CN116422375B

CN116422375B - 一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂及其应用

Info

Publication number: CN116422375B
Application number: CN202310698629.7A
Authority: CN
Inventors: 彭福军; 周宝龙; 郭文雪
Original assignee: Weifang Medical University
Current assignee: Weifang Medical University
Priority date: 2023-06-14
Filing date: 2023-06-14
Publication date: 2023-08-15
Anticipated expiration: 2043-06-14
Also published as: CN116422375A

Abstract

本发明公开了提供一种具有光热‑酶协同杀菌作用的催化剂及其应用，属于抗菌技术领域。将二茂铁二甲醛、反式肉桂醛、甘露醇加入至有机溶剂中进行溶剂热反应，反应结束冷却到室温后，减压抽滤得固体，然后洗涤、干燥得到具有光热‑酶协同杀菌作用的催化剂。本发明的催化剂FcMC，具有的光热活性对其类酶活性具有协同作用和优异杀菌作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率最高可达99.65%。

Description

一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂及其应用

技术领域

本发明涉及抗菌技术领域，具体涉及一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂及其应用。

背景技术

病原体微生物引发的细菌感染一直是威胁人类健康的世界性公共难题，全球每年约四分之一的死亡是由此导致的。抗生素的发展为治疗细菌感染提供了一种有效的方法，挽救了成千上万感染者的生命。然而，长期被忽视的时间窗口，以及抗生素的滥用，导致了细菌耐药性的出现，继而使得传统抗生素作用的失效。同时，抗生素的种类有限，以及新药研发速度缓慢，也加速了耐药性病原体数量的增长，导致对生态环境和人类健康的巨大危害，单纯依靠抗生素来治疗细菌感染已经成为一种高风险治疗手段。

无抗生素策略（如光疗和气体疗法），因其抑菌活性与细菌类型无关，具有强大的优势。光热疗法（PTT），尤其是具有超强组织穿透力的生物友好型近红外疗法，是一种非侵入性的、低生物毒性的无抗生素策略，它利用光热剂将光能转化为热量来对抗细菌感染。但单独使用光热疗法抗菌效果一般，因此一般会将其与其他抗菌方法结合使用。例如将PTT与化学动力疗法相结合抗菌，其中羟基自由基（·OH）作为典型的活性氧（ROS）类型，有着极强的反应活性及氧化性，可以迅速结合细菌蛋白质中的氢原子，使其丧失生理活性。但目前将PTT与羟基自由基（·OH）结合进行抗菌的报道较少且制备的抗菌剂都是低毒的，如何提高抗菌效果、增加生物相容性、制备无毒无副作用的光热-酶协同杀菌剂是亟需解决的问题。

发明内容

针对上述现有技术，本发明的目的是提供一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂及其应用。本发明制备得到的催化剂FcMC，其具有的光热活性对其类酶活性具有协同作用和优异杀菌作用，对大肠杆菌和金黄色葡萄球菌的杀灭率最高可达99.65%。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂，所述催化剂是由二茂铁二甲醛，反式肉桂醛和甘露醇经羟醛缩合，聚合得到的多孔聚合物。

优选的，由以下方法制备：

将二茂铁二甲醛、反式肉桂醛、甘露醇加入至有机溶剂中进行溶剂热反应，反应结束冷却到室温后，减压抽滤得固体，然后洗涤、干燥得到具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂。

优选的，所述二茂铁二甲醛、反式肉桂醛、甘露醇的摩尔比为2：1：2.5。

优选的，所述有机溶剂为N，N-甲基甲酰胺。

优选的，所述溶剂热反应的温度为180℃，反应的时间为24h。

本发明的第二方面，提供具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂在制备抗菌药物中的应用。

优选的，所述催化剂具有光热活性和类酶活性，经1.2W·cm^-2的808 nm激光照射升温，并在弱酸条件下催化H₂O₂产生·OH，实现光热-酶协同杀菌。

优选的，所述抗菌为杀灭致病细菌；所述致病细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。

本发明的有益效果：

（1）本发明的催化剂制备方法简单，只需进行溶剂热反应即可一步得到，大大降低了制备成本。

（2）本发明的催化剂在激光照射下具有光热活性，温度可升至55.6℃，使细菌蛋白质变性，可以杀死部分细菌；在弱酸环境中可催化H₂O₂产生·OH，使细菌裂解而亡，杀死一定量的细菌；当光热活性和类酶活性协同作用，具有强杀菌作用，可杀灭绝大部分细菌。

（3）本发明的催化剂对人体无毒副作用，可以用于体内杀菌；并且具有良好的生物相容性，溶血率未超过5%。

附图说明

图1是二茂铁二甲醛Fc，甘露醇Ma，反式肉桂醛Ca和FcMC的红外光谱图；

图2是FcMC在扫描电镜图；其中（a）为比例尺200nm的电镜图；（b）为比例尺为1μm的电镜图；（c）为比例尺为3 μm的形貌图像；（d）为比例尺为5μm下的形貌图像；

图3是FcMC的TEM图像，其中（a）为比例尺50nm的TEM图像；（b）为比例尺100nm的TEM图像；（c）为比例尺为200nm的高分辨图像像；（d）为比例尺为500nm的TEM图像；

图4是FcMC的高分辨TEM图像和元素映射，其中（a）为FcMC在10nm比例尺下的高分辨TEM图像；（b）为FcMC在500nm比例尺下的高分辨TEM图；（c）为FcMC的C元素映射；（d）为FcMC的N元素映射；（e）为FcMC的O元素映射，（f）为FcMC的Fe元素映射；

图5是FcMC的X射线衍射（XRD）图谱；

图6是FcMC的多孔结构分析图，其中（a）为FcMC的N₂吸附/解吸曲线；（b）为FcMC的孔径分布情况；

图7是不同浓度的FcMC水悬浮液在NIR照射下的温度升高曲线；

图8是不同功率密度808nm激光照射下FcMC悬浮液（100μg/ml）的温升曲线；

图9（a）为FcMC水悬浮液在五个循环中的光热分布；（b）为FcMC水悬浮液在一个循环中的光热分布；（c）为用近红外激光（808nm，1W·cm^-2）处理FcMC悬浮液600秒，然后冷却得到的红外照片；

图10是从冷却阶段获得的线性时间数据与-lnθ的曲线图；

图11是FcMC活性氧体外检测结果，其中（a）为 FcMC+TMB+PBS、FcMC+TMB+PBS+H₂O₂、FcMC+PBS+H₂O₂、TMB+PBS+ H₂O₂的紫外光谱图；（b）为不同浓度FcMC的TMB显色曲线的紫外光谱；（c）为TMB显色反应体系在不同pH条件下在652nm处的吸光度；（d）为FcMC+TMB+PBS+H₂O₂+激光与FcMC+TMB+PBS+ H₂O₂的紫外光谱图；

图12是FcMC体外抗菌实验，其中（a）为I: PBS; II: FcMC; III: H₂O₂; IV: 激光;V: FcMC + H₂O₂; VI: FcMC + 激光; VII: FcMC + H₂O₂+ 激光处理后细菌的菌落情况；（b）为I: PBS; II: FcMC; III: H₂O₂; IV: 激光; V: FcMC + H₂O₂; VI: FcMC + 激光;VII: FcMC + H₂O₂+ 激光处理后金黄色葡萄球菌的菌落情况；（c）为I: PBS; II: FcMC;III: H₂O₂; IV: 激光; V: FcMC + H₂O₂; VI: FcMC + 激光; VII: FcMC + H₂O₂+ 激光处理后大肠杆菌的菌落情况；

图13是细菌活/死染色测定FcMC杀大肠杆菌能力，其中（a）为用PBS处理后的染色图像；（b）为用FcMC处理后的染色图像；（c）为用H₂O₂处理后的染色图像；（d）为用激光处理后的染色图像；（e）为用FcMC+ H₂O₂处理后的染色图像；（f）为用FcMC+激光处理后的染色图像；（g）为用FcMC+ H₂O₂+激光处理后的染色图像，比例尺均为200μm；

图14是细菌活/死染色测定FcMC杀大肠杆菌能力时各组的细菌活/死数量图；

图15是细菌活/死染色测定FcMC杀金黄色葡萄球菌能力，其中（a）为用PBS处理后的染色图像；（b）为用FcMC处理后的染色图像；（c）为用H₂O₂处理后的染色图像；（d）为用激光处理后的染色图像；（e）为用FcMC+H₂O₂处理后的染色图像；（f）为用FcMC+激光处理后的染色图像；（g）为用FcMC+ H₂O₂+激光处理后的染色图像，比例尺均为200μm；

图16是细菌活/死染色测定FcMC杀金黄色葡萄球菌能力时各组的细菌活/死数量图；

图17是透射电镜观察FcMC作用后大肠杆菌的形态，其中（a）为用PBS处理后的透射电镜图像；（b）为用FcMC处理后的透射电镜图像；（c）为用H₂O₂处理后的透射电镜图像；（d）为用激光处理后的透射电镜图像；（e）为用FcMC+H₂O₂处理后的透射电镜图像；（f）为用FcMC+激光处理后的透射电镜图像；（g）为用FcMC+H₂O₂+激光处理后的透射电镜图像；

图18是透射电镜观察FcMC作用后金黄色葡萄球菌的形态，其中（a）为用PBS处理后的透射电镜图像；（b）为用FcMC处理后的透射电镜图像；（c）为用H₂O₂处理后的透射电镜图像；（d）为用激光处理后的透射电镜图像；（e）为用FcMC+H₂O₂处理后的透射电镜图像；（f）为用FcMC+激光处理后的透射电镜图像；（g）为用FcMC+H₂O₂+激光处理后的透射电镜图像；

图19：FcMC聚合物的合成路线图。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

正如背景技术部分介绍的，光热疗法（PTT），尤其是具有超强组织穿透力的生物友好型近红外疗法，是一种非侵入性的、低生物毒性的无抗生素策略。因此将PTT与其他抗菌方法联合使用的抗菌剂很难做到抗菌效果好的同时还无毒副作用、生物相容性好。

基于此，本发明的目的是提供一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂及其应用。本发明通过二茂铁二甲醛，反式肉桂醛和甘露醇的羟醛缩合反应，聚合成具有多孔结构的多孔聚合物。当有H₂O₂时，催化剂在808nm激光（1.2Wcm^-2）下照射10min，无论是大肠杆菌还是金黄色葡萄球菌，杀菌率均在99.00%以上，具有良好的杀菌效果。

为了使得本领域技术人员能够更加清楚地了解本申请的技术方案，以下将结合具体的实施例详细说明本申请的技术方案。

本发明实施例中所用的试验材料均为本领域常规的试验材料，均可通过商业渠道购买得到。

实施例：光热-类酶协同杀菌的催化剂FcMC的制备

（1）二茂铁二甲醛的合成：二茂铁（5g，26mmol）、无水正己烷（75mL）和正丁基锂（2.5M，24mL）置于三颈瓶中混合，全程氩气保护，随后加入8.5ml四甲基乙二胺（TMEDA）（56mmol）。将反应混合物搅拌2h，然后在-78℃下滴加6.5ml N，N-二甲基甲酰胺（DMF）。搅拌2h后，将混合物在-78℃下水解。用二氯甲烷（CH₂Cl₂）萃取有机相，并干燥。1，1’-二茂铁甲醛的提纯以石油和乙酸乙酯（5:1）为流动相，用柱层析提纯。以63.51%的产率获得亮红色晶体（4.15g）。二茂铁二甲醛的单体核磁数据见图1，¹H NMR（400MHz，三氯甲烷-d）δ 9.94（s，2H）、4.87（s，4H）、4.66（s，4 H）。

（2）FcMC聚合物的制备：将二茂铁二甲醛（2mmol）、反式肉桂醛（1mmol）、甘露醇（2.5mmol）和N，N-甲基甲酰胺（DMF）放置具有四氟乙烯内层的反应釜中，180℃下反应24h，待冷却到室温后，打开反应釜，减压抽滤得固体，然后用蒸馏水清洗数次，直至上清清澈无色，80℃真空干燥24h，得到FcMC聚合物，合成路线见图19。

表征：

（1）催化剂红外光谱的测定：利用红外光谱确定催化剂的结构，分别取3mg的FcMC和单纯聚吡咯与干燥溴化钾粉末在研钵中充分研磨，然后放置压片模具中压制成透明无裂痕的模片，将压片放置于红外光谱扫描仪中在400-4500cm^-2范围内扫描36圈。

傅里叶变换红外光谱（FT-IR）用于验证FcMC聚合物的结构。如图1显示，在3410cm^-1处有强宽峰，是因为羟基的伸缩振动，催化剂在2910cm^-1处有吸收，归因为-C-H伸缩振动，此外，在1601cm^-1处有较强的尖锐吸收带，归因于二茂铁二甲醛和反式肉桂醛的醛基振动，且在1704cm^-1处出现了环状缩醛拉伸振动的新吸收峰，1440cm^-1处存在C=C伸缩振动吸收峰，证明了三种化合物单体成功聚合。

（2）扫描电镜SEM和透射电镜TEM：将FcMC用导电胶黏附在云母基底上并喷金，然后再SEM下观察样品形貌。将超声分解后的FcMC聚合物甲醇分散液滴加到铜网上，阴干后得到观察样本，将样本装至TEM中观察样本形貌并拍照，导出样本元素分析图及各种元素的原子含量表。通过SEM观察聚合物的形态，图2中（a）-（d）是FcMC在扫描电镜图，显示了材料在200nm、1μm、3μm和5μm下的形貌，呈现相互连接的片块状，小碳颗粒聚集，并存在大量大孔和微孔。图3中（a）-（d）是催化剂的TEM形貌图，图中黑色颗粒可能是催化剂中铁元素聚集，存在纳米颗粒，图4中（a）-（b）是高分辨TEM图，经过观察无明显的晶格条纹，且明场暗场对比并未发现有金属晶型。另外，图4中（c）-（f）是元素mapping图，显示了催化剂各种元素的均匀分布。

（3）X射线光电子能谱的测定：将2mg的FcMC直接粘贴在双面碳导电胶上制成样品，利用X-射线光电子能谱仪测量样品的电子形态，元素含量等特征。为了验证FcMC中是否有金属晶型存在，对催化剂进行了X射线衍射（XRD）检测，结果显示催化剂只有一个宽泛峰，呈现无定形状态，验证了上述高分辨TEM的结论。

（4）图6中（a）是N₂吸附解吸曲线，催化剂的N₂吸附解析曲线显示出典型II型等温线，具有分级孔结构；催化剂的BET表面积为276.46m²/g，最大孔隙体积为0.594m³g^-1，图6中（b）是FcMC的孔径分布情况，显示催化剂在0-25nm间具有分级孔，微孔主峰在1.34nm处，占据主导地位，次级峰分布在2-25nm的介孔范围，表明催化剂具有丰富的多孔结构和高孔隙率。

（5）FcMC的光热性能：

绘制光热曲线：将不同浓度（50、75、100、150µg mL^-1）的FcMC混悬液分别加入到1.5mL的EP管中，用水作为空白对照组，将样品放置于热成像仪下并用808 nm激光照射10min，记录其升温过程及温度成像。不同功率密度的催化剂升温曲线测试方法和上述类似，固定催化剂浓度为150μg/mL，将混悬液放置在热成像仪下，并用不同功率密度（0.6、0.8、1、1.2W·cm^-2）的808nm激光照射样品10min，记录其温度变化过程。另外，用加热/冷却循环评价催化剂本身的光热稳定性，用1.2W·cm^-2的808nm近红外激光照射1 mL的FcMC（150µg mL^-1）水悬浮液，照射10min后关闭激光，待水悬浮液的稳定降到室温后再次打开激光，如此开启/关闭激光五次，记录材料五个周期的升温降温过程。

光热转换效率的计算：利用加热/冷却循环中降温过程来计算光热转换效率：

[hS (T_max-T_surr)-Q_Dis]/I (1-10^-A808)（公式1）。

其中，h是传热系数。S是容器的表面积；T_max是照射10min后的平衡温度；T_surr是周围环境温度；Q_Dis是指测试单元的散热；I代表808nm激光功率（1W·cm^-2）；A808是FcMC水悬浮液溶液在808 nm处的吸光度。

hS的值是根据以下公式确定的：

hS= m_dC_d/_S （公式2）。

其中m_d是水溶剂的质量（1g），C_d是水溶剂的热容量（4.2J/g）；_S是指冷却时间的斜率与温度的负自然对数，有以下公式确定：

t= -_S(Inq) （公式3）。

其中，定义为/>T（变化的温度）和/>T_Max（最大变化温度）的比值，t是最高温度降温到室温所用的时间。

FcMC的碳骨架结构具有光热活性，进一步协同增强了催化剂的抗菌活性。材料悬浮液可达到的最高温度与其自身浓度和激光照射功率直接相关。图7是不同浓度的FcMC水悬浮液在NIR照射下的温度升高曲线，当激光照射功率为1.2W·cm^-2时，照射10min后，浓度为75μg/mL的材料悬浮液已经可以达到50.6℃，当浓度达到150μg/mL时，温度可以达到55.6℃，这足以杀死大部分细菌。图8是当浓度为150μg/mL的悬浮液用不同功率密度的激光照射时，当激光功率为0.6W·cm^-2时，悬浮液可升温至39.2℃，随着照射激光功率密度的增加，悬浮液的温度升高，当功率密度为1.2W·cm^-2时，最高温度升至55.5℃。此外，图9中（a）通过五个加热/冷却循环评估了FcMC的光热稳定性，升温和冷却曲线基本相同，表明其良好的光热稳定性及其作为长效光热剂的潜力。图9中（c）是FcMC水悬浮液的相应红外热图像，用近红外激光（808nm，1W·cm^-2）处理FcMC悬浮液600秒，然后冷却，悬浮液的升温过程在图中清晰可见。显示了催化剂的单独加热和冷却过程，根据其冷却过程，获得了时间和- Inq之间的线性关系，见图10，使用公式1、2、3计算，得催化剂的光热转换效率为41.45%。

（6）FcMC产生活性氧能力体外检测：3，3’，5，5’-四甲基联苯胺（TMB）可被过氧化物酶催化产生可溶性蓝色产物，并在652nm处有特殊吸收峰，利用此特性，可以检测FcMC聚合物在体外催化释放ROS情况。首先将FcMC（200μg/mL，1mL）、TMB（1.5mM，1mL）、PBS（pH=4）、H₂O₂（500μL）按照控制变量法分为四组，分别为FcMC+TMB+PBS、FcMC+TMB+PBS+H₂O₂、FcMC+PBS+H₂O₂、TMB+PBS+H₂O₂，将混合液避光孵育10min后，用0.22μm的滤膜将FcMC滤掉，用紫外分光光度记检测混合液在750-450nm范围内的吸收情况。分别不同浓度的FcMC（50、100、150、200、250、300μg/mL）与TMB（1.5mM，1mL）+ PBS（pH=4）+ H₂O₂（500μL）混合，用PBS调控，使混合液的终体积为4mL,避光孵育10min后，用0.22μm滤膜过滤后，在紫外分光光度计下测量其在750-450nm内的吸收情况。跟上述操作类似，将FcMC浓度固定为150μg/mL，PBS的pH值分别设置为1.5、2.5、3.5、4.5、5.5、6.5，与TMB、H₂O₂混合孵育过滤后测试混合液在750~50nm的吸收情况。按照FcMC（150μg/mL）、TMB（1.5mM，1mL）、H₂O₂（500μL）、PBS（pH=4）配置相同的混合液1和混合液2，将混合液1放置808nm激光（1.2 W·cm^-2）下照射10min，同时混合液2避光孵育10min，然后将混合液1和2经滤膜过滤后测其紫外吸收，收集数据并作图。

FcMC不仅具有良好的光热转换效率，而且其结构中含有Fe²⁺，可催化过氧化氢生成羟基自由基。3,3’,5,5’-四甲基联苯胺（TMB）溶液可以被羟基自由基氧化，这可以使溶液从无色变为蓝色，因此可以用作显色底物来检测羟基自由基的存在，并且蓝色溶液在652nm处具有特殊的吸收峰。图11中（a）通过TMB和H₂O₂作为双底物来测定FcMC的酶活性，在没有FcMC的溶液中，TMB溶液未被氧化且不会使溶液变色，然而，在添加FcMC之后，检测到溶液中的蓝色变化，652nm处的强烈吸收峰归因于羟基自由基对TMB的氧化。此外，图11中（b）是不同浓度FcMC的TMB显色曲线的紫外光谱，观察到FcMC的酶活性的浓度依赖性，蓝色的深度随着催化剂浓度的增加而加深，652nm处的吸收峰强度在pH＝5且含有双底物的溶液中爬升。图11中（c）是TMB显色反应体系在不同pH条件下在652nm处的吸光度，FcMC的酶样活性与天然相似，表现出pH依赖性。在酸性条件下，FcMC表现出酶样活性，并且在pH＝3.5时特别显著。在弱酸性条件下，该催化剂仍具有一定的过氧化物酶活性，为下一步应用于细菌感染的治疗奠定了良好的基础。图11中（d）是FcMC+TMB+PBS+ H₂O₂+激光与FcMC+TMB+PBS+ H₂O₂的紫外光谱图，当用激光照射时，652nm处的吸收峰强度显著增加。激光照射激发了催化剂的光热活性，温度升高，进一步促进了羟基自由基对TMB的氧化，增强了FcMC的类酶活性，这为接下来的体外抗菌实验提供了有力的基础。获得了光热和羟基自由基双重有效协同杀菌活性的结果。

试验例1：体外抗菌试验：

（1）细菌培养：本试验采用了大肠杆菌和金黄色葡萄球菌两种细菌，利用二代细菌（OD600=0.1）来完成以下实验。

（2）平板计数法测定FcMC的抗菌活性：向2mL EP管加入400µL 104CFU mL^-1细菌溶液（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）将体外细菌实验分为七组，分别为PBS（pH=5）记为I组、FcMC（200μg/mL）记为II组、H₂O₂（100μL）记为III组、激光（808nm，1.2W·cm^-2，10min）记为IV组、FcMC+H₂O₂记为V组、FcMC+激光记为VI组、FcMC+H₂O₂+激光记为VII组。按照分组要求处理完成后，放置恒温摇窗（110rpm，37℃）培养12h，然后将吹匀的菌液转移100μL到固体培养基中，并涂抹均匀，在37℃下孵育24h，以观察克隆的形态。计算菌落并与各组比较细菌活性。

上述实验证明了该催化剂的优异光热性能及其在弱酸条件下催化H₂O₂产生羟基自由基的能力，该催化剂已用于杀死细菌。接下来，基于其双重效应功能，使用平板计数法分别评估在FcMC处理下金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的活性。基于类酶反应的双底物原因，将分组分为七组，即PBS组（I组）；FcMC组（II组）；H₂O₂组（III组）；激光组（IV组）；FcMC+H₂O₂组（V组）；FcMC+激光组（VI组）；FcMC+H₂O₂+激光组（VII组）。在实验期间，使用pH 5.5的PBS模拟细菌感染微环境。如图12所示，对于金黄色葡萄球菌和大肠杆菌，仅使用激光（IV组）、H₂O₂（III组）和FcMC（II组），只能实现轻微的细菌抑制，甚至没有杀菌效果（激光组（IV组）：大肠杆菌的存活率为97.22%，金黄色葡萄球菌的存活率为99.16%；H₂O₂组（III组）：大肠杆菌的存活率为78.24%，金黄色葡萄球菌的存活率为78.78%；FcMC组（II组）: 大肠杆菌的存活率为74.7%，金黄色葡萄球菌的存活率为72%），无法达到理想的杀菌效果，仅依靠材料的光热效应，FcMC+激光组（VI组）只能杀死69%的金黄色葡萄球菌，68%的大肠杆菌，仅依靠材料本身的类酶活性，FcMC+H₂O₂组（V组）可以杀死55%的金黄色葡萄球菌，57%的大肠杆菌；当光热活性和类酶活性协同作用时，FcMC+H₂O₂+激光组的杀金黄色葡萄球菌效率高达99.44%，大肠杆菌98%。

试验例2：细菌活/死染色试验：

SYTO-9和PI用于区分活/死细菌。SYTO-9由于穿透所有细菌膜（完整和受损）而将细菌标记为绿色，而PI只能穿透受损的细胞膜，将细菌标记为红色，同时减少SYTO-9染色产生的绿色。处理细菌，分为a）PBS（I组）；b）FcMC（II组）；c）H₂O₂（III组）；d）激光（IV组）；e）FcMC+H₂O₂（V组）；f）FcMC+激光（VI组）；g）FcMC+ H₂O₂+激光（VII组）七个组，分别按照组别要求与400µL 大肠杆菌或金黄色葡萄球菌（10⁸CFU mL^-1）共培养12h，然后吸取100μL的细菌悬浮与20µL SYTO-9（1.0×10^-3M）和20µL PI（1.5×10^-3M）在37℃黑暗处理15min。染色后，用PBS离心混合液以去除过量的SYTO-9和PI，最后将细菌重新悬浮于50µL PBS中，吸取10μL置于载玻片表面。使用60倍放大的倒置荧光显微镜，观察染色的大肠杆菌或金黄色葡萄球菌的图像。将细菌按照各组要求，共培养12h进行活/死染色。

利用SYYO-9和PI对共培养后的细菌染色，观察荧光情况来判定细菌死亡情况。大肠杆菌经染料染色后在倒置荧光显微镜下的观察图像见图13，图13中（a）是用PBS处理后的染色图像、图13中（b）是用FcMC处理后的染色图像、图13中（d）是用激光处理后的染色图像，这三幅图满屏绿色，基本没有红色，且根据image J量化后的荧光强度显示，绿色占比99.32%以上，其各组分别对应PBS、FcMC和激光组，表明其对大肠杆菌的基本没有杀伤作用。图13中（c）为用H₂O₂处理后的染色图像、图13中（e）为用FcMC+ H₂O₂处理后的染色图像、图13中（f）为用FcMC+激光处理后的染色图像、图13中（g）为用FcMC+ H₂O₂+激光处理后的染色图像，上述四图中出现红色荧光，尤其是图13中（g）基本全是红色，看不到绿色荧光。图14为各组的细菌活/死数量图，可以看出FcMC+ H₂O₂+激光组绿色荧光强度为0.10%，红色荧光强度为99.90%，表明FcMC+H₂O₂+激光对细菌有强有力的杀伤作用，与共培养细菌活性量化得出的结论一致。图15显示的结果和大肠杆菌试验结果类似，在图15中（a）、图15中（b）、图15中（d）均出现大量绿色，图15中（c）、图15中（e）、图15中（f）中红绿掺杂，图15中（g）出现大量红色，基本无绿色，在图16量化图中得出的结论和共培养量化结果一致。上述两种菌种的活/死染色均表明，单纯的光热或者酶反应对细菌具有一定的杀伤作用，当将两者结合协同时，具有强效杀伤作用，能杀灭99.65%以上的细菌。

试验例3：细菌透射电镜：

将细菌分别与按照试验例2设置的七个组共培养12h之后，用2.50%戊二醛溶液固定细菌，经PBS洗涤之后包埋并封闭。而后依次用低浓度到高浓度的乙醇脱水，再用丙酮脱醇，最后经梯度渗透包埋，负染后即可放置TEM下观察。

为了进一步探讨FcMC的杀菌作用，通过透射电子显微镜观察了催化剂作用后金黄色葡萄球菌和大肠杆菌的形态。如图17所示，在透射电子显微镜下，经PBS、激光、FcMC、H₂O₂处理后，大肠杆菌细菌壁光滑，且细菌密度高，但是经过FcMC+H₂O₂、FcMC+激光、FcMC+H₂O₂+激光处理后，细菌壁明显破裂，胞浆外流，显示出FcMC的光热和类酶活性协同的强有效杀菌能力。如图18所示，经PBS、激光、FcMC、H₂O₂处理后，金黄色葡萄球菌表面光滑，未破裂，与处理前无明显差异，但经FcMC+H₂O₂、FcMC+激光、FcMC+H₂O₂+激光处理后，细菌表面出现不同程度的细胞壁破裂和胞浆流出，证明FcMC具有较强的杀菌能力。

以上所述仅为本申请的优选实施例而已，并不用于限制本申请，对于本领域的技术人员来说，本申请可以有各种更改和变化。凡在本申请的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本申请的保护范围之内。

Claims

1.一种具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂，其特征在于，所述催化剂是由二茂铁二甲醛，反式肉桂醛和甘露醇经羟醛缩合，聚合得到的多孔聚合物；所述二茂铁二甲醛、反式肉桂醛、甘露醇的摩尔比为2：1：2.5。

2.根据权利要求1所述的具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂，其特征在于，由以下方法制备：

3.根据权利要求2所述的具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂，其特征在于，所述有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺。

4.根据权利要求2所述的具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂，其特征在于，所述溶剂热反应的温度为180℃，反应的时间为24h。

5.根据权利要求1~4任一项所述的具有光热-酶协同杀菌作用的催化剂在制备抗菌药物中的应用。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述催化剂具有光热活性和类酶活性，经1.2W·cm^-2的808nm激光照射升温，并在弱酸条件下催化H₂O₂产生·OH，实现光热-酶协同杀菌。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述抗菌为杀灭致病细菌；所述致病细菌为大肠杆菌和金黄色葡萄球菌。