CN116410953A - 一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法，该酶来源于大不里士杆菌(Tabrizicolasp.)，该酶在大肠杆菌里具有很高的表达量，且表现出良好的催化活性和稳定性，可用于酶催化的ATP再生系统。
Description
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法。
背景技术
三磷酸腺苷(Adenosine triphosphate、ATP)是一种高能磷酸化合物，在细胞中，它能与ADP相互转化实现贮能和放能，从而保证了细胞各项生命活动的能量供应。在细胞外，可以为ATP依赖酶的催化过程提供能量从而生产高值化合物，如醛类、酰胺类和芳香氨基糖苷类等。在工业生产过程中，直接使用ATP，不但成本过高，而且反应过程中形成的副产物ADP或AMP会对反应产生抑制。所以采用一定的技术手段使反应系统中ATP再生，以实现ATP的循环利用很有必要。
目前，已经报道了几种不同类型的ATP再生系统，例如，磷酸烯醇式丙酮酸/丙酮酸激酶、乙酰磷酸/乙酸激酶、多聚磷酸盐/多聚磷酸激酶等。其中多聚磷酸盐(Polyphosphate，PolyP)是一种通过酸酐连接磷酸盐残基的无机聚合物，其合成工艺成熟，价格低，纯度高，并且在广泛的温度、pH和氧化剂范围都是稳定的，所以基于多聚磷酸盐/多聚磷酸激酶的ATP再生系统成本优势明显。
多聚磷酸激酶(Polyphosphate kinase，PPK)是一类以多聚磷酸盐作为磷酸供体，催化ADP或AMP生成ATP的酶。PPK被分为PPK1和PPK2两类，PPK1偏好以ATP为底物，进行ATP的降解；PPK2家族又可以进一步被分为三类，PPK2-I偏好以ADP为底物生成ATP，PPK2-II偏好以AMP为底物生成ADP，PPK2-III既以ADP为底物又以AMP为底物生成ATP。因此，这类酶可用于ATP的合成。
已有文献报道多聚磷酸激酶在ATP再生系统中的应用，例如，来源于细长嗜热聚球藻菌的多聚磷酸激酶应用于生产D-氨基酸二肽、来源于类球红细菌的多聚磷酸激酶应用于生产L-茶氨酸。
目前基于多聚磷酸激酶的ATP再生系统中所报道的多聚磷酸激酶还存在活性不够高、热稳定性不够好等问题。因此开发新的多聚磷酸激酶对能够利用廉价Poly P原料进行ATP再生具有较大经济价值。
发明内容
本发明的目的是提供一种多聚磷酸激酶、其编码基因及其制备方法。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案如下：
一种多聚磷酸激酶，所述多聚磷酸激酶来源于大不里士杆菌(Tabrizicolasp.)，因此简称为TaPPK，其氨基酸序列选自以下其中一种：
(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
本发明还提供一种多聚磷酸激酶的编码基因，编码基因编码多聚磷酸激酶，其天然的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供所述多聚磷酸激酶TaPPK的制备方法，包括以下步骤：
(1)构建包含多聚磷酸激酶TaPPK的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，得到重组菌；
(2)培养重组菌株使其发酵，诱导多聚磷酸激酶TaPPK表达；
(3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；
(4)对收集的上清液的进行纯化，获得多聚磷酸激酶TaPPK。
优选地，所述步骤4)中上清液的的纯化方式为硫酸铵沉淀法，用10％饱和度的硫酸铵对其上清液进行两轮沉淀。
本发明检测了上述多聚磷酸激酶TaPPK的酶学性质，包括最适温度、最适pH、最适金属离子、最适金属离子浓度、温度稳定性、pH稳定性、表观动力学参数等，证实其具有良好的催化活性和稳定性。
与现有技术相比，本发明的有益成果为：
本发明的多聚磷酸激酶TaPPK是一种新的高活性多聚磷酸激酶，该多聚磷酸激酶可以利用廉价且稳定性高的多聚磷酸盐进行ATP再生，具有广泛的应用前景，且其具有良好的催化活性和稳定性
附图说明
图1为本发明实施例2中多聚磷酸激酶TaPPK的SDS-PAGE结果。
图2为本发明实施例4中温度对多聚磷酸激酶TaPPK催化活性的影响。
图3为本发明实施例4中pH对多聚磷酸激酶TaPPK催化活性的影响。
图4为本发明实施例4中金属离子对多聚磷酸激酶TaPPK催化活性的影响。
图5为本发明实施例4中Mg2+浓度对多聚磷酸激酶TaPPK催化活性的影响。
图6为本发明实施例4中多聚磷酸激酶TaPPK在不同温度条件下的稳定性。
图7为本发明实施例4中多聚磷酸激酶TaPPK在不同pH条件下的稳定性。
图8为本发明实施例4中多聚磷酸激酶TaPPK的动力学曲线。
具体实施方式：
下面结合实施例对本发明的技术方案进行详细说明。以下采用的试剂和生物材料如未特别说明，均为商业化产品。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。
本发明中的载体(vector)是指能够将DNA片段转移到受体细胞中的一种能自我复制的环状DNA分子。
“同源性”或“同源性百分比”是指两个氨基酸序列之间或两个核酸序列之间的序列同一性。为确定两个氨基酸序列或两个核酸的同源性百分比，以最佳比较目的对序列进行比对。
实施例1多聚磷酸激酶TaPPK表达菌株的构建
将TaPPK与文献中活性较好的来源于类球红细菌(Rhodobactersphaeroides)的RhPPK(序列号：WP_011338472)进行氨基酸序列比对，比对结果发现：TaPPK与RhPPK具有80％的氨基酸序列同源性。TaPPK的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，含有323个氨基酸，预测蛋白分子量为37kDa。
为了保证目的基因能在大肠杆菌中高效表达，对目的基因进行密码子优化(DNA序列见SEQ ID NO.2)，委托金斯瑞生物科技公司合成和并克隆于pET28a的NdeI和BamH I位点之间，将表达质粒导入感受态大肠杆菌BL21(DE3)中，获得重组菌株。
实施例2多聚磷酸激酶TaPPK的表达、纯化
(1)将实施例1得到的重组菌株，挑取单菌落接种到5mL含有Kan抗性的液体LB培养基中，37℃，220rpm，培养12h。再将菌液接种到100mL含Kan抗性的液体TB培养基中，37℃，220rpm培养至OD600值为0.6-0.8时，加入终浓度为0.2mM的IPTG，30℃，200rpm诱导表达16-18h。9000rpm离心，收集菌体。
(2)将收集的菌体悬浮到破胞缓冲液(pH7.4)中进行超声破碎，12000rpm离心收集上清液。
(3)使用硫酸铵沉淀法对上述收集的上清液进行纯化，10％饱和度的硫酸铵对其上清液进行两轮沉淀，获得目标蛋白多聚磷酸激酶TaPPK，纯化后蛋白电泳结果见图1。
实施例3多聚磷酸激酶TaPPK的酶活测定方法
酶活测定：反应体系组成及反应条件：1mL反应体系：加入终浓度为5mM ADP，50mM六偏磷酸钠，100mM MgCl2·6H2O，50mM Tris-HCl(pH8.0)，3.1μgTaPPK，37℃，999rpm反应10min后，加入1mL浓度为1M的盐酸终止反应。
HPLC检测，具体条件：A为pH为6.5的0.5M的磷酸盐缓冲液，B为甲醇。洗脱条件为A:B＝95:5，流速为0.6mL/min，检测温度为30℃，检测波长为254nm。经计算TaPPK的比酶活为676U/mg。
实施例4多聚磷酸激酶TaPPK的酶学性质
(1)温度对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，将反应体系分别放在不同温度(18℃、26℃、45℃、50℃、60℃)下反应。考察温度对催化活性的影响，如图2所示，酶反应最适温度为37℃。
(2)pH对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，将反应体系分别放在不同pH(5.5、7.5、8.5、9.5)反应。考察pH对催化活性的影响，如图3所示，酶反应最适pH为7.5。
(3)金属离子对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，在反应体系中分别加入不同金属离子(Ni2+、Zn2+、Co2+、Mn2+、Te2+、Cu2+、Ca2+)反应。考察金属离子种类对催化活性的影响，如图4所示，酶反应最适金属离子为Mg2+。
(4)Mg2+浓度对酶催化活性的影响：根据实施例3所示方法，其它条件不变，将反应体系在不同Mg2+浓度(10mM、25mM、50mM、75mM、125mM、150mM)反应。考察Mg2+浓度对催化活性的影响，如图5所示，酶反应最适Mg2+浓度为100mM。
(5)温度稳定性：1mL反应体系：加入终浓度为5mM ADP，50mM六偏磷酸钠，100mMMgCl2·6H2O，50mM Tris-HCl(pH8.0)，3.1μg经不同温度(4℃、25℃、35℃、45℃、55℃、65℃)孵育1h的TaPPK，37℃，999rpm反应10min后，加入1mL浓度为1M的盐酸终止反应。考察酶在不同温度下的稳定性，如图6所示，酶在45℃下孵育1h保留80％以上的活性。
(6)pH稳定性：根据实施例3所示方法，1mL反应体系：加入终浓度为5mM ADP，50mM六偏磷酸钠，100mM MgCl2·6H2O，50mM Tris-HCl(pH8.0)，3.1μg经不同pH(5.5、6.5、7.5、8.5、9.5)孵育(1h、6h、12h)的TaPPK，37℃，999rpm反应10min后，加入1mL浓度为1M的盐酸终止反应。考察酶在不同pH条件下的稳定性，如图7所示，酶在弱酸、弱碱条件下孵育12h后保留70％以上活性。
(7)表观动力学参数：根据实施例3所示方法，将酶在不同底物浓度下反应。直至底物浓度不再影响反应速率。测定酶的表观动力学参数，结果见图8、表1。
表1TaPPK的表观动力学参数
Claims (4)
1.一种多聚磷酸激酶，其特征在于，所述多聚磷酸激酶来源于大不里士杆菌(Tabrizicolasp.)，其氨基酸序列选自以下其中一种：
(1)如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；
(2)对SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列进行一个或多个氨基酸的取代、缺失或添加修饰且具有相同功能的氨基酸序列；
(3)与SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有相同功能的氨基酸序列。
2.一种多聚磷酸激酶的编码基因，其特征在于，所述编码基因编码权利要求1所述的多聚磷酸激酶。
3.一种如权利要求1所述的多聚磷酸激酶的制备方法，其特征在于包括以下步骤：
(1)构建包含多聚磷酸激酶的重组表达载体，将重组表达载体转化至宿主细胞，得到重组菌；
(2)培养重组菌株使其发酵，诱导多聚磷酸激酶表达；
(3)收集菌体，破碎菌体细胞，离心收集上清液；
(4)对收集的上清液进行纯化，获得多聚磷酸激酶。
4.如权利要求3所述的制备方法，其特征在于步骤4)中上清液的的纯化方式为硫酸铵沉淀法，用10％饱和度的硫酸铵对其上清液进行两轮沉淀。
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