种基因与调节序列如此相连以致在合适的分子(如，转录的激活子蛋白)与调节序列连接时可允许基因表达。

“报告基因”指一种其表达可测试的基因；没有限制，这类基因包括：lacZ、氯霉素酰基转移酶(CAT)、β-葡糖苷酸酶(GUS)和虫荧光素酶基因。

“基本相同”是指一种多肽或核酸表现出至少50％，优选为85％，更优选为90％而最优选为95％与参照氨基酸或核酸的同源性。对于多肽，对比序列的长度一般至少为16个氨基酸，优选至少为20个氨基酸。更优选地至少为25个氨基酸而最优选至少为35个氨基酸。对核酸，对比序列的长度一般至少为50核苷酸，优选为至少60个核苷酸，更优选为至少75个核苷酸而最优选为110个核苷酸。

序列相同性典型地是用序列分析软件测定(例如，WI53705，麦迪逊1770大学街道，威斯康星大学生物技术中心，遗传计算研究组的序列分析软件包)。该软件通过各种替换、缺失、替换和其它修饰形成同源性的程度来匹配相似的序列。保守替换典型地包括在以下各组内替换：甘氨酸，丙氨酸；缬氨酸，异亮氨酸，亮氨酸；天冬氨酸，谷氨酸，天冬氨酰，谷氨酰；丝氨酸，苏氨酸；赖氨酸，精氨酸；和苯丙氨酸，酪氨酸。

“基本纯化的多肽”指从天然伴随成分中分离的多肽。典型地，多肽重量的60％不含与其天然相连的蛋白或天然存在的有机分子时该多肽基本纯化。优选的制剂至少为按重量计75％、更优选为90％而最优选为99％所需的蛋白质。例如，从天然原料(如，人的细胞)中提取；表达编码CIITA转录激活结构域或CIITA相互作用结构域的重组核酸；或化学合成多肽可获得基本纯化的CIITA转录激活结构域或CIITA相互作用结构域。纯度可用合适的方法(例，柱层析、聚丙烯酰胺凝胶电泳和HPLC分析)测定。

蛋白从其天然伴随的污染物中分离出来时基本不含天然伴随的成分。于是，化学合成、体外合成或在不同于其天然产生细胞的细胞体系中产生的蛋白基本上不含其天然伴随的成分。因此，基本纯净的多肽包括那些源于真核细胞但在大肠杆菌或其它原核细胞中表达的多肽。

“基本纯化的DNA”指不含在本发明DNA来源的有机体天然存在基因组中处于该基因侧翼的基因。所以该术语包括比如，连接入载体的重组DNA、或连接入一种自我复制的质粒或病毒、或进入一种原核或真核细胞基因组DNA(如，酵母细胞)；或作为一个单独的分子(cDNA或一个基因组或PCR或限制性酶切片段产生的cDNA片段)独立于其它序列存在。该术语还包括作为编码额外多肽序列杂交基因部分的重组DNA。

详述

首先说明附图。

图1为全长CIITA(见SEQ ID NO：1)的核酸和推测氨基酸序列。

图2是CIITA缺失突变子和用于鉴别CIITA转录激活或相互作用结构域的体内分析的图解说明。转录分析的结果也总结于本图。

图3是转录分析中用于鉴别CIITA转录激活或相互作用结构域的酵母细胞的照片。

图4组方图中的数据来自比色分析，用于测定lazC基因的转录从而鉴别CIITA的转录激活结构域和相互作用结构域。

图5是质粒pCMV.ciita的图解。

图6A-E是一系列FACS图谱，表明α-TDF/CIITA任何蛋白在克隆13细胞和RM3中的表达恢复MHC II类基因的表达。

图7是一系列FACS图谱，表明野生型CIITA在克隆13细胞中的表达修正了DR和DP同型表达的缺陷而且增加了DQ的表达。

图8A-F是本文描述过的质粒的图解说明。

CIITA转录激活结构域

我们首次鉴别了CIITA的一个片段，该片段在CIITA蛋白区域部分缺失而存在另一种完整的转录系统时足以激活转录。我们称该片段为CIITA的转录激活结构域。为了鉴别CIITA的这一结构域，构建一系列质粒(从载体pEG202)以产生融合蛋白，这些蛋白包含附着于大肠杆菌阻遏蛋白LexA N末端202氨基酸二聚化和DNA结合结构域的CIITA部分。

构建这些质粒或本文描述过的其它质粒的方法见以下的“质粒的构建”。

每一个lexA-CIITA独立地与一种lacZ报告质粒(pSH18-34)共转化入酵母细胞EGY48株(his3^-和ura3^-)。这些质粒在酵母中是由LexA-CIITA质粒中HIS3质粒的表达和pSH18-34中URA3的表达维持的。LexZ报告基因的调节序列在GAL1上游激活序列包括8个LexA结合位点(图2)。该实验分析中，LexA多肽作为一种DNA结合蛋白，使CIITA多肽接近转录位点。

缺乏LexA融合蛋白时，携带pSH18-34报告基因的酵母没有从lacZ基因中产生可检测的β-半乳糖苷酶而且在含X-gal培养基中呈现白色(图3；pHRFM1，一个阴性对照)。此外，携带只表达LexA N末端202个氨基酸或一种已知没有转录活性(pSH17-4)的融合蛋白的转录的酵母没有产生可检测的β-半乳糖苷酶。相反，含与CIITA转录激活结构域(大约N末端29％)融合的LexA多肽的酵母株诱导合成足量的β-半乳糖苷酶，宿主酵母细胞在含X-gal培养基上呈现蓝色。此外，测定含融合蛋白和邻硝基苯基-β-半乳糖苷酶培养基的光密度进行定量的比色分析(见图4)(Ausubel等，In：分子生物学动态(Current Protocol inMolecular Biology)，J.Wiley&Sons，1994)。我们的数据还表明包括CIITAN末端区域大约8％的多肽足以激活转录。CIITA的这一部分包含转录激活结构域的酸性部分；如果需要，用N末端29％所做的实验可与用N末端8％所做的实验对比。包括CIITA N末端区域大约29％的多肽至少与全长的CIITA一样有效的激活转录。于是，CIITA全长的氨基酸26-352和核苷酸78-1,056表示转录激活结构域(这些数字涉及CIITA编码序列，CIITA cDNA序列在核苷酸116处的起始(以下Steinle.等，))。

用CIITA转录激活结构域鉴别自身免疫疾病治疗药物

CIITA激活结构域可用以鉴别抑制CIITA依赖转录的化合物。因为CIITA为MHC II类基因激活所需，所以特异抑制CIITA依赖转录的化合物是有效的自身免疫疾病候选药物。我们发现CIITA的一个片段(称CIITA转录激活结构域)在CIITA蛋白其余部分缺失而其它完整的转录系统存在时能够激活转录，由此有利于鉴别抑制为CIITA激活的转录的化合物。

有效的化合物因其抑制CIITA依赖转录的能力而可鉴别。因此，在任何使用CIITA激活结构域的转录分析系统中可测试化合物对转录的抑制。下面的例子可用以鉴别抑制CIITA依赖的转录；该实验中鉴别出的化合物可作为自身免疫疾病候选药物。其它的实验分析(如，Keegan等1986科学23：699；Ma等，1987细胞48：847；Lin等，1988，细胞54：659；Sadowski等，1988，自然335：563；Robert等，1993自然363：741；Ma etal.，以及1998，细胞55：443等所记述过的)可改进为用我们发现的CIITA转录激活域。CIITA转录激活域可简单地克隆入合适的载体，这样其它的转录分析也包含于本发明中，其适用和范围由以下的权利要求确定。

实施例1鉴别抑制CIITA转录激活结构域的化合物

为了鉴别有效的化合物，宿主酵母株EGY48(his3^-，ura3^-和Leu^-)用两种质粒转化。第一个质粒，pSH18-34携带GAL1 TATA转录起始位点和与lacZ基因可切割相连的GAL1编码序列的一个片段(Zervos等，1993，细胞72：223-232和Gyuris等，1993，细胞75；791-803)。该质粒也为LexA在GAL1上游激活序列处携带8个结合位点，而且它携带一个URA3选择标记。第二个质粒，pEG.ciita.N29，源于质粒pEG202而且携带编码CIITA转录激活结构域的序列。该质粒也携带选择标记(HIS3)基因和LexA(氨基酸1-202)的DNA结合和二聚化结构域。对照酵母株中，第二质粒可以为pSH17-4(Gyuris等，1993，细胞75：791-803)，它编码与一个质粒激活结构域如pHRFM1或CDK2(Zervos等.，1993，细胞72：223-232 Gyuris等，1993，细胞75：791-803)融合的LexA。

双重转化酵母株的少量培养物与化合物混合用以在适宜的条件(如，30℃摇动过夜)下于合适的培养基(如，SGR、-his，-ura，+X-gal(80mg/L))中筛选和培养。然后测定产生的蓝色发色团(例如，测定光密度或人工检查培养基)。抑制测试质粒(pEG.ciita，N29)而不抑制对照质粒(pSH17-4)转录的激活的化合物可抑制MHC II类分子的表达，从而是自身免疫疾病有效的候选药物。

CIITA相互作用结构域

以上的缺失分析也表明包括全长CIITA氨基酸1-26和301-1130(核苷酸1-78和903-3390)的多肽单独不能激活转录(图1、2、3)。由于该结构域在缺失转录激活结构域(源于CIITA或其它转录激活子)时不能激活转录，可作出结论：该结构域通过结合细胞转录器(如，一种聚合酶或一种DNA结合蛋白)的其它成分介导转录。因此，CIITA氨基酸301-1130(C末端74％)称为CIITA相互作用结构域。尽管CIITA相互作用结构域单独不能激活转录，但是抑制相互作用结构域与其正常的细胞靶蛋白结合的化合物可有效的抑制CIITA的转录，因此也是潜在的自身免疫疾病治疗药物。

CIITA相互作用结构域用于恢复MHC II类基因表达

为了证实氨基酸301-1130包括了CIITA相互作用结构域，我们实验分析了在不能表达这些基因的突变细胞系中CIITA的这一区域恢复MHC II类基因表达的能力。这些研究中，我们用质粒pCMV.ciita(图5)构建了一个质粒pCMV.αTDF-CIITA.C70，它在CIITA相互作用结构域和单纯疱疹病毒株F的α-诱导因子转录激活结构域之间产生一个融合蛋白。作为阴性对照，产生一个缺失CIITA转录激活结构域的质粒pCMV.CIITA.C74。第二个阴性对照使用在缺失相互作用结构域时编码CIITA转录激活结构域的pCMV.ciita Hind III。作为转染效率的对照，用pCMV/K^b转染细胞。作为阳性对照，用编码全长CIITA的pCMV.ciita转染细胞。这些细胞独立地转染入人B细胞。一个B细胞系RM3缺乏DR、DP和DQ的表达。第二个B细胞系克隆B、DR和DP的表达缺陷，但不包括DQ。第三个细胞系Raji表达三个MHC II类基因的野生型水平。以DR(LB3.1)、DQ(SPV.L3，相当于Genox.53)、DP(B7/21)、I类分子(W6/32)或K^b(Y-3)的抗体用标准技术对每个细胞系中细胞染色，然后用荧光激活细胞分选(图6 FACS)进行分析。这些数据表示哺乳类B细胞中α-TDF/CIITA相互作用结构域融合蛋白的表达恢复突变细胞系表面MHC II类基因的表达。于是，CIITA的氨基酸(301-1130)可发挥相互作用结构域的作用。

实施例2  相互作用抑制剂化合物的细胞实验

以上描述过的方法改进后可提供一个测定化合物是否抑制CIITA依赖的转录的方法。该方法中，待试化合物只是简单地加入转染细胞的培养基中。抑制α-TDF/CIITA融合蛋白恢复细胞表面MHC II类分子表达的化合物是潜在自身免疫疾病治疗药物。该方法也可鉴别转录的同型特异抑制剂。例如，导致α-TDF/CIITA融合蛋白只恢复MHC II类基因的一种亚类的化合物是同型特异抑制剂。因为这样的化合物可选择性地抑制MHC II类基因转录，所以是特别有价值的自身免疫疾病药物。以上描述的细胞为基础的测试可单独使用或与以下描述的用两种融合蛋白所做的测试联合使用。

CIITA相互作用靶蛋白

其它的测定中，抑制CIITA依赖的转录的化合物也可因其在细胞转录机器中抑制CIITA相互作用结构域结合靶蛋白的能力而得以鉴别。现在我们已经发现CIITA氨基酸301-1130的功能是通过其在细胞中结合其它的蛋白(在此指靶蛋白)来介导转录，用广泛使用的相互作用捕获克隆可方便快捷地克隆出CIITA靶蛋白。如以下所要说明的，相互作用捕获克隆改进后可用以鉴别抑制CIITA相互作用结构域结合其靶蛋白的化合物；这种化合物为潜在的自身免疫疾病治疗药物。简单地说，相互作用捕获克隆是用一个蛋白的相互作用结构域和第二个蛋白激活结构域方便快捷地鉴别相互作用结构域所联的一个靶蛋白。靶蛋白使相互作用结构域能够介导报告基因的转录；转录可用以下的方法鉴定。用该系统以及我们发现的相互作用结构域可快捷地克隆出CIITA相互作用结构域的靶蛋白。下面是关于CIITA靶蛋白克隆和用CIITA相互作用结构域鉴别潜在自身免疫疾病治疗药物的说明。

实施例3：克隆CIITA相互作用靶蛋白

为了克隆CIITA相互作用结构域的靶蛋白，用编码第一个融合蛋白的第一个质粒转化宿主细胞(例如，EGY48株酵母细胞)。第一个融合蛋白包括与一种没有CIITA激活结构域的CIITA相互作用结构域融合的DNA结合蛋白(如，LexAN末端202个氨基酸)。酵母细胞还携带一个报告基因(lacZ、CAT、GUS、人生长激素、碱性磷酸酶或虫荧光素酶基因)，后者与第一个融合蛋白结合的调节序列可操作地相连。报告基因可能在一个质粒或染色体上。此外，用编码第二个融合蛋白的质粒转化酵母细胞。第二个融合蛋白包括与待试多肽融合的一个蛋白的转录激活结构域(如，B42酸性激活结构域(Ma等，1988，细胞55：443-446))，该多肽按下述方法测试其介导报告基因转录的能力。允许报告基因转录的多肽为CIITA相互作用结构域的靶蛋白。编码潜在靶蛋白的DNA分子可从文库(例如从人Burkitt氏B淋巴细胞，Raji所获的poly-A⁺RNA制备的cDNA文库)中获得。对照测试中，CIITA相互作用结构域可由其它蛋白(例如，pHRFM1或CDK2(以下的Zervos和Gyuris))的相互作用结构域代替。

实施例4：用CIITA相互作用结构域鉴别自身免疫疾病治疗药物

通过干扰CIITA相互作用结构域而抑制转录的化合物可通过测试其抑制CIITA相互作用结构域与靶蛋白结合的能力得以鉴别。任何测定蛋白质-蛋白质间相互作用的方法可用于鉴别加入后抑制蛋白质-蛋白质相互作用的化合物。例如，基于ELISA、Southwestern杂交，滤纸和膜结合蛋白以及固定化蛋白的鉴定均可用于测定对CIITA相互作用结构域和其靶蛋白结合的抑制。以下一种方法的详例用于识别抑制CIITA相互作用结构域功能，从而是潜在自身免疫疾病治疗药物的化合物。

一种优选的方法中，编码第一个融合蛋白的第一个质粒转化宿主细胞(例如，EGY48株的酵母细胞)。第一个融合蛋白包括与一个没有CIITA激活结构域的CIITA相互作用结构域融合的DNA结合蛋白(如，LexA N末端202个氨基酸)。酵母细胞还携带一种报告基因(lacZ、CAT、GUS、人生长激素、碱性磷酸酶或虫荧光素酶基因)，后者与第一个融合蛋白结合的调节序列可操作地相连。报告基因可能在质粒或染色体上。此外，用编码第二个融合蛋白的质粒转化酵母细胞。第二个融合蛋白包括与CIITA相互作用结构域的靶蛋白融合的一种蛋白的转录激活结构域(如，B42)。

有效的化合物可由其抑制报告基因转录的能力而鉴别。转化细胞的培养物与待试化合物混合并在适宜的条件(如，30℃摇动过夜)下于维持质粒表达的培养基上生长。然后测定基因表达的水平。例如，如果LacZ用作报告基因可测定X-gal存在时蓝色发色团产生的数量(例如测定光密度或人工检查细胞培养基的颜色)。测试中用CIITA相互作用结构域而非对照相互作用结构域抑制转录激活的化合物能够抑制MHC II类分子的表达，所以是自身免疫疾病有力的候选药物。这种鉴定可独立或与实施例2中基于细胞的测定联合使用。

CIITA克隆13突变子鉴别

在改变蛋白激活某一MHC II类同型抗原转录能力的CIITA中我们鉴别了一种突变子。该突变子称为克隆13 CIITA，存在于人B细胞Jijoye(由麻省哈佛大学L.Glimcher惠赠)来源的克隆13细胞系中。克隆13CIITA在MHC II基因DR和DP同型抗原的转录中活力低下但在DQ中却并非如此。我们已经发现野生型CIITA基因在克隆13中的表达能够使细胞转录DR和DP同型抗原。这些研究中，CIITA基因克隆入载体pCMV，产生载体pCMV.ciita(图5)，然后通过电穿孔转染克隆13细胞。

转染细胞用FACS分析DR和DP同型的表达(图7)。作为对照，以同样的方法检测Raji细胞(它表达DR、DP和DQ)和未转化的克隆13细胞。用标准技术以抗体给细胞染色。除了用抗DR(LB3.1；自Becton-Dickinson的L243抗体亦可用)、抗DQ(Genox.53；ATCC#HB103)或抗DP(B7/21；Becton-Dickinson)抗体之外，也用抗I类抗体(W6/32；阳性对照，ATCC#HB95)和抗Kb抗体(Y-3；阴性对照。ATCC#HB95)给细胞染色。参看图7，用抗DP、抗DR或抗DQ的抗体染色时CIITA在克隆13细胞中的表达增加了这些细胞的相对荧光。于是，野生型CIITA在克隆13细胞中的表达纠正了克隆13突变CIITA的缺陷。

实施例5同型特异化合物的鉴别

克隆13突变CIITA的相互作用结构域可用在实施例4描述的方法以鉴别为CIITA依赖性转录同型特异抑制剂的化合物。如果需要，克隆13CIITA转录激活结构域或全长多肽可用于其它方法中以鉴别有效的化合物。抑制野生型CIITA而非克隆13突变CIITA的CIITA依赖转录的化合物对抑制DR和DP MHC II类同型抗原的表达有效，但不抑制DQ的表达。这种化合物为同型特异性而且可用于参与抑制某一免疫应答的特殊基因的表达而不引起普遍的免疫抑制。因为很多自身免疫疾病如类风湿关节炎(参考表1和表2)与特定的同型相关，可抑制MHC II类基因的亚类表达的化合物对选择性影响免疫系统特别有价值。

其它的实施方案

其它的实施方案在以下的权利要求中。例如，克隆13 CIITA以外的同型特异性CIITA突变子激活和相互作用结构域也包含在本发明中。同型特异性CIITA突变子可用上面克隆13CIITA所描述过的方法鉴别。MHC II类基因的一种亚类表达缺陷的细胞系是同型特异CIITA蛋白的潜在来源。含同型特异CIITA的细胞系可由潜在细胞系中野生型CIITA的表达和CIITA的表达是否纠正MHC II类基因表达的缺陷来鉴别。突变CIITA基因可用克隆13中所用的技术克隆。于是，实施例5中提示的方法对分离其它同型特异CIITA突变子仍然有效，该突变子可用于确定化合物是否是转录的同型特异抑制剂。

另外的测试CIITA依赖的转录的方法也包含在本发明中。例如，以前描述过的转录测试(例如，参看Keegan等，1986，科学23：699；Ma等，1987细胞48：847；Lin等，1988，细胞54：659；Sadowski等，1988，自然335：563；Roberts等，1993，自然363：741；和Ma等，1988，细胞55：443)用合适的CIITA转录激活结构域替代物，简单地将化合物加入测定实验中，可鉴定有效的化合物。此外，以上描述的测定的改进可用于本发明中。例如，其它的DNA结合蛋白如GAL4可代替LexA。报告基因，如氯霉素酰基转移酶(CAT)、荧光素酶β-葡糖苷酸酶(GUS)、人生长激素、碱性磷酸酶或任何其表达可鉴定的基因均可代替lacZ基因。非酵母的宿主细胞也可使用。例如：可用原核或其它真核细胞(如：细菌，哺乳动物和植物细胞)测定蛋白质-蛋白质相互作用的方法如基于ELISA、Southerstern杂交、滤纸和膜结合的蛋白和固定化蛋白的测试均可用于鉴别抑制CIITA相互作用结构域和其靶蛋白结合的化合物。显而易见，标准分子生物学技术使人们能够将CIITA相互作用结构域用于其它蛋白质相互作用的测定。

质粒构建

原始的CIITA模板是由HLA II类阳性B细胞系Raji提取的polyA⁺RNA通过RT-PCR获得。然后将PCR产物直接克隆入PCRII(In vitrogen)。所获的克隆中，三个(pCRII.ciita.b，pCRII.ciita.h和pCRII.ciita.p)用于产生一个完整的cDNA真核表达构建物(参看图5和8)。

pCRII.ciita.b：用于该构建物的CIITA特异性PCR引物5’末端为5’-   GGAAGCTGAGGGCACGAGGA-3’而3’末端为3’-CAGAAGAGACAGGGGACGGTAAC-5’。

pCRII.ciita.h：用于该构建物的CIITA特异性PCR引物5’末端为5’-   CTCCAACAAGCTTCCAAAATG-3’而3’末端为3’-GTACAAGAGACTCCTGTGATTG-5’。

pCRII.ciita.p：用于该构建物的CIITA特异性PCR引物5’末端的为5’-   GTCCCTGAAGGATGTGGAAGAC-3’而3’末端为3’-GTCTGACCTTCGTGTCGAAG-5’。

pCMV.ciita：该构建物以pLB-1为载体以pCRII.ciita.b、pCRII.ciita.和pCRII.ciita.p为插入片段通过多步亚克隆而得。首先，由HindII酶切pLB-1和T4聚合酶处理制备载体DNA，然后NotI活化消化；5’CIITADNA插入片段由pCRII构建物中PCR插入片段侧翼的EcoRI位点酶切pCRII.ciita.b，凝胶纯化较小的片段，T4聚合酶处理后NotI活化消化(NotI在CIIT序列的核苷酸1340处)。这两个片段由T4连接酶连接，所产生的pCMV.ciita亚构建物称为pCMV.ciita.b。

BamHI消化pCMV.ciita.b，凝胶纯化较小的片段，T4聚合酶钝化，然后为NotI消化活化；类似的，pCRII.ciita.p为EcoRI酶切、T4聚合酶钝化、然后NotI活化消化。较小的片段凝胶纯化后使用。载体和插入片段以T4连接酶连接，由此产生的pCMV.ciita的第二个亚构建物称pCMV.ciita.bp。

pCMV.ciita.bp进一步用BamHI和NotI消化；pCRII.citta.h也用BamHI和NotI消化，凝胶纯化较小的片段。T4连接酶连接两个较小的片段，所得的含CIITA cDNA序列(核苷酸48-4471)的构建物称为pCMV.ciita.bp。

pCMV.CIITA：pCMV.ciita构建后并确证其恢复HLA II类一般表达(通过转染HLA II类阴性细胞系(RM3和克隆13)和FACS分析)的生物学功能之后制备了该构建物。CIITA cDNA构建物pKS/CIITA(+)(自瑞士日内瓦，日内瓦大学B.Mach博士)也在这些实验中使用。该质粒中，载体为pBluescript KS(+)(Stratagene)，cDNA插入多克隆位点的SalI位点。为了构建pCMV.CIITA，pCMV用XhoI和NheI消化，用酶切位点在cDNA插入片段侧翼的XhoI和SpeI酶切pKS/CIITA获得CIITAcDNA酶切片段。两个片段用T4连接酶连接，所得的构建物称为pCMV.CIITA(大写字母表示DNA来源为原始cDNA文库)。

pEG.CIITA：用pED.CIITA.SalI和pTrc.CIITA制备该质粒。BamHI消化pED.CIITA.SalI而且凝胶纯化大片段；BamHI消化pTrc.CIITA获得CIITA序列，载体和插入片段应T4连接酶连接。

pED.CIITA.SalI pEG202首先用SalI线性化并用CIP脱磷酸化；SalI消化pCMV.CIITA获得CIITAcDNA；载体和插入片段连接，所得的带CIITAcDNA插入片段的中间pEG构建物称为pED.CIITA.SalI.

pTrc.ciita该构建物最初产生于重组CIITA蛋白的过表达。首先将5’CIITA序列克隆(用PCR，如以下pEG.ciita.N29构建的途径)入pTrcHisC(Invitrogen)的BamHI的位点和XhoI位点。所得的质粒pTrc5或pTrc/ciita5用XhoI线性化、T4聚合酶钝化并且用DraIII活化；CIITA下游3790bp由ScaI和DraIII消化pCMV.ciita、并且连接两个片段而得。

pEG.ciita.N29：设计一对引物用以在LexA N末端第202个密码子处将CIITAN末端29％按阅读框融合入pEG202。5’反向引物的序列为AATGGATCcgttgcctggctcca(大写字母表示标记的序列包括一个以阅读框克隆的BamHI位点)3’正向引物为CCGCTCGAGcggcaccatacgtgt(标记的序列包括一个XhoI位点)。这些引物在聚合酶链式反应(PCR)中以全长的CIITAcDNA模板产生一个1060bp片段。PCR反应为95℃5分钟、55℃5分钟72℃3分钟循环三次，随后95℃1分钟、60℃2分钟、72℃1分钟循环30次。产生的DNA片段用BamHI和XhoI循环后，克隆入pEG202载体相应的BamHI和XhoI的位点。终止密码子由pEG202XhoI位点后的载体序列提供。

pCMV和pLB-1：pCMV是由pREP7(InVitrogen)产生的一个EBV过表达载体；过程为：用SalI部分消化Klenow酶钝化后将以后BglII连接子插入第二个SalI位点(nt.1091)；Hind III和BglII双酶切消化；最后与pCDM8(Invitrogen)SpeI消化Klenow酶钝化；BglII连接子插入；以及HinlIII和BglI消化并凝胶纯化而。制备的CMV启动子片段连接。用于制备第一个ciita(小写字母表示构建物为PCR衍生产物)亚构建物的载体为pLB-1，它是通过在HindIII和NotI位点之间插入约1kb填充DNA以助于HindIII/NotI的双重消化而从pCMV中衍生而来。

pEG.CIITA.C74：用BamIII使pEG202线性化，T4聚合酶钝化、SalI活化；插入片段通过SphI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶钝化，SalI活化制备；然后连接两个片段。

pEG.CIITA.C50：用EcoRI使pEG202线性化，T4聚合酶钝化、SalI活化；插入片段通过NcoI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶钝化，SalI活化制备；然后连接两个片段.

pEG.CIITa.C30：用BamHI使pEG202线性化，T4聚合酶钝化、SalI活化；插入片段通过kpnI消化pCMV.CIITA，T4聚合酶钝化，SalI活化制备；然后连接两个片段.

pEG.CIITA.C14：用BamHI完全酶切、稀释和连接pEG.ciita。用标准技术分离含ORF N-14％的重环化缺失构建物。

pEG.ciita.N70：用XhoI使pEG202线性化，T4聚合酶钝化、BamHI活化；插入片段通过KpnI消化pET.ciiTA，T4聚合酶钝化，BamHII活化制备；然后连接两个片段。CIITA的过表达构建物pET.ciiTA如pEG.ciiTA(以上)的构建一样，将CIITA的开放阅读框克隆入pET28c(Novagen)。

pEG.ciita.N56：用XhoI使pEG202线性化，T4聚合酶钝化、BamHI活化；插入片段通过SfiI消化pET.ciiTATA，T4聚合酶钝化，BamHI活化制备；然后连接两个片段。

pEG.ciita.N22：用BanI消化pTrc5的含ciita的NheI/XhoI片段、T4聚合酶钝化、用BamHI酶切获得插入片段。用XhoI线性化pEG202、T4聚合酶钝化、最后用BamHI酶切获得载体。然后连接制备的插入片段和载体。

pEG.ciita.N17：用EaeI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶钝化、用BamHI酶切获得插入片段。用XhoI线性化pEG202、T4聚合酶钝化、最后用BamHI酶切获得载体。然后连接制备的插入片段和载体。

pEG.ciita.N12：用MspI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶钝化、用BamHI酶切而获得插入片段。用SalI线性化pEG202、T4聚合酶钝化、最后用BamHI酶切获得载体。然后按阅读框连接制备的插入片段和载体。

pEG.ciita.N7.6：用EcoNI消化pTrc5的小NheI/XhoI片段、T4聚合酶钝化、用BamHI酶切获得插入片段。用XhoI线性化pEG202、T4聚合酶钝化、最后用BamHI酶切获得载体。然后连接制备的插入片段和载体。

pEG.C-αTDF：插入HSV-1 F株α-转导因子(transducing factor)C未端16％Pelltt等，1985，PNAS 82：5870-5874；登记号k033501到pEG202。

pEG.C’-αTDF：插入HSV-1 F株α诱导因子C末端16％(除了最C末端的3个密码子)。这一构建物的插入片段后来用于构建pCMV.αTDF-CIITA.C70。

pCMV.ciita＾HindIII：该构建物包括CIITA N末端的29％的ORF，由HindIII消化pCMV.ciita、纯化主要谱带和重环化制得。

pCMV.CIITA.C74：该构建物包括N末端25个密码子和CIITA大约74％的C末端ORF，由多步亚克隆产生。首先，NcoI酶切pKS/CIITA(+)、T4聚合酶钝化、然后XhoI酶切作为载体。类似的，它为SphI酶切，T4聚合酶钝化然后用XhoI酶切作为插入片段。两个片段以T4聚合酶连接，产生所构建物称为pKS.CIITA＾N/S。为了产生pCMV.CIITA.C74，pKS.CIITA＾N/S用SpeI和XhoI酶切，然后将含CIITA片段插入NheI/XhoI酶切的pCMV载体中。

pCMV.αTDF-CIITA.C70：这是由多步亚克隆产生的。首先，pKS/CIITA(+)用Tth111I酶切、T4聚合酶钝化、然后用T4连接酶连接。该中间构建物称pKS/CIITA.＾Tth。然后以NcoI和AatII酶切之、T4聚合酶钝化、与编码HSV1(F株)α诱导因子C末端(除了最C端3个密码子)按阅读框连接。第二个中间载体称pKS/α TDF-CIITA.＾Tth。含NotI片段的5’αTDF-CIITA用于置换pKS/CIITA(+)相应的5’NotI片段。该第三中间构建物称为pKS/α TDF-CIITA.70。为了产生pCMV.αTDF-CIITA，pKS/αTDF-CIITA用SpeI和XhoI酶切。然后将含αTDF-CIITA片段插入NheI/XhoI酶切的pCMV片段。

序列表

(1)概况

(i)申请人：Glimcher，Laurie H.

           Zhou，Hong

           Douhan III，John

(ii)发明标题：鉴别对治疗自身免疫疾病有效的化合物的方法

(iii)序列数：1

(iv)联系地址：

  (A)地址：Fish&Richardson

  (B)街道：225 Franklin Street

  (C)城市：波士顿

  (D)州：马萨诸塞

  (E)国家：美国

  (F)区号：02110-2804

(v)计算机可读方式：

  (A)介质类型：软盘

  (B)计算机：IBM PC兼容机

  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

  (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本#1.30B(vi)当前申请材料：

  (A)申请号：

(B)提交日期：

(C)分类：(viii)委托/代理人信息：

(A)姓名：Freeman，John W.

(B)注册号：29,066

(C)参考/存档号：00264/188001(2)SEQ ID No：1：的信息：(i)序列特征：

(A)长度：3393碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓朴学：线性(ii)分子类型：DNA(基因组的)(ix)特征：

(A)名称/键：CDS

(B)定位：1..3393(xi)序列描述：SEQ ID No：1：ATG CGT TGC CTG GCT CCA CGC CCT GCT GGG TCC TAC CTG TCA GAG CCC         48Met Arg Cys Leu Ala Pro Arg Pro Ala Gly Ser Tyr Leu Ser Glu Pro1               5                  10                  15CAA GGC AGC TCA CAG TGT GCC ACC ATG GAG TTG GGG CCC CTA GAA GGT         96Gln Gly Ser Ser Gln Cys Ala Thr Met Glu Leu Gly Pro Leu Glu Gly

         20                  25                  30GGC TAC CTG GAG CTT CTT AAC AGC GAT GCT GAC CCC CTG TGC CTC TAC        144Gly Tyr Leu Glu Leu Leu Asn Ser Asp Ala Asp Pro Leu Cys Leu Tyr

     35                  40                  45CAC TTC TAT GAC CAG ATG GAC CTG GCT GGA GAA GAA GAG ATT GAG CTC        192His Phe Tyr Asp Gln Met Asp Leu Ala Gly Glu Glu Glu Ile Glu Leu

 50                  55                  60TAC TCA GAA CCC GAC ACA GAC ACC ATC AAC TGC GAC CAG TTC AGC AGG        240Tyr Ser Glu Pro Asp Thr Asp Thr Ile Asn Cys Asp Gln Phe Ser Arg65                  70                  75                  80CTG TTG TGT GAC ATG GAA GGT GAT GAA GAG ACC AGG GAG GCT TAT GCC        288Leu Leu Cys Asp Met Glu Gly Asp Glu Glu Thr Arg Glu Ala Tyr Ala

             85                  90                  95AAT ATC GCG GAA CTG GAC CAG TAT GTC TTC CAG GAC TCC CAG CTG GAG        336Asn Ile Ala Glu Leu Asp Gln Tyr Val Phe Gln Asp Ser Gln Leu Glu

        100                 105                 110GGC CTG AGC AAG GAC ATT TTC AAG CAC ATA GGA CCA GAT GAA GTG ATC        384Gly Leu Ser Lys Asp Ile Phe Lys His Ile Gly Pro Asp Glu Val Ile

    115                 120                 125GGT GAG AGT ATG GAG ATG CCA GCA GAA GTT GGG CAG AAA AGT CAG AAA        432Gly Glu Ser Met Glu Met Pro Ala Glu Val Gly Gln Lys Ser Gln Lys

130                 135                 140AGA CCC TTC CCA GAG GAG CTT CCG GCA GAC CTG AAG CAC TGG AAG CCA        480Arg Pro Phe Pro Glu Glu Leu Pro Ala Asp Leu Lys His Trp Lys Pro145                 150                 155                 160GCT GAG CCC CCC ACT GTG GTG ACT GGC AGT CTC CTA GTG GGA CCA GTG        528Ala Glu Pro Pro Thr Val Val Thr Gly Ser Leu Leu Val Gly Pro Val

            165                 170                 175AGC GAC TGC TCC ACC CTG CCC TGC CTG CCA CTG CCT GCG CTG TTC AAC        576Ser Asp Cys Ser Thr Leu Pro Cys Leu Pro Leu Pro Ala Leu Phe Asn

        180                 185                 190CAG GAG CCA GCC TCC GGC CAG ATG CGC CTG GAG AAA ACC GAC CAG ATT        624Gln Glu Pro Ala Ser Gly Gln Met Arg Leu Glu Lys Thr Asp Gln Ile

    195                 200                 205CCC ATG CCT TTC TCC AGT TCC TCG TTG AGC TGC CTG AAT CTC CCT GAG        672Pro Met Pro Phe Ser Ser Ser Ser Leu Ser Cys Leu Asn Leu Pro Glu

210                 215                 220GGA CCC ATC CAG TTT GTC CCC ACC ATC TCC ACT CTG CCC CAT GGG CTC        720Gly Pro Ile Gln Phe Val Pro Thr Ile Ser Thr Leu Pro His Gly Leu225                 230                 235                 240TGG CAA ATC TCT GAG GCT GGA ACA GGG GTC TCC AGT ATA TTC ATC TAC        768Trp Gln Ile Ser Glu Ala Gly Thr Gly Val Ser Ser Ile Phe Ile Tyr

            245                 250                 255CAT GGT GAG GTG CCC CAG GCC AGC CAA GTA CCC CCT CCC AGT GGA TTC        816His Gly Glu Val Pro Gln Ala Ser Gln Val Pro Pro Pro Ser Gly Phe

        260                 265                 270ACT GTC CAC GGC CTC CCA ACA TCT CCA GAC CGG CCA GGC TCC ACC AGC        864Thr Val His Gly Leu Pro Thr Ser Pro Asp Arg Pro Gly Ser Thr Ser

    275                 280                 285CCC TTC GCT CCA TCA GCC ACT GAC CTG CCC AGC ATG CCT GAA CCT GCC        912Pro Phe Ala Pro Ser Ala Thr Asp Leu Pro Ser Met Pro Glu Pro Ala

290                 295                 300CTG ACC TCC CGA GCA AAC ATG ACA GAG CAC AAG ACG TCC CCC ACC CAA        960Leu Thr Ser Arg Ala Asn Met Thr Glu His Lys Thr Ser Pro Thr Gln305                 310                 315                 320TGC CCG GCA GCT GGA GAG GTC TCC AAC AAG CTT CCA AAA TGG CCT GAG       1008Cys Pro Ala Ala Gly Glu Val Ser Asn Lys Leu Pro Lys Trp Pro Glu

            325                 330                 335CCG GTG GAG CAG TTC TAC CGC TCA CTG CAG GAC ACG TAT GGT GCC GAG       1056Pro Val Glu Gln Phe Tyr Arg Ser Leu Gln Asp Thr Tyr Gly Ala Glu

        340                 345                 350CCC GCA GGC CCG GAT GGC ATC CTA GTG GAG GTG GAT CTG GTG CAG GCC       1104Pro Ala Gly Pro Asp Gly Ile Leu Val Glu Val Asp Leu Val Gln Ala

    355                 360                 365AGG CTG GAG AGG AGC AGC AGC AAG AGC CTG GAG CGG GAA CTG GCC ACC       1152Arg Leu Glu Arg Ser Ser Ser Lys Ser Leu Glu Arg Glu Leu Ala Thr

370                 375                 380CCG GAC TGG GCA GAA CGG CAG CTG GCC CAA GGA GGC CTG GCT GAG GTG       1200Pro Asp Trp Ala Glu Arg Gln Leu Ala Gln Gly Gly Leu Ala Glu Val385                 390                 395                 400CTG TTG GCT GCC AAG GAG CAC CGG CGG CCG CGT GAG ACA CGA GTG ATT       1248Leu Leu Ala Ala Lys Glu His Arg Arg Pro Arg Glu Thr Arg Val Ile

            405                 410                 415GCT GTG CTG GGC AAA GCT GGT CAG GGC AAG AGC TAT TGG GCT GGG GCA       1296Ala Val Leu Gly Lys Ala Gly Gln Gly Lys Ser Tyr Trp Ala Gly Ala

        420                 425                 430GTG AGC CGG GCC TGG GCT TGT GGC CGG CTT CCC CAG TAC GAC TTT GTC       1344Val Ser Arg Ala Trp Ala Cys Gly Arg Leu Pro Gln Tyr Asp Phe Val

    435                 440                 445TTC TCT GTC CCC TGC CAT TGC TTG AAC CGT CCG GGG GAT GCC TAT GGC       1392Phe Ser Val Pro Cys His Cys Leu Asn Arg Pro Gly Asp Ala Tyr Gly

450                 455                 460CTG CAG GAT CTG CTC TTC TCC CTG GGC CCA CAG CCA CTC GTG GCG GCC       1440Leu Gln Asp Leu Leu Phe Ser Leu Gly Pro Gln Pro Leu Val Ala Ala465                 470                 475                 480GAT GAG GTT TTC AGC CAC ATC TTG AAG AGA CCT GAC CGC GTT CTG CTC       1488Asp Glu Val Phe Ser His Ile Leu Lys Arg Pro Asp Arg Val Leu Leu

            485                 490                 495ATC CTA GAC GCC TTC GAG GAG CTG GAA GCG CAA GAT GGC TTC CTG CAC       1536Ile Leu Asp Ala Phe Glu Glu Leu Glu Ala Gln Asp Gly Phe Leu His

        500                 505                 510AGC ACG TGC GGA CCG GCA CCG GCG GAG CCC TGC TCC CTC CGG GGG CTG       1584Ser Thr Cys Gly Pro Ala Pro Ala Glu Pro Cys Ser Leu Arg Gly Leu

    515                 520                 525CTG GCC GGC CTT TTC CAG AAG AAG CTG CTC CGA GGT TGC ACC CTC CTC       1632Leu Ala Gly Leu Phe Gln Lys Lys Leu Leu Arg Gly Cys Thr Leu Leu

530                 535                 540CTC ACA GCC CGG CCC CGG GGC CGC CTG GTC CAG AGC CTG AGC AAG GCC       1680Leu Thr Ala Arg Pro Arg Gly Arg Leu Val Gln Ser Leu Ser Lys Ala545                 550                 555                 560GAC GCC CTA TTT GAG CTG TCC GGC TTC TCC ATG GAG CAG GCC CAG GCA       1728Asp Ala Leu Phe Glu Leu Ser Gly Phe Ser Met Glu Gln Ala Gln Ala

            565                 570                 575TAC GTG ATG CGC TAC TTT GAG AGC TCA GGG ATG ACA GAG CAC CAA GAC       1776Tyr Val Met Arg Tyr Phe Glu Ser Ser Gly Met Thr Glu His Gln Asp

        580                 585                 590AGA GCC CTG ACG CTC CTC CGG GAC CGG CCA CTT CTT CTC AGT CAC AGC       1824Arg Ala Leu Thr Leu Leu Arg Asp Arg Pro Leu Leu Leu Ser His Ser

    595                 600                 605CAC AGC CCT ACT TTG TGC CGG GCA GTG TGC CAG CTC TCA GAG GCC CTG       1872His Ser Pro Thr Leu Cys Arg Ala Val Cys Gln Leu Ser Glu Ala Leu

610                 615                 620CTG GAG CTT GGG GAG GAC GCC AAG CTG CCC TCC ACG CTC ACG GGA CTC       1920Leu Glu Leu Gly Glu Asp Ala Lys Leu Pro Ser Thr Leu Thr Gly Leu625                 630                 635                 640TAT GTC GGC CTG CTG GGC CGT GCA GCC CTC GAC AGC CCC CCC GGG GCC       1968Tyr Val Gly Leu Leu Gly Arg Ala Ala Leu Asp Ser Pro Pro Gly Ala

            645                 650                 655CTG GCA GAG CTG GCC AAG CTG GCC TGG GAG CTG GGC CGC AGA CAT CAA       2016Leu Ala Glu Leu Ala Lys Leu Ala Trp Glu Leu Gly Arg Arg His Gln

        660                 665                 670AGT ACC CTA CAG GAG GAC CAG TTC CCA TCC GCA GAC GTG AGG ACC TGG       2064Ser Thr Leu Gln Glu Asp Gln Phe Pro Ser Ala Asp Val Arg Thr Trp

    675                 680                 685GCG ATG GCC AAA GGC TTA GTC CAA CAC CCA CCG CGG GCC GCA GAG TCC       2112Ala Met Ala Lys Gly Leu Val Gln His Pro Pro Arg Ala Ala Glu Ser

690                 695                 700GAG CTG GCC TTC CCC AGC TTC CTC CTG CAA TGC TTC CTG GGG GCC CTG       2160Glu Leu Ala Phe Pro Ser Phe Leu Leu Gln Cys Phe Leu Gly Ala Leu705                 710                 715                 720TGG CTG GCT CTG AGT GGC GAA ATC AAG GAC AAG GAG CTC CCG CAG TAC       2208Trp Leu Ala Leu Ser Gly Glu Ile Lys Asp Lys Glu Leu Pro Gln Tyr

            725                 730                 735CTA GCA TTG ACC CCA AGG AAG AAG AGG CCC TAT GAC AAC TGG CTG GAG       2256Leu Ala Leu Thr Pro Arg Lys Lys Arg Pro Tyr Asp Asn Trp Leu Glu

        740                 745                 750GGC GTG CCA CGC TTT CTG GCT GGG CTG ATC TTC CAG CCT CCC GCC CGC       2304Gly Val Pro Arg Phe Leu Ala Gly Leu Ile Phe Gln Pro Pro Ala Arg

    755                 760                 765TGC CTG GGA GCC CTA CTC GGG CCA TCG GCG GCT GCC TCG GTG GAC AGG       2352Cys Leu Gly Ala Leu Leu Gly Pro Ser Ala Ala Ala Ser Val Asp Arg

770                 775                 780AAG CAG AAG GTG CTT GCG AGG TAC CTG AAG CGG CTG CAG CCG GGG ACA       2400Lys Gln Lys Val Leu Ala Arg Tyr Leu Lys Arg Leu Gln Pro Gly Thr785                 790                 795                 800CTG CGG GCG CGG CAG CTG CTT GAG CTG CTG CAC TGC GCC CAC GAG GCC       2448Leu Arg Ala Arg Gln Leu Leu Glu Leu Leu His Cys Ala His Glu Ala

            805                 810                 815GAG GAG GCT GGA ATT TGG CAG CAC GTG GTA CAG GAG CTC CCC GGC CGC       2496Glu Glu Ala Gly Ile Trp Gln His Val Val Gln Glu Leu Pro Gly Arg

        820                 825                 830CTC TCT TTT CTG GGC ACC CGC CTC ACG CCT CCT GAT GCA CAT GTA CTG       2544Leu Ser Phe Leu Gly Thr Arg Leu Thr Pro Pro Asp Ala His Val Leu

    835                 840                 845GGC AAG GCC TTG GAG GCG GCG GGC CAA GAC TTC TCC CTG GAC CTC CGC       2592Gly Lys Ala Leu Glu Ala Ala Gly Gln Asp Phe Ser Leu Asp Leu Arg

850                 855                 860AGC ACT GGC ATT TGC CCC TCT GGA TTG GGG AGC CTC GTG GGA CTC AGC       2640Ser Thr Gly Ile Cys Pro Ser Gly Leu Gly Ser Leu Val Gly Leu Ser865                 870                 875                 880TGT GTC ACC CGT TTC AGG GCT GCC TTG AGC GAC ACG GTG GCG CTG TGG       2688Cys Val Thr Arg Phe Arg Ala Ala Leu Ser Asp Thr Val Ala Leu Trp

            885                 890                 895GAG TCC CTG CGG CAG CAT GGG GAG ACC AAG CTA CTT CAG GCA GCA GAG       2736Glu Ser Leu Arg Gln His Gly Glu Thr Lys Leu Leu Gln Ala Ala Glu

        900                 905                 910GAG AAG TTC ACC ATC GAG CCT TTC AAA GCC AAG TCC CTG AAG GAT GTG       2784Glu Lys Phe Thr Ile Glu Pro Phe Lys Ala Lys Ser Leu Lys Asp Val

    915                 920                 925GAA GAC CTG GGA AAG CTT GTG CAG ACT CAG AGG ACG AGA AGT TCC TCG       2832Glu Asp Leu Gly Lys Leu Val Gln Thr Gln Arg Thr Arg Ser Ser Ser

930                 935                 940GAA GAC ACA GCT GGG GAG CTC CCT GCT GTT CGG GAC CTA AAG AAA CTG       2880Glu Asp Thr Ala Gly Glu Leu Pro Ala Val Arg Asp Leu Lys Lys Leu945                 950                 955                 960GAG TTT GCG CTG GGC CCT GTC TCA GGC CCC CAG GCT TTC CCC AAA CTG       2928Glu Phe Ala Leu Gly Pro Val Ser Gly Pro Gln Ala Phe Pro Lys Leu

            965                 970                 975GTG CGG ATC CTC ACG GCC TTT TCC TCC CTG CAG CAT CTG GAC CTG GAT       2976Val Arg Ile Leu Thr Ala Phe Ser Ser Leu Gln His Leu Asp Leu Asp

        980                 985                 990GCG CTG AGT GAG AAC AAG ATC GGG GAC GAG GGT GTC TCG CAG CTC TCA       3024Ala Leu Ser Glu Asn Lys Ile Gly Asp Glu Gly Val Ser Gln Leu Ser

    995                 1000                1005GCC ACC TTC CCC CAG CTG AAG TCC TTG GAA ACC CTC AAT CTG TCC CAG       3072Ala Thr Phe Pro Gln Leu Lys Ser Leu Glu Thr Leu Asn Leu Ser Gln

1010                1015                1020AAC AAC ATC ACT GAC CTG GGT GCC TAC AAA CTC GCC GAG GCC CTG CCT       3120Asn Asn Ile Thr Asp Leu Gly Ala Tyr Lys Leu Ala Glu Ala Leu Pro1025                1030                1035                1040TCG CTC GCT GCA TCC CTG CTC AGG CTA AGC TTG TAC AAT AAC TGC ATC       3168Ser Leu Ala Ala Ser Leu Leu Arg Leu Ser Leu Tyr Asn Asn Cys Ile

            1045                1050                1055TGC GAC GTG GGA GCC GAG AGC TTG GCT CGT GTG CTT CCG GAC ATG GTG       3216Cys Asp Val Gly Ala Glu Ser Leu Ala Arg Val Leu Pro Asp Met Val

        1060                1065                1070TCC CTC CGG GTG ATG GAC GTC CAG TAC AAC AAG TTC ACG GCT GCC GGG       3264Ser Leu Arg Val Met Asp Val Gln Tyr Asn Lys Phe Thr Ala Ala Gly

    1075                1080                1085GCC CAG CAG CTC GCT GCC AGC CTT CGG AGG TGT CCT CAT GTG GAG ACG       3312Ala Gln Gln Leu Ala Ala Ser Leu Arg Arg Cys Pro His Val Glu Thr

1090                1095                1100CTG GCG ATG TGG ACG CCC ACC ATC CCA TTC AGT GTC CAG GAA CAC CTG       3360Leu Ala Met Trp Thr Pro Thr Ile Pro Phe Ser Val Gln Glu His Leu1105                1110                1115                1120CAA CAA CAG GAT TCA CGG ATC AGC CTG AGA TGA                           3393Gln Gln Gln Asp Ser Arg Ile Ser Leu Arg  ^*

            1125                1130

Claims (27)

1.一种测定化合物是否抑制多肽激活转录能力的方法，该多肽其特征在于它包括一个CIITA转录激活结构域而缺失一个有功能的CIITA相互作用结构域，其中转录的抑制表示该化合物是一种潜在的自身免疫疾病治疗药物。

2.权利要求1中的方法，其中转录激活的抑制如下测定：

a)提供一种所述多肽与一种DNA结合蛋白的融合蛋白。

b)提供一种在系统中与报告基因可操作地连接的转录调节DNA序列，该系统在融合蛋白与调节序列连接时适于转录报告基因。

c)在所述系统中提供所述融合蛋白和所述化合物；以及

d)测定所述化合物抑制报告基因转录的能力。

3.权利要求1中的方法，它进一步包括测定化合物抑制第二个多肽激活转录的能力，第二个多肽其特征在于包括一个同型特异CIITA转录激活结构域而缺失一个有功能的CIITA相互作用结构域，其中所述的方法鉴别了同型特异化合物。

4.一种基本纯化的DNA，它编码CIITA转录激活结构域而不编码有功能的CIITA相互作用结构域。

5.权利要求4中的DNA，其中DNA有图1核苷酸192-1142的核苷酸序列，或其简并的变异序列。

6.权利要求4中的DNA，其中DNA80％或更多的序列与图1DNA序列的核苷酸192-1149相同。

7.权利要求4中的DNA，其中CIITA是同型特异的。

8.一种基本纯化的包括一个CIITA转录激活结构域而缺失一个有功能的CIITA相互作用结构域的多肽。

9.权利要求8中的多肽，它包括与图1氨基酸序列氨基酸26-352基本相同的氨基酸序列。

10.权利要求8中的多肽，其中CIITA是同型特异的。

11.一种测定化合物是否抑制多肽与其靶蛋白结合能力的方法，该多肽其特征在于它包括一个CIITA相互作用结构域而缺失一个有功能的CIITA激活结构域，其中结合的抑制表示化合物是潜在的自身免疫疾病治疗药物。

12.权利要求11中的方法，该方法包括测定所述化合物是否抑制上述多肽介导的转录能力，转录的抑制表示化合物为潜在的自身免疫疾病治疗药物。

13.权利要求12的方法，其中所说的抑制如下测定

a)提供第一个包括所述多肽与一种DNA结合蛋白的融合蛋白；

b)为DNA序列提供一种转录调节序列，它在适于转录报告基因的系统中可操作地与报告基因连接；

c)提供第二个融合蛋白，所述第二个融合蛋白其特征在于它包含与CIITA相互作用结构域的靶蛋白融合的转录激活结构域；

d)在系统中提供所述第一个和所述第二个融合蛋白以及所述化合物；以及

e)测定所述化合物抑制报告基因转录的能力。

14.权利要求11中的方法，进一步包括测定所述化合物抑制第二个多肽结合其靶蛋白的能力，上述第二个多肽特征在于它包含一个同型特异CIITA相互作用结构域而缺失一个有功能的CIITA激活结构域，其中所说的方法鉴别同型特异化合物。

15.权利要求14中的方法，其中所述第二多肽包含克隆13 CIITA的相互作用结构域。

16.一种基本纯化的DNA，它编码CIITA相互作用结构域而不编码有功能的CIITA转录激活结构域。

17.权利要求16中的方法，其中所DNA具有图1核苷酸1016-3509的核苷酸序列或其简并的变异序列。

18.权利要求16中的方法，其中所述DNA有80％或更多的序列与图1DNA序列的核苷酸1016-3509的序列相同。

19.权利要求16中的方法，其中CIITA是同型特异的。

20.权利要求19中的方法，其中CIITA为克隆13CIITA。

21.一种基本纯净的多肽，它包括CIITA相互作用结构域而缺失有功能的CIITA转录激活结构域。

22.权利要求21中的多肽，它包含与图1氨基酸序列中氨基酸301-1130基本相同的氨基酸序列。

23.权利要求21中的多肽，其中所述CIITA是同型特异的。

24.权利要求23中的多肽，CIITA为克隆13CIITA。

25.测定一个化合物是否抑制多肽介导转录能力的方法，该多肽其特征在于它包含一个与转录激活结构域融合的CIITA相互作用结构域而缺失有功能的CIITA相互作用结构域，其中转录的抑制表示所述化合物是潜在的自身免疫疾病治疗药物。

26.权利要求25中的方法，它进一步包含在B淋巴细胞中提供上述多肽而且测定MHC II类基因的表达。

27.权利要求26中的方法，其中所述细胞是选自克隆13细胞和RM3细胞的人B淋巴细胞。

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