CN1250484A - 青光眼的诊断和治疗 - Google Patents

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Abstract

本文公开了,通过检测与青光眼有关的基因中的突变,例如CYP1B1基因,诊断青光眼,尤其是原发性先天青光眼的方法。本文公开的方法包括杂交分析,如Southern或Northern分析,其使用的是突变核酸探针和与青光眼有关的基因杂交;使用限制消化酶的直接突变分析;对与青光眼有关的基因测序;等位基因特异寡核苷酸探针与扩增的基因组DNA的杂交;或确定与青光眼有关的基因编码突变蛋白质的存在。本文也公开了在诊断青光眼中使用的工具。此外,本文公开了治疗青光眼的方法,包括服用与青光眼有关的基因编码的蛋白质;服用基因,基因结构物或其它的核酸结构物,或服用其他治疗剂。

Description

青光眼的诊断和治疗 政府基金
本发明在国家眼科研究院授权合同No.EY-11095和国家健康研究院授权合同No.MOI-RR-06192下由政府支持完成。政府对本发明有一定的权利。相关的专利申请
本申请是1997年9月10日提交的，美国序列号No.08/926,492申请的部分继续申请，美国序列号No.08/926,492申请是1997年2月3日提交的，美国序列号No.08/800,036申请的部分继续申请，两篇申请全部内容都通过在此引述而合并于本文。
本发明的背景
青光眼是一组眼睛病变，其特点是视神经的衰退。它是世界范围内失明的重要原因之一。引发青光眼的一个主要风险因素是家族病史：青光眼的几种不同的遗传形式已经被描述了。
原发性先天青光眼或婴儿期青光眼(基因符号：GLC3)是一种遗传病变，占整体失明的0.01-0.04％。其特点是眼睛的水排出系统的发育不当，导致眼内压升高，眼球或角膜增大(如，水眼)，损伤视神经，最终导致视觉损伤。尽管努力确认了具体组织上的缺陷，但GLC3基因的致病原因一直难以捉摸。与该疾病有关的至少两个染色体位点已经确定：一个位点在2p21(GLC3A)[Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30：171-177(1995)]；第二个位点在1p36(GLC3B)[Akarsu，A.N.et al.，Hum.Mol.Gen.5(8)：1199-1203(1996)]。其他特异位点，包括6p区域和染色体11，已被排除[Akarsu，A.N.et al.，Am.J.Med.Genet.61：290-292(1996)]。
原发性开角型青光眼(基因符号：GLC1)是一种常见的病变，其特点是视神经萎缩导致视域损失，最终失明。根据发病年龄和临床表现的不同，GLC1主要可分为两组。
青少年发病的原发性开角型青光眼(GLC1A)，通常在孩童期晚期或成年期早期显现。GLC1A的发展很快并严重伴随眼内压升高，对内科治疗反应较差，通常需要眼睛外科手术。GLC1A已被制图在染色体1的q21-q31区域，带有遗传异质性。[Sheffield，V.C.et al.，Hum.Mol.Genet.4：1837-1844(1995)]。
成年或成年晚期发病的原发性开角型青光眼(GLC1B)是最常见的青光眼类型。与青少年发病的原发性开角型青光眼相比，它比较柔和，且发展的较缓慢，发病期不同，通常在40岁以后。GLC1B的眼内压升高轻微和缓，对定期调节内科治疗反应令人满意。然而，由于疾病的发展缓慢并且没有痛苦，所以直到视神经已经发生了不可逆转的损伤的晚期阶段时，疾病才可能被发现。基因连锁、单倍型、及临床数据已为GLC1B在2cen-q13区域指定了一个位点[Stoilova，D.et al.，Genomics.36：142-150(1996)]，和一个新位点3q21-q22[Sarfarazi，M.et al.，Submitted1996)]，及提供了其他几个位点的进一步的证据。
由于青光眼的不知不觉中加居的特点，所以需要一种较好的早期方式来诊断或预测青光眼发展的可能性，这样，在视神经发生大的损伤之前，可采用预防或减轻的措施。
本发明的概述
本发明涉及诊断或治疗青光眼的方法。个体青光眼的诊断方法包括，检测与疾病有关的基因中突变的存在。突变可能是一个或多个核苷酸的插入或缺失，导致移码突变；至少一个核苷酸的改变，导致编码氨基酸中的改变；至少一个核苷酸的改变，导致提前出现终止密码子；一个或几个核苷酸的插入，如由于不等重组或基因转换引起的插入，导致基因编码序列的中断；部分基因的重复；全部或部分基因的转位；或全部或部分基因的重排。与青光眼有关的基因中可能存在一种以上的突变。与青光眼有关的突变可用多种方法确定，如对基因组DNA的Southern分析；基因组DNA的扩增，接着用限制酶消化进行的直接突变分析；对RNA的Northern分析；基因分离和直接测序；或对与青光眼有关的基因编码蛋白质的分析。
例如，含有基因的DNA样品是从怀疑患有青光眼，或是青光眼的携带者的个体中获取的(测试个体)。在基因与突变核酸探针的特异杂交充分的条件下，将DNA与至少一种突变核酸探针接触。突变核酸探针含有，具有至少一种上述突变的基因的DNA、cDNA、或RNA，或基因片段，或与这样的cDNA片段对应的RNA片段。突变核酸片段与突变核酸探针特异性杂交的存在，表示基因中的突变与青光眼有关。在另一个实例中，在基因与PNA探针的特异性杂交充分的条件下，将DNA与PNA探针接触；特异杂交存在，表示基因中的突变与青光眼有关。
另外，如果突变导致限制位点的产生或消除，那么，可以通过对从测试个体获取的基因组DNA、RNA或cDNA样品的限制性消化，进行直接突变分析。相关DNA、RNA或cDNA片段的消化模式，显示与青光眼有关的突变存在或不存在。
与青光眼有关的突变存在也可以通过序列数据诊断。从测试个体获取到基因组DNA、RNA或cDNA的样品，确定基因序列、或基因片段。将从个体获取的基因序列与已知基因序列(对照序列)相比较。在个体的基因中，如有以上所述的突变存在，则表示突变与青光眼有关。
本发明另外还涉及，通过检测与青光眼有关的基因编码蛋白质表达的变化，来诊断个体青光眼的方法。表达的变化可以是蛋白质表达量的变化(量变化)，或蛋白质表达组成的变化(质变化)，或两者都有。当测试样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质表达，与对照样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质表达相比较时，有变化的表示患有疾病。蛋白质表达中的变化可以采用标准技术来确定，如Western印迹法。
本发明另外还涉及与青光眼有关的突变基因编码蛋白质的抗体(单克隆的或多克隆的)。这些抗体也可用在诊断方法中。如，将含有有关蛋白质的测试样品与，对含有如上所述的与青光眼有关的突变的基因编码蛋白质有特异性的抗体相接触。有关的蛋白质与抗体的特异性结合，表示突变与青光眼有关。
本发明还涉及治疗青光眼的方法，如服用代替、模仿或补充与青光眼有关的基因编码蛋白质的活性的治疗剂，及青光眼基因治疗法。
本发明可容易地确定与青光眼有关的基因中的突变，因此也促使疾病得到即好又早的诊断和治疗。对这种突变的确定，将一种形式的青光眼与其他形式区别开来，这样可为患病个体，及家族中可能是患病个体或疾病携带者的其他成员，作出较好的治疗计划。
附图简要说明
图1是对与原发性先天青光眼有关的基因的GLC3A主要候选区域的描述。
图2是对CYP1B1基因的基因组结构的描述，其中带有与青光眼有关的确定的三个突变。
图3是一组示意图，分别标为图3A、图3B、和图3C，描述了五个GLC3A家族中基因组突变的分析。图3A描述的是，通过丙烯酰胺凝胶电泳及测序测定的家族17和26的13个碱基对的缺失；图3B描述的是，对家族10和11的单个胞嘧啶碱基插入的分析；图3C描述的是，在家族15中观察到的大型缺失的PCR特征。
本发明的详细叙述
本发明涉及诊断青光眼的方法。本文所用的“青光眼”，是指遗传青光眼，如原发性先天和婴儿期青光眼；原发性开角型青光眼(POAG)，包括青少年发病的和成年-或晚期发病的POAG；继发性青光眼；色素青光眼；和低压青光眼。
如本文所述，申请人已确定了与青光眼有关的基因，该基因中的突变与疾病存在是有关的。为了确定与青光眼有关的基因，申请人研究了存在于与原发性先天青光眼相关的位点GLC3A的基因。确定候补基因后，对从患有原发性先天青光眼的家族测试组个体中，取出的基因组DNA样品的候补基因，申请人作了直接测序分析。申请人确定了人类细胞色素P4501B1(CYP1B1)基因中的17种不同突变与原发性先天青光眼有关。CYP1B1基因由Sutter所描述[Sutter，T.R.et al.，J.Biol.Chem.269：13092(1994)]，其全部内容都通过在此引述而合并于本文；CYP1B1基因的核苷酸序列可从GenBank获得，登记号为UO3688。
CYP1B1基因中的一种突变是13个碱基对的缺失，即核苷酸1410到核苷酸1422[GAGTGCAGGCAGA(SEQ ID NO.1)]被从CYP1B1基因编码序列中移出，这种突变在不止一个家族中发现。这种突变导致移码，通过在缺失位置下游203个碱基对处产生提前出现的终止密码子，截断开放读框(最后原始氨基酸Thr-354(早移码)后的68个氨基酸)。CYP1B1基因中与原发性先天青光眼有关的第二种突变是，在位于核苷酸1209到1214之间的六个胞嘧啶片段上，插入一个额外的胞嘧啶。这种插入也导致移码突变，在插入位置下游106个碱基对处产生提前出现终止密码子(最后一个原始氨基酸Pro-289下游的36个氨基酸)。CYP1B1基因中的第三种突变也是移出部分内含子II和外显子III的大部分编码序列的一种缺失。第四种突变是核苷酸1546-1555的十个碱基对的重复(TCATGCCACC，SEQ ID NO.20)；这种十个碱基对的重复导致移码突变，在氨基酸403后产生提前出现中止，从全长蛋白质(没有突变的)上移出140个氨基酸。第五种突变是核苷酸1737上的胞嘧啶的单个碱基缺失，导致移码，产生提前出现终止密码子TAG，导致移出80个氨基酸(氨基酸463后的全部氨基酸缺失)。第六种突变是核苷酸1187上的单个碱基的改变(G→T转换)，这样导致提前出现TAA终止密码子。第七种突变是核苷酸1482上的单个碱基的改变(C→T转换)，这样导致从脯氨酸到亮氨酸编码氨基酸的改变。第八种突变是核苷酸517上的单个碱基的改变(G→T转换)，这样导致从色氨酸到半胱氨酸编码氨基酸的改变。第九种突变是核苷酸528上的单个碱基的改变(G→A转换)，这样导致从甘氨酸到谷氨酸编码氨基酸的改变。第十种突变是在核苷酸846上插入胸腺嘧啶，造成移码突，导致从蛋白质的羧基端377个氨基酸的缺失。第十一种突变是核苷酸1439上的单个碱基的改变(G→T转换)，这样导致从甘氨酸到色氨酸编码氨基酸的改变。第十二种突变是核苷酸1505上的单个碱基的改变(G→A转换)，这样导致从谷氨酸到赖氨酸编码氨基酸的改变。第十三种突变是核苷酸1515上的单个碱基的改变(G→A转换)，这样导致从精氨酸到组氨酸编码氨基酸的改变。第十四种突变是核苷酸1656上的单个碱基的改变(C→T转换)，这样导致从脯氨酸到亮氨酸编码氨基酸的改变。第十五种突变是核苷酸1691上缺失单个碱基(G)，造成移码突变，导致从蛋白质的羧基端95个氨基酸的缺失。第十六种突变是核苷酸1751上的单个碱基的改变(C→T转换)，这样导致从精氨酸到色氨酸编码氨基酸的改变。第十七种突变是开始于核苷酸1749的27个核苷酸的重复(即从1749-1775的核苷酸的重复)，造成移码突变，导致从蛋白质的羧基端76个氨基酸的缺失。
由于在与青光眼有关的基因中发现了这些突变，所以就有了诊断青光眼的方法。现在，使用如本文所述的方法或其他适当的方法，就可以确定与青光眼有关的基因。“与青光眼有关的基因”是这样一种基因，如果它发生了突变，那么突变与青光眼有关。“与青光眼有关的基因”包括编码蛋白质的DNA，连同其他组成，如前导和尾部序列，启动子单元，内含子和外显子。本文所述的“与青光眼有关的突变”，包括基因中的突变，连同基因的cDNA或mRNA中的突变，其中基因(或基因的cDNA和mRNA)中的突变已确定与青光眼有关，如通过连锁分析(或通过直接测序)而确定。
为了确定其他与青光眼有关的基因，可对与青光眼有关的已知位点进行分析：采用如下述的方法，对在有关位点内、或与有关位点(已确定与青光眼有关的位点)紧密连锁的基因进行突变分析。如，对成年发病的原发性开角型青光眼(POAG)，几个位点已指定，包括2cen-q13区域[Stoilova，D.et al.，Genomics26：142-150(1996)]；3q21-q22区域[Sarfarazi，M.et al.，submitted(1996)]；8q24(Tarfan，et al.，in preparation)；和10p(Sarfarazi，M.et al.，in preparation)。可对这些位点进行研究以确定与青光眼有关的基因。或者，通过对患有青光眼的血缘族进行基因分析，可确定新位点；然后可以分析这些位点，确定与青光眼有关的基因。这些方法对有遗传基础的所有形式的青光眼适用。
确定与青光眼有关的基因后，诊断就成为可能。诊断青光眼是通过检测与青光眼有关的基因中的一种或多种突变完成的。与青光眼有关的基因中的突变可以是单个、或一个以上的核苷酸的插入或缺失，导致在移码突变；至少一个核苷酸的改变，导致编码氨基酸的改变；至少一个核苷酸的改变，导致提前出现终止密码子的产生；几个核苷酸的缺失，导致核苷酸编码的一种或多种氨基酸的缺失；一个或多个核苷酸的插入，如不等重组或基因转换，导致基因编码序列的中断；全部或部分基因的重复；全部或部分基因的转位；或全部或部分基因的重排。在单个基因中可能存在一种以上这样的突变。这样的序列改变导致与青光眼有关的基因所编码的蛋白质的改变。例如，当突变是移码突变时，移码会导致编码的氨基酸的改变，和/或导致提前出现终止密码子的产生，造成截断蛋白质的产生。另外，与青光眼有关的突变会是，在一个或多个核苷酸中的同义突变(如，突变不会导致与青光眼有关的基因编码蛋白质的改变)。这样的突变可能会改变基因的拼接位置，或要么影响基因的转录或翻译。有上述的任何突变的与青光眼有关基因，本文称之为“突变基因。”
在诊断青光眼的第一种方法中，使用的是杂交方法，如Southern分析(参阅Current Protocols in Molecular Biology，Ausubel，F.et al.，eds.，John Wiley & Son，包括至1997年的所有补充材料)。例如，基因组DNA，RNA，或cDNA的测试样品，是从怀疑患有青光眼的(或携带缺陷基因的)个体中获取的。个体可以是成年人，孩子，或胎儿。测试样品可以从含有基因组DNA任何样源获取，如血液或组织样品，如从皮肤或其他器官获取。在一个较好的具体实施中，DNA的测试样品是从成纤维细胞皮肤样品、发根、或口腔取到的细胞(如，通过漱口)中获取的。在另一个较好的具体实施中，DNA的测试样品是用适当的方法从胎儿细胞或组织中获取的，如采用羊膜穿刺术或绒毛膜取样。检测DNA，RNA，或cDNA样品，以确定是否有与青光眼有关的突变存在；突变的存在是由基因组DNA、RNA、或cDNA中的基因与核酸探针杂交而显示。本文所用的“核酸探针”，可以是DNA探针或RNA探针。这些核酸探针与至少一种如上所述的与青光眼有关的突变基因杂交。只要一种核酸探针片段与含有突变的部分基因杂交，这样的片段就可被使用。
为了用杂交法来诊断青光眼，将含有与青光眼有关的基因的测试样品与至少一种核酸探针接触制成杂交样品。将杂交样品保留在核酸探针和与青光眼有关的基因可进行特异杂交的充分条件下。本文所用的“特异杂交”，是指精确杂交(如，没有误配)。例如，特异杂交可在高度严紧条件下，或在中度严紧条件下实施。在本领域中，杂交的“严紧条件”是指使特定核酸与另一种核酸可进行杂交的缓冲液的浓度和温度条件，其中第一种核酸可能是完全与第二种核酸互补，或第一种和第二种核酸可能是一定程度的互补。例如，某些高度精确条件可用于区分完全互补的核酸和部分互补的核酸。在Current Protocols in Molecular Biology(同上)中，2.10和6.3章，具体在2.10.1-2.10.16和6.1.1-6页中，解释了“高度严紧条件”和“中度严紧条件”，其中的内容通过在此引述而合并于本文。决定杂交严紧性的恰当条件，取决于多种因素，如核酸的长度，碱基组成，杂交序列之间误配的百分率和分布，温度，离子浓度，脱稳定剂浓度，和其他因素。这样，高度或中度严紧条件可经验地确定。在一个具体实施中，特异杂交的杂交条件是中度严紧条件。在一个尤其推荐的具体实施中，特异杂交的杂交条件是高度严紧条件。
如果发生了特异杂交，那么可用标准方法测得。如果特异杂交发生在核酸探针和测试样品中与青光眼有关的基因之间，那么与青光眼有关的基因就有突变。在这种方法中，可同时使用一种以上的核酸探针。任何一种核酸探针的特异杂交表示，基因中的突变与青光眼有关，因此诊断了疾病。
例如，在诊断原发性先天青光眼中，可制备与带有核苷酸1410到1422的13个碱基对缺失的部分CYP1B1基因杂交的核酸探针。如果这种核酸探针特异地与测试样品中的与青光眼有关的基因杂交，原发性先天青光眼的诊断就完成了。或者，可制备与带有上述一种其他突变的CYP1B1基因杂交的核酸探针，如：位于核苷酸1209和1214之间的六个胞嘧啶的片段上的一个额外的胞嘧啶(C)；核苷酸1546一1555的10个碱基对的重复；核苷酸1737上胞嘧啶(C)的缺失；核苷酸1187上G→T的转换；核苷酸1482上C→T的转换；核苷酸517上G→C的转换；核苷酸528上G→A的转换；核苷酸846上胸腺嘧啶(T)的插入；核苷酸1439上G→T的转换；核苷酸1505上G→A的转换；核苷酸1515上G→A的转换；核苷酸1656SHANG C→T的转换；核苷酸1691上鸟嘌呤(G)的缺失；核苷酸1751上C→T的转换；开始于核苷酸1749的27个核苷酸的重复。这样的核酸探针与测试样品中与青光眼有关的基因的特异杂交，表示患有原发性先天青光眼。
在另一个杂交方法中，Northern分析(参阅Current Protocolsin Molecular Biology，Ausubel，F.et al.，eds.，John Wiley & Son，同上)被用于确定与青光眼有关的突变的存在。对于Northern分析，RNA样品是用适当的方式从测试个体获取的。如上所述，核酸探针与从个体获取的RNA的特异杂交，表示基因中的突变与青光眼有关，因此是对疾病的诊断。
使用核酸探针的典型实例参阅，如，美国专利No.5,288,611和4,851,330。
另外，在上述杂交法中，可使用肽核酸(PNA)探针代替核酸探针。PNA是一种DNA模拟，具有类肽、无机主链，如N-(2-氨基乙基)甘氨酸单元，有机碱基(A，G，C，T或U)通过亚甲基羰基接头附着在甘氨酸的氮上[参阅如，Nielsen，P.E.et al.，Bioconjugate Chemistry，1994，5，American Chemical Society，P，1(1994)]。PNA可设计成，与含有与青光眼有关的突变的基因特异杂交的探针。PNA探针和与青光眼有关的突变基因杂交，是对疾病的诊断。
在本发明的另一个方法中，如果基因中的突变导致限制位点的产生或消除，那么通过限制性消化的突变分析，可以用来检测突变基因。从测试个体获取含有基因组DNA的测试样品。聚合酶链反应(PCR)可用于扩增从测试个体获取的基因组DNA测试样品中的与青光眼有关的基因(如果必要，侧翼序列)。如所述方式进行RFLP分析(参阅Current Protocols in MolecularBiology，同上)。相关DNA片段的消化模式显示，存在或不存在与青光眼有关的突变。
序列分析也可用于检测基因中的特异突变。从测试个体获取DNA测试样品。PCR可用于扩增基因，和/或其侧翼序列。使用标准方法确定与青光眼有关的基因序列，或基因片段。将基因(或基因片段)序列与已知基因核酸序列比较。存在任何如上所述的与青光眼有关的突变，表示个体患有、或携带青光眼。在这种方法的一个具体实施中，这样的序列分析可用于确定CYP1B1基因中的与青光眼有关的突变。
通过使用扩增基因产品与等位基因特异寡核苷酸(ASO)探针的斑点-印迹杂交，等位基因特异寡核苷酸也可用来检测与青光眼有关的突变的存在[参阅如，Saiki，R.et al.，(1986)，Nature(London)324：163-166]。“等位基因特异寡核苷酸”(本文也指“等位基因特异寡核苷酸探针”)是指约10-50个碱基对的寡核苷酸，较好的是约15-30个碱基对，其与含有与青光眼有关的突变的基因特异杂交。使用标准方法，可配制对与青光眼有关的基因中的特定突变有特异性的等位基因特异寡核苷酸探针。为确定与青光眼有关的基因中的突变，从测试个体获取DNA测试样品。可用PCR扩增所有与青光眼有关的基因或片段，及其侧翼序列。使用标准方法，将含有被扩增的与青光眼有关的基因(或基因片段)的DNA进行斑点-印迹处理(参阅Current Protocols inMolecular Biology，同上)，将印迹与寡核苷酸探针接触。这样，即可测得被扩增的与青光眼有关的基因与探针存在的特异杂交。从个体获取的DNA与寡核苷酸探针的特异杂交，表示与青光眼有关的基因中的突变与青光眼是有关的，因此是对疾病的诊断。
对青光眼的诊断，也可通过检测与青光眼有关的基因所编码的蛋白质的表达来完成。对从个体获取的测试样品进行存在与青光眼有关的基因编码蛋白质表达的变化的评价。与青光眼有关的基因编码蛋白质表达的变化，可能是蛋白质表达量的变化(如，产生蛋白质的量)；蛋白质表达质的变化(如，蛋白质的组成)，或两者都有。本文所用的蛋白质表达的“变化”是指，对照样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质的表达，与测试样品中的蛋白质的表达相比的变化。对照样品是与测试样品相对应的样品(如，取自同类细胞)，是从没有患青光眼的个体获取的。与对照样品比较，在测试样品中的蛋白质表达的变化，表示患有青光眼。可使用多种方法检测与青光眼有关的基因所编码的蛋白质的表达，包括光谱法、比色法、电泳法、等电聚焦法和免疫印迹法(参阅Current Protocols in Molecular Biology，特指10章)。例如，Western印迹分析法，使用与突变基因编码蛋白质特异结合的抗体，或与非突变基因编码蛋白质特异结合的抗体，可用来确定，在测试样品中，存在与青光眼有关的突变基因编码的蛋白质，或在测试样品中不存在非突变基因编码的蛋白质。存在突变基因编码的蛋白质，或不存在非突变基因编码的蛋白质，是对青光眼的诊断。
在这种方法的一个具体实施中，将测试样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质的量或浓度，与对照样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质的量或浓度相比较。在测试样品中的蛋白质的量或浓度比对照样品中的蛋白质的量或浓度高或低，这样，统计上显著的差别，表示了与青光眼有关的基因编码蛋白质表达中的变化，这种变化是与疾病有关的。另外，将测试样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质的组成，与对照样品中的与青光眼有关的基因编码蛋白质的组成相比较。与对照样品中的蛋白质组成相比较，在测试样品中的蛋白质组成的差别，表示患有青光眼。在另一个具体实施中，在测试样品中和对照样品中，蛋白质的浓度或量以及组成可以测定。测试样品中的蛋白质的浓度或量与对照样品相比的差别；测试样品中的蛋白质组成与对照样品相比的差别；浓度或量和组成的两种差别，表示患有疾病。
本发明还涉及，与青光眼有关的基因所编码的突变蛋白质的抗体。本文所用的“突变蛋白质”，是指与青光眼有关的突变基因编码的蛋白质或蛋白质片段。一旦与青光眼有关的基因中的突变被确定了，由突变基因编码的蛋白质或蛋白质片段(本文也称作有关蛋白质)也就可被确定，并且使用标准方法可以培养蛋白质或蛋白质片段的抗体(参阅Current Protocols in MolecularBiology，同上)。本文所用的“抗体”，包括多克隆和单克隆抗体，以及一种以上的与蛋白质或蛋白质片段反应的抗体的混合物(如不同类型的与突变蛋白质或蛋白质片段反应的单克隆抗体的合剂)。抗体进一步包括全部抗体和/或其生物功能片段、含有取自多种物种蛋白质的嵌合抗体、人源化抗体、类人类抗体、双功能抗体。生物功能抗体片段是，足以与有关蛋白质结合的那部分片段。
和与青光眼有关的基因编码突变蛋白质反应的单克隆抗体(mAb)，可使用体细胞杂交技术[Kohler and Milstein，Nature256：495-497(1975)]或其他技术制备。在典型的杂交工艺中，与青光眼有关的基因编码的、未提纯或提纯的突变蛋白质可用作免疫原。用免疫原使动物免疫，以获取产生抗体的脾细胞。根据所需mAb的特异性，免疫动物的种类可以是不同的。产生抗体的细胞与不死细胞(如骨髓瘤细胞)相融合，产生一种杂交细胞，其能分泌本发明突变蛋白质的抗体。除去未融合的残留产生抗体的细胞和不死细胞。产生所需抗体的杂交细胞，是使用传统的技术选取的，选取的杂交细胞被克隆、培养。
多克隆抗体可用上述产生单克隆抗体相似的方式，通过免疫动物制备。将动物保留在所制备的抗体能同与青光眼有关的基因编码突变蛋白质反应的条件下。当抗体达到所需的滴定度时，收集动物的血液。将含有多克隆抗体(抗血清)的血清与血液的其他组分分离。含有多克隆抗体的血清可进一步选择地分成含有特种类型抗体的组分(如IgG，IgM)。
和与青光眼有关的突变基因编码蛋白质或蛋白质片段特异结合的抗体(如和突变基因编码蛋白质片段或蛋白质结合，但不和基因非突变复制编码蛋白质结合)，也可用在诊断方法中。将含有与青光眼有关的基因编码蛋白质的测试样品与抗体接触；抗体与蛋白质的结合，表示存在突变基因编码的蛋白质，即诊断了疾病。
本发明还包括使用在发明方法中的试剂盒。试剂盒包括获取测试样品的装置；核酸探针，PNA探针，或等位基因特异寡核苷酸探针；适当的试剂；针对与青光眼有关的基因编码的蛋白质的抗体；实施发明方法的说明；对照样品；和/或其他组成。
本发明还涉及治疗青光眼的方法。青光眼可通过服用药剂治疗，服用后，改善、缓解、减轻青光眼症状的严重性，或消除症状。如，可以服用和与青光眼有关的基因编码突变蛋白质特异结合的抗体，以减轻或消除突变蛋白质的活性。另外，与青光眼有关的基因编码的非突变蛋白质，也可作为治疗青光眼的治疗剂服用。在另一个具体实施中，也可服用模仿与青光眼有关的基因编码蛋白质(突变蛋白质)的活性的药剂，以补充或替代与青光眼有关的基因编码蛋白质的活性。如，可以使用和与青光眼有关的基因编码突变蛋白质具有相同生物活性的肽。可根据与青光眼有关的基因编码蛋白质的结构设计制备Peptidomimetics(不是多肽分子，但模仿多肽的结构)。也可制备与蛋白质含有相同官能团，并与蛋白质具有相同功能的多糖。另外，药剂文库，如，可用组合化学已知的方法制成的药剂文库，可被用于测定另外的试剂。这样的药剂可用标准方法分离，如通过试剂与，也和与青光眼有关的基因编码蛋白质特异结合的抗体的相互作用来分离。
在另一个具体实施中，使用了诱发或加强有关基因表达的药剂，这样，有关基因编码蛋白质的表达补充或替代了突变蛋白质的活性。替代或补充突变蛋白质的活性，会减轻或消除青光眼的生理病因，因此治疗了疾病。这样的药剂包括蛋白质，肽，peptidomimetics，抗体，或其他诱发或加强有关基因表达的小分子。如，诱发或加强家族细胞色素p450中另一种蛋白质的表达的试剂，通过补充或替代突变CYP1B1基因的活性，可用来治疗先天青光眼。另外，如采用WO95/31560中所述的方法，也可制备诱发或加强有关基因表达的DNA结构物。
此外，为了靶中突变蛋白质并减轻或消除其活性，和与青光眼有关的基因编码突变蛋白质特异结合的抗体，可与上述任何药剂同时服用，或之前，之后服用。
青光眼也可通过服用基因，基因转运载体，或其他核酸结构物治疗。可提供给个体，与青光眼有关的基因(或基因的cDNA)的非突变复制，或与青光眼有关的基因(或cDNA)的非突变复制mRNA。如，可服用含有与青光眼有关的非突变基因的基因转运载体，在患青光眼个体中表达非突变基因。基因转运载体也可包含组织特异启动子，以及其他单元(如加强单元，拼接信号，终止及聚腺苷酸化信号，病毒复制，细菌质粒序列，或其他载体核酸序列)。载体的运送可以靶向专门的区域或细胞类型(如使用修饰脂质体，或在身体的特定区域引入载体)。另外，提纯的DNA或mRNA也可用作治疗剂，如在WO 93/19183或WO90/11092中所述。这些方法也可来引入有关基因，这样，有关基因编码蛋白质的表达补充了或替代了突变蛋白质的活性。
在另一个具体实施中，使用了靶向与青光眼有关的突变基因、并通过整合或同源重组“修正”突变的核酸结构物。如，在WO90/09222中描述了结构物使用同源重组，提供DNA编码治病的蛋白质或肽。如上所述的基因疗法，通过直接给个体服用治疗剂，可靶向活体细胞。另外，基因疗法也可以靶向体外细胞，如从个体中移出的细胞；然后，将治疗后的细胞重植入个体。上面段落中引用的出版物的全部内容参考收入本篇。
治疗剂，包括上面描述的药剂，连同上面描述的与基因治疗有关的基因转运载体、DNA、和/或mRNA，可采用眼科用药，皮下注射用药，静脉注射用药，肌肉注射用药，局部用药，口服用药，直肠用药，阴道用药，鼻用药，口腔用药，通过吸入喷雾，或通过植入贮器方式用药。在一个较好的具体实施中，治疗剂对眼睛用药，如采用局部用药(如眼睛滴液或乳剂)。它们也能以包含传统无毒药用可接受的载体，辅剂和/或赋形剂的配方剂用药。服用药剂的形式(如胶囊，片剂，溶液，乳剂)，至少部分取决于药剂服用的途径。药剂治疗有效量是指显著减轻或消除与青光眼有关症状的必要量。治疗有效量依据个体而定，并且至少部分取决于，对药剂、个体体重和性别、需治疗症状的严重性、所需效果的考虑。这样，通过考虑这些因素和实施常规试验，治疗有效量可由此领域中普通技术人员确定。
治疗有效量可以由适当的间隔，如小时、天、周分成的系列剂量服用。另外，治疗有效量也可单剂服用。本文所用的“单剂”，可是单个剂量，也可是持续释放剂量，如采用持续浸剂的控释用药配方。其他药物可随药剂一起服用。
本发明由下列实例进一步说明。实例  与青光眼筛查组有关的基因的确定，及位点的确定
使用17个患有原发性先天青光眼家族的筛查测试组[Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30：171(1995)；Turacli，M.E.et al.，Ophthamol.16：359(1995)]。排除一些基因和候选染色体区域后[Akarsu，A.N.et al.，Am.J.Med Genet.62：102(1996)]，对于原发性先天青光眼，基因组的随机筛查定位在两个位点，GLC3A[2p21 Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30：171(1995)]和GLC3B[1p36 Akarsu，A.N.et al.，Hum.Mol.Genetics.5：1199(1996)]，有证据显示对于这种情况至少有一个其他未制图的位点。在2p21上的GLC3A位点，最近在沙特阿拉伯的25个家族的另一个测试组中已经证实[Bejjani，B.A.et al.，Am.J.Human Genet.59 suppl.，A212-1216(1996)]。在另外两个家族中也得到确定。因此，对于这种情况，GLC3A位点是以主要位点出现的，近85％的测试家族与这个位点连锁。
近亲家族患病成员中纯合子的最小保留片段的重要重组事件和检定，将GLC3A主要候选区域减小到约2.5cM，由标记D2S2186和D2S1346各在一侧。这个候选区域如图1所示。着丝粒方向和端粒方向分别标出。锚定在染色体2放射杂交图上的位点[Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995)]被框出。从染色体2顶端的距离用cR或cM标出。灰色阴影区域表示GLC3A的候选区域，用标记D2S2186[Bejjani，B.A.et al.，Am.J.Hum.Genet.59 suppl.，A212/1216(1996)]和D2S1346标记[Sarfarazi，M.et al.，Genomics 30：171(1995)]由重组事件确定。黑边框表示在近亲家族中观察到的纯合子的最小片段。黑色水平箭头表示一段间隔，在其间对特定基因制图。
有三个基因预先绘制在2p21区域上：非红细胞形式的β-血影蛋白或β-胞衬蛋白(SPTBN1)[Chang，J.G.et al.，Genomics17：287(1993)；Hu，R.J.et al.，Biol.Chem.267：18715(1992)]；Ras的鸟嘌呤核苷酸交换因子(hSOS1)[Chardin，P.et al.，Science260：1338(1993)；Webb，G.C.et al.，Genomics 18：14(1993)]；和干扰素诱导dsRNA依赖蛋白质激酶(PRKR)[Barber，G.N.et al.，Genomics 16：765(1993)；Squire，J.et al.，ibid 16：768(1993)；Hanash，S.M.et al.，Genes Chromosom Cancer 8：34 1993)]。对于这种情况，这些基因是可能的候选基因。通过用GeneBridge 4放射杂交(RH)测试组筛查它们，及绘制它们相对于WhiteheadRh框架的图(Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995))，来精确基因位置。使用91细胞系的原始MIT顺序。在WhiteheadInstitute for Genome Research的制图服务器上，对RH数据进行统计分析。详细RH图谱资料可从http：//www-genome.wi.mit.edu网址获取。RH测试组的筛查，通过基因特异聚合酶链反应试验完成。较好的是，测试内含子或3-前导非翻译序列，以防止地鼠DNA本底的交叉扩增。这些基因的图谱位置确定如下(见图1)：SPTBN1距标记WI-4077为1.51cR(LOD＞3.0)；hSOS1距标记WI-10326为1.51 cR(LOD＞3.0)；PRKR距D2S177为1.51cR(LOD＞3.0)。因此，由于SPTBN1位于D2S1356的着丝粒方向，这样作为GLC3A的候选基因就被排除了。
检测包含GLC3A位点的重叠克隆系图[Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995)；Shuler，G.D.et al.，Science 274：540(1996)]，显示出标记WI-7936距D2S177非常近。这个序列标志位点(STS)与人类细胞色素P4501B1基因相对应[Sutter，T.R.et al.，J.Biol.Chem.269：13092(1994)]。当BLAST研究确定，从该基因的3-前导非翻译区域已衍生得到表达序列标签(EST)标记TIGR-A004S39时[Popielarz，M.et al.，J.Biol.Chem.270：17830(1995)]，编码9G8拼接因子(SERS7)的第五个基因就确定了。在染色体2RH图上，这个EST已经绘制在标记D2S177旁边[Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995)；Shuler，G.D et al.，Science 274：540(1996)]。所有这些基因认为是潜在的候选基因；将几个基因的编码序列用直接测序法进行突变筛查。
将单层人类皮肤成纤维细胞保存在37℃ CO2孵化器中，置于补充了10％的牛胎血清和抗生素(青霉素-G，硫酸链酶素，Gibco/BRL，目录号15140-015)的MEM介质(Gibco/BRL，目录号11095-080)中。依据生产商的原型，用TRIzol(Gibco/BRL)试剂制备全部RNA。第一条链的合成是用50ng随机六位体，从10μl的RNA样品启动的。反应在20mM Tris-HCl(pH 8.4)，40mM KCl，2.5mM MgCl，0.5mM每种dNTP，0.01M DDT，和200USuperScript II RT中，总体积20μl，42℃进行1小时。CYP1B1基因的编码序列用cDNA基的引物扩增：
CYP1(CYP1F 5’-GGTTCCTGTTGACGTCTTG-3’(SEQ ID NO.2)，
CYP1R 5’-CTTCCAGTGCTCCGAGTAG-3’(SEQ ID NO.3)；
CYP2(CYP2F 5’-GTGGTGCTGAATGGCGAG-3’(SEQ ID NO.4)，
CYP2R 5’-TACTGCAGCCAGGGCATC-3’(SEQ ID NO.5)；
CYP3(CYP3F 5’-GTGGCCAACGTCATGAGTG-3’(SEQ ID NO.6)，
CYP3R 5’-TCATAAAGGAAGGCCAGGAC-3’(SEQ ID NO.7)；
CYP4(CYP4F 5’-AGACTCGAGTGCAGGCAG-3’(SEQ ID NO.8)，
CYP4R 5’-TCCTCATCTCCGAAGATGGT-3’(SEQ ID NO.9)；
依据生产商的要求，用重组Taq聚合酶(Gibco/BRL)进行PCR扩增。扩增的PCR片段直接提纯，或用Wizard PCR preps DNA提纯系统(Promega)从琼脂糖凝胶中提纯。在ABI-373测序仪(Perkin Elmer)上用Taq聚合酶FS进行染色终止子测序。
首先，筛查hSOS1和PRKR基因的编码序列；当没有观察到序列变异型时，CYP1B1基因的突变筛查就完成了。
这种筛查的结果是，确定了13个碱基对同源缺失(家族26，患病个体10)，核苷酸1410到1422[即，GAGTGCAGGCAGA(SEQ ID NO.1)]从CYP1B1基因的编码序列(即，外显子III)移出。这种突变导致移码，截断开放读框，即在缺失下游的203个碱基对(或最后原始氨基酸Thr-354后的68个氨基酸)处产生提前出现的终止密码子(TGA)。确定基因内含子/外显子的接合，以对基因组DNA筛查进一步测试。使用cDNA基的引物组CYP1-4作大范围的PCR扩增，以发现含有CYP1B1编码序列的基因组区域。将从含有YAC806-F-8株系制备的全部酵母DNA[Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995)]用作模板。在总体积50μl，含有60mM Tris-SO4(25℃pH 9.1)，18mM(NH4)2SO4，1.5mM MgSO4，0.2mM每种DNTP，和2μl eLONGase酶混合物(Gibco/BRL)中，用20pmol的每种引物，对约50ng的全部酵母DNA进行PCR扩增。扩增条件包括在94℃1分钟的初始变性，接着在94℃进行35个周期的变性30秒，在53℃退火30秒，在68℃延伸6分钟。结果，尺寸范围从1kb到3kb的四个PCR片段被扩增。如上所述，对这些片段进行提纯和测序。通过比较扩增片段的序列和参考cDNA的序列，确定CYP1B1基因中的内含子/外显子的接合[Sutter，T.R.et al.，J.Biol.Chem.269：13092(1994)]。为从基因组DNA扩增CYP1B1编码序列，安装了三个引物组。在所述长距离PCR(1.6kb)条件下，为了对于外显子II进行扩增，将引物CYP1F与内含子引物5’-CCTCCCAGAGGCTTTACCT-3’(SEQ ID NO.1O)配对。对于位于外显子III中的编码区域的扩增，将内含子引物5’-TAAGAATTTTGCTCACTTGC-3’(SEQ ID NO.11)与引物CYP4F(693个碱基对片段)配对。包含CYP1B1编码序列3’-末端的134个碱基对，用引物5’-TCAATGTCACTCTCAGAGAG-3’(SEQ ID NO.12)和CYP4R扩增。总结得出，CYP1B1基因含有三个外显子和两个内含子，如表1所示。
                    表1 CYP1B1基因中的外显子
 外显子No.   外显子尺寸     内含子位置 5’拼接供体 3’拼接受体
  I    345     345/346    CGCAgtcagt(SEQ ID No.13)    cccagCATGG(SEQ ID No.14)
  II    1044     1389/1390   ACCAGgtaaag(SEQ ID No.15)   aacagGTATC(SEQ ID No.16)
  III    3073*
*3121碱基对3’-非翻译的序列
基因结构如图2所示。数字表示基因的cDNA序列，编码区域用黑色表示。基因的全部编码序列包含在外显子II和III中。本文所确定的CYP1B1的基因结构与最近公开的结果[Tang，Y.M.et al.，J.Biol.Chem.271：28324(1996)]一致。
通过对含有缺失区域的124个碱基对PCR片段的丙烯酰胺凝胶电泳，在家族26及其疾病显型的近亲中，存在13个碱基对的缺失得到证实。为进行快速突变筛查，用CYP3R以及引物：5’-CAAACAGGTATCCTGATGTG-3’(SEQ ID NO.17)，将含有13个碱基对缺失的124个碱基对从基因组DNA扩增。将PCR产品在含有5％丙烯酰胺/Bis溶液(19∶1)，15％脲，1XTBE(参阅图3A)的聚丙烯酰胺微量凝胶上进行分析。在另一个家族(家族17图3A)中也检测到了相同的13个碱基对缺失，并随后证实以区别显型疾病的成员。在杂合子个体中观察到的第三带表示异源双链。家族17是患病父亲和正常母亲的近亲婚配。在这样的家系中，对于13个碱基对缺失，父亲是纯合子，而母亲是同样缺失的杂合子。因此，所有患病的和正常的后代单独从其父亲遗传缺失的单一复制，而患病的后代，另外从其母亲遗传13个碱基对缺失。
通过上述快速突变筛查，在另外两个家族(家族10和11)中观察到了第二种突变，他们表现出，在位于外显子II(图2和图3B)中核苷酸位置1209和1214之间的六个胞嘧啶片段上，额外胞嘧啶的纯合插入。这也证实了是一种移码突变，产生了提前出现终止密码子(TAG)，在插入位置下游的106个碱基对(或原始氨基酸Pro-289下游的36个氨基酸)处。
在另一个近亲家族(家族15)中，检测到了第三种突变。这是开始于内含子II的大型缺失，移出了某部分外显子III的编码序列，超过了上面提到的13个碱基对的缺失(图2，3C)。采用上述快速突变筛查测试法。将在外显子III中检测到的突变，用引物：5’-GACAAGTTCTTGAGGCACTGC-3’(SEQ ID NO.18)和5’-ACGTTCTCCAAATCCAGCC-3’(SEQ ID NO.19)从基因组DNA扩增。将扩增的片段在变性条件下(1M脲，50-54℃)，在测序类丙烯酰胺凝胶上进行电泳。通过银着色使凝胶可视。PCR扩增模型显示外显子III的5-始端和相邻的内含子区域缺失，但外显子的3-始端保持完整(图3C)。上面的带表示含有完整外显子II和相邻5-始端内含子的1.6kb片段。第二个片段含有外显子III中完整的编码序列。最小的扩增产品含有从CYP1B1编码序列的3’-末端的134个碱基对。由于内含子II的3-始端拼接受体位点已经缺失，这种突变应会干扰CYP1B1基因的正常拼接，导致截断蛋白质的合成，或无等位基因。
在个体中检测到第四种突变。这种突变是核苷酸1546-1555的10个碱基对的重复(TCATGCCACC，SEQ ID NO.20)，导致了产生提前出现终止密码子的移码突变。提前出现终止密码子导致氨基酸403后所有氨基酸缺失(最后140个氨基酸缺失)。
对随机选取的正常个体(330个土耳其人，140个其他白种人)进行470个染色体分析，没有检测出上述四种突变等位基因存在，使这些序列变异型表示罕见多态现象的可能性变小。这些突变仅在18个患病个体中观察到了，而没有在全部7个家族(包括5个近亲家族)的正常成员，和那些肯定没有携带这些突变的家族的正常群体中观察到，这有力地说明了，CYP1B1基因是位于2p21上的GLC3A的基因。
第五种突变是核苷酸1737上的胞嘧啶的单个碱基缺失。这种突变同样导致，产生提前出现终止密码子的移码突变。提前出现终止密码子导致80个氨基酸的缺失(氨基酸463后的全部氨基酸)。
第六种突变是核苷酸1188单个碱基，G→T的转换。这种突变，在氨基酸281后，产生提前出现TAA终止密码子，导致从全长蛋白质上移出263个氨基酸。
核苷酸1482上单个碱基对C→T的转换也被检测到。这种改变导致脯氨酸到亮氨酸氨基酸编码的改变。
其他突变也已经被确定。这些突变或是散发性的，或是家族性的，在不同地域群体中的(土耳其，美国，巴基斯坦，英国，西班牙，法裔加拿大地区的家族)，一个或多个个体或家族中发现。所发现的突变有：核苷酸517上的单个碱基的改变(G→T转换)，导致了从色氨酸到半胱氨酸编码氨基酸的改变；核苷酸528上的单个碱基的改变(G→A转换)，导致了从甘氨酸到谷氨酸编码氨基酸的改变；核苷酸846上插入胸腺嘧啶，造成移码突变，导致从蛋白质的羧基端377个氨基酸的缺失；核苷酸1439上的单个碱基的改变(G→T转换)，导致了从甘氨酸到色氨酸编码氨基酸的改变；核苷酸1505上的单个碱基的改变(G→A转换)，导致了从谷氨酸到赖氨酸编码氨基酸的改变；核苷酸1515上的单个碱基的改变(G→A转换)，导致了从精氨酸到组氨酸编码氨基酸的改变；核苷酸1656上的单个碱基的改变(C→T转换)，导致了从脯氨酸到亮氨酸编码氨基酸的改变；核苷酸1691上缺失单个碱基(G)，造成移码突变，导致从蛋白质的羧基端95个氨基酸的缺失；核苷酸1751上的单个碱基的改变(C→T转换)，导致了从精氨酸到色氨酸编码氨基酸的改变；开始于核苷酸1749的27个核苷酸的重复，造成移码突变，导致从蛋白质的羧基端76个氨基酸的缺失。
上面描述的突变在表2中归纳列出。表2中的“蛋白质中的位置”是指含有突变的蛋白质结构的区域；“限制位点”是指限制位点的加入或缺失。限制位点中的改变可以被使用，例如，按照以上所述，通过限制酶消化进行突变分析。前五个突变是在外显子II内；剩余的突变作用外显子III。
                 表2与原发性先天青光眼有关的突变
位置** DNA改变 改变的影响 蛋白质中的位置 缺失的羧基氨基酸 限制位点
517 G→C Trp(5 7)→Cys 铰链区 n/a n/a
528 G→A Gly(61)→Glu 铰链区 n/a +TaqI
846 插入T 移码 n/a 377 -XhoI
1187 G→T Glu(281)→中止 n/a 262 n/a
1209 插入C 移码 n/a 254 n/a
外显子II，III 大型缺失 拼接错误 n/a n/a n/a
1410 13个核苷酸缺失 移码 n/a 189 -XhoI
1439 G→T Gly(365)→Trp J-螺旋型 n/a n/a
1482 C→T Pro(379)→Leu K-螺旋型 n/a n/a
1505 G→A Glu(387)→Lys K-螺旋型 n/a n/a
1515 G→A Arg(390)→His K-螺旋型 n/a -CfoI
1546 重复10个氨基酸 移码 n/a 140 +Nia III
1656 C→T Pro(437)→Leu 回纹波型 n/a n/a
1691 G缺失 移码 n/a 95 n/a
1751 C→T Arg(469)→Trp 结合正铁血红蛋白 n/a -AciI
1749 重复27个氨基酸 移码 n/a 76 +BlaI
1737 C缺失 中止密码子 n/a 80 n/a
**位置是核苷酸改变、插入、或缺失的位置，或核苷酸重复开始的位置，除非另外指出。
如果，上述突变基因产生了稳定的蛋白质，那么，该产品应会从羧基端缺少从80到377氨基酸。这个片段含有众所周知的细胞色素P450氨基酸序列非变异型半胱氨酸(即，CYP1B1的Cys-470)。这个残基提供了轴键正铁血红素配位体，定义了细胞色素P450蛋白质的许多功能和光谱特性[Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995)；Gonzalez，F.J.，Pharmacol.Rev.40：243(1989)]。相邻的残基Phe-463到Gly-472，与蛋白质序列模式相对应，确定了细胞色素P450的半胱氨酸正铁血红素-铁配位体[记号序列(PROSITE accession)PS00086；Hudson，T.et al.，Science 270：1945(1995)；Bairoch，A.，Nucl.Acids Res.20(suppl)：2013(1992)]。这种重要的区域的移出，会干扰截断的分子实施正常的生理功能的能力。
CYP1B1编码序列核苷酸1640上G到C的转换，将Val-432改变为Leu，也已经检测到(图2)。所发现的是，这个改变将建立Eco57I限制位点，从而提供了快速筛查法。对总计70个正常个体(47个土耳其人和23个其他白种人)进行是否存在或不存在此种改变的筛查。36个个体(51.4％)发现是此种改变的杂合子。剩余34个是纯合子个体(48.6％)。27个测试个体含有亮氨酸，7个个体含有缬氨酸。这种改变所处的氨基酸的位置不是CYP1B1保留序列的部分；而且，缬氨酸和亮氨酸都是中性亲水氨基酸，带有相似的脂族侧基，仅有单个CH2基团不同。这样，这种改变表示的是与显型原发性先天青光眼不相关的多态现象。等同物原则
本领域的技术人员仅使用常规的试验，即能辨别或确定本文特定描述的发明的具体实施的许多等同物。这样的等同物都将包含在下列权利要求书的范围内。
                      序列表(1)通用资料(i)申请人/发明人
  (A)名称：康涅狄格大学
           The University of Connecticut
  (B)街道：213 Whetten Graduate Center
           438 Whitney Road Extension
  (C)城市：Storrs
  (D)州/省：康涅狄格Connecticut
  (E)国家：美国U.S.A.
  (F)邮编/区号：06269-1133(i)申请人/发明人
  (A)名称：Mansoor Sarfarazi
  (B)街道：395 Brittany Farms Road，#212
  (C)城市：New Britain
  (D)州/行政区：康涅狄格Connecticut
  (E)国家：美国U.S.A.
  (F)邮编/区号：06053  (ii)发明题目：青光眼的诊断和治疗
            Diagnosis and Treatment of Glaucoma(iii)序列号；20(iv)通信地址：
  (A)地址：David E.Brook，Esq.
  (B)街道：Hamilton，Brook，Smith & Reynolds
           P.C.Tow Militia Drive
  (C)城市：Lexington
  (D)州：麻萨诸塞Massachusetts
  (E)国家：美国U.S.A.
  (F)邮编；02173(v)计算机数据形式：
  (A)媒体类型：软盘
  (B)计算机：IBM PC兼容
  (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS
  (D)软件；Patent In Release#1.0，Version#1.30  (vi)当前申请数据：
  (A)申请号：
  (B)申请日期：
  (C)类别：(vii)在前申请数据：
  (A)申请号：US 08/926,492
  (B)申请日期：1997年9月13日(vii)在前申请数据；
  (A)申请号：US 08/800,036
  (B)申请日期：1997年2月13日(viii)律师/代理人资料
  (A)名称：Brook，David E.
  (B)注册号：22,592
  (C)文献/摘要号：UCT97-01(ix)通讯资料；
  (A)电话：(617)861-6240
  (B)电传：(617)861-9540(2)关于SEQ ID NO；1；(i)序列特征；
  (A)长度：13碱基对
  (B)类型；核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO：1；
  GAGTGCAGGC AGA(2)关于SEQ ID NO：2；序列特征：
  (A)长度：19碱基对
  (B)类型：核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；2；
  GGTTCCTGTT GACGTCTTG(2)关于SEQ ID NO：3；(i)序列特征；
  (A)长度；19碱基对
  (B)类型；核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；3；
  CTTCCAGTGC TCCGAGTAG(2)关于SEQ ID NO：4；(i)序列特征；
  (A)长度；18碱基对
  (B)类型；核酸
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  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；4；
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  (A)长度；18碱基对
  (B)类型；核酸
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  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；5；
  TACTGCAGCC AGGGCATC(2)关于SEQ ID NO：6；(i)序列特征；
  (A)长度；19碱基对
  (B)类型；核酸
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  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；6；
  GTGGCCAACG TCATGAGTG(2)关于SEQ ID NO：7；(i)序列特征；
  (A)长度；20碱基对
  (B)类型；核酸
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  TCATAAAGGA AGGCCAGGAC(2)关于SEQ ID NO：8；(i)序列特征；
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  (A)长度；20碱基对
  (B)类型；核酸
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  (A)长度；20碱基对
  (B)类型；核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；9；
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  (A)长度；19碱基对
  (B)类型；核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；10；
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  (A)长度；20碱基对
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  TCAATGTCAC TCTCAGAGAG(2)关于SEQ ID NO：13；(i)序列特征；
  (A)长度；11碱基对
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  CGCAGGTCAG T(2)关于SEQ ID NO：14；(i)序列特征；
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  CCCAGCATGG(2)关于SEQ ID NO：15；(i)序列特征；
  (A)长度；11碱基对
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  ACCAGGTAAA G(2)关于SEQ ID NO：16；(i)序列特征；
  (A)长度；10碱基对
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  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；16；
  AACAGGTATC(2)关于SEQ ID NO：17；(i)序列特征；
  (A)长度；20碱基对
  (B)类型；核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；17；
  CAAACAGGTA TCCTGATGTG(2)关于SEQ ID NO：18；(i)序列特征；
  (A)长度；21碱基对
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  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；18；
  GACAAGTTCT TGAGGCACTG C(2)关于SEQ ID NO：19；(i)序列特征；
  (A)长度；19碱基对
  (B)类型；核酸
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  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；19；
  ACGTTCTCCA AATCCAGCC(2)关于SEQ ID NO：20；(i)序列特征；
  (A)长度；10碱基对
  (B)类型；核酸
  (C)链型；单链
  (D)拓扑；线性(xi)序列描述；SEQ ID NO；20；
  TCATGCCACC

Claims (32)

1.一种个体青光眼的诊断方法，包括检测与青光眼有关的基因中的突变，其中，基因中存在突变的表示患有青光眼。
2.根据权利要求1所述的方法，其中，与青光眼有关的基因中的突变的存在，是通过限制性消化直接突变分析检测的。
3.根据权利要求1所述的方法，其中，与青光眼有关的基因中的突变的存在，是通过核酸探针与测试样品中的与青光眼有关的基因的杂交检测的。
4.根据权利要求1所述的方法，其中，与青光眼有关的基因中的突变的存在，是通过肽核酸探针与测试样品中的与青光眼有关的基因的杂交检测的。
5.根据权利要求1所述的方法，其中，与青光眼有关的基因中的突变的存在，是通过对与青光眼有关的基因的序列分析检测的。
6.根据权利要求1所述的方法，其中，与青光眼有关的基因中的突变的存在，是通过等位基因特异寡核苷酸探针与测试样品中的与青光眼有关的基因的杂交检测的。
7.根据权利要求1所述的方法，其中，青光眼是开角型青光眼。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，与开角型青光眼有关的基因位于8q24。
9.根据权利要求7所述的方法，其中，与开角型青光眼有关的基因位于10p。
10.根据权利要求1所述的方法，其中，青光眼是原发性先天青光眼。
11.根据权利要求10所述的方法，其中，与青光眼有关的基因是CYP1B1。
12.根据权利要求11所述的方法，其中，突变是一个或多个核苷酸的缺失。
13.根据权利要求12所述的方法，其中，突变是从包括下列缺失的组中选取的：核苷酸1414-1422的缺失；核苷酸1727的缺失；内含子II和外显子III的部分缺失；核苷酸1691的缺失。
14.根据权利要求11所述的方法，其中，突变是一个或多个核苷酸的插入。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，突变是从下列组中选取的，包括：在核苷酸1209-1214中单个胞嘧啶残基的插入；在核苷酸846上单个胸腺嘧啶残基的插入。
16.根据权利要求11的方法，其中，突变是几个核苷酸的重复。
17.根据权利要求16的方法，其中，突变是从下列组中选取的，包括：核苷酸1546-1555的重复；核苷酸1749-1775的重复。
18.根据权利要求11所述的方法，其中，突变是一个或多个核苷酸的改变。
19.根据权利要求18所述的方法，其中，突变是从下列组中选取的，包括：核苷酸1428C到T的改变；核苷酸1187G到T的改变；核苷酸517G到C的改变；核苷酸528G到A的改变；核苷酸1439G到T的改变；核苷酸1505G到A的改变；核苷酸1515G到A的改变；核苷酸1656C到T的改变；核苷酸1751C到T的改变。
20.一种青光眼的诊断方法，包括检测与青光眼有关的基因编码蛋白质表达的改变，其中蛋白质表达中存在改变的表示患有青光眼。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，改变是与青光眼有关的基因编码蛋白质表达中的质的改变。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，改变是与青光眼有关的基因编码蛋白质表达中的量的改变。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，改变是与青光眼有关的基因编码蛋白质表达中的量的改变和质的改变。
24.根据权利要求20所述的方法，其中，与青光眼有关的突变基因编码蛋白质特异结合的抗体，在检定蛋白质表达中使用。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，与青光眼有关的非突变基因编码蛋白质特异结合的抗体，在检定蛋白质表达中使用。
26.一种用于诊断青光眼的试剂盒，包括和与青光眼有关的突变基因特异杂交的探针。
27.一种和与青光眼有关的突变基因特异杂交的核酸探针。
28.一种和与青光眼有关的突变基因特异杂交的肽核酸探针。
29.一种和与青光眼有关的突变基因编码蛋白质特异结合的抗体。
30.与青光眼有关的基因编码蛋白质在生产治疗青光眼的药剂中的应用。
31.和与青光眼有关的基因编码蛋白质特异结合的抗体在生产治疗青光眼的药剂中的应用。
32.含有与青光眼有关的基因的核酸在生产治疗青光眼的药剂中的应用。
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