CN116411054A

CN116411054A - 一种提高pcr风干试剂稳定性的组合物及其应用

Info

Publication number: CN116411054A
Application number: CN202310098603.9A
Authority: CN
Inventors: 胡飞驰; 蒋析文; 王丽芳; 宋健娟; 潘俊霞
Original assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Current assignee: Guangzhou Da'an Gene Co ltd
Priority date: 2023-02-10
Filing date: 2023-02-10
Publication date: 2023-07-11
Also published as: WO2024164676A1

Abstract

本发明公开了一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物及其应用，所述组合物包含0.15g/mL～0.25g/mL蔗糖、0.20g/mL～0.25g/mL海藻糖、0.10g/mL～0.15g/mL葡聚糖、0.05g/mL～0.10g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL～0.10g/mL棉籽糖；所述应用为所述组合物在制备PCR风干试剂中的应用。本发明提供的稳定剂可使全预混的PCR体系在风干前后保持相当的检测性能，稳定性好，室温长期存放仍可保持高效的检测性能，且检测的灵敏度高，对于不同的检测靶标有良好的普适性，使用方便，便于常温下保存及运输。

Description

一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物及其应用

技术领域

本发明涉及PCR技术领域，具体地，涉及一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物及其应用。

背景技术

聚合酶链反应(PCR)是一种简单、灵敏、快速地体外放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术，用于扩增特定的基因片段，目前该技术现已被广泛用于疾病检测、基因检测、病毒和病原菌检测、遗传病、癌症基因检测、动物检测、食品及环境检测等各个领域。

目前市场流通的PCR试剂因大部分为液体试剂，因为含有生物活性成分(DNA酶、反转录酶等)，一般需要在-20℃左右的冷链环境中储运，以确保试剂有效成分的生物活性。冷链运输不仅成本高，而且环境温度的变化造成试剂反复冻融会直接影响检测试剂的性能和保质期。

此外，现有的PCR检测试剂通常是多个组分各自分装，需要本领域技术人员在检测前进行试剂混匀配制，在操作过程中容易增加环境中气溶胶对扩增体系的污染风险。

发明内容

为了解决现有技术中PCR试剂保存不便、运输成本高及使用方法繁琐的问题，本发明提供了一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物及其应用。

本发明的第一个目的是提供一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物。

本发明的第二个目的是提供上述组合物在制备PCR风干试剂中的应用。

本发明的第三个目的是提供一种PCR风干试剂。

本发明的第四个目的是提供一种制备PCR风干试剂的方法。

本发明的第五个目的是提供上述方法制得的PCR风干试剂。

本发明的第六个目的是提供上述PCR风干试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用。

为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的：

糖是最常见、使用最广的一类冻干保护剂，是蛋白质的非特异性稳定剂，在干燥过程中能对蛋白质起到一定的保护作用。糖的保护作用与其及蛋白质的种类有关，而双糖是研究最多也公认最有效的保护剂，其中蔗糖是由一分子葡萄糖及一分子果糖所构成的双糖，化学性质稳定，多呈无定型结构，对阻止蛋白质二级结构改变、干燥处理过程中及贮藏期内蛋白质的伸展和聚集起显著作用。与蔗糖相比，海藻糖具有更高的玻璃化温度、更低的引湿性、更不具有还原性，这些优点均预示着海藻糖可能具有更广阔的应用前景。

PVP40聚合物也常用作为蛋白质的冷冻保护剂。通常聚合物的稳定作用取决于聚合物的多重性质，PVP能够提高PCR产物生成量，PVP也能有效提高PCR效率和特异性。

本发明通过将PCR反应体系中各组分混合在一起，并添加特殊的可风干稳定剂，放在烘箱进行处理后，使PCR反应试剂达到一定的失水率，从而使PCR试剂由溶液状态达到胶质状态。

一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物，包含0.15g/mL～0.25g/mL蔗糖、0.20g/mL～0.25g/mL海藻糖、0.10g/mL～0.15g/mL葡聚糖、0.05g/mL～0.10g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL～0.10g/mL棉籽糖。

优选地，所述组合物包含0.15g/mL蔗糖、0.20g/mL海藻糖、0.10g/mL葡聚糖、0.05g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL棉籽糖。

优选地，所述组合物包含0.15g/mL蔗糖、0.20g/mL海藻糖、0.10g/mL葡聚糖、0.10g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL棉籽糖。

优选地，所述组合物包含0.25g/mL蔗糖、0.25g/mL海藻糖、0.10g/mL葡聚糖、0.10g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL棉籽糖。

优选地，所述组合物包含0.20g/mL蔗糖、0.20g/mL海藻糖、0.10g/mL葡聚糖、0.05g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.10g/mL棉籽糖。

优选地，所述组合物包含0.20g/mL蔗糖、0.25g/mL海藻糖、0.15g/mL葡聚糖、0.05g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.10g/mL棉籽糖。

更优选地，所述组合物包含0.15g/mL蔗糖、0.20g/mL海藻糖、0.10g/mL葡聚糖、0.05g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL棉籽糖。

上述组合物在制备PCR风干试剂中的应用。

一种PCR风干试剂，包含上述的组合物、dNTPs、PCR反应酶和PCR反应buffer。

优选地，所述dNTPs的终浓度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。

更优选地，所述dNTPs的终浓度为2mmol/L。

进一步优选地，所述dNTPs包括终浓度为0.4mmol/L dATP、终浓度为0.4mmol/LdTTP、终浓度为0.4mmol/L dCTP、终浓度为0.4mmol/L dGTP和终浓度为0.4mmol/L dUTP。

更优选地，所述PCR反应酶包括终浓度为0.06U/μL～0.24U/μL的热启动Taq抗体酶、终浓度为0.06U/μL～0.24U/μL的Taq酶和终浓度为0.01U/μL～0.04U/μL的UDG酶。

进一步优选地，热启动Taq抗体酶终浓度为0.12U/μL。

进一步优选地，Taq酶终浓度为0.12U/μL。

进一步优选地，UDG酶终浓度为0.02U/μL。

更进一步优选地，所述PCR反应酶还包括终浓度为3.6％v/v稀释液，所述稀释液的主要成分为：Tris-HCl(pH 9.0)，15mM；KCl，100mM；EDTA(pH8.0)，0.1mM；Tween-20，0.5％v/v；NP-40，4mL，DTT，1mM；丙三醇(甘油)，50％v/v。

更优选地，所述PCR反应buffer为6×buffer。

进一步优选地，所述PCR反应buffer包括终浓度为0.06mol/L的Tris-HCl pH8.8、终浓度为0.01mol/L的(NH4)₂SO₄、终浓度为0.003mol/L的MgCl₂和终浓度为0.05mol/L的KCl。

更进一步优选地，所述PCR反应buffer还包括终浓度为0.4％v/v的Tween-20。

优选地，所述PCR风干试剂还包含PCR引物和/或PCR探针。本发明对PCR引物和PCR探针的序列没有限定，用于进行PCR反应的引物和探针均可实现本发明的目的。

更优选地，所述PCR引物的终浓度为0.2pmol/μL～0.5pmol/μL。

进一步优选地，所述PCR引物包含检测B群链球菌的PCR引物，终浓度为0.33pmol/μL。

更一步优选地，所述PCR引物还包含检测GAPDH的引物，终浓度为0.5pmol/μL。

更优选地，所述PCR探针的终浓度为0.1pmol/μL～0.4pmol/μL。

进一步优选地，所述PCR探针包含检测B群链球菌的PCR探针，终浓度为0.167pmol/μL。

更一步优选地，所述PCR探针还包含检测GAPDH的探针，终浓度为0.267pmol/μL。

更优选地，所述PCR风干试剂还包含Tris-EDTA缓冲液。

进一步优选地，所述Tris-EDTA缓冲液的终浓度为2.00％v/v～4.00％v/v。

更进一步优选地，所述Tris-EDTA缓冲液的终浓度为2.47％v/v。

一种制备PCR风干试剂的方法，包括以下步骤：

S1.将上述组合物、dNTPs、PCR反应酶和PCR反应buffer混合均匀；

S2.将上一步所得混合物于37℃～50℃风干8小时～16小时。

优选地，步骤S1中，所述dNTPs的终浓度为0.2mmol/L～0.5mmol/L。

更优选地，步骤S1中，所述dNTPs的终浓度为2mmol/L。

进一步优选地，步骤S1中，所述dNTPs包括终浓度为0.4mmol/L dATP、终浓度为0.4mmol/L dTTP、终浓度为0.4mmol/L dCTP、终浓度为0.4mmol/LdGTP和终浓度为0.4mmol/L dUTP。

更优选地，步骤S1中，所述PCR反应酶包括终浓度为0.06U/μL～0.24U/μL的热启动Taq抗体酶、终浓度为0.06U/μL～0.24U/μL的Taq酶和终浓度为0.01U/μL～0.04U/μL的UDG酶。

进一步优选地，步骤S1中，热启动Taq抗体酶终浓度为0.12U/μL。

进一步优选地，步骤S1中，Taq酶终浓度为0.12U/μL。

进一步优选地，步骤S1中，UDG酶终浓度为0.02U/μL。

更进一步优选地，步骤S1中，所述PCR反应酶还包括终浓度为3.6％v/v稀释液，所述稀释液的主要成分为：Tris-HCl(pH 9.0)，15mM；KCl，100mM；EDTA(pH 8.0)，0.1mM；Tween-20，0.5％(v/v％)；NP-40，4mL，DTT，1mM；丙三醇(甘油)，50％(v/v％)。

更优选地，步骤S1中，所述PCR反应buffer为6×buffer。

进一步优选地，步骤S1中，所述PCR反应buffer包括终浓度为0.06mol/L的Tris-HCl pH8.8、终浓度为0.01mol/L的(NH4)₂SO₄、终浓度为0.003mol/L的MgCl₂和终浓度为0.05mol/L的KCl。

更进一步优选地，步骤S1中，所述PCR反应buffer还包括终浓度为0.4％v/v的Tween-20。

优选地，步骤S1中，还加入PCR引物和/或PCR探针。本发明对PCR引物和PCR探针的序列没有限定，用于进行PCR反应的引物和探针均可实现本发明的目的。

更优选地，步骤S1中，所述PCR引物的终浓度为0.2pmol/μL～0.5pmol/μL。

进一步优选地，步骤S1中，所述PCR引物包含检测B群链球菌的PCR引物，终浓度为0.33pmol/μL。

更一步优选地，步骤S1中，所述PCR引物还包含检测GAPDH的引物，终浓度为0.5pmol/μL。

更优选地，步骤S1中，所述PCR探针的终浓度为0.1pmol/μL～0.4pmol/μL。

进一步优选地，步骤S1中，所述PCR探针包含检测B群链球菌的PCR探针，终浓度为0.167pmol/μL。

更一步优选地，步骤S1中，所述PCR探针还包含检测GAPDH的探针，终浓度为0.267pmol/μL。

更优选地，步骤S1中，还加入Tris-EDTA缓冲液。

进一步优选地，步骤S1中，所述Tris-EDTA缓冲液的终浓度为2.00％v/v～4.00％v/v。

更进一步优选地，步骤S1中，所述Tris-EDTA缓冲液的终浓度为2.47％v/v。

优选地，步骤S2中，37℃风干8小时～16小时。

优选地，步骤S2中，37℃～50℃风干16小时。

更优选地，步骤S2中，37℃风干16小时。

任一上述方法制得的PCR风干试剂也应在本发明的保护范围之内。

任一上述方法在制备核酸检测试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

任一上述PCR风干试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用也应在本发明的保护范围之内。

一种B群链球菌核酸检测试剂盒，包含PCR风干试剂；所述PCR风干试剂包含上述的组合物、dNTPs、PCR反应酶和PCR反应buffer。

优选地，所述B群链球菌核酸检测试剂盒还包含检测B群链球菌的PCR引物和/或检测B群链球菌的PCR探针。

更优选地，所述PCR风干试剂包含检测B群链球菌的PCR引物和/或检测B群链球菌的PCR探针。

更优选地，所述检测B群链球菌的PCR引物的靶标为cAMP基因。

更优选地，所述检测B群链球菌的PCR探针的靶标为cAMP基因。

所述cAMP基因的NCBI基因号为X72754.1。

进一步优选地，所述检测B群链球菌的PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No：1～2所示。

更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No：1所示的检测B群链球菌的PCR引物的终浓度为0.33pmol/μL；所述核苷酸序列如SEQ ID No：2所示的检测B群链球菌的PCR引物的终浓度为0.33pmol/μL。

进一步优选地，所述检测B群链球菌的PCR探针的核苷酸序列如SEQ ID No：3所示。

更进一步优选地，所述检测B群链球菌的PCR探针的终浓度为0.167pmol/μL。

更优选地，所述B群链球菌核酸检测试剂盒还包含以GAPDH基因为靶标的PCR引物和/或PCR探针。

进一步优选地，所述PCR风干试剂还包含以GAPDH基因为靶标的PCR引物和/或PCR探针。

所述GAPDH基因的NCBI基因号为NG_007073.2。

进一步优选地，所述以GAPDH基因为靶标的PCR引物的核苷酸序列如SEQ ID No：4～5所示。

更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No：4所示的以GAPDH基因为靶标的PCR引物的终浓度为0.5pmol/μL，所述核苷酸序列如SEQ ID No：5所示的以GAPDH基因为靶标的PCR引物的终浓度为0.5pmol/μL。

进一步优选地，所述以GAPDH基因为靶标的PCR探针的核苷酸序列如SEQ ID No：6所示。

更进一步优选地，所述核苷酸序列如SEQ ID No：6所示的以GAPDH基因为靶标的PCR探针的终浓度为0.267pmol/μL。

更优选地，所述B群链球菌核酸检测试剂盒还包含B群链球菌阳性质控品。

进一步优选地，所述B群链球菌阳性质控品的核苷酸序列如SEQ ID No：7所示。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

本发明提供的稳定剂可使全预混的PCR体系在风干前后保持相当的检测性能，稳定性好，室温长期存放仍可保持高效的检测性能，且检测的灵敏度高，对于不同的检测靶标有良好的普适性，使用方便，便于常温下保存及运输。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作出进一步地详细阐述，所述实施例只用于解释本发明，并非用于限定本发明的范围。下述实施例中所使用的试验方法如无特殊说明，均为常规方法；所使用的材料、试剂等，如无特殊说明，为可从商业途径得到的试剂和材料。

本发明实施例所用试剂和材料：除注明外，纯度均为分析纯，试验用水均为灭菌水；主要材料包括引物探针、热启动Taq抗体酶、Taq酶、UDG酶、酶系稀释液、蔗糖、海藻糖、葡聚糖、聚乙烯吡络烷酮40(PVP40)、棉籽糖及其它常规化学试剂。

本发明实施例所用仪器设备包括：ABI7500荧光定量PCR检测仪、电热恒温鼓风干燥机、高速离心机、漩涡混匀器及电子天平。

实施例1风干预混液的制备

1、稳定剂的制备

以蔗糖、海藻糖、葡聚糖、PVP40及棉籽糖作为稳定剂的组成成分，按照如表1所示的信息进行配制，每个配方均溶于纯化水，定容至100mL，共得到14种不同的稳定剂，记为稳定剂1～14。

表1稳定剂的配方

2、引物探针混合液的制备

以cAMP基因(NCBI基因号：X72754.1)作为PCR检测的目的基因，上游引物G-F1：5’-CCAACCCTGAGACAGTTTATGAT-3’(SEQ ID No：1)，下游引物G-R1：5’-GTTGAGTTGAAAAAGTGATTGCT-3’(SEQ ID No：2)，探针：G-P1：5’-TGAATTCTATTGGTAGTCGTGTAGAAGCC-3’(SEQ ID No：3)。

以GAPDH作为PCR检测的内参基因，上游引物G-GAPDH-F：5’-ACACCCACTCCTCCACCTTT-3’(SEQ ID No：4)，G-GAPDH-R：5’-CCACCACCCTGTTGCTGTA-3’(SEQID No：5)；G-GAPDH-P：5’-CATTGCCCTCAACGACCACTTTGTC-3’(SEQ ID No：6)。

按照如表2所示的信息配制引物探针混合液。

表2引物探针混合液的配方

3、酶系混合液的制备

按照如表3所示的信息配制酶系混合液。

表3酶系混合液的配方

上表中的酶系稀释液为常规用于稀释PCR反应酶的溶液，主要成分为：Tris-HCl(pH 9.0)，15mM；KCl，100mM；EDTA(pH 8.0)，0.1mM；Tween-20，0.5％(v/v％)；NP-40，4mL，DTT，1mM；丙三醇(甘油)，50％(v/v％)。

4、buffer的制备

按照如表4所示的信息配制buffer(在后续的PCR反应体系中作为6×buffer使用)。

表4buffer的配方

5、风干预混液的制备

按照如表5所示的信息配制风干预混液，得到14个所含稳定剂不同的风干预混液，记为风干预混液1～14。

表5风干预混液的配方

按照如表6所示的信息配制对照预混液。

表6对照预混液的配方

分别将风干预混液1～14和对照预混液以20μL/管分装至八联管中，放入鼓风干燥箱中，37℃风干16小时，即得到风干PCR反应体系1～14和对照体系，真空密封包装备用。

实施例2风干PCR反应体系的检测性能

1、实验方法

分别用20μL灭菌水复溶实施例1制得的风干PCR反应体系1～14和对照体系。

以2000copise/mL B群链球菌菌液、200copise/mL B群链球菌菌液和B群链球菌阳性质控品(SEQ ID No：7)作为模板(模板用量为10μL)，用实施例1制得的风干预混液1～14(未风干，即液相组)、复溶的风干PCR反应体系1～14(即风干组)和对照体系(对照组)进行PCR反应检测，统计各组的Ct值。

PCR反应体系为：模板(2000copise/mL B群链球菌菌液或200copise/mL B群链球菌菌液或阳性质控品(SEQ ID No：7))，10μL；液相组或风干组或对照组，20μL。

PCR反应程序为：50℃，2min；95℃，5min；95℃，5s，60℃，35s，45个循环，收集荧光。

2、实验结果

表7风干PCR反应体系的性能评价结果

如表7所示，风干组的14个风干PCR反应体系中有5个(风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11)与液相组的对应风干预混液(风干预混液7、风干预混液8、风干预混液9、风干预混液10和风干预混液11)的扩增Ct值无明显差异(Ct值差值的平均绝对值均小于1)，并且这5个风干PCR反应体系及其对应风干预混液都与对照组的扩增Ct值无明显差异，说明风干过程对这5个风干预混液的性能无明显影响；而风干组的其他9个风干PCR反应体系检测不同浓度样品和阳性质控品的扩增Ct值均比液相组的对应风干预混液及对照组的扩增Ct值明显增大，说明风干过程使这9个风干预混液的性能变差。

以上结果表明，使用稳定剂7、稳定剂8、稳定剂9、稳定剂10和稳定剂11制备的风干PCR反应体系(风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11)保留了液相风干预混液的检测性能，使得PCR反应体系在风干前后的检测效果相当。

实施例3风干PCR反应体系的稳定性

1、实验方法

采用“37℃加速法”对实施例1制得的风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11进行加速稳定性检测。

将对照体系、风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11经过真空密封包装后，于37℃分别放置0、1、3、7和14天。

放置结束后，分别加入20μL灭菌水复溶对照体系、风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11。

以2000copise/mL B群链球菌菌液、200copise/mL B群链球菌菌液和B群链球菌阳性质控品(SEQ ID No：7)作为模板，使用实施例1制得的对照预混液及复溶的对照体系、风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11，按照实施例2中的PCR反应体系和PCR反应条件进行PCR反应检测，统计各组的Ct值。

2、实验结果

表8 37℃加速0天检测结果

表9 37℃加速3天检测结果

表10 37℃加速7天检测结果

表11 37℃加速14天检测结果

如表8～11所示，风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11在37℃分别放置0、3、7、14天后均能正常测得扩增Ct值，而未添加稳定剂的对照组体系在放置第3天起扩增Ct值逐渐增大，稳定性严重下降。

以上结果表明，使用稳定剂7、稳定剂8、稳定剂9、稳定剂10和稳定剂11制备的风干PCR反应体系(风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11)的稳定性好，可在室温长期存放，37℃存放两周以上依然保持高效的检测性能；而且使用稳定剂7、稳定剂8、稳定剂9、稳定剂10和稳定剂11制备的风干PCR反应体系(风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11)的检测灵敏度高，当检测样本的浓度低至200copise/mL时仍可测得有效的CT值(CT值均小于36)。

实施例4一种B群链球菌核酸检测试剂盒

1、组成

试剂盒主要包括PCR预混体系和B群链球菌阳性质控品(SEQ ID No：7)，其中PCR预混体系为实施例1制得的风干PCR反应体系7、风干PCR反应体系8、风干PCR反应体系9、风干PCR反应体系10和风干PCR反应体系11中的任意一种。

2、使用方法

(1)待测样本的提取

本试剂盒对待测样本的提取方法没有指定要求，一般实验室常规核酸提取方法或商用核酸提取试剂均适用。

(2)PCR扩增

以提取后的待测样本和B群链球菌阳性质控品(SEQ ID No：7)作为模板，进行PCR扩增。

PCR反应体系为：模板(待测样本或B群链球菌阳性质控品(SEQ ID No：7))，10μL；PCR预混体系，20μL。

(3)结果判读

若待测样本FAM通道无扩增曲线或Ct值＞38，且CY5通道有扩增曲线且Ct值≤36，则判定待测样本为B群链球菌阴性；

若待测样本FAM通道有扩增曲线且Ct值≤38，CY5通道有或无扩增曲线，则判定待测样本为B群链球菌阳性；

若FAM通道无扩增曲线或Ct值＞38，CY5通道无扩增曲线或Ct值＞36，则该样本检测结果无效，应查找并排除原因后重新进行检测。

实施例5稳定剂的普适性

1、实验方法

(1)检测HSV-Ⅱ的反应组分A制备

以HSV-Ⅱ糖蛋白G基因(NCBI基因号：EU018103.1)作为PCR检测的目的基因，上游引物H-F1：5’-GTCAGCCCATCCTCCTTC-3’(SEQ ID No：8)，下游引物H-R1：5’-AGAGCGTACCGGGTCGGAG-3’(SEQ ID No：9)，探针：H-P1：5’-CCGCCGCGACACCCTCCATACTG-3’(SEQ ID No：10。

以PPIA作为PCR检测的内参基因，上游引物PPIA-F：5’-AATGTTGGGCATCAGGTTA-3’(SEQ ID No：11)；PPIA-R：5’-CGAAAGTCTGAAAGGGAAG-3’(SEQ ID No：12)；PPIA-P：5’-AAGAGCTTCAGGGAAATGAGAAAG-3’(SEQ ID No：13)。

将所得引物和探针按照表12所示的配方配制得到反应组分A。

表12检测HSV-Ⅱ的反应组分A

(2)检测HSV-Ⅱ的反应组分B及其对照的制备

根据如表13所示的配方配制反应体系预混液。

表13检测HSV-Ⅱ的反应组分B的预混液

根据如表14所示的配方配制反应组分B的对照预混液。

表14反应组分B对照预混液

(3)PCR反应体系的制备及检测前准备

按照实施例1中的风干方法，分别将含有不同稳定剂的反应组分B的预混液以20μL/管分装至八联管中，放入鼓风干燥箱中，37℃风干16小时，即得到风干的反应组分B。

用20μL灭菌水复溶风干的反应组分B，再将反应组分A与复溶的反应组分B混合均匀，即得到可用于PCR检测的反应体系，记为稳定剂7风干PCR反应体系、稳定剂8风干PCR反应体系、稳定剂9风干PCR反应体系、稳定剂10风干PCR反应体系和稳定剂11风干PCR反应体系。

将反应组分A分别与含有不同稳定剂的反应组分B的预混液或反应组分B的对照预混液混合均匀，即得到可用于PCR检测的反应体系，记为稳定剂7预混液反应体系、稳定剂8预混液反应体系、稳定剂9预混液反应体系、稳定剂10预混液反应体系、稳定剂11预混液反应体系和对照反应体系，真空密封包装备用。

(3)PCR检测

以1×10⁵copies/mL HSV-Ⅱ菌液、500copise/mL HSV-Ⅱ菌液和HSV-Ⅱ阳性质控品(SEQ ID No：14)作为模板，用本实施例制得的稳定剂7风干PCR反应体系、稳定剂8风干PCR反应体系、稳定剂9风干PCR反应体系、稳定剂10风干PCR反应体系、稳定剂11风干PCR反应体系、稳定剂7预混液反应体系、稳定剂8预混液反应体系、稳定剂9预混液反应体系、稳定剂10预混液反应体系、稳定剂11预混液反应体系和对照反应体系进行PCR反应检测，统计各组的Ct值。

PCR反应体系为：模板(1×10⁵copies/mL HSV-Ⅱ菌液/500copise/mL HSV-Ⅱ菌液/HSV-Ⅱ阳性质控品(SEQ ID No：14))，10μL；各PCR反应体系，20μL。

PCR反应程序为：50℃，2min；95℃，15min；94℃，15s，55℃，45s，40个循环，收集荧光。

2、实验结果

表15稳定剂的普适性检测结果

如表15所示，各PCR反应体系与对应预混液反应体系及对照组的扩增Ct值无明显差异(Ct值差值的平均绝对值均小于0.2)，说明风干过程不会影响使用实施例1制备的稳定剂7、稳定剂8、稳定剂9、稳定剂10和稳定剂11配制的检测HSV-Ⅱ的风干PCR反应体系的检测性能。

以上结果表明，实施例1制备的稳定剂7、稳定剂8、稳定剂9、稳定剂10和稳定剂11具有良好的普适性，还适用于制备检测HSV-Ⅱ的风干PCR反应体系，对于不同的检测靶标有良好的普适性。

最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，对于本领域的普通技术人员来说，在上述说明及思路的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施方式予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。

Claims

1.一种提高PCR风干试剂稳定性的组合物，其特征在于，包含0.15g/mL～0.25g/mL蔗糖、0.20g/mL～0.25g/mL海藻糖、0.10g/mL～0.15g/mL葡聚糖、0.05g/mL～0.10g/mL聚乙烯吡络烷酮40和0.05g/mL～0.10g/mL棉籽糖。

2.权利要求1所述组合物在制备PCR风干试剂中的应用。

3.一种PCR风干试剂，其特征在于，包含权利要求1所述的组合物、dNTPs、PCR反应酶和PCR反应buffer。

4.根据权利要求3所述的PCR风干试剂，其特征在于，还包含PCR引物和/或PCR探针。

5.一种制备PCR风干试剂的方法，其特征在于，包括以下步骤：

S1.将权利要求1所述组合物、dNTPs、PCR反应酶和PCR反应buffer混合均匀；

S2.将上一步所得混合物于37℃～50℃风干8小时～16小时。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，步骤S1中，还加入PCR引物和/或PCR探针。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述PCR引物的终浓度为0.2pmol/μL～0.5pmol/μL。

8.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，步骤S1中，所述PCR探针的终浓度为0.1pmol/μL～0.4pmol/μL。

9.权利要求5～8任一所述方法制得的PCR风干试剂。

10.权利要求3～4任一所述PCR风干试剂和/或权利要求9所述PCR风干试剂在制备核酸检测试剂盒中的应用。