CN116420618A

CN116420618A - 一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法

Info

Publication number: CN116420618A
Application number: CN202310355070.8A
Authority: CN
Inventors: 吴雪莉; 王增裕; 孙娟; 杨国锋; 熊王丹; 姜凯; 胡晓辰; 卢文杰
Original assignee: Qingdao Agricultural University
Current assignee: Qingdao Agricultural University
Priority date: 2023-04-04
Filing date: 2023-04-04
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2043-04-04
Also published as: CN116420618B

Abstract

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，包括如下步骤：S1：外植体消毒；S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；S4：愈伤组织再生培养基筛选；S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。本发明通过优化小花灯心草诱导、分化、再生不同阶段的条件，首次成功建立了采用成熟种子和无菌苗产生的胚根和根尖两种外植体的小花灯心草高效稳定的再生体系。高效、快速的组培再生体系的建立，为小花灯心草的种质资源的创新研究和功能基因的调控机理研究奠定了坚实的基础。

Description

一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法。

背景技术

小花灯心草(Juncus articulatus Linn.2n＝80)是灯心草科(Juncaceae)灯心草属(Juncus)的多年生草本植物，在我国的山东、江苏、浙江、安徽、江西、湖南、湖北、福建、贵州、四川、广东、广西、云南、海南、西藏、台湾等地区均有分布[1]，在亚洲北部、欧洲、北美洲及非洲也有分布。作为一种湿生植物，小花灯心草主要生于海拔1200-3680m的溪边、水边、湿地、沼泽、湿地、疏林草地及稻田旁，但在不同生境中，形态特征存在较大变异。

灯心草属在我国共有属植物77种，10变种以及1亚种，多数属于纤维植物，可用于园林绿化，可作为牲畜饲草，少数还可供药用，具有抗炎、抗菌、抗肿瘤、催眠镇静等多种药理作用，具有较好的药品开发前景。小花灯心草根系发达，具有很强的抗污能力，能够在富营养化、重金属污染水体中正常生长，可以大量吸收水中过剩的氮、磷和钾等营养盐用于自身生长，还能有效地吸附富集铜、铅、镉等重金属，具有较好的去除效果。

小花灯心草是黑河中游盐碱化沼泽的植被之一。随着植物生态修复和人工湿地技术的发展应用，常被作为湿地的观赏绿植，应用于人工湿地生态系统中，同时发挥观赏和水质净化、重金属污水吸附处理的重要作用。小花灯心草作为湿生植物根系发达，叶片绿色筒状，是研究植物生态修复和禾本科单面叶发育形态发生的重要材料。

目前，国内外对灯心草属植物的研究较少，且主要集中在药用价值考证、重金属积累的生理特性和单面叶发育形态发生等方面，关于灯心草属植物组织培养的研究尚未见报道，更未有小花灯心草组织培养再生体系建立的报道。

发明内容

本发明针对小花灯心草的植物组织培养再生体系建立，以小花灯心草的成熟种子为外植体，比较分析了不同灭菌方式、外植体类型、培养基及植物生长调节剂对愈伤组织诱导、分化和植株再生的影响，提供了一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，建立并优化了小花灯心草的组织培养再生体系。

一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，包括如下步骤：

S1：外植体消毒；

S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；

S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；

S4：愈伤组织再生培养基筛选；

S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。

在上述技术方案基础上，所述步骤S1中将小花灯心草种子进行消毒处理，消毒处理的方法为A 30％ NaClO消毒15-30min或方法B 75％乙醇消毒30s，10％-30％ NaClO消毒15-30min中的任意一种。

在上述技术方案基础上，所述步骤S1在种子消毒处理前使用4％烟熏液进行种子破除休眠处理，提高出愈伤率，缩短诱导愈伤组织的时间。

在上述技术方案基础上，所述步骤S2中，诱导愈伤组织使用的外植体为S1处理得到的种子或S1处理得到的种子经培养所得的无菌幼苗的胚根和根尖。

在上述技术方案基础上，所述步骤S3中愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：MS+2,4-D 2.0-5.0mg/L+6-BA 0.6mg/L，得到三类愈伤组织。

在上述技术方案基础上，所述三类愈伤组织，Ⅰ类为黄色颗粒且硬实度高、Ⅱ类黄色颗粒但松软、Ⅲ类白色或略褐色且松软。

在上述技术方案基础上，所述步骤S4中愈伤组织再生培养基为以下浓度的组分：MS+KT 1.0-2.0mg/L+NAA 0-2.0mg/L，再生培养4-5周，得到不定芽。

在上述技术方案基础上，所述步骤S5中继代Ⅰ类愈伤组织，再生率90％以上。

在上述技术方案基础上，所述步骤S5中愈伤组织每4周继代一次，继代培养4-36周的愈伤组织均可最为再生/遗传转化的材料。

在上述技术方案基础上，S4中再生培养和S5中继代培养的条件如下：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5500-8000Lux，恒温28℃。

本发明具有如下优点：

本发明通过优化小花灯心草诱导、分化、再生不同阶段的条件，首次成功建立了采用成熟种子和无菌苗产生的胚根和根尖两种外植体的小花灯心草高效稳定的再生体系。高效、快速的组培再生体系的建立，为小花灯心草的种质资源的创新研究和功能基因的调控机理研究奠定了坚实的基础。

附图说明

为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一种实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。

图1：本发明植物材料小花灯心草的形态特征，A为植株形态，B为叶片形态，C为蒴果和种子形态；

图2：本发明不同外植体类型对诱导率和成愈率的影响，A为成熟种子做外植体，B为无菌苗产生的胚根和根尖做外植体，C为不同时间的诱导率，D为不同时间的成愈率；

图3：不同愈伤组织状态对再生的影响，ABC为Ⅰ类愈伤组织及再生，DEF为Ⅱ类愈伤组织及再生，HIJ为Ⅲ类愈伤组织及再生；

图4：愈伤组织年龄对再生的影响，A为基因型1的再生率和褐化率，B为基因型2的再生率和褐化率，C为基因型3的再生率和褐化率，D为不同基因型培养36周的愈伤组织状态，E为不同基因型培养48周的愈伤组织状态。

具体实施方式

下面结合附图、实验和实验数据对本发明作进一步说明：

植物材料：

小花灯心草(Juncus articulatus Linn.)采集于山东省滨州市，须根发达，具根状茎和匍匐茎，节上生有不定根；直立茎部分高10-25cm，直径1-2mm，绿色且光滑无毛，可产生2-4个分蘖(图1-A)；叶多为茎生，圆筒形，绿色，具有5-10个明显的横隔，叶长6-12cm，宽0.7-3mm(图1-B)；花序具有3-9个分头，花序梗长短不等，蒴果三棱状圆锥形；种子长卵形，极小，长0.4-0.5mm，两端具有小尖头，蜡黄色，表面具细微横纹和纵条纹(图1-C)。小花灯心草基因为杂合型，因此后续实验中以基因型1、基因型2和基因型3来分别指代3个不同种子所诱导出的愈伤组织。

数据统计与分析：

污染率(％)＝染菌的外植体数/接种的外植体数×100％；

存活率(％)＝存活的外植体数/接种的外植体数×100％；

灭活率(％)＝失去活力的外植体数/接种的外植体数×100％；

诱导率(％)＝诱导产生愈伤组织的外植体数/接种的外植体数×100％；

成愈率(％)＝生成黄色颗粒状的愈伤组织数/接种的外植体数×100％；

褐化率(％)＝不能再生且愈伤组织变软且褐色的愈伤组织数/接种的愈伤组织数×100％；

再生率(％)＝再生的健壮幼苗数/接种的愈伤组织数×100％；

通过以上公式进行数据统计，运用SPSS 25.0统计分析软件，对获得的数据进行显著性分析，以筛选最佳的组织培养和再生条件。

实验例1：外植体消毒

选取完全成熟且饱满的小花灯芯草种子，用流水冲洗掉杂质和浮皮后，装入5mL离心管中，在超净台中进行种子的消毒处理。选取75％乙醇和次氯酸钠(NaClO)溶液作为消毒灭菌试剂。设置8个处理组(如表1所示)，消毒处理后，使用无菌水冲洗4-6次。倒掉多余水分，使用移液枪吸取灭菌后的种子，均匀铺在MS-1培养基中，吸除多余水分。每种消毒方法接种3盘，培养10-20d后统计数据，筛选最佳的处理方法及消毒方法，实验数据如表1所示：

表1不同处理和灭菌方法对外植体的影响

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

如表1实验数据所显示，采用75％乙醇和NaClO进行不同浓度、时间的组合消毒处理，对外植体的存活率、污染率和灭活率的具有明显影响。单一使用NaClO进行消毒处理，随浓度提高和时间的延长，污染率持续下降；使用30％ NaClO消毒15min或30min都能起到很好的消毒效果，并且存活率和灭活率之间无显著差异。使用75％乙醇消毒30s和NaClO进行联合消毒处理时，使用10％ NaClO处理30min可以达到较好的消毒效果，污染率为0，存活率为92.6％；使用30％ NaClO处理的污染率均为0，但明显降低了存活率，灭活率最高达到了22.6％。

上述实验数据可得:小花灯心草种子作为外植体的最佳的消毒方法为30％ NaClO处理15min，或使用75％乙醇处理30s+10％ NaClO处理30min。

实验例2：破除休眠处理

针对愈伤组织产生时间较长的问题，在最佳的消毒处理之前，选择使用1％和4％烟熏液进行破除休眠处理，通过比较不同处理浓度和时间对愈伤组织产生时间的影响，在MS-1培养基中培养30d后统计数据，筛选最佳的破除休眠处理，进一步提高愈伤组织产生的速度，缩短培养时间的方法，实验数据如表2所示：

表2破除休眠处理对愈伤组织产生的影响

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

如表2实验数据所显示，通过烟熏浸泡破除休眠处理显著提高30天出愈伤率和60天出愈伤率，相同浓度的烟熏液，随着浸泡处理时间的增加显著提高出愈伤率；浸泡处理时间相同时，随着烟熏液浓度的增加显著提高出愈伤率。综上试验数据所得，在烟熏液浓度为4％、浸泡处理时间为24h时，30天出愈伤率为82.6％，60天出愈伤率高达97.4％，为最佳处理方式。

实验例3：诱导愈伤组织的外植体筛选

外植体的选择直接关系到愈伤组织的诱导效率。本发明选择了两种外植体类型。

一种为直接在MS-1诱导培养基上接种灭菌后的成熟种子，所述MS-1诱导培养基配方组分如下：MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.6mg/L；

另一种是将灭菌后的种子接种在1/2MS培养基中，将发芽后1-1.5cm的无菌幼苗平铺接种在MS-1诱导培养上，其胚根和根尖为外植体，所述1/2MS培养基配方组分为MS培养基中大量元素减半。

每种外植体类型重复接种3盘，在接种后30-40d后统计数据，筛选诱导率和成愈率最佳的外植体类型。

结果如图2所示，小花灯心草的成熟种子或无菌苗产生的胚根和根尖均可诱导产生质量较高的颗粒状黄色愈伤组织(图2-A、B)；但成熟种子作为外植体获得愈伤组织的时间较长；在MS-1诱导培养基中培养30d的诱导率仅为11.7％，成愈率仅为10.1％。而使用无菌苗的胚根和根尖作为外植体的诱导率和成愈率均显著更高，分别为73.5％和59.3％。延长培养时间，均可以显著提高成熟种子和无菌苗胚根和根尖的诱导率以及成愈率。培养90d的成愈率均最高，成熟种子为47.9％，无菌苗胚根和根尖的成愈率为97.1％(图2-C、D)。

上述实验数据可得:无菌苗的胚根和根尖更适合作为小花灯心草组织培养的外植体，具有更高的诱导率和成愈率，诱导产生的愈伤组织的生长速度较快，而愈伤组织的生长状态无显著差异，均可以诱导产生结构紧实呈黄色颗粒状的高质量愈伤组织。

实验例4：愈伤组织诱导分化培养基筛选

分别以N6和MS为基本培养基，在培养基中均加入0.6mg/L 6-BA(6-苄氨基嘌呤6-Benzylaminopurine)，添加2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-dichlorophenoxyacetic acid,2,4-D)浓度分别为2mg/L和5mg/L(培养基配比见表3)，添加30g/L蔗糖，调节pH值为5.8，然后加入8g/L琼脂，在121℃高压蒸汽灭菌条件下，灭菌20min。在不同植物调节剂配比的培养基中接种无菌苗的胚根和根尖为外植体，培养6周左右，统计成愈率，同时记录愈伤组织的生长状态，筛选愈伤组织质量和成愈率最好的诱导培养基。

植物生长调节物质配比和不同的基本诱导培养基，对愈伤组织的成愈率具有决定性的影响。N6和MS基本诱导培养基是单子叶植物组织培养中最常用两种培养基类型。本发明通过比较2,4-D和6-BA两种生长调节物质的不同配比，对小花灯心草愈伤组织诱导的影响，从而筛选小花灯心草的最佳诱导培养基，共设置4个处理，如表3所示：

表3不同诱导培养基对成愈率和愈伤组织状态的影响

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)

如表3实验数据所显示，在添加相同浓度的2,4-D和6-BA的培养基中，MS作为基本培养基的成愈率均高于N6，愈伤组织的生长较快且质量较好。在添加0.6mg/L 6-BA条件下，比较了添加不同浓度2,4-D对愈伤组织诱导的影响，结果表明添加2mg/L 2,4-D，诱导率最高为93.3％，愈伤组织呈黄色颗粒状且结构紧实，增殖速度较快。由此可见，MS-1是最优的小花灯心草愈伤组织诱导培养基，MS-1配方组分为：MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA 0.6mg/L。

实验例5：愈伤组织再生培养基筛选

再生培养基的生长调节剂配比是决定不定芽诱导率和再生率的关键因素。选取来自同一基因型且结构紧实的黄色颗粒状胚性愈伤组织，用尖头镊子剥取3-4mm左右，分别接种于添加激动素(Kinetin,KT)和1-萘乙酸(1-Naphthaleneacetic acid,NAA)不同浓度配比的MS基本培养基中，设置6个处理(编号MG-1/6，表3)，每种再生培养基上接种20-25个愈伤组织，3次重复，再生培养4-5周后，对不同再生培养基中的愈伤组织的再生率进行统计，以确定最佳的再生培养基。

表4不同生长调节剂配比对再生的影响

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。

如表4实验数据所显示，KT和NAA浓度和组合对小花灯心草的再生具有重要影响。在添加同浓度KT的再生培养基中，不添加6-BA和添加2mg·L-1NAA的再生率无显著差异，说明高浓度的NAA对小花灯心草的再生没有明显的正向促进作用。在添加相同浓度NAA的培养基中，添加KT浓度调高至2mg·L-1时，小花灯心草的再生率反而降低。小花灯心草愈伤组织在分别添加1mg·L-1KT和NAA的MG-3再生培养基中的再生率最高为95.5％。

因此，最适合小花灯心草不定芽诱导和再生的培养基是MG-3配方组分为：MS+KT1mg/L+NAA1mg/L，能够保证高效率的植株再生，且再生苗生长健壮。

实验例6：愈伤组织种类和继代时间筛选

选择来自同一基因型的，不同生长状态的Ⅰ-Ⅲ类愈伤组织进行继代培养，(Ⅰ类黄色颗粒且硬实度高；Ⅱ类黄色颗粒但松软、Ⅲ类白色或略褐色且松软)，每种状态的愈伤组织挑取大小基本相同的20-25个愈伤组织，均接种于再生培养基(MG-3)中，3次重复，统计再生率(详见表5)，以确定后续可用于再生或遗传转化的最佳的愈伤组织生长状态。

表5不同愈伤组织状态对再生的影响

如表5实验数据和图3所显示，通过对同一基因型不同质量愈伤组织的再生率的统计(表5)，可以看出黄色颗粒、硬度高、结构紧实的Ⅰ类愈伤组织具有最高的再生率为94.8％，并且不定芽和再生苗的生长速度快且健壮，再生数量也更多(图3-A～C)。具有黄色较小颗粒但微软的Ⅱ类愈伤组织变绿后，需要较长的时间才能产生不定芽，不定芽诱导过程较长，再生率显著较低为65.5％，且再生苗的生长速度较慢(图3-D～F)。白色或略褐色且松软的Ⅲ类愈伤组织的再生率显著更低，且大部分愈伤组织已失去再生能力，虽然可变绿但是大部分无不定芽的再生，仅有16.3％可再生出不定芽，并且生长非常缓慢，约3-4个月才能生长至1cm左右(图3-H～J)。由此可见，具有黄色颗粒，组织紧实度较高，硬度较大的小花灯心草Ⅰ类愈伤组织最适用于再生或遗传转化，具有非常高的再生率，且再生苗健壮。

选择3个不同基因型的愈伤组织，挑选生长状态最好的愈伤组织每4周继代1次，继代时选取部分生长状态基本一致的愈伤组织，接种于再生培养基(MG-3)中，3次重复，统计基因型和继代时间(16、24、36、48周)对再生率的影响，确定愈伤组织最佳的再生时期。

愈伤组织的再生过程均在同一光照培养箱，相同的培养条件(28℃，16h光照/8h黑暗，光照5500-8000Lux)下培养4-5周后进行统计。

如图3所示，愈伤组织继代培养的年龄对再生的影响因不同基因型而不同。随继代培养时间的延长，所有基因型愈伤组织的再生率降低，褐化率升高。基因型1继代培养24周后的再生率无显著下降，而其他2个基因型均显著下降；培养48周后所有基因型的再生率均显著下降，最高为72.2％，而基因型2仅为再生率仅12.7％。基因型2在继代培养过程中的褐化率随时间直线上升，愈伤组织质量下降较快，培养36周左右的愈伤组织不适合做后续的遗传转化材料(图4-A～C)。基因型1和3的愈伤组织状态在多次继代后，仍能保持较好的生长状态，继代48周的愈伤组织状态仍大部分可以保持黄色的紧实颗粒状(图4-D、E)，且再生率在62.6％以上，是适合作为后续遗传转化的基因型。

本发明所建立小花灯心草组织培养再生体系：

1、小花灯心草成熟种子最优消毒方式：方式A：30％ NaClO处理15min；方式B：使用75％乙醇处理30s+10％ NaClO处理30min；

2、小花灯心草破除休眠提高诱导率的最佳处理方式：烟熏液浓度为4％、浸泡处理时间为24h；

3、诱导愈伤组织最优外植体为无菌苗胚根和根尖，培养方式为：将灭菌后的种子接种在1/2MS培养基中，将发芽后1-1.5cm的无菌幼苗平铺接种在MS-1诱导培养上，其胚根和根尖为外植体；

4、愈伤组织诱导分化最佳培养基配方组分为：MS+2,4-D 2.0mg/L+6-BA0.6mg/L；

5、愈伤组织再生最佳培养基配方组分为：MS+KT 1mg/L+NAA 1mg/L；

6、愈伤组织再生的最佳类型为：Ⅰ类黄色颗粒且硬实度高；

7、愈伤组织继代再生的最佳时期为：愈伤组织每4周继代一次，继代培养4-36周的愈伤组织均可最为再生/遗传转化的材料；

8、最适合作为后续遗传转化的基因型为：基因型1。

上面以实验例方式对本发明进行了说明，但本发明不限于上述具体实施例，凡基于本发明所做的任何改动或变型均属于本发明要求保护的范围。

Claims

1.一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，包括如下步骤：

S1：外植体消毒；

S2：诱导愈伤组织的外植体筛选；

S3：愈伤组织诱导分化培养基筛选；

S4：愈伤组织再生培养基筛选；

S5：愈伤组织种类和继代时间筛选。

2.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S1中将小花灯心草种子进行消毒处理，消毒处理的方法为A 30％NaClO消毒15-30min或方法B 75％乙醇消毒30s，10％-30％NaClO消毒15-30min中的任意一种。

3.根据权利要求2所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S1在种子消毒处理前使用4％烟熏液进行种子破除休眠处理。

4.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S2中，诱导愈伤组织使用的外植体为S1处理得到的种子或S1处理得到的种子经培养所得的无菌幼苗的胚根和根尖。

5.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S3中愈伤组织诱导培养基为以下浓度的组分：MS+2,4-D 2.0-5.0mg/L+6-BA0.6mg/L，得到三类愈伤组织。

6.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述三类愈伤组织，Ⅰ类为黄色颗粒且硬实度高、Ⅱ类黄色颗粒但松软、Ⅲ类白色或略褐色且松软。

7.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S4中愈伤组织再生培养基为以下浓度的组分：MS+KT 1.0-2.0mg/L+NAA 0-2.0mg/L，再生培养4-5周，得到不定芽。

8.根据权利要求1和5所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S5中继代Ⅰ类愈伤组织，再生率90％以上。

9.根据权利要求1所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，所述步骤S5中愈伤组织每4周继代一次，继代培养4-36周的愈伤组织均可最为再生/遗传转化的材料。

10.根据权利要求7-9中任一所述的一种小花灯心草组织培养再生体系建立的方法，其特征在于，S4中再生培养和S5中继代培养的条件如下：光周期为16h光照/8h黑暗，光照强度为5500-8000Lux，恒温28℃。